KR102661066B1 - 면역반응의 조절을 위한 방법 및 항체 - Google Patents

Abstract

항-CD11b 항체 또는 이의 항원-결합 부분, 및 세포 상의 CD11b 발현을 조정함에 의해 면역반응을 조절하기 위한 방법 및 항체의 용도에 관한 것이다.

Description

면역반응의 조절을 위한 방법 및 항체 {METHODS AND ANTIBODIES FOR MODULATION OF IMMUNORESPONSE}

본 발명은 면역치료요법 분야에 관한 것이다. 특히, 본 발명은 세포 상의 CD11b 발현을 조정함에 의해 면역반응을 조절하기 위한 방법 및 항체에 관한 것이다.

암세포는 종양 형성에 대해 효과적인 면역 반응을 유도할 수 있는 면역원성 항원을 발현하는 것으로 널리 사료되고 있다. 추가로, 종양 미세환경은 항-종양 반응을 활성화하기 위해 TLR 시그날 전달을 유발할 수 있는 성분이 풍부하다 (문헌참조: Standiford TJ, Keshamouni VG (2012) Breaking the tolerance for tumor: Targeting negative regulators of TLR signaling. Oncoimmunology 1: 340-345). 이것은, 질환의 초기 단계에서, 암 세포가 종양을 발병하는 것에 대한 숙주-보호 및 종양-모델링 작용 둘다를 발휘하는 면역계에 의해 인지되고 거부될 기회를 가질 수 있음을 의미한다. 그럼에도 불구하고, 암 세포는 또한 MHC 분자의 하향 조절 또는 항원 프로세싱 및 제공 기구와 같은, 억제성 사이토킨의 분비를 증가시키고 억제성 분자를 발현하여 암세포에 대한 면역 내성을 유도하는 면역 감시를 회피하기 위한 많은 음성 조절 기작을 갖는다. 따라서, 암 환자는 흔히 불량한 면역력을 갖는 것으로 고려된다. 따라서, 여전히 암 관련 면역억제의 역전을 위한 제제 또는 치료요법을 개발할 필요가 있다.

인테그린 알파 M (CD11b, CR3A, 및 ITGAM)은 단핵구, 과립구, 마크로파아지, 수지상 세포, 천연 킬러 세포 및 골수-유래된 서프레서 세포를 포함하는 많은 면역 세포의 표면상에 발현하는 이종이량체 인테그린 αMβ2 분자를 형성하는 하나의 단백질 서브유니트이다. 인테그린 αMβ2는 이의 난잡한 리간드 레퍼토리를 통해 세포 접착, 이동, 주화성 및 식세포 작용을 조정함에 의해 염증을 매개한다. 최근 연구는 TLR4 반응을 조절함에 의해 염증에 대한 중요한 역할을 지적했다 (문헌참조: Han C, Jin J, Xu S, Liu H, Li N, et al. (2010) Integrin CD11b negatively regulates TLR-triggered inflammatory responses by activating Syk and promoting degradation of MyD88 and TRIF via Cbl-b. Nat Immunol 11: 734-742). 혈관의 관강 측면내 다양한 내인성 인테그린 αMβ2 리간드, 예를 들어, 피브리노겐은 TLR4 시그날 전달을 유발할 수 있다. β2 인테그린과 커플링되는 ITAM의 높은 결합가 연결은 일시적으로 TLR 활성화를 유도하지만 Cbl-b-매개된 단백질용해 분해를 위해 MyD88 및 TRIF를 표적화함을 통해 TLR 시그날 전달을 신속히 억제한다. 따라서, 인테그린 αMβ2는 TLR 계열의 효과를 차단하기 위해 TLR-시그날 전달 경로의 성분을 선택적으로 억제하는 음성 조정인자로서 작용할 수 있다 (Wang L, Gordon RA, Huynh L, Su X, Park Min KH, et al. (2010) Indirect inhibition of Toll-like receptor and type I interferon responses by ITAM-coupled receptors and integrins. Immunity 32: 518-530).

PD-L1은 다양한 수준에서 많은 유형의 면역 세포 상에서 발현되고 단핵구, 마크로파아지 및 수지상 세포, T-세포, B-세포, 상피 세포 및 혈관 내피 세포 상에서 항상성으로 발현되는 동시-억제성 단백질 중 하나이다. IFN-γ 및 미토겐 자극과 같은 양성 유도시, PD-L1은 추가로 상향조절된다. PD-L1은 이의 수용체, T-세포 아폽토시스 및 아네르기를 촉진시키는 활성화된 T-세포에서 동시-억제성 시그날을 유도함에 의해 잠재적 면역억제를 생성하는 활성화된 T 세포상에 발견되는 PD-1에 결합한다 (Butte MJ, Keir ME, Phamduy TB, Sharpe AH, Freeman GJ (2007) Programmed death-1 ligand 1 interacts specifically with the B7-1 costimulatory molecule to inhibit T cell responses. Immunity 27: 111-122; Francisco LM, Salinas VH, Brown KE, Vanguri VK, Freeman GJ, et al. (2009) PD-L1 regulates the development, maintenance, and function of induced regulatory T cells. J Exp Med 206: 3015-3029). PD-L1/PD-1 상호작용의 통합성은 또한 과도한 면역 반응을 피하는데 중요하다. PD-L1과 PD-1 간의 상호작용에서의 결함은 면역 반응의 조절가능하지 않은 확대를 유도하여 자가면역 질환, 과민성, 이식 거부 및 접합 대 숙주 장애와 같은 병태를 유도할 수 있다.

US 8,008,449는 PD-1에 특이적으로 결합하는 단리된 모노클로날 항체, 특히 인간 모노클로날 항체를 제공한다. US 8,354,509는 인간 프로그램화된 사멸 수용체 1 (hPD-1)의 이의 리간드(hPD-L1 또는 hPD-L2)로의 결합을 차단하는 항체에 관한 것이다. US 8,900,587은 hPD-1의 hPD-L1 또는 hPD-L2로의 결합을 차단하는 항체 및 PD-1 경로를 통해 면역 세포의 활성을 증가시키는 (또는 하향조절을 감소시키는) 방법을 기재하고 있다. US 9,067,999 및 US 9,073,994는 PD-1, PD-L1, 또는 PD-L2 및 이들을 사용한 치료요법에 의해 유도되는 면역억제 시그날의 억제에 의해 유발되는 면역강화를 통한 암 또는 감염 치료를 위한 조성물을 제공한다. 그러나, 상기 특허 문허문헌에 언급된 항체는 치료요법에 대해 낮은 반응율을 갖는다. US 20140099254 A1은 암 또는 감염성 질환을 앓는 대상체에게 (i) ADAM17, CD2, CD3, CD4, CD5, CD6, CD8, CD11a, CD11b, CD14, CD16, CD16b, CD25, CD28, CD30, CD32a, CD40, CD40L, CD44, CD45, CD56, CD57, CD64, CD69, CD74, CD89, CD90, CD137, CD177, CEACAM6, CEACAM8, HLA-DR 알파 쇄, KIR 및 SLC44A2를 포함하는 백혈구 재지시 이특이적 항체; (ii) 인터페론; (iii) CTLA4, PD1, PD-L1, LAG3, B7-H3, B7-H4, KIR 및 TIM3을 포함하는 체크포인트 억제제 항체; 및 (iv) 항체-약물 접합체 (ADC)로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 2개 이상의 제제의 배합물을 투여함을 포함하는, 암 또는 감염성 질환에 대한 면역 반응을 유도하는 방법을 제공한다. 그러나, 상기 문헌은 단지 다수의 공지된 면역 관련 성분들을 배합하는 것이고 이것은 성분들 간의 상호작용에 대해 기재하고 있지 않다.

본 발명은 예상치 않게 PD-L1의 발현이 면역 세포 및/또는 다른 세포 상의 CD11b에 결합된 CD11b 조절제에 의해 억제될 수 있음을 밝혔다. CD11b 조절제의 CD11b로의 결합은 LPS-프라이밍된 단핵구 상에 PD-L1 발현을 감소시킨다. LPS-유도된 면역억제된 단핵구 또는 패혈증 쇼크를 갖는 환자 유래의 단핵구에서, CD11b 조절제의 CD11b로의 결합은 또한 세포가 LPS로 챌린지되는 경우 PD-L1 발현을 감소시킨다.

본 발명은 면역 세포에서 PD-L1 발현을 억제하기 위한 방법을 제공하고, 상기 방법은 상기 면역 세포를 세포 상의 CD11b에 결합하는 CD11b 조절제와 접촉시켜 상기 면역 세포의 PD-L1 발현을 조정함을 포함한다.

본 발명은 면역 억제 또는 면역 고갈을 역전시키거나 면역 세포에서 기존의 면역력을 유도하기 위한 방법을 제공하고, 상기 방법은 상기 면역 세포를 세포 상의 CD11b에 결합하는 CD11b 조절제와 접촉시킴을 포함한다.

본 발명은 CD11b 조절제에 반응하는 대상체를 결정하기 위한 방법을 제공하고, 상기 방법은 생물학적 샘플 또는 대상체 중 면역 세포를 CD11b 조절제와 접촉시키고 CD11b 조절제에 의한 면역 세포 상의 PD-L1의 억제를 검출함에 의해 PD-L1이 생물학적 샘플 또는 대상체에서 억제되는지를 검출함을 포함하고, 여기서, 상기 PD-L1이 억제되는 경우 상기 대상체는 CD11b 조절제에 반응하는 것임을 지적한다.

일부 구현예에서, 본원에 기재된 CD11b 조절제는 CD11b 발현을 억제하는 RNAi 제제, 항-CD11b 항체 또는 CD11b를 조절하는 소분자 화합물이다.

하나의 구현예에서, 상기 면역 세포는 T 세포 또는 단핵구 또는 과립구 또는 마크로파아지 또는 골수-유래된 서프레서 세포 또는 천연 킬러 세포이다. 하나의 구현예에서, CD11b 결합은 IFN-γ, IL-12 또는 CD8 T 세포를 증가시킨다. 또 다른 구현예에서, CD11b 조절제의 세포 상의 CD11b로의 결합은 면역억제와 관련된 질환을 치료하고/하거나 예방한다. 추가의 구현예에서, 면역억제 또는 면역 고갈과 관련된 질환은 급성 및/또는 만성 감염, 패혈증, 암에서 면역결핍 또는 노화에서 면역노화 (immunosenescence)에서 면역 세포 T-세포 고갈이다.

하나의 구현예에서, 암의 예방 및/또는 치료 방법은 추가의 활성제 또는 치료요법제를 투여함을 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 추가의 활성제는 면역 체크포인트 치료요법 (immune checkpoint therapy), 방사선치료요법 또는 화학치료요법이다.

본 발명은 또한 NYWIN (서열번호 1) 또는 GFSLTSNSIS (서열번호 2)의 아미노산 잔기로 이루어진 중쇄 상보성 결정 영역 1 (H-CDR1) 또는 서열번호 1 또는 2와 적어도 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % 동일성을 갖는 아미노산 서열을 갖는 변이체; NIYPSDTYINHNQKFKD (서열번호 3) 또는 AIWSGGGTDYNSDLKS (서열번호 4)의 아미노산 잔기로 이루어진 중쇄 CDR2 (H-CDR2) 또는 서열번호 3 또는 4와 적어도 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % 동일성을 갖는 아미노산 서열을 갖는 변이체; 및 SAYANYFDY (서열번호 5) 또는 RGGYPYYFDY (서열번호 6)의 아미노산 서열로 이루어진 중쇄 CDR3 (H-CDR3) 또는 서열번호 5 또는 6과 적어도 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % 동일성을 갖는 아미노산 서열을 갖는 변이체 중 적어도 하나; 및

RASQNIGTSIH (서열번호 7) 또는 KSSQSLLYSENQENYLA (서열번호 8)의 아미노산 잔기로 이루어진 경쇄 CDR1 (L-CDR1) 또는 서열번호 7 또는 8과 적어도 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % 동일성을 갖는 아미노산 서열을 갖는 변이체; YASESIS (서열번호 9) 또는 WASTRQS (서열번호 10)의 아미노산 잔기로 이루어진 경쇄 CDR2 (L-CDR2) 또는 서열번호 9 또는 10 중 어느 하나와 적어도 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % 동일성을 갖는 아미노산 서열을 갖는 변이체; 및 아미노산 잔기 QQSDSWPTLT (서열번호 11) 또는 QQYYDTPLT (서열번호 12)로 이루어진 경쇄 CDR3 (L-CDR3) 또는 서열번호 11 또는 12 중 어느 하나와 적어도 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % 동일성을 갖는 아미노산 서열을 갖는 변이체 중 적어도 하나를 포함하는 항-CD11b 항체 또는 이의 항원-결합 부분을 제공하고, 상기 단리된 항체 또는 이의 항원-결합 부분은 CD11b에 결합한다.

일부 구현예에서, 본원에 기재된 CDR은 하나 이상의 삽입, 치환 및/또는 결실을 포함한다.

추가의 구현예에서, 본 발명은 (i) 서열번호 1을 포함하는 H-CDR1, 서열번호 3을 포함하는 H-CDR2 및 서열번호 5를 포함하는 H-CDR3을 포함하는 중쇄 가변 영역, 및 (ii) 서열번호 7을 포함하는 L-CDR1, 서열번호 9를 포함하는 L-CDR2 및 서열번호 11을 포함하는 L-CDR3을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하거나; (iii) 서열번호 2를 포함하는 H-CDR1, 서열번호 4를 포함하는 H-CDR2 및 서열번호 6을 포함하는 H-CDR3을 포함하는 중쇄 가변 영역, 및 (iv) 서열번호 8을 포함하는 L-CDR1, 서열번호 10을 포함하는 L-CDR2 및 서열번호 12를 포함하는 L-CDR3을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는, 항-CD11b 항체 또는 이의 항원-결합 부분을 제공한다. 추가의 구현예에서, H-CDR1은 서열번호 1 또는 2로 이루어진 아미노산 서열을 갖고; H-CDR2는 서열번호 3 또는 4로 이루어진 아미노산 서열을 갖고; H-CDR3은 서열번호 5 또는 6으로 이루어진 아미노산 서열을 갖고; L-CDR1은 서열번호 7 또는 8로 이루어진 아미노산 서열을 갖고; L-CDR2는 서열번호 9 또는 10으로 이루어진 아미노산 서열을 갖고 L-CDR3은 서열번호 11 또는 12로 이루어진 아미노산 서열을 갖는다.

추가로, 본 발명은:

(a) 서열번호 13으로 이루어진 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역, 및 (ii) 서열번호 23으로 이루어진 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역;

(c) 서열번호 14로 이루어진 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역, 및 (ii) 서열번호 24로 이루어진 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역;

(e) 서열번호 15로 이루어진 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역, 및 (f) 서열번호 25로 이루어진 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역;

(g) 서열번호 16으로 이루어진 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역, 및 (h) 서열번호 26으로 이루어진 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역;

(i) 서열번호 17로 이루어진 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역, 및 (j) 서열번호 27로 이루어진 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역;

(k) 서열번호 18로 이루어진 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역, 및 (l) 서열번호 28로 이루어진 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역;

(m) 서열번호 19로 이루어진 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역, 및 (n) 서열번호 29로 이루어진 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역;

(o) 서열번호 20으로 이루어진 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역, 및 (p) 서열번호 30으로 이루어진 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역;

(q) 서열번호 21로 이루어진 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역, 및 (r) 서열번호 31로 이루어진 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역; 또는

(s) 서열번호 22로 이루어진 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역, 및 (t) 서열번호 32로 이루어진 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는, 인간화된 항-CD11b 항체 또는 이의 항원-결합 부분을 제공한다.

본 발명은 또한 항-CD11b 항체 또는 이의 항원-결합 부분을 포함하는 조성물을 제공한다. 본 발명은 또한 본 발명의 인간화된 항-CD11b 항체를 대상체에게 투여함을 포함하는 방법을 제공한다. 상기 방법은 면역 세포에서 PD-L1 발현을 억제하거나, 면역 세포에서 면역 억제 또는 면역 고갈을 역전시키거나 기존의 면역력을 유도하고, 대상체에서 PD-L1을 결정하고, 패혈증에서 급성 및/또는 만성 감염, 암에서 면역결핍 또는 노화에서 면역노화를 치료하거나 예방하기 위한 방법을 포함한다. 본 발명의 항-CD11b 항체는 상기 언급된 방법에 사용될 수 있다.

도 1은 CD11b와 항-CD11b 항체의 결합이 PD-L1의 표면 발현을 변화시킴을 보여준다. 인간 단핵구는 이소형 대조군 IgG, 또는 항-CD11b 항체 (ICRF44)의 존재하에 18시간 동안 LPS(100ng/ml)로 자극하였다. 세포를 수거하고 HLA-DR, PD-L1, CD80 및 CD86 분자는 유동 세포측정을 사용하여 분석하였다. 표면 분자 발현은 MFI로서 제공된다. 값은 3개의 독립적 실험으로부터 평균 ± SEM으로서 나타낸다.
도 2a 및 2b는 각각 피브리노겐으로의 세포 접착의 효과 및 CD11b에 결합함에 의해 PD-L1 발현의 감소 효과를 보여준다. 도 2a는 피브리노겐으로의 K562/CD11b 세포 접착에 대한 ML-C19-A의 효과를 보여준다. K562/CD11b 세포 중 25000개는 20분 동안 37℃에서 10μM ML-C19-A 또는 DMSO의 존재하에 피브리노겐 (20 ㎍/ml)-피복된 웰의 바닥에 부착하였다. 상기 결과는 루시퍼라제-기반 세포역가-Glo (Promega CO.)에 의해 정량하였다. 각각의 막대는 대표적인 실험으로부터 3회 결정의 평균 ± SEM을 나타낸다. 도 2b는 CD11b와 CD11b 길항제의 결합이 단핵구 상의 PD-L1 발현을 감소시킴을 보여준다. 인간 단핵구는 18시간 동안 DMSO 대조군 또는 10μM의 ML-C19-A의 존재하에 LPS (100 ng/ml)로 자극하였다. 상기 세포를 수거하고 PD-L1 분자는 유동 세포측정을 사용하여 분석하였다. 표면 분자 발현은 MFI로서 제공된다. 값은 10개의 독립적 실험으로부터의 평균 ± SEM으로서 나타낸다.
도 3은 B16F10 종양의 성장에 대한 항-CD11b 항체 단독치료요법의 효과를 보여준다. C57BL/6 마우스에 0일째에 2×10⁵ B16F10 세포를 피하 주사하였다. 7일째에, 마우스 (n=5/그룹)에 대조군 IgG (5 mg/kg) 또는 래트 항-마우스 CD11b 항체를 복강내 주사하였다. 주사는 3일 내지 4일 마다 반복하였다. 18일째에 마우스를 희생시켰다. 종양 용적을 측정하고 결과는 평균 ± SEM으로서 나타낸다.
도 4는 항-CD11b 항체 치료 후 종양-침윤 백혈구에서 MDSC 및 CD8 T 세포 집단을 보여준다. C57BL/6 마우스에 0일째에 2×10⁵ B16F10 세포를 피하주사하였다. 7일째에, 마우스 (n=5/그룹)에 대조군 IgG (5 mg/kg) 또는 래트 항-마우스 CD11b 항체를 복강내 주사하였다. 주사는 3일 내지 4일마다 반복하였다. 18일째에, 마우스를 희생시켰다. 종양은 콜라게나제로 분해하였고 종양-침윤 백혈구는 유동 세포측정에 의해 분석하였다.
도 5는 항-CD11b 치료 후 혈액에서 WBC 및 IAIE+/CD8 T 세포 상의 PD-L1 발현을 보여준다. 2x10⁵ B16F10 세포를 0일째에 꼬리 정맥을 통해 각각의 마우스에 주사하였다. 1일째에, 마우스 (n=3/그룹)에 대조군 IgG (5 mg/kg), 또는 항-마우스 CD11b 항체 (5 mg/kg)를 복강내 주사하였다. 주사는 3일 내지 4일마다 반복하였다. 15일째에, 마우스를 희생시켰다. WBC 세포를 수거하고 PD-L1 분자 및 IAIE+/CD8 T 세포는 유동 세포 측정을 사용하여 분석하였다.
도 6은 종양-함유 마우스에서 IFN-γ, IL-12 및 TNF-α의 생성이 항-CD11b 항체를 사용한 치료에 의해 역전시킴을 보여준다. 2x10⁵ B16F10 세포를 0일째에 꼬리 정맥을 통해 각각의 마우스로 주사하였다. 1일째에, 마우스 (n=3/그룹)에 대조군 IgG (5mg/kg) 또는 래트 항-마우스 CD11b 항체 (5 mg/kg)를 복강내 주사하였다. 주사는 3일 내지 4일 마다 반복하였다. 9일째에, 마우스를 희생시켰다. 혈장 사이토킨은 BD CBA 마우스 염증 키트에 의해 정량하였다.
도 7은 LLC1 종양의 성장에 대한 항-CD11b 항체 단독치료요법의 효과를 보여준다. C57BL/6 마우스에 0일째에 1×10⁶ LLC1 세포를 피하 주사하였다. 7일째에, 마우스 (n=5/그룹)에 대조군 IgG (5 mg/kg) 또는 래트 항-마우스 CD11b 항체를 복강내 주사하였다. 주사는 3일 내지 4일 마다 반복하였다. 종양 용적을 측정하고 결과는 평균 ± SEM으로서 나타낸다.
도 8은 LLC1 종양 모델에서 생존에 대한 항-CD11b 항체 단독치료요법의 효과를 보여준다. C57BL/6 마우스에 0일째에 1×10⁶ LLC1 세포를 피하 주사하였다. 7일째에, 마우스 (n=5/그룹)에 대조군 IgG (5 mg/kg) 또는 래트 항-마우스 CD11b 항체로 복강내 주사하였다. 주사는 3일 내지 4일 마다 반복하였다. 마우스는 그룹 각각에서 치료된 마우스의 장기 생존에 대한 항-CD11b 항체의 효과에 대해 분석하였다.
도 9는 LLC1 폐 전이 모델에 대한 항-CD11b 항체와 항-PD1 병용 치료요법의 효과를 보여준다. 1×10⁶ LLC1 세포를 0일째에 꼬리 정맥을 통해 각각의 마우스에 주사하였다. 1일째에, 마우스(n=3/그룹)에 대조군 IgG (10 mg/kg), 항-마우스 CD11b 항체 (10 mg/kg), 항-PD1 항체 (10 mg/kg), 또는 항-CD11b (10 mg/kg) + 항-PD1 (10 mg/kg)를 복강내 주사하였다. 주사는 3일 내지 4일 마다 반복하였다. 15일째에, 마우스를 희생시키고 종양 씨딩의 양은 현미경하에 폐에 제공된 결절의 총 수로서 계산하였다.
도 10은 폐 전이 모델에서 생존에 대한 항-CD11b 항체 및 항-PD1 병용 치료요법의 효과를 보여준다. 1×10⁶ LLC1 세포는 0일째에 꼬리 정맥을 통해 각각의 마우스에 주사하였다. 1일째에, 마우스(n=4-5/그룹)에 대조군 IgG (10 mg/kg), 항-마우스 CD11b 항체 (10 mg/kg), 항-PD1 항체 (10 mg/kg), 또는 항-CD11b (10 mg/kg) + 항-PD1 (10 mg/kg)을 복강내 주사하였다. 주사는 3일 내지 4일 마다 반복하였다. 마우스는 그룹 각각에서 치료받은 마우스의 장기 생존에 대한 병용 치료요법의 효과에 대해 분석하였다.
도 11은 B16F10 종양의 성장에 대한 항-CD11b 항체 및 탁솔 병용 치료요법의 효과를 보여준다. C57BL/6 마우스에 0일째에 2×10⁵ B16F10 세포를 피하 주사하였다. 7일째에, 마우스 (n=5/그룹)에 대조군 IgG (5 mg/kg), 항-마우스 CD11b 항체 (5 mg/kg), 탁솔 (10 mg/kg) + 대조군 IgG (5 mg/kg), 또는 탁솔 (10 mg/kg) + 항-CD11b 항체 (5 mg/kg)를 복강내 주사하였다. 주사는 3일 내지 4일 마다 반복하였다. 종양 용적을 측정하고 상기 결과는 평균 ± SEM으로서 나타낸다.
도 12는 B16F10 모델에서 생존에 대한 항-CD11b 항체 및 탁솔 병용 치료요법의 효과를 보여준다. C57BL/6 마우스에 0일째에 2×10⁵ B16F10 세포를 피하 주사하였다. 7일째에, 마우스 (n=5/그룹)에 대조군 IgG (5 mg/kg), 항-마우스 CD11b 항체 (5 mg/kg), 탁솔 (10 mg/kg) + 대조군 IgG (5 mg/kg), 또는 탁솔 (10 mg/kg) + 항-CD11b (5 mg/kg)을 복강내 주사하였다. 주사는 3일 내지 4일 마다 반복하였다. 마우스는 그룹의 각각에서 치료받은 마우스의 장기 생존에 대한 병용 치료요법의 효과에 대해 분석하였다.
도 13은 CD11b와 항-CD11b 항체의 결합이 1 ㎍/ml LPS가 챌린지된 LPS-유도된 면역억제된 단핵구에서 PD-L1 발현을 감소시킴을 보여준다. (A) 인간 단핵구는 건강한 지원자로부터 단리하였고 면역억제를 유도하기 위해 2일 동안 100 ng/ml LPS로 전처리하였다. (B) LPS-유도된 면역억제된 단핵구에 10 ㎍/ml IgG1 또는 항-CD11b 항체 (ICRF44)의 존재하에 18시간 동안 1 ㎍/ml의 LPS를 챌린지하였다. 치료된 세포를 세척하고 유동 세포측정에 의해 분석하였다. 표면 PD-L1 발현은 MFI로서 나타낸다.
도 14는 CD11b와 항-CD11b 항체의 결합이 1 ㎍/ml의 LPS로 챌린지되는 경우 패혈증 쇼크를 갖는 환자로부터의 인간 단핵구에서 PD-L1 발현을 감소시킴을 보여준다. 인간 단핵구는 패혈증 쇼크를 갖는 환자로부터 단리하였고 10 ㎍/ml의 IgG1 또는 항-CD11b 항체의 존재하에 18시간 동안 1 ㎍/ml의 LPS로 챌린지하였다. 치료된 세포를 세척하고 유동 세포측정에 의해 분석하였다. 표면 PD-L1 발현은 MFI로서 나타낸다.
도 15는 인간화된 CD11b 항체의 경쇄 가변 영역의 아미노산 서열을 보여준다. CDR은 밑줄쳐진 문자로 나타낸다.
도 16은 인간화된 CD11b 항체의 중쇄 가변 영역의 아미노산 서열을 보여준다. CDR은 밀줄쳐진 문자로 나타낸다.
도 17은 인간화된 항-CD11b 항체의 결합 활성을 보여준다. K562 세포 또는 인간 CD11b (K562/CD11b)로 형질감염된 세포를 30분 동안 10 ㎍/ml의 인간화된 항-CD11b 항체로 항온처리하였다. 결합된 Ab는 FITC-접합된 마우스 항-인간 IgG에 의해 검출하였다. 세포는 유동 세포측정에 의해 분석하였다. 점선은 K562 세포에 결합된 항체를 나타낸다. 실선은 K562/CD11b 세포에 결합된 항체를 나타낸다.
도 18은 CD11b와 항-CD11b 항체의 결합이 LPS-프라이밍된 인간 단핵구에서 PD-L1 발현을 감소시킴을 보여준다. 프라이밍된 단핵구는 18시간 동안 이소형 대조군 IgG, 항-CD11b 항체 (ICRF44) 또는 인간화된 항-CD11b 항체의 존재하에 항온처리하였다. 세포를 수거하고 단핵구 상의 PD-L1 발현은 유동 세포측정을 사용하여 분석하였다.

본 발명의 조성물, 방법 및 단리 방법을 기재하기 전에, 본 발명은 상기 조성물, 방법 및 조건이 다양할 수 있기 때문에 여기에 제한되지 않는 것으로 이해되어야만 한다. 또한 본원에 사용된 용어는 단지 특정 구현예의 기재 목적을 위한 것으로 이해되어야만 하고 제한하는 것으로 의도되지 않는다.

본 발명은 놀랍게도 PD-L1의 발현이 면역 세포 및/또는 다른 세포 상의 CD11b로의 조절제 개입에 의해 억제되어 만성 감염, 패혈증, 암에서 면역결핍 및 노화에서 면역노화와 같은 면역억제와 관련된 질환을 치료하고/하거나 예방할 수 있음을 밝혔다.

정의

달리 정의되지 않는 경우, 본원에 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어는 본 발명이 속하는 기술 분야의 통상의 숙련가에 의해 통상적으로 이해되는 바와 동일한 의미를 갖는다. 변형 및 변이가 본원 기재의 취지 ?? 범위 내에 포함되는 것으로 이해됨으로 본원에 기재된 것들과 유사하거나 동등한 임의의 방법 및 재료는 본 발명의 수행 또는 시험에 사용될 수 있다.

달리 특정되지 않는 경우, "a" 또는 "an"은 하나 이상을 의미한다.

본원에 사용된 바와 같은 아미노산 잔기는 다음과 같이 약칭된다: 알라닌 (Ala; A), 아스파라긴 (Asn; N), 아스파르트산 (Asp; D), 아르기닌 (Arg; R), 시스테인 (Cys; C), 글루탐산 (Glu; E), 글루타민 (Gln; Q), 글라이신 (Gly; G), 히스티딘 (His; H), 이소류신 (Ile; I), 류신 (Leu; L), 라이신 (Lys; K), 메티오닌 (Met; M), 페닐알라닌 (Phe; F), 프롤린 (Pro; P), 세린 (Ser; S), 트레오닌 (Thr; T), 트립토판 (Trp; W), 티로신 (Tyr; Y), 및 발린 (Val; V).

본원에 사용된 바와 같은 용어 "CD11b"는 이종이량체 인테그린 αMβ2의 하나의 서브유니트인 인테그린 알파 M (ITGAM)을 언급한다. 인테그린 αMβ2의 제2 서브유니트는 CD18로서 공지된 통상의 인테그린 β2 서브유니트이다. 인테그린 αMβ2는 또한 단핵구, 과립구, 마크로파아지 및 천연 킬러 세포를 포함하는 백혈구의 표면 상에서 발현되는 마크로파아지-1 항원 (Mac-1) 또는 상보체 수용체 3 (CR3)으로 호칭된다.

본원에 사용된 바와 같은 용어 "PD-L1"은 프로그램화된 사멸-리간드 1 (PD-L1), 분화 274 (CD274)의 클러스터 또는 B7 동족체 1 (B7-H1)을 언급한다. PD-L1은 임신, 자가면역 질환, 암, 패혈증 및 다른 감염성 질환, 예를 들어, 마이코박테리움 튜버쿨로시스 (mycobacterium tuberculosis), 사이토메갈로바이러스 및 간염바이러스와 같은 특정 반응 동안에 면역계를 억제하는데 주요 역할을 수행하는 40kDa 1형 막관통 단백질이다.

단핵성 백혈구로도 호칭되는 본원에 사용된 바와 같은 용어 "단핵구"는 제1 선 방어 기작에 관여하는 백혈구 세포의 한 유형에 속하고 수지상 세포 또는 마크로파아지 전구체로 분화할 수 있는 것으로 인지된다. 단핵구는 정상적으로 혈관계에서 이동한다. 외부 자극 시그날에 응답하여, 단핵구는 많은 면역-조절 사이토킨을 분비하여 조직내 감염 부위로 이동하고 마크로파아지로 분화한다.

본원에 사용된 바와 같은 용어 "조정하는"은 대조군과 비교하여 통계학적으로 유의적이거나 생리학적으로 유의적인 양에서 "줄어드는" 또는 "감소하는" 뿐만 아니라 "증가시키는" 또는 "자극하는"을 포함한다.

본원에 사용된 바와 같은 용어 "대상체"는 치료 또는 치료요법을 위해 선택되는 인간 또는 비-인간 동물을 의미한다.

본원에 사용된 바와 같은 "동일성"은 서열을 비교함에 의해 결정된 바와 같이 2개 이상의 폴리펩타이드 또는 단백질 서열 사이의 관계를 언급한다. 당업계에서, "동일성"은 또한 일련의 상기 서열 간의 일치에 의해 결정된 바와 같이, 폴리펩타이드 또는 단백질 간의 서열 관련성 정도를 언급한다. "동일성"은 공지된 생정보학적 방법에 의해 용이하게 계산될 수 있다. 2개의 폴리뉴클레오타이드 또는 2개의 폴리펩타이드 서열의 "퍼센트 동일성"은 디폴트 파라미터를 사용하는 GAP 컴퓨터 프로그램 (GCG 위스콘신 팩키지의 일부, 버젼 10.3 (Accelrys, San Diego, Calif.))을 사용하여 서열을 비교함에 의해 결정된다.

본원에 사용된 바와 같은 용어 "펩타이드", "폴리펩타이드" 및 "단백질"은 각각 서로 펩타이드 결합에 의해 연결된 2개 이상의 아미노산 잔기를 포함하는 분자를 언급한다. 이들 용어는 예를 들어, 해독후 또는 다르게 공유적으로 또는 비공유적으로 변형된 단백질 뿐만 아니라 천연 및 인공 단백질, 단백질 단편 및 단백질 서열의 폴리펩타이드 유사체 (예를 들어, 뮤테인, 변이체 및 융합 단백질)를 포함한다. 펩타이드, 폴리펩타이드 또는 단백질은 단량체성 또는 중합체성일 수 있다.

본원에 사용된 바와 같은 용어 "친화성"은 분자 (예를 들어, 항체)의 단일 결합 부위와 이의 결합 파트너 (예를 들어, 항원) 간의 비공유 상호작용의 총합 강도를 언급한다. 달리 지적되지 않는 경우, 본원에 사용된 바와 같은 "결합 친화성"은 결합 쌍 (예를 들어, 항체 및 항원)의 구성원 간의 1:1 상호작용을 반영하는 고유 결합 친화성을 언급한다. 분자 X의 이의 파트너 Y에 대한 친화성은 일반적으로 해리 상수 (Kd)로 나타낼 수 있다. 친화성은 본원에 기재된 것들을 포함하는 당업계에 공지된 통상의 방법에 의해 측정될 수 있다. 결합 친화성을 측정하기 위한 특정 실례 및 예시적 구현예는 하기에 기재되어 있다.

본원에 사용된 바와 같은 용어 "항체"는 광범위한 의미에서 사용되고 구체적으로 모노크로날 항체 (완전한 길이의 모노클로날 항체를 포함하는), 폴리클로날 항체, 다중특이적 항체 (예를 들어, 이특이적 항체), 1가 항체, 다가 항체, 및 이들이 목적하는 생물학적 활성을 갖는 한 항체 단편 (예를 들어, Fab 및/또는 단일-아암의 항체)을 포함한다.

본원에 사용된 바와 같은 용어 "항체 단편"은 온전한 항체가 결합하는 항원에 결합하는 온전한 항체의 일부를 포함하는 온전한 항체 이외의 분자를 언급한다. 항체 단편의 예는 Fv, Fab, Fab', Fab'-SH, F(ab')2; 디아바디; 선형 항체; 단일-쇄 항체 분자 (예를 들어, scFv); 및 항체 단편으로부터 형성된 다중특이적 항체를 포함하지만 이에 제한되지 않는다.

본원에 사용된 바와 같은 용어 항체의 "항원-결합 단편"은 항원에 특이적으로 결합하는 능력을 보유하는 항체의 하나 이상의 부분을 언급한다. 항체의 항원-결합 기능은 전장 항체의 단편에 의해 수행될 수 있는 것으로 보여주었다. 용어 항체의 "항원-결합 단편" 내 포함되는 결합 단편의 예는 (i) Fab 단편인 V_L, V_H, C_L 및 C_H1 도메인으로 이루어진 1가 단편; (ii) F(ab')₂ 단편인 힌지 영역에서 디설파이드 브릿지에 의해 연결된 2개의 Fab 단편을 포함하는 2가 단편; (iii) V_H 및 C_H1 도메인으로 이루어진 Fd 단편; (iv) 단일 아암의 항체의 V_L 및 V_H 도메인으로 이루어진 Fv 단편, (v) V_H 도메인으로 이루어진 dAb 단편; 및 (vi) 단리된 상보성 결정 영역 (CDR)을 포함한다. 이들 항체 단편은 문헌 [참조: J. Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, pp 98-118 (N.Y. Academic Press 1983)]에 기재된 바와 같은 단백질용해 단편화 과정과 같은 통상의 과정을 사용하여 수득된다. 상기 단편은 온전한 항체와 동일한 방식으로 사용을 위해 스크리닝된다.

본원에 사용된 바와 같은 용어 "상보성 결정 영역" (CDR)은 이들 단백질이 항원의 형태에 상보적인 항체내 영역을 언급한다. 동의어 CDR은 "상보성 결정 영역"을 의미하기 위해 본원에 사용된다.

항체의 "가변 영역"은 단독으로 또는 조합하여 항체 경쇄의 가변 영역 또는 항체 중쇄의 가변 영역을 언급한다. 중쇄 및 경쇄의 가변 영역 각각은 초가변 영역으로서도 또한 공지된 3개의 CDR에 의해 연결된 4개의 골격 영역 (FR)으로 이루어진다. 각각의 쇄에서 CDR은 FR에 의해 인접하게 함께 유지되고 있고 다른 쇄 기원의 CDR과 함께 항체의 항원-결합 부위의 형성에 기여한다. CDR의 경계선을 동정하기 위해 사용될 수 있는 예시적 통상의 기술은 예를 들어 캐뱃 정의 및 초티아 정의를 포함한다. 상기 캐뱃 정의는 서열 가변성을 기준으로 하고 (문헌참조: Kabat et al., 1992, Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th ed., Public Health Service, NIH, Washington D.C.), 초티아 정의는 구조적 루프 영역의 위치를 기반으로 한다 (문헌참조: Chothia et al., 1989, Nature 342:877-883). CDR 동정에 대한 다른 방법은 "IMGT 정의" (Lefranc, M.-P. et al., 1999, Nucleic Acids Res. 27:209-212) 및 "AbM 정의"를 포함하고, 이는 캐뱃과 초티아 사이의 절충안이고 옥스포드 몰레큘러의 AbM 항체 모델링 소프트웨어, 또는 문헌 [참조: MacCallum et al., 1996, J. Mol. Biol. 262:732-745]에 제시된 관찰된 항원 접촉을 기반으로 하는 CDR의 "접촉 정의"를 사용하여 유래된다. 본원에 사용된 바와 같은 CDR은 캐뱃 넘버링 시스템에 의해 정의되는 CDR을 언급할 수 있다.

본원에 사용된 바와 같은 용어 "인간화된 항체" 또는 "인간화된 항체 단편"은 소정의 항원에 결합할 수 있고 실질적으로 인간 면역글로불린의 아미노산 서열을 갖는 하나 이상의 골격 (FR) 및 실질적으로 비-인간 면역글로불린의 아미노산 서열을 갖는 하나 이상의 상보성 결정 영역 (CDR)을 포함하는, 면역글로불린 아미노산 서열 변이체 또는 이의 단편을 포함하는 특정 유형의 키메라 항체이다. "임포트" 서열로서 흔히 언급되는 이러한 비-인간 아미노산 서열은 전형적으로 "임포트" 항체 도메인, 특히 가변 도메인으로부터 취해진다. 일반적으로, 인간화된 항체는 인간 중쇄 또는 경쇄 가변 도메인의 FR 사이에 삽입되는, 비-인간 항체의 적어도 CDR 또는 초가변 영역 (HVL)을 포함한다.

본원에 사용된 바와 같은 "인간 항체"는 인간 또는 인간 세포에 의해 제조되고 인간 항체 레퍼토리 또는 다른 인간 항체-암호화 서열을 사용하는 비-인간 공급원으로부터 유래된 항체의 서열에 상응하는 아미노산 서열을 갖는 항체이다. 인간 항체의 상기 정의는 구체적으로 비-인간 항원-결합 잔기를 포함하는 인간화된 항체를 배제한다.

본원에 사용된 바와 같은 용어 "키메라 항체"는 하나의 항체로부터 하나 이상의 영역 및 하나 이상의 다른 항체로부터 하나 이상의 영역을 함유하는 항체를 언급한다.

본원에 사용된 바와 같은 용어 "중쇄"는 전장 중쇄 및 에피토프에 특이성을 부여하기에 충분한 가변 영역을 갖는 이의 단편을 포함한다. 전장 중쇄는 가변 영역 도메인, V_H, 및 3개의 불변 영역 도메인, CH₁, CH₂, 및 CH₃을 포함한다. VH 도메인은 폴리펩타이드의 아미노-말단에 있고 CH₃ 도메인은 카복실-말단에 있다.

본원에 사용된 바와 같은 용어 "경쇄"는 전장 경쇄 및 에피토프에 특이성을 부여하기에 충분한 가변 영역 서열을 갖는 이의 단편을 포함한다. 전장 경쇄는 가변 영역 도메인, V_L, 및 불변 영역 도메인, C_L을 포함한다. 중쇄와 같이, 경쇄의 가변 영역 도메인은 폴리펩타이드의 아미노-말단에 있다.

본원에 사용된 바와 같은 용어 "약제학적으로 허용되는 담체"는 활성 성분 이외에 약제학적 제형 중에서 대상체에게 비독성인 성분을 언급한다. 약제학적으로 허용되는 담체는 완충제, 부형제, 안정화제 또는 보존제를 포함하지만 이에 제한되지 않는다.

본원에 사용된 바와 같은 용어 "대상체"는 척추동물, 바람직하게, 포유동물, 보다 바람직하게 인간을 언급한다. 포유동물은 인간, 농장 동물, 스포츠 동물 및 애완 동물을 포함하지만 이에 제한되지 않는다.

본원에 사용된 바와 같은 용어 "유효량"은 이롭거나 목적하는 임상적 결과를 수득하기에 충분한 양을 언급한다. 유효량은 1회 이상의 투여로 투여될 수 있다. 본 발명의 목적을 위해, 유효량은 질환 상태의 진행을 진단하거나, 완화시키거나, 개선시키거나, 안정화시키거나, 역전시키거나, 서행시키거나 지연시키기에 충분한 양이다.

본원에 사용된 바와 같은 용어 "치료", "치료하는", "치료한다" 등은 일반적으로, 목적하는 약리학적 및/또는 생리학적 효과를 수득하는 것을 언급한다. 상기 효과는 질환 또는 이의 증상을 완전히 또는 부분적으로 예방하는 측면에서 예방학적일 수 있고/있거나 질환 및/또는 질환에 기인할 수 있는 부작용에 대한 부분적 또는 완전한 안정화 또는 치유 측면에서 치료학적일 수 있다. 본원에 사용된 바와 같은 "치료"는 포유동물, 특히 인간에서 질환의 임의의 치유를 포함하고 다음을 포함한다: (a) 질환 또는 증상에 대한 소인을 가질 수 있지만 이것을 갖는 것으로서 아직 진단되지 않은 대상체에서 질환 또는 증상이 발병되는 것을 예방하거나; (b) 상기 질환 증상을 억제하는, 즉 이의 발병을 중지시키거나; (c) 질환 증상을 경감시키는, 즉, 질환 또는 증상의 퇴행을 유발하는 것을 포함한다.

본원에 사용된 바와 같은 용어 "예방하는"은 환자 또는 대상체에서 질환 상태 또는 병태가 일어나는 것을 중단시키는 방지적 또는 예방학적 대책을 언급한다. 예방은 또한 환자 또는 대상체에서 질환 상태 또는 병태가 발병할 가능성을 감소시키고 상기 질환 상태 또는 병태의 발병을 차단하거나 중단시킴을 포함할 수 있다.

값의 범위가 제공되는 경우, 달리 명백히 언급되지 않는 경우 상기 범위의 상한치와 하한치 사이에서 하한치의 유니트의 10분 1에 대한 각각의 중재 값 및 상기된 범위에서 임의의 다른 기재된 또는 중재 값은 본 발명에 포함되는 것으로 이해된다. 이들 보다 작은 범위의 상한치 및 하한치는 독립적으로 보다 작은 범위에 포함될 수 있고 또한 기재된 범위에서 임의의 구체적으로 배제된 한계치에 적용되는 본 발명에 포함된다. 상기된 범위가 한계치 중 하나 또는 둘다를 포함하는 경우, 상기 포함된 한계치 중 하나 또는 둘다를 배제한 범위가 또한 본 발명에 포함된다.

CD-11b 조절제의 결합은 PD-L1 발현에 영향을 미친다

본 발명은 놀랍게도 면역 세포의 표면 상에 발현되는 CD11b 분자와 반응하는 CD11b 조절제를 사용한 치료를 통해 패혈증, 만성 감염 및 암에 관여된 면역억제된 상태와 연관된 증상의 역전을 발견하였다.

하나의 양상에서, 본 발명은 면역 세포에서 PD-L1 발현을 억제하기 위한 방법을 제공하고, 상기 방법은 상기 면역 세포를 상기 세포 상의 CD11b와 결합하는 CD11b 조절제와 접촉시키고 이에 의해 면역 세포의 PD-L1 발현을 억제함을 포함한다. 대안적으로, 본 발명은 면역 세포에서 PD-L1 발현을 억제하기 위한 제제의 제조에서 CD11b 조절제의 용도를 제공한다. 본 발명은 또한 면역 세포에서 PD-L1 발현을 억제하기 위한 CD11b 조절제를 제공한다.

또 다른 양상에서, 본 발명은 면역 세포에서 면역 억제 또는 면역 고갈을 역전시키거나 기존의 면역력을 유도하기 위한 방법을 제공하고, 상기 방법은 상기 면역 세포를 세포 상의 CD11b에 결합하는 CD11b 조절제와 접촉시킴을 포함한다. 대안적으로, 본 발명은 포유동물 세포에서 면역 억제 또는 면역 고갈을 역전시키거나 기존의 면역력을 유도하기 위한 제제의 제조에 CD11b 조절제의 용도를 제공한다. 본 발명은 또한 면역 세포에서 면역 억제 또는 면역 고갈을 역전시키거나 기존의 면역력을 유도하기 위한 CD11b 조절제를 제공한다.

또 다른 양상에서, 본 발명은 CD11b 조절제에 반응하는 대상체를 결정하기 위한 방법을 제공하고, 상기 방법은 PD-L1이 생물학적 샘플 또는 대상체에서 면역 세포를 CD11b 조절제와 접촉시킴에 의해 생물학적 샘플 또는 대상체에서 억제되는지를 검출하고 CD11b 조절제에 의한 면역 세포상의 PD-L1의 억제를 검출함을 포함하고, 여기서, 상기 PD-L1이 억제되는 경우 상기 대상체는 CD11b 조절제에 반응하는 것임을 지적한다.

하나의 구현예에서, 본원에 기재된 CD11b 조절제는 CD11b 발현을 억제하는 RNAi 제제, 항-CD11b 항체 또는 CD11b를 조절하는 소분자 화합물이다.

일부 구현예에서, CD11b 발현을 억제하는 RNAi 제제는 CD11b 발현을 억제하는 마이크로RNA (miRNA) 또는 작은 간섭 RNA (siRNA)이다. 일부 구현예에서, 항-CD11b 항체는 모노클로날, 키메라, 인간화된, 인간 또는 이특이적 항-CD11b 항체이다.

일부 구현예에서, CD11b를 조절하는 소분자 화합물의 예는 문헌 [참조: US 8,268,816, US 20120035154, WO002007039616, WO002006111371, WO002007054128, WO00199901258, J Immunol 2010, 184, pp.3917-26, and Cancer Discov, 2012, 2, pp.1091-99]에 기재된 화합물을 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 바람직하게, 상기 화합물은 하기로 이루어진 그룹으로부터 선택된다:

하나의 구현예에서, 면역 세포는 단핵구, 과립구, 마크로파아지, 골수-유래된 서프레서 세포 또는 천연 킬러 세포 또는 T 세포이다.

하나의 구현예에서, CD11b 결합은 IFN-γ, IL-12 또는 CD8 T 세포를 증가시킨다. 또 다른 구현예에서, CD11b 조절제의 세포 상의 CD11b로의 결합은 면역억제와 관련된 질환을 치료하고/하거나 예방한다.

추가의 구현예에서, 면역억제 또는 면역 고갈과 관련된 질환은 급성 및/또는 만성 감염, 패혈증, 암에서 면역결핍 또는 노화에서 면역노화에서의 T-세포 고갈이다. 따라서, 본 발명은 유효량의 CD11b 조절제를 대상체에게 투여함을 포함하는, 대상체에서 급성 및/또는 만성 감염, 패혈증, 암에서 면역결핍 또는 노화에서 면역노화를 치료하거나 예방하기 위한 방법을 제공한다.

하나의 구현예에서, 본원에 기재된 암은 면역치료요법에 반응하는 암이다. 면역치료요법에 반응하는 암의 예는 흑색종, 폐암, 폐의 편평 세포 암종, 두경부암, 유방암, 난소암, 자궁암, 전립선암, 위암종, 자궁암, 식도 암종, 방광암, 신장암, 뇌암, 간암, 결장암, 골암, 췌장암, 피부암, 피부암 또는 안내 악성 흑색종, 난소암, 직장암, 항문 영역의 암, 위암, 고환암, 나팔관 암종, 자궁내막 암종, 자궁 암종, 질 암종, 외음부 암종, 호지킨 질환, 비-호지킨 림프종, 식도암, 소장암, 내분비계암, 갑상선암, 부갑상선암, 부신암, 연조직 육종, 요도암, 음경암, 급성 골수 백혈병을 포함하는 만성 또는 급성 백혈병, 만성 골수 백혈병, 급성 림프아구성 백혈병, 만성 림프구 백혈병, 소아 고형 종양, 림프구 림프종, 신우 암종, 중추신경계(CNS)의 신생물, 1차 CNS 림프종, 종양 혈관형성, 척추종양, 뇌간 신경 교종, 뇌하수체 선종, 카포시 육종, 표피양 암 (epidermoid cancer), 편평 세포암, 및 T-세포 림프종을 포함하지만 이에 제한되지 않는다.

하나의 구현예에서, 상기 암은 암 전이, 난치성 암, 재발암 또는 진행암이다.

하나의 구현예에서, 암의 예방 및/또는 치료 방법은 추가의 활성제 또는 치료요법제를 투여함을 포함한다. 일부 구현예에서, 추가의 활성제는 면역 체크포인트 치료요법, 방사선치료요법 또는 화학치료요법이다.

하나의 구현예에서, CD11b 조절제 및 면역 체크포인트 치료요법, 방사선치료요법 또는 화학치료요법은 동시에, 연속적으로 또는 별도로 투여된다. 추가의 구현예에서, 면역 체크포인트 치료요법은 면역 체크포인트 단백질을 투여함을 포함한다. 바람직하게, 면역 체크포인트 단백질은 항-PD-1 리간드 또는 항-CTLA-4 항체 또는 항-PD-L1 항체 또는 이의 항원 결합 단편 또는 이의 임의의 조합물이다. 항-PD-1 리간드의 예는 항-PD-1 항체 (예를 들어, 니볼루맙 및 펨브롤리주맙) 및 항-CTLA-4 항체 (예를 들어, 이필리무맙)를 포함하지만 이에 제한되지 않는다.

또 다른 구현예에서, 상기 화학치료요법은 화학치료학적 제제를 투여함을 포함한다. 화학치료학적 제제의 예는 알킬화제, 항대사물, 항-미세소관 제제 (anti-microtubule agent), 토포이소머라제 억제제 또는 세포독성 항생제를 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 바람직하게, 화학치료학적 제제는 시스플라틴, 5-Fu, 탁솔, 도세탁셀, 비노렐빈, 빈데신, 빈플루닌, 겜시타빈, 메토트렉세이트, 게피티니브, 라파티니브 또는 에를로티니브이다.

본원에 기재된 CD11b 조절제 및 다른 제제는 제형 또는 조성물로서 제형화될 수 있다. 본 발명의 제형 또는 약제학적 조성물은 국소 또는 전신 치료가 요구되는지 및 치료될 영역에 따라 다수의 방식으로 투여될 수 있다. 투여는 경구 또는 비경구일 수 있다.

특정 구현예에서, 본원에 기재된 바와 같은 화합물 및 조성물은 비경구로 투여된다. 비경구 투여는 정맥내, 동맥내, 피하, 복강내 또는 근육내 주사 또는 주입을 포함한다.

특정 구현예에서, 비경구 투여용 제형 또는 조성물은 완충제, 희석제 및 다른 적합한 첨가제, 예를 들어, 이에 제한되지 않지만 침투 증진제, 담체 화합물 및 다른 약제학적으로 허용되는 담체 또는 부형제를 함유할 수도 있는 멸균 수용액을 포함할 수 있다.

특정 구현예에서, 경구 조성물을 위한 제형 또는 조성물은 약제학적 담체, 부형제, 산제 또는 입제, 마이크로미립자, 나노미립자, 물 또는 비-수성 매질 중 현탁액 또는 용액, 겔 캡슐, 사쉐, 정제 또는 소형정제 (minitablet)를 포함할 수 있지만 이에 제한되지 않는다. 증점제, 향제, 희석제, 유화제, 분산 보조제 또는 결합제가 바람직할 수 있다.

용량은 수일 내지 수개월 동인 지속적인 치료 과정과 함께 또는 치유가 나타날때까지 또는 질환 상태의 감소가 성취될 때까지 치료될 질환 상태의 중증도 및 반응성에 의존한다. 용량은 또한 약물 잠재력 및 대사에 의존한다.

면역 세포에서 PD-L1 발현의 수준은 면역억제 및 면역 고갈을 역전시키고 기존의 면역력을 유도하기 위한 새로운 치료학적 표적으로 작용할 수 있다.

본 발명의 항-CD11b 항체

본원에서는 신규한 항-CD11b 항체, 및 암 면역치료요법, 만성 감염에서 T-세포 고갈, 패혈증, 암에서 면역결핍 및 노화에서 면역노화와 같은 면역억제 및 면역 고갈과 관련된 질환의 치료 및/또는 예방에서 이들의 사용 방법이 제공된다.

하나의 양상에서, 본 발명은, NYWIN (서열번호 1) 또는 GFSLTSNSIS (서열번호 2)의 아미노산 잔기로 이루어진 중쇄 상보성 결정 영역 1 (H-CDR1) 또는 서열번호 1 또는 2와 적어도 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % 동일성을 갖는 아미노산 서열을 갖는 변이체; NIYPSDTYINHNQKFKD (서열번호 3) 또는 AIWSGGGTDYNSDLKS (서열번호 4)의 아미노산 잔기로 이루어진 중쇄 CDR2 (H-CDR2) 또는 서열번호 3 또는 4와 적어도 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % 동일성을 갖는 아미노산 서열을 갖는 변이체; 및 SAYANYFDY (서열번호 5) 또는 RGGYPYYFDY (서열번호 6)의 아미노산 잔기로 이루어진 중쇄 CDR3 (H-CDR3) 또는 서열번호 5 또는 6과 적어도 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % 동일성을 갖는 아미노산 서열을 갖는 변이체 중 적어도 하나; 및

RASQNIGTSIH (서열번호 7) 또는 KSSQSLLYSENQENYLA (서열번호 8)의 아미노산 잔기로 이루어진 경쇄 CDR1 (L-CDR1) 또는 서열번호 7 또는 8과 적어도 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % 동일성을 갖는 아미노산 서열을 갖는 변이체; YASESIS (서열번호 9) 또는 WASTRQS (서열번호 10)의 아미노산 잔기로 이루어진 경쇄 CDR2 (L-CDR2) 또는 서열번호 9 또는 10과 적어도 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % 동일성을 갖는 아미노산 서열을 갖는 변이체; 및 QQSDSWPTLT (서열번호 11) 또는 QQYYDTPLT (서열번호 12)의 아미노산 잔기로 이루어진 경쇄 CDR3 (L-CDR3) 또는 서열번호 11 또는 12 중 어느 하나와 적어도 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % 동일성을 갖는 아미노산 서열을 갖는 변이체 중 적어도 하나를 포함하는, 항-CD11b 항체 또는 이의 항원-결합 부분을 제공하고; 상기 단리된 항체 또는 이의 항원-결합 부분은 CD11b에 결합한다.

일부 구현예에서, 본원에 기재된 CDR은 하나 이상의 삽입, 치환 및/또는 결실을 포함한다.

추가의 구현예에서, 본 발명은 (i) 서열번호 1을 포함하는 H-CDR1, 서열번호 3을 포함하는 H-CDR2 및 서열번호 5를 포함하는 H-CDR3을 포함하는 중쇄 가변 영역, 및 (ii) 서열번호 7을 포함하는 L-CDR1, 서열번호 9를 포함하는 L-CDR2 및 서열번호 11을 포함하는 L-CDR3를 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하거나; (iii) 서열번호 2를 포함하는 H-CDR1, 서열번호 4를 포함하는 H-CDR2 및 서열번호 6을 포함하는 H-CDR3을 포함하는 중쇄 가변 영역, 및 (iv) 서열번호 8을 포함하는 L-CDR1, 서열번호 10을 포함하는 L-CDR2 및 서열번호 12를 포함하는 L-CDR3을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는, 항-CD11b 항체 또는 이의 항원-결합 부분을 제공한다. 추가의 구현예에서, H-CDR1은 서열번호 1 또는 2로 이루어진 아미노산 서열을 갖고; H-CDR2는 서열번호 3 또는 4로 이루어진 아미노산 서열을 갖고; H-CDR3은 서열번호 5 또는 6으로 이루어진 아미노산 서열을 갖고; L-CDR1은 서열번호 7 또는 8로 이루어진 아미노산 서열을 갖고; L-CDR2는 서열번호 9 또는 10으로 이루어진 아미노산 서열을 갖고; L-CDR3은 서열번호 11 또는 12로 이루어진 아미노산 서열을 갖는다.

하나의 양상에서, 본 발명은 서열번호 1 또는 2로 이루어진 아미노산 서열을 갖는 H-CDR1, 서열번호 3 또는 4로 이루어진 아미노산 서열을 갖는 H-CDR2 및 서열번호 5 또는 6으로 이루어진 아미노산 서열을 갖는 H-CDR3을 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함하는, 중쇄 가변 영역 또는 이의 항원-결합 부분을 제공한다.

하나의 양상에서, 본 발명은 서열번호 7 또는 8로 이루어진 아미노산 서열을 갖는 L-CDR1, 서열번호 9 또는 10으로 이루어진 아미노산 서열을 갖는 L-CDR2, 및 서열번호 11 또는 12로 이루어진 아미노산 서열을 갖는 L-CDR3을 포함하는, 경쇄 가변 영역 또는 이의 항원-결합 부분을 제공한다.

하나의 구현예에서, 본 발명은 (i) 서열번호 13 내지 22의 아미노산 서열 중 어느 하나와 적어도 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역, 및 (ii) 서열번호 23 내지 32의 아미노산 서열 중 어느 하나와 적어도 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는, 인간화된 항-CD11b 항체 또는 이의 항원-결합 부분을 제공한다.

추가의 구현예에서, 본 발명은, 서열번호 13 내지 22로 이루어진 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역, 및 서열번호 23 내지 32로 이루어진 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는, 인간화된 항-CD11b 항체 또는 이의 항원-결합 부분을 제공한다.

바람직하게, 본 발명은,

(a) 서열번호 13으로 이루어진 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역, 및 서열번호 23으로 이루어진 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역;

(b) 서열번호 14로 이루어진 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역, 및 서열번호 24로 이루어진 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역;

(c) 서열번호 15로 이루어진 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역, 및 서열번호 25로 이루어진 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역;

(d) 서열번호 16으로 이루어진 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역, 및 서열번호 26으로 이루어진 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역;

(e) 서열번호 17로 이루어진 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역, 및 서열번호 27로 이루어진 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역;

(f) 서열번호 18로 이루어진 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역, 및 서열번호 28로 이루어진 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역;

(g) 서열번호 19로 이루어진 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역, 및 서열번호 29로 이루어진 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역;

(h) 서열번호 20으로 이루어진 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역, 및 서열번호 30으로 이루어진 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역;

(i) 서열번호 21로 이루어진 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역, 및 서열번호 31로 이루어진 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역; 또는

(j) 서열번호 22로 이루어진 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역, 및 서열번호 32로 이루어진 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는, 인간화된 항-CD11b 항체 또는 이의 항원-결합 부분을 제공한다.

서열번호 13 내지 32의 아미노산 서열은 하기와 같이 열거된다:

본 발명의 인간화된 항-DC11b 항체의 중쇄 가변 영역: (서열번호 13 내지 22)

본 발명의 인간화된 항-CD11b 항체의 경쇄 가변: (서열번호 23 내지 32)

실제로 임의의 표적 항원에 대한 모노클로날 항체를 제조하기 위한 기술은 당업계에 널리 공지되어 있다. 예를 들어, 문헌 [Kohler and Milstein, Nature 256: 495 (1975), and Coligan et al. (eds.), Current Protocols In Immunology, Vol. 1, pages 2.5.1-2.6.7 (John Wiley & Sons 1991)]을 참조한다. 모노클로날 항체는 마우스 또는 닭에게 항원을 포함하는 조성물을 주사하고, 비장을 제거하여 B-림프구를 수득하고, 상기 B-림프구를 골수종 세포와 융합하여 하이브리도마를 생성하고, 상기 하이브리도마를 클로닝하고, 상기 항원에 대한 항체를 생성하는 양성 클론을 선택하고, 항원에 대한 항체를 생성하는 클론을 배양하고, 상기 하이브리도마 배양물로부터 항체를 단리함에 의해 수득될 수 있다.

키메라 또는 인간화된 항체의 생성과 같은 다양한 기술은 항체 클로닝 및 작제의 과정을 포함할 수 있다. 목적하는 항체에 대한 항원-결합 가변 경쇄 및 가변 중쇄 서열은 다양한 분자 클로닝 과정에 의해 수득될 수 있다. 키메라 항체는 인간 항체의 가변 영역이 예를 들어, 마우스 항체의 상보성-결정 영역 (CDR)을 포함하는 마우스 항체의 가변 영역에 의해 대체된 재조합 단백질이다. 키메라 항체는 대상체에게 투여되는 경우 감소된 면역원성 및 증가된 안정성을 나타낸다. 키메라 항체를 작제하기 위한 방법은 당업계에 널리 공지되어 있다. 키메라 모노클로날 항체는 마우스 면역글로불린의 중쇄 및 경쇄 가변 도메인으로부터의 마우스 CDR을 인간 항체의 상응하는 가변 도메인으로 전달함에 의해 인간화될 수 있다. 키메라 모노클로날 항체에서 마우스 골격 영역 (FR)은 또한 인간 FR 서열로 대체된다.

예를 들어, CD11b에 특이적으로 결합하는 인간화된 항체의 VL 및/또는 VH를 암호화하는 핵산은 예를 들어, 폴리머라제 연쇄 반응 (PCR), 리가제 연쇄 반응 (LCR), 전사-기반 증폭 시스템 (TAS) 등과 같은 시험관내 방법에 의해 클로닝되거나 증폭될 수 있다. 예를 들어, 상기 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드는 분자의 DNA 서열을 기반으로 하는 프라이머를 사용하는 cDNA의 폴리머라제 연쇄 반응에 의해 단리될 수 있다. 광범위한 클로닝 및 시험관내 증폭 방법은 당업자에게 널리 공지되어 있다. 폴리뉴클레오타이드는 또한 엄중 하이브리드화 조건하에서 목적하는 폴리뉴클레오타이드의 서열로부터 선택된 프로브로 게놈 또는 cDNA 라이브리러를 스크리닝함에 의해 단리될 수 있다.

폴리뉴클레오타이드는 벡터로; 자가 복제 플라스미드 또는 바이러스로; 또는 원핵 세포 또는 진핵 세포의 게놈 DNA로 혼입되거나, 다른 서열과는 독립적으로 별도의 분자 (예를 들어, cDNA)로서 존재하는 재조합 DNA를 포함한다. 본 발명의 뉴클레오타이드는 리보뉴클레오타이드, 데옥시리보뉴클레오타이드 또는 변형된 형태의 뉴클레오타이드일 수 있다. 상기 용어는 단일 또는 이중 형태의 DNA를 포함한다.

CD11b에 특이적으로 결합하는 인간화된 항체의 VL 및/또는 VH를 암호화하는 DNA 서열은 적합한 숙주 세포로의 DNA 전달에 의해 시험관내 발현될 수 있다. 상기 세포는 원핵 세포 또는 진핵 세포일 수 있다. 용어는 또한 대상체 숙주 세포의 임의의 자손을 포함한다. 모든 자손은 복제 동안에 일어나는 돌연변이 때문에 모 세포와는 동일하지 않을 수 있는 것으로 이해된다. 외래 DNA가 숙주에 계속적으로 유지됨을 의미하는 적합한 전달 방법은 당업계에 공지되어 있다.

CD11b에 특이적으로 결합하는 인간화된 항체의 VL 및/또는 VH를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드 서열은 발현 제어 서열에 작동적으로 연결될 수 있다. 암호화 서열에 작동적으로 연결된 발현 제어 서열은 상기 암호화 서열의 발현이 발현 제어 서열과 상용성인 조건하에 성취되도록 연결된다. 발현 제어 서열은 단백질-암호화 유전자 전방의 적당한 프로모터, 인핸서, 전사 종결인자, 개시 코돈(예를 들어, ATG), 인트론에 대한 스플라이싱 시그날, mRNA의 적당한 해독을 가능하게 하는 유전자의 올바른 판독 프레임의 유지 및 종료 코돈을 포함하지만 이에 제한되지 않는다.

CD11b에 특이적으로 결합하는 인간화된 항체의 VL 및/또는 VH를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드 서열은 발현 벡터에 삽입될 수 있다. 발현 벡터의 예는 플라스미드, 바이러스 또는 서열의 삽입 또는 혼입이 가능하도록 조작될 수 있고 원핵 세포 또는 진핵 세포에서 발현될 수 있는 다른 비히클을 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 숙주는 미생물, 효모, 곤충 및 포유동물 유기체를 포함할 수 있다. 원핵 세포에서 진핵 또는 바이러스 서열을 갖는 DNA 서열을 발현하는 방법은 당업계에 널리 공지되어 있다. 숙주에서 발현할 수 있고 복제할 수 있는 생물학적 기능성 바이러스 및 플라스미드 DNA 벡터는 당업계에 공지되어 있다. 재조합 DNA를 사용한 숙주 세포의 형질전환은 당업자에게 널리 공지된 통상의 기술에 의해 수행될 수 있다.

재조합적으로 발현된 폴리펩타이드의 단리 및 정제는 상업용 크로마토그래피 및 면역학적 분리를 포함하는 통상의 수단에 의해 수행될 수 있다.

인간화는 일반적으로 설치류 CDR 또는 CDR 서열을 인간 항체의 상응하는 서열로 치환함에 의해, 당업계에 공지된 통상의 방법에 따라 수행될 수 있다. 따라서, 상기 "인간화된" 항체는 온전한 인간 가변 도메인의 실질적으로 일부 미만이 비-인간 종 기원의 상응하는 서열에 의해 치환된 항체이다. 실제로, 인간화된 항체는 전형적으로 일부 CDR 잔기 및 가능한 일부 FR 잔기가 비-인간, 예를 들어, 설치류 항체내 유사 부위로부터의 잔기들로 치환된 인간 항체이다.

인간화된 항체를 제조하는데 사용될 경쇄 및 중쇄 둘다의 인간 가변 도메인의 선택은 항원성을 감소시키기 위해 매우 중요하다. 설치류 항체의 가변 도메인의 서열은 공지된 인간 가변-도메인 서열의 전체 라이브러리에 대해 스크리닝된다. 설치류의 것과 가장 유사한 인간 서열을 이어서 인간화된 항체를 위한 인간 골격 (FR)으로서 수용된다. 또 다른 방법은 경쇄 또는 중쇄의 특정 서브그룹의 모든 인간 항체의 컨센서스 서열로부터 유래된 특정 골격을 사용한다. 동일한 골격은 여러 상이한 인간화된 항체에 대해 사용될 수 있다.

항체 결합 부분은 예를 들어, Fab, Fab', F(ab)₂, F(ab')₂, Fv, scFv 등을 포함한다. 이들 단편은 당업계에 널리 공지된 방법을 사용하여, 예를 들어, 파파인 (Fab 단편을 생성하기 위해) 또는 펩신 (F(ab')₂ 단편을 생성하기 위해)에 의해 온전한 항체로부터 생성된다.

이의 생물학적 활성을 감소시키는 것 없이 본원에 기재된 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산으로 변형시킬 수 있다. 표적화 분자의 융합 단백질로의 클로닝, 발현 또는 혼입을 촉진시키기 위해 일부 변형시킬 수 있다. 상기 변형은 당업자에게 널리 공지되어 있고 예를 들어, 종결 코돈, 개시 부위를 제공하기 위해 아미노 말단에 부가된 메티오닌, 편의로 위치된 제한 부위를 생성하기 위해 말단 상에 위치하는 추가의 아미노산 또는 정제 단계를 돕기 위한 추가의 아미노산을 포함한다. 재조합 방법에 추가로, 본원의 개시내용의 항체는 또한 당업계에 널리 공지된 표준 펩타이드 합성을 사용하여 전체적으로 또는 부분적으로 작제될 수 있다.

또 다른 양상에서, 본 발명은 본 발명의 항-CD11b 항체를 포함하는 조성물을 제공한다. 일부 구현예에서, 상기 조성물은 대상체에게 투여될 수 있다. 일부 구현예에서, 본 발명의 항-CD11b 항체는 약제학적으로 허용되는 담체, 보조제, 습윤제 또는 유화제, pH 완충제, 보존제 및/또는 조성물의 의도된 사용을 위해 적합한 다른 성분들을 포함하지만 이에 제한되지 않는 하나 이상의 다른 성분들을 포함하는 조성물에 제공될 수 있다. 상기 조성물은 용액, 현탁액, 에멀젼 등의 형태를 취할 수 있다. 용어 "약제학적으로 허용되는 담체"는 다양한 희석제, 부형제 및/또는 비히클을 포함한다. 약제학적으로 허용되는 담체는 인간 및/또는 다른 동물 대상체로의 전달을 위해 안전하고/하거나 연방 또는 주 정부의 규제 기관에 의해 승인되고/되거나 미국 약전 및/또는 다른 일반적으로 인지된 약전 및/또는 인간 및/또는 다른 동물에 사용하기 위해 하나 이상의 일반적으로 인지된 규제 기관으로부터의 특정 또는 개별 승인을 받은 것으로 공지된 담체를 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 상기 약제학적으로 허용되는 담체는 물, 수용액 (식염수 용액, 완충액 등과 같은), 유기 용매 (특정 알콜, 및 석유, 동물성, 식물성 또는 합성 기원의 오일, 예를 들어, 땅콩유, 대두유, 광유, 참깨유를 포함하는 오일과 같은) 등을 포함하지만 이에 제한되지 않는다.

하나의 구현예에서, 본 발명의 인간화된 항-CD11b 항체는 암의 치료에 사용되는, 또한 항-신생물 약물로 불리우는 화학적 화합물인 하나 이상의 "화학치료학적 제제"를 포함하는 조성물에 제공될 수 있다. 항-신생물 약물은 일반적으로 약물의 화학적 구조 및 기원의 차이에 따라 알킬화제, 항대사물 약물, 항신생물 항생제, 안트라사이클린 항생제, 항신생물 허브 약물 및 호르몬으로 분류된다. 사이클 또는 상 특이성에 의존하여, 종양에 대한 화학치료학적 약물은 (1) 세포 사이클 비-특이적 제제 (CCNSA), 예를 들어, 알킬화제, 항-신생물 항생제 및 백금 배위 착물 등 및 (2) 세포 사이클 특이적 제제 (CCSA), 예를 들어, 항-대사성 약물, 빈카 알칼로이드 등으로 분류될 수 있다.

일부 구현예에서, 본 발명의 조성물은 본 발명의 항-CD11b 항체의 "유효량"을 포함한다. "유효량"은 목적하는 최종 결과를 성취하기 위해 요구되는 양이다. 목적하는 최종 결과를 성취하기 위해 효과적인 본 발명의 인간화된 항-CD11b 항체의 양은 의도된 대상체의 종 (예를 들어, 인간 또는 일부 다른 동물 종인지), 의도된 대상체의 연령 및/또는 성별, 계획된 투여 경로, 계획된 투여 용법, 임의의 진행되는 질환 또는 병태의 중증도 등을 포함하지만 이에 제한되지 않는 다양한 인자에 의존한다. 유효량의 범위일 수 있는 유효량은 예를 들어, 의도된 대상체 종 또는 임의의 적합한 동물 모델 종에서 시험관내 검정 및/또는 생체내 검정을 사용하여, 임의의 과도한 실험 없이 표준 기술에 의해 결정될 수 있다. 적합한 검정은 투여-반응 곡선으로부터의 외삽 및/또는 시험관내 및/또는 생체내 모델 시스템으로부터 유래된 다른 데이터로부터의 외삽을 포함하는 것들을 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 일부 구현예에서, 상기 유효량은 특정 상황을 기준으로 의학적 또는 수의학적 의사의 판단에 따라 결정될 수 있다.

하나의 구현예에서, 인간화된 항-CD11b 항체의 유효량은 투여 당 체중을 기준으로 약 0.01 mg/kg 내지 약 40 mg/kg; 바람직하게, 약 0.01 mg/kg 내지 약 30 mg/kg, 약 0.01 mg/kg 내지 약 20 mg/kg, 약 0.01 mg/kg 내지 약 10 mg/kg, 약 1 mg/kg 내지 약 40 mg/kg, 약 1 mg/kg 내지 약 30 mg/kg, 약 1 mg/kg 내지 약 20 mg/kg, 약 1 mg/kg 내지 약 10 mg/kg, 약 2 mg/kg 내지 약 40 mg/kg, 약 2 mg/kg 내지 약 30 mg/kg, 약 2 mg/kg 내지 약 20 mg/kg, 약 2 mg/kg 내지 약 10 mg/kg, 약 5 mg/kg 내지 약 40 mg/kg, 약 5 mg/kg 내지 약 30 mg/kg, 약 5 mg/kg 내지 약 20 mg/kg 또는 약 5 mg/kg 내지 약 10 mg/kg 또는 약 1 mg/kg 내지 약 5 mg/kg의 범위이다.

일부 구현예에서, 본 발명은 본 발명의 인간화된 항-CD11b 항체를 대상체에게 투여함을 포함하는 방법을 제공한다. 상기 방법은 면역 세포에서 PD-L1 발현을 억제하고, 면역 세포에서 면역 억제 또는 면역 고갈을 역전시키고 기존의 면역력을 유도하고, 대상체에서 PD-L1을 검출하고, 급성 및/또는 만성 감염, 패혈증, 암에서 면역결핍 또는 노화에서 면역노화를 치료하거나 예방하기 위한 방법을 포함한다. 본 발명의 항-CD11b 항체는 상기 언급된 방법에서 사용될 수 있다.

본원에 기재된 암은 면역치료요법에 반응하는 암이고 암의 예는 본원에 기재된 바와 같다. 암의 예방 및/또는 치료 방법은 추가의 활성제 또는 치료요법제를 투여함을 포함한다. 추가의 활성제, 이들의 구현예 및 투여는 본원에 기재된 바와 같다.

본 발명의 항-CD11b 항체 또는 상기 항-CD11b 항체를 포함하는 조성물이 투여될 수 있는 (예를 들어, 치료 방법의 과정에서) 대상체는 임의의 그리고 모든 동물 종을 포함한다. 일부 구현예에서, 대상체는 포유동물 종이다. 포유동물 대상체는 인간, 비-인간 영장류, 설치류, 토끼 및 흰담비를 포함하지만 이에 제한되지 않는다.

다양한 전달 시스템이 당업계에 공지되어 있고 임의의 적합한 전달 시스템은 본 발명의 조성물을 대상체에게 투여하기 위해 사용될 수 있다. 상기 전달 시스템은 피내, 근육내, 복강내, 정맥내, 피하, 비강내, 경막외, 및 경구 전달 시스템을 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 본 발명의 조성물은 임의의 간편한 경로, 예를 들어, 주입 또는 볼러스 주사에 의해, 상피 또는 점막피부 내벽 (예를 들어, 경구 점막, 직장 및 장 점막 등)을 통한 흡수에 의해 투여될 수 있고 다른 생물학적 활성제와 함께 투여될 수 있다. 투여는 전신 또는 국소 투여일 수 있다.

일부 상기 구현예에서, 단일 용량의 투여가 바람직하다. 그러나, 다른 구현예에서, 추가의 용량은 목적하는 효과를 성취하기 위해 동일하거나 상이한 경로에 의해 투여될 수 있다. 일부 구현예에서, 용량 투여 용법은 단일 투여를 포함할 수 있다. 다른 구현예에서, 용량 투여 용법은 다수의 투여를 포함할 수 있다.

실시예

하기의 실시예에 사용되는 재료 및 방법은 하기에 기재되어 있다.

재료 및 방법

인간 세포 단리 및 세포 배양

건강한 지원자로부터 백혈구 세포 농축물은 기관 [Taiwan Blood Service Foundation (Taipei, Taiwan)]으로부터 구입하였다. 서면 고지 동의서는 기관 (Institutional Review Board of the Mackay Memorial Hospital)에 의해 승인된, 연구에 참여하기 위해 수득되었다. 인간 단핵구는 이전에 기재된 바와 같이 단리하였다. 간략하게, 말초 혈액 단핵 세포 (PBMC)는 피콜-파케 플러스 (Ficoll-Paque Plus) (GE Healthcare) 농도구배 원심분리를 사용하여 단리하였다. 단핵구는 추가로 CD14 MACS 마이크로비드 (Miltenyi Biotec)를 사용한 CD14 선택을 수행함에 의해 정제되었다. 유동 세포측정 분석을 사용하여 확인된 단핵구의 순도는 대략 90 %였다.

동물 및 종양 세포주

C57BL/6 마우스 (6 내지 8주령)는 기관 (National Laboratory Animal Center (Taipei, Taiwan))으로부터 구입하였다. 모든 동물 실험은 특정 병원체-부재 병태하에 및 기관 (Animal Care and Usage Committee of Mackay memorial hospital (Taipei, Taiwan))에 의해 승인된 가이드라인에 따라 수행하였다. 각각의 마우스의 체중은 치료 개시 시점에서 및 치료 기간 동안에 매일 측정하였다. B16F10은 쥐 흑색종 세포이고 LLC1은 쥐 루이스 폐 암종이다. 모든 세포는 C57BL/6 마우스로부터 유래하였다. 세포는 5 % CO₂ 습윤화된 대기에서 37℃에서 듈베코 변형된 이글 배지 (DMEM), 10 % 열-불활성화된 태아 소 혈청, 2 mM L-글루타민, 페니실린 (100 U/ml), 및 스트렙토마이신 (100 ㎍/ml)에 유지시켰다.

항체 및 시약

인간 단핵구 연구를 위해

이. 콜라이 (0111:B4)로부터의 LPS는 제조원 (Sigma)으로부터 구입하였다. 대조군 항체를 위해 사용되는 인간 CD11b (ICRF44) 및 마우스 IgG1에 특이적인 쥐 결합 항체는 제조원 (Biolegend)으로부터 구입하였다.

쥐 암 모델을 위해

쥐 CD11b (M1/70)에 특이적인 래트 결합 항체, 래트 대조군 IgG2b 항체 (LTF-2), 아메리칸 햄스터 항-쥐 PD1 (J43) 및 아메리칸 햄스터 대조군 IgG는 BioXcell로부터 구입하였다. 탁솔은 기관 (MacKay Memorial hospital)으로부터 구입한 화학치료요법 약물이다.

암 치료의 프로토콜

피하 종양 모델

C57BL/6 마우스에 2×10⁵ B16F10 세포 또는 1 x 10⁶ LLC1 세포를 피하 접종하였다. 종양 접종 7일 후, 치료를 개시하였다. 종양-함유 마우스는 주당 2회 상이한 항체 및 화학치료요법 약물로 복강내(ip) 치료하였다. 마우스는 주당 2회 감지할 수 있는 종양의 형성에 대해 모니터링하고 스코어링하고 종양이 3000 mm³의 미리 결정된 크기를 초과하는 경우 희생시켰다. 종양 용적은 캘리퍼로 측정하고 하기식에 따라 계산하였다: A×B²×0.54 (여기서, A는 최대 직경이고 B는 최소 직경이다).

폐 전이 모델

2×10⁵ B16F10 세포 또는 LLC1 세포를 0일째에 꼬리 정맥을 통해 각각의 마우스에 주사하였다. 1일째에, 마우스에 다양한 항체를 복강내 주사하였다. 주사는 3일 내지 4일 마다 반복하였다. 15일째에 마우스를 희생시키고 종양 씨딩의 양은 현미경 하에 폐에 제공된 결절의 총 수로서 계수하였다. 다른 실험에서, 마우스는 그룹 각각에서 치료받은 마우스의 장기 생존에 대한 병용 치료요법의 효과에 대해 분석하였다.

유동 세포측정 분석

인간 단핵구 연구를 위해

단핵구는 항-CD11b (ICRF44), 또는 적당한 이소형 대조군 항체와 1시간 동안 미리 항온처리하였다. 세포에 후속적으로 100 ng/ml의 LPS를 첨가하고 밤새 항온처리하였다. LPS 프라임된 단핵구의 표면 표현형을 분석하기 위해, 세포는 빙상에서 암실에서 1 % BSA를 함유하는 인산염-완충 식염수 (PBS) 중에 희석된 하기 mAb로 항온처리하였다: PD-L1-FITC, CD80-PE, CD86-PE, HLA-DR-PE, 및 CD14-PerCP (BD Biosciences). 단핵구, 다핵형 백혈구 (PMN), 및 림프구는 이들의 FSC/SSC 성질을 기준으로 게이팅하였다. 형광성은 FACS 캘리버를 사용하여 검출하고 분석은 FCS 익스프레스 버젼 3 (드 노보 소프트웨어)을 사용하여 수행하였다.

쥐 암 연구를 위해

종양-침윤 백혈구를 수득하기 위해, 종양 조직은 콜라게나제 IV (Sigma)로 분해하였다. 단일-세포 현탁액은 하기의 항체로 염색시켰다: CD45-PE, Ly-6G-FITC, Ly-6C-APC, 및 CD8b.2-FITC. 종양-침윤 백혈구는 CD45+ 집단으로부터 게이팅하였다. 형광성은 FACS 캘리버를 사용하여 검출하고, 데이터 분석은 FCS 익스프레션 버젼 3 (드 노보 소프트웨어)을 사용하여 수행하였다.

각각의 실험으로부터 백혈구 세포 (WBC)를 단리하기 위해, 전혈 세포는 RBC 용해 완충액으로 용해시켰다. 단일-세포 현탁액은 하기의 항체로 염색시켰다: PD-L1-APC, IAIE-APC, 및 CD8b.2-FITC (Biolegend). 단핵구, 다핵형 백혈구 (PMN), 및 림프구는 이들의 FSC/SSC 성질을 기준으로 한다. 형광성은 FACS 캘리버를 사용하여 검출하고, 상기 데이터 분석은 FCS 익스프레스 버젼 3 (드 노보 소프트웨어)을 사용하여 수행하였다.

사이토킨 정량

배양 상등액에서 인간 IL-6, IL-10, IL-12, 및 TNF-α는 제조업자의 지침에 따라 시판되는 효소-연결된 면역흡착 검정 (ELISA; R&D Systems)에 의해 검출하였다. 혈장에서 쥐 IL-12, IFN-γ, 및 TNF-α는 BD CBA 마우스 염증 키트에 의해 정량하였다.

실시예 1 결합 CD11b은 LPS-프라임된 단핵구 상에서 PL-L1 발현을 감소시킨다

본 실시예에서, 본원 발명자는 인테그린 αMβ2 (Mac-1)의 차단이 TLR 반응을 기능적으로 증가시킬 수 있는지를 조사하였다. 도 1에 도시된 바와 같이, 항-CD11b 항체 (ICRF44)와 같은 CD11b 결합제의 투여는 단핵구에 대한 LPS 유도된 PD-L1 발현을 감소시킬 수 있다. 대조적으로, 항-CD11b 항체 치료는 LPS-프라임된 단핵구 상의 HLA-DR, CD80, 및 CD86 발현의 수준을 변화시키지 않았다. CD11b 길항제의 소분자인 ML-C19-A와 CD11b 길항제의 결합 (도 2a)은 또한 LPS-프라임된 단핵구에서 억제성 PL-L1 발현을 입증하였다 (도 2b). 이와 함께, 이들 결과는 CD11b가 LPS-프라임된 단핵구 상의 PD-L1 발현의 유도에서 중요한 역할을 수행함을 시사한다.

실시예 2 항종양 면역력에서 CD11b 결합의 효과

항종양 면역력에서 CD11b 결합의 효과를 조사하기 위해, 항-종양 CD11b (M1/70) 항체는 B16F10 쥐 종양 모델에서 단독치료요법제로서 시험하였다. C57BL/6 마우스에 0일째에 B16F10 세포를 피하 주사하였다. 7일째에, 마우스에 대조군 IgG (5 mg/kg) 또는 항-마우스 CD11b 항체 (5 mg/kg)를 복강내 (ip) 주사하였다. 주사는 3일 내지 4일 마다 반복하였다. 효능은 각각의 그룹에 대해 종양 용적 및 장기 생존율을 모니터링함에 의해 결정하였다. 도 3에 보여진 바와 같이, 항-마우스 CD11b 항체와 CD11b의 결합은 잠재적으로 B16F10 종양의 피하 성장을 억제하였다 (18일째에 대조군 IgG 대 항-CD11b = 1054 ± 385.4 mm³ 대 502.7 ± 268.2 mm³). 본원 발명자는 종양에서 면역 세포 집단의 비율을 조사하였다. 18일째에, 종양 접종 후, CD11b와 항-CD11b 항체의 결합은 T세포를 억제하는 종양-침윤 골수-유래된 서프레서 세포 (MDSC)의 국소 축적을 감소시키고 종양 침윤된 CD8 T 세포를 증가시켰다 (도 4). 이와 함께, CD11b와 항-CD11b 항체의 결합은 면역억제성 종양 미세환경을, 항종양 효과에 유리하게 기여하는 면역 자극 상태로 전환시킨다. 본원 발명자는 추가로 항-CD11b 항체 치료 후 말초에서 면역 세포 집단의 비율을 조사하였다. 종양 주사후 15일째에, 항-CD11b 치료는 CD11b 추정 백혈구 세포에서 PD-L1 발현을 감소시키고 CD8 T 세포에서 활성화된 T 세포인 IAIE 양성 CD8 T 세포의 퍼센트는 증가하였다 (도 5). IFN-γ, IL-12, 및 TNF-α의 혈장 수준은 다양한 염증 또는 악성 질환에서 면역자극 상태를 반영한다. 본원 발명자는 항-CD11b 항체 치료받은 종양-함유 마우스에서 혈장 IFN-γ, IL-12, 및 TNF-α 수준을 측정하였다. 대조군 IgG 치료와 비교하여, 항-CD11b 항체 치료받은 마우스는 상승된 혈장 IFN-γ, IL-12, 및 TNF-α 수준을 보여주었다 (도 6).

CD11b 결합은 또한 독특한 동계 (syngeneic) LLC1 종양 모델에서 효능을 입증하였다. 5 mg/kg의 항-CD11b 항체를 사용한 치료는 잠재적으로 LLC1 종양의 종양 성장을 억제하였고 (도 7) 동물 생존율을 연장시켰다 (도 8) (중앙 생존일 Ctrl IgG: 31일; 항-CD11b: 42일).

실시예 3 항종양 면역력에서 CD11b 결합 및 면역 체크포인트 치료요법제의 상승작용 효과

병용 치료는 독특한 동계 LLC1 폐 전이 모델에서 효능을 입증하였다. 항-CD11b (10 mg/kg) + 항-PD-1 (10 mg/kg) 항체를 사용한 치료는 잠재적으로 LLC1 종양의 종양 결절을 감소시켰고 (도 9) (15일째에 Ctrl IgG 대 항-CD11b 대 항-PD-1 대 항-CD11b + 항-PD-1 = 200 ± 13 대 167 대 164 ± 11 대 131 ± 2) 동물 생존율을 연장한다 (도 10) (중앙 생존일 Ctrl IgG: 24일; 항-CD11b: 24일; 항-PD-1: 22일; 항-CD11b + 항-PD-1: 26일).

실시예 4 항종양 면역력에서 CD11b 결합 및 화학치료요법제의 상승작용 효과

CD11b 결합은 또한 화학치료요법제를 증진시킨다. 본 실시예에서, B16F10 세포는 0일째에 이식시켰다. 7일째에, 마우스에 대조군 IgG (5 mg/kg), 항-마우스 CD11b 항체 (5 mg/kg), 탁솔 (10 mg/kg) + 대조군 IgG (5 mg/kg), 또는 탁솔 (10 mg/kg) + 항-CD11b (5 mg/kg)를 복강내 주사하였다. 주사는 3일 내지 4일 마다 반복하였다. 도 11에 보여진 바와 같이, 탁솔 + 항-CD11b 항체의 조합을 사용한 치료는 종양 성장을 효과적으로 억제하였다. 상기 병용 치료의 효과는 또한 장기 생존율에서 확인하였다 (도 12) (중앙 생존일 Ctrl IgG: 25일; 항-CD11b: 32일; 탁솔 + Ctrl IgG: 25일; 탁솔 + 항-CD11b: 32일).

실시예 5 LPS-유도된 면역억제된 단핵구 또는 패혈증 쇼크를 갖는 환자로부터의 단핵구에서, 항-CD11b 항체와 CD11b의 결합은 또한 세포에 LPS가 챌린지되는 경우 PD-L1 발현을 감소시킨다.

중증 감염에 의해 유발되는 전신 염증 반응 증후군인 패혈증은 전세계 건강보건 문제점 및 생명-위협 질환으로 남아있다. 패혈증이 시간 경과에 따라 변화하는 이상 (biphasic) 면역학적 반응을 개시한다는 것이 날로 명백해지고 있다. 패혈증의 초기 단계 동안에, 전신 과염증 면역 반응은 전신적으로 혈류역학 불안정성, 다중기관 기능부전, 응고 이상 및 쇼크를 유발할 수 있는 인터류킨 (IL)-1, IL-6, 및 종양 괴사 인자 (TNF)-α를 포함하는 염증 사이토킨을 생성할 수 있다. 과염증성 면역 반응에 수반하여 IL-10, 및 종양 성장 인자 (TGF)-β를 포함하는 항-염증성 사이토킨의 거의 동시 생성이고; 면역계는 1차 감염 및 후기 병원내 감염 (late nosocomial infection)의 발병을 박멸시키지 못하는 무능력으로 나타나는 면역마비 (immunoparalysis)로 호칭되는 면역 저반응성 상태로 신속히 진입한다. 패혈증을 갖는 환자에서 관찰되는 면역마비의 징후는 림프구 비정상, 감소된 인간 백혈구 항원-DR (HLA-DR) 표면 발현을 갖는 단핵구성 불활성화 및 생체외 자극하에 낮은 TNF-α 생성을 포함한다. 단핵구 HLA-DR 발현에서 지속적 감소는 패혈증을 갖는 환자에서 병원성 감염 및 사망에 대한 큰 위험을 지적한다. 최근에, 패혈증 쇼크를 갖는 환자내 단핵구에서 상승된 프로그램 사망 리간드-1 (PD-L1) 발현이 관찰되었고 2차 병원성 감염 및 치사율의 증가된 발생과 관련되었다 (문헌참조: Guignant C, Lepape A, Huang X, Kherouf H, Denis L, et al. (2011) Programmed death-1 levels correlate with increased mortality, nosocomial infection and immune dysfunctions in septic shock patients. Crit Care 15: R99). 따라서, 단핵구에서 PD-L1 발현의 수준은 면역마비에 대한 신규 마커로서 작용할 수 있다.

2일에 걸쳐 동안 단핵구의 LPS로의 사전 노출이 이들이 면역억제된 단핵구가 되도록 하는 것으로 보고되었다 (문헌참조: Wolk K, Docke WD, von Baehr V, Volk HD, and Sabat R. (2000) Impaired antigen presentation by human monocytes during endotoxin tolerance. Blood 96: 218). 임상적으로, 이들 세포는 면역마비 및 치사율과 관련되었다. 본원 발명자는 재생가능한 LPS-유도된 면역억제된 단핵구를 확립하였고, 여기서, 인간 단핵구는 2일 동안 100 ng/ml의 LPS로 사전 항온처리하였다. 새롭게 단리된 인간 단핵구와 비교하여, LPS-유도된 면역억제된 단핵구는 세포 표면 상에서 높은 PD-L1 수준을 발현하였다 (도 13a). LPS-유도된 면역억제된 단핵구에서 CD11b 조절제의 효과를 조사하기 위해, 세포는 IgG1 또는 항-CD11b 항체 (ICRF44)의 존재하에 18시간 동안 1 ㎍/ml의 LPS에 노출시켰다. 도 13b에 나타낸 바와 같이, CD11b와 항-CD11b 항체 (ICRF44)의 결합은 세포가 LPS로 챌린지 받는 경우 LPS-유도된 면역억제된 단핵구에서 PD-L1 발현을 감소시켰다. 더욱이, 항-CD11b 항체 (ICRF44) 치료는 또한 시험관내 LPS 자극시 패혈증 쇼크를 갖는 환자로부터의 단핵구에서 PD-L1 발현을 감소시켰다 (도 14).

실시예 6 인간 CD11b에 결합하는 인간화된 항체

쥐 항-인간 CD11b 항체의 가변 도메인 서열은 인간 항체 데이터베이스에 대해 검색하였다. 쥐 항-인간 CD11b와 높은 유사성을 갖는 10개 세트의 인간 골격 서열은 경쇄 및 중쇄 둘다에 대해 인간 수용체로서 선택하였다. 한편, N-당화 모티프를 분석하였다. 후보 인간 가변 영역에서 잠재적 당화 부위는 따라서 회피되어야만 한다. 10개 경쇄의 인간화된 가변 도메인은 VL1, VL2, VL3, VL4, VL5, LC1, LC2, LC3, LC4, 및 LC5로서 지칭되고 (도 15); 10개 중쇄의 인간화된 가변 도메인은 VH1, VH2, VH3, VH4, VH5, HC1, HC2, HC3, HC4, 및 HC5로서 지칭된다 (도 16). 이들 경쇄 및 중쇄 펩타이드 서열은 인간화된 항체 또는 고친화성으로 인간 항-CD11b에 결합하는 항원-결합 부분을 제공할 수 있다.

실시예 7 인간화된 CD11b 항체의 기능적 활성

인간화된 항-CD11b 항체의 특이성은 CD11b를 발현하는 K562 세포를 사용한 유동 세포측정에 의해 결정하였다. 도 17에 보여지는 바와 같이, 본 실시예에서 모든 인간화된 항-CD11b 항체는 CD11b 형질감염된 K562 세포에 결합할 수 있다. 대조적으로, 이들 항체는 K562 세포에 결합하지 않았다. 이를 종합해 보면, 이들 결과는 인간화된 항-CD11b 항체가 CD11b 에피토프에 특이적으로 결합할 수 있음을 입증한다.

인간화된 항-CD11b 항체의 기능적 활성을 조사하기 위해, 항체는 단핵구의 표면상에 PD-L1 발현을 억제하는 항체의 능력을 측정하는 LPS-프라임된 단핵구에 사용하였다. 도 18에 나타낸 바와 같이, LPS에 의한 PD-L1의 상항조절은 인간화된 항-CD11b 항체에 의해 상당히 감소될 수 있다.

요약컨대, 본원 발명자는 인간 αM 도메인에 대해 지시된 일련된 인간화된 항-CD11b 항체를 기재하였다. 인간화된 항-CD11b 항체의 결합은 LPS-프라임된 단핵구 상에서 PD-L1 발현을 감소시킬 수 있다.

SEQUENCE LISTING <110> Lu, Yen-Ta <120> METHODS AND ANTIBODIES FOR MODULATION OF IMMUNORESPONSE <130> L88340/CN24523 <160> 32 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> H-CDR1 <400> 1 Asn Tyr Trp Ile Asn 1 5 <210> 2 <211> 10 <212> PRT <213> artificial <220> <223> H-CDR1 <400> 2 Gly Phe Ser Leu Thr Ser Asn Ser Ile Ser 1 5 10 <210> 3 <211> 17 <212> PRT <213> artificial <220> <223> H-CDR2 <400> 3 Asn Ile Tyr Pro Ser Asp Thr Tyr Ile Asn His Asn Gln Lys Phe Lys 1 5 10 15 Asp <210> 4 <211> 16 <212> PRT <213> artificial <220> <223> H-CDR2 <400> 4 Ala Ile Trp Ser Gly Gly Gly Thr Asp Tyr Asn Ser Asp Leu Lys Ser 1 5 10 15 <210> 5 <211> 9 <212> PRT <213> artificial <220> <223> H-CDR3 <400> 5 Ser Ala Tyr Ala Asn Tyr Phe Asp Tyr 1 5 <210> 6 <211> 10 <212> PRT <213> artificial <220> <223> H-CDR3 <400> 6 Arg Gly Gly Tyr Pro Tyr Tyr Phe Asp Tyr 1 5 10 <210> 7 <211> 11 <212> PRT <213> artificial <220> <223> L-CDR1 <400> 7 Arg Ala Ser Gln Asn Ile Gly Thr Ser Ile 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Claims (15)

1. (a) 서열번호 1의 서열을 갖는 H-CDR1, 서열번호 3의 서열을 갖는 H-CDR2 및 서열번호 5의 서열을 갖는 H-CDR3을 포함하는 중쇄 가변 영역; 및
   (b) 서열번호 7의 서열을 갖는 L-CDR1, 서열번호 9의 서열을 갖는 L-CDR2 및 서열번호 11의 서열을 갖는 L-CDR3을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는, PD-L1 발현을 억제하는데 사용하기 위한, 항-CD11b 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
2. 제 1항에 있어서, 항-CD11b 항체 또는 이의 항원-결합 단편이,
   서열번호 13 내지 서열번호 17 중 하나의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역, 및
   서열번호 23 내지 서열번호 27 중 하나의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는, 항-CD11b 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
3. 제 2항에 있어서, 항-CD11b 항체 또는 이의 항원-결합 단편이,
   (a) 서열번호 13의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역, 및 서열번호 23의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역;
   (b) 서열번호 14의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역, 및 서열번호 24의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역;
   (c) 서열번호 15의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역, 및 서열번호 25의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역;
   (d) 서열번호 16의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역, 및 서열번호 26의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역;
   (e) 서열번호 17의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역, 및 서열번호 27의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는, 항-CD11b 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
4. 제 1항 내지 제 3항 중 어느 한 항에 있어서, 항-CD11b 항체 또는 이의 항원-결합 단편이 키메라, 인간화된, 또는 인간 항체, 또는 이의 항원-결합 단편인, 항-CD11b 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
5. 상승된 PD-L1 발현과 관련된 질환을 치료하는데 사용하기 위한, 제 1항 내지 제 3항 중 어느 한 항에 따른 항-CD11b 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 포함하는, 약제학적 조성물로서, 상승된 PD-L1 발현과 관련된 질환이 패혈증, 피부암 또는 폐암인, 약제학적 조성물.
6. 제 5항에 있어서,
   면역 체크포인트를 조절하기 위한 제제 또는 화학치료학적 제제를 추가로 포함하고, 면역 체크포인트를 조절하기 위한 제제가 항-PD-1 항체이고, 화학치료학적 제제가 탁솔인, 약제학적 조성물.
7. 삭제
8. 삭제
9. 제 5항에 있어서, 피부암이 흑색종, 피부 또는 안내 악성 흑색종, 또는 표피양 암(epidermoid cancer)인, 약제학적 조성물.
10. 제 5항에 있어서, 폐암이 폐의 편평 세포 암종인, 약제학적 조성물.
11. 패혈증, 피부암 또는 폐암에서 PD-L1 발현을 억제하는데 사용하기 위한, 제 1항 내지 제 3항 중 어느 한 항에 따른 항-CD11b 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 포함하는, 약제학적 조성물.
12. 제 1항에 있어서, PD-L1 발현을 억제하는 것이 상승된 PD-L1 발현과 관련된 질환을 치료하고, 상승된 PD-L1 발현과 관련된 질환이 패혈증 또는 암인, 항-CD11b 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
13. 삭제
14. 제 12항에 있어서, 암이 피부암 또는 폐암인, 항-CD11b 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
15. 제 6항에 있어서, 항-PD-1 항체가 니볼루맙 또는 펨브롤리주맙인, 약제학적 조성물.