CN108103105A - 一种car-t细胞的制备方法、制得的car-t细胞及其应用 - Google Patents

一种car-t细胞的制备方法、制得的car-t细胞及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种CAR‑T细胞的制备方法、制得的CAR‑T细胞及其应用，所述制备方法包括以下步骤：S1、T淋巴细胞的分离、激活和扩增：将分离的CD3+CD8+T淋巴细胞激活后培养扩增；S2、携带CAR的重组慢病毒感染所述步骤S1处理后的T淋巴细胞，制得所述CAR‑T细胞，其中，所述携带CAR的重组慢病毒中携带的CAR基因包含CD28胞内区和4‑1BB胞内区，所述CD28胞内区和4‑1BB胞内区的核苷酸序列分别如SEQ ID7和SEQ ID9所示。本发明制备方法制得的CAR‑T细胞可广泛应用于多种癌症的治疗。与现有技术相比，本发明方法制备的CAR‑T细胞增殖率相比于常规方法得到了显著提高。

Description

一种CAR-T细胞的制备方法、制得的CAR-T细胞及其应用
技术领域
本发明涉及免疫学领域，具体涉及一种嵌合抗原受体T淋巴细胞(ChimericAntigen Receptor T-cell，CAR-T)的制备方法、制得的CAR-T细胞及其应用。
背景技术
近10年来，免疫疗法在癌症治疗中展现出了巨大的潜力和前景，嵌合抗原受体T细胞疗法的出现是免疫治疗领域的一大突破性进展。1989年，Gross等首次提出构建特异性嵌合抗原受体修饰的T淋巴细胞(CAR-T)。CAR-T疗法是利用患者自身免疫细胞杀伤肿瘤细胞，是一种特异性杀伤肿瘤细胞的方法，该治疗方法通过提取患者外周血中的T淋巴细胞，再将提取的T淋巴细胞通过基因工程方法进行改造，改造后的T淋巴细胞具备强大的特异性识别肿瘤抗原的能力，将改造后的T淋巴细胞经体外扩增后回输到患者体内，对肿瘤细胞具有特异性杀伤力。与传统免疫疗法相比，CAR-T疗法在体外和临床试验中均已表现出了更好的靶向性和杀伤性，展示了巨大的应用潜力和发展前景。
尽管如此，CAR-T疗法在多项肿瘤治疗研究中的效果仍存在差异，推测其原因之一是由于现有技术中制备的CAR-T细胞的增殖效率和存活持久性不同。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是：提供一种能够确保增殖效率高的CAR-T细胞的制备方法、制得的CAR-T细胞及其应用。
为了解决上述技术问题，本发明采用的技术方案为：一种CAR-T细胞的制备方法，包括以下步骤：
S1、T淋巴细胞的分离、激活和扩增：将分离的CD3+CD8+T淋巴细胞激活后培养扩增；
S2、携带CAR的重组慢病毒感染所述步骤S1处理后的T淋巴细胞，制得所述CAR-T细胞，其中，所述携带CAR的重组慢病毒中携带的CAR基因包含CD28胞内区和4-1BB胞内区，所述CD28胞内区和4-1BB胞内区的核苷酸序列分别如SEQ ID7和SEQ ID9所示。
本发明的有益效果在于：优化设计的CAR基因结构和序列有利于后期的表达和增殖，采用两个共刺激分子胞内区有助于促进CAR-T细胞的增殖；通过本发明方法制备CAR-T细胞增殖率相比于常规制备方法可提升75％以上。
本发明还包括通过上述方法制得的CAR-T细胞。
本发明还包括将上述CAR-T细胞在制备治疗或预防癌症的药物中的用途。
本发明的有益效果还在于：本发明CAR-T细胞应用前景广泛，将可广泛应用于各种治疗或预防癌症的药物中且具有良好的治疗或预防效果。
具体实施方式
为详细说明本发明的技术内容、所实现目的及效果，以下结合实施方式予以说明。
本发明最关键的构思在于：优化设计的CAR基因结构和序列有利于后期的翻译、表达和增殖，其中Leader序列有助于后期的翻译，采用两个共刺激分子胞内区有助于促进CAR-T细胞的增殖。
一种CAR-T细胞的制备方法，包括以下步骤：
S1、T淋巴细胞的分离、激活和扩增：将分离的CD3+CD8+T淋巴细胞激活后培养扩增；
S2、携带CAR的重组慢病毒感染所述步骤S1处理后的T淋巴细胞，制得所述CAR-T细胞，其中，所述携带CAR的重组慢病毒中携带的CAR基因包含CD28胞内区和4-1BB胞内区，所述CD28胞内区和4-1BB胞内区的核苷酸序列分别如SEQ ID7和SEQ ID9所示。
从上述描述可知，本发明的有益效果在于：优化设计的CAR基因结构和序列有利于后期的表达和增殖，采用两个共刺激分子胞内区有助于促进CAR-T细胞的增殖；通过本发明方法制备CAR-T细胞增殖率相比于常规制备方法可提升75％以上。
进一步地，所述步骤S2中，携带CAR的重组慢病毒感染T淋巴细胞时，添加聚凝胺(Polybrene)，所述Polybrene的添加浓度范围为5～10μg/ml，优选为5μg/ml。
进一步地，所述步骤S2中，病毒感染的时间为10～20天，优选为14天。
进一步地，将所述步骤S1中的T淋巴细胞激活后第3天进行所述步骤S2。
进一步地，所述CAR基因为CD19CAR基因，所述CD19CAR基因包含Leader-CD19scfv-hinge-CD28TM-CD28胞内区-linker-4-1BB胞内区-CD3zeta片段或由上述片段组成，所述Leader-CD19scfv-hinge-CD28TM-CD28胞内区-linker-4-1BB胞内区-CD3zeta片段由Leader基因片段、CD19scfv基因片段、hinge基因片段、CD28TM基因片段、CD28胞内区基因片段、linker基因片段、4-1BB胞内区基因片段和CD3zeta基因片段依次拼接而成，所述Leader基因片段、CD19scfv基因片段、hinge基因片段、CD28TM基因片段、CD28胞内区基因片段、linker基因片段、4-1BB胞内区基因片段和CD3zeta基因片段的核苷酸序列依次如SEQ ID2、SEQ ID3、SEQ ID5、SEQ ID6、SEQ ID7、SEQ ID8、SEQ ID9和SEQ ID10所示。
从上述描述可知，本发明的有益效果在于：在CAR基因中设计Leader序列，有助于后期的翻译。
进一步地，所述步骤S2中携带CAR的重组慢病毒为携带CD19CAR的重组慢病毒，所述携带CD19CAR的重组慢病毒的制备包括以下步骤：通过基因合成获得EF1α-CD19CAR基因，连接到pMD18-T载体，通过PCR扩增得到EF1α-CD19CAR片段，且基因片段两端分别带有BstXI/BamHI酶切位点。
进一步地，所述携带CD19CAR的重组慢病毒的制备还包括以下步骤：BstXI/BamHI双酶切pRRLSIN.cPPT.PGK-GFP.WPRE载体，将PGK启动子替换为EF1α启动子，通过In-Fusion法将EF1α-CD19CAR片段克隆至载体中；筛选阳性克隆并扩大培养后，采用pMD2.G、pRSVRev、pMDLg/pRRE辅助质粒用lipo2000法转染293FT细胞，于24小时后收集病毒颗粒。
进一步地，所述携带CAR的基因为EGFRvIII CAR基因，所述EGFRvIII CAR基因包含Leader-EGFRvIII scfv-hinge-CD28TM-CD28胞内区-linker-4-1BB胞内区-CD3zeta片段或由上述片段组成，所述Leader-EGFRvIII scfv-hinge-CD28TM-CD28胞内区-linker-4-1BB胞内区-CD3zeta片段由Leader基因片段、EGFRvIII scfv基因片段、hinge基因片段、CD28TM基因片段、CD28胞内区基因片段、linker基因片段、4-1BB胞内区基因片段和CD3zeta基因片段依次拼接而成，所述Leader基因片段、EGFRvIII scfv基因片段、hinge基因片段、CD28TM基因片段、CD28胞内区基因片段、linker基因片段、4-1BB胞内区基因片段和CD3zeta基因片段的核苷酸序列依次如SEQ ID2、SEQ ID4、SEQ ID5、SEQ ID6、SEQ ID7、SEQ ID8、SEQ ID9和SEQ ID10所示。
进一步地，所述步骤S2中携带CAR的重组慢病毒为携带EGFRvIII CAR的重组慢病毒，所述携带EGFRvIII CAR的重组慢病毒的制备包括以下步骤：通过基因合成获得基因EF1α-EGFRvIII CAR，连接到pMD18-T载体，通过PCR扩增得到EF1α-EGFRvIII CAR片段，且基因片段两端分别带有BstXI/BamHI酶切位点。
进一步地，所述携带EGFRvIII CAR的重组慢病毒的制备还包括以下步骤：BstXI/BamHI双酶切pRRLSIN.cPPT.PGK-GFP.WPRE载体，将PGK启动子替换为EF1α启动子，通过In-Fusion法将EF1α-EGFRvIII CAR片段克隆至载体中；筛选阳性克隆并扩大培养后，采用pMD2.G、pRSVRev、pMDLg/pRRE辅助质粒用lipo2000法转染293FT细胞，于24小时后收集病毒颗粒。
进一步地，所述CD3+CD8+T淋巴细胞通过以下步骤分离得到：从外周血单个核细胞中分离T淋巴细胞，采用抗CD3抗体、抗CD8抗体，通过流式细胞术分选得到CD3+CD8+T淋巴细胞。
进一步地，所述步骤S1中的激活操作如下：在分离得到的CD3+CD8+T淋巴细胞悬液中，添加CD3/CD28抗体偶联磁珠激活T淋巴细胞，所述CD3/CD28抗体偶联磁珠与T淋巴细胞的比例为1:1～3:1，优选为3:1。
进一步地，所述步骤S1中的培养扩增操作如下：在上述从外周血单个核细胞中分离T淋巴细胞后的第2天起，添加最终浓度为300～500IU/ml的重组人IL-2、最终浓度为5～8ng/ml的重组人IL-7和最终浓度为5～8ng/ml的重组人IL-15。
优选地，所述步骤S1中的培养操作如下：在上述从外周血单个核细胞中分离T淋巴细胞后的第2天起，添加最终浓度为300IU/ml的重组人IL-2、最终浓度为6ng/ml的重组人IL-7和最终浓度为6ng/ml的重组人IL-15。
进一步地，所述步骤S1和S2中的培养操作均是将细胞置于37℃、5％CO2培养箱中培养。
本发明还包括通过上述方法制得的CAR-T细胞。
本发明还包括将上述CAR-T细胞在制备治疗或预防癌症的药物中的用途。
从上述描述可知，本发明的有益效果还在于：本发明CAR-T细胞应用前景广泛，将可广泛应用于各种治疗或预防癌症的药物中且具有良好的治疗或预防效果。
本发明的实施例一为：一种CAR-T细胞的制备方法，包括以下步骤：
S1、T淋巴细胞的分离、激活和扩增
无菌条件下采集外周血50mL，将血液标本送至实验室，进行外周血单个核细胞的分离。将外周血2000rpm，l0min离心，收集上层自体血浆。余下血液与0.01mol/L PBS液按1:1稀释吹打均匀，利用淋巴细胞分离液分离单个核细胞，PBS洗涤细胞，将细胞沉淀用含10％自体血浆的GTT551无血清培养基重悬，按Pan T Cell Isolation Kit II(可直接市购于美天旎公司)的操作说明，从外周血单个核细胞中分离T淋巴细胞。采用抗-CD3、抗-CD8抗体，通过流式细胞术分选出CD3+CD8+T淋巴细胞。
在分离得到的CD3+CD8+T淋巴细胞悬液中，添加CD3/CD28抗体偶联磁珠激活T淋巴细胞，其中CD3/CD28抗体偶联磁珠与T淋巴细胞的比例为3:1，在上述培养体系中添加重组人IL-2使其终浓度为300IU/mL，同时添加重组人IL-7与重组人IL-15使其终浓度均为6ng/ml。将细胞置于37℃、5％CO2培养箱中培养。
S2、携带CAR的重组慢病毒感染T淋巴细胞，制备CAR-T细胞
从T淋巴细胞激活操作开始计时的第3天，用携带CD19-CAR的重组慢病毒感染T淋巴细胞，感染时添加Polybrene，使其终浓度为5μg/mL，制备CAR-T细胞。病毒感染后10天，用有限稀释法筛选阳性克隆细胞株。将CAR-T细胞与转导了CD19的K562细胞按1:1的比例共培养5天，采用CFSE染色法检测细胞增殖率。
所述携带CD19CAR的重组慢病毒制备步骤如下：
1、CAR基因序列构建
CD19CAR基因结构：Leader-CD19scfv-hinge-CD28TM-CD28胞内区-linker-4-1BB胞内区-CD3zeta，序列见附录。
2、携带CD19CAR重组慢病毒制备
通过基因合成获得EF1α-CD19CAR基因，连接到pMD18-T载体，通过PCR扩增得到EF1α-CD19CAR片段，且基因片段两端分别带有BstXI/BamHI酶切位点。所述EF1α基因的核苷酸序列如SEQ ID1所示。BstXI/BamHI双酶切pRRLSIN.cPPT.PGK-GFP.WPRE载体，将PGK启动子替换为EF1α启动子，通过In-Fusion法将EF1α-CD19CAR片段克隆至载体中。挑选阳性克隆测序。鉴定正确的质粒扩大培养。采用pMD2.G、pRSVRev、pMDLg/pRRE辅助质粒用lipo2000法转染293FT细胞，于24小时后收集病毒颗粒。
对照实验一操作如下：除携带CD19CAR的重组慢病毒中CD19CAR基因结构为Leader-CD19scfv-hinge-CD28TM-CD28胞内区-CD3zeta外，其他步骤均与实施例一相同。
用CFSE染色法检测本发明实施例一和对照实验一制备的CAR-T细胞增殖情况，结果如下：
对照实验一制备的CAR-T细胞增殖效率为18％，本发明实施例一制备的CAR-T细胞增殖率30％。
从上述结果可以看出，采用本发明方法制备的CAR-T的细胞增殖率比对照实验一采用常规方法制备的CAR-T的细胞增殖率高出67％。
本发明的实施例二为：一种CAR-T细胞的制备方法，包括以下步骤：
S1、T淋巴细胞的分离、激活和扩增
无菌条件下采集外周血50mL，将血液标本送至实验室，进行外周血单个核细胞的分离。将外周血2000rpm，l0min离心，收集上层自体血浆。余下血液与0.01mol/L PBS液按1:1稀释吹打均匀，利用淋巴细胞分离液分离单个核细胞，PBS洗涤细胞，将细胞沉淀用含10％自体血浆的GTT551无血清培养基重悬，按Pan T Cell Isolation Kit II(美天旎公司)的操作说明，从外周血单个核细胞中分离T淋巴细胞。采用抗-CD3、抗-CD8抗体，通过流式细胞术分选出CD3+CD8+T淋巴细胞。
在分离得到的CD3+CD8+T淋巴细胞悬液中，添加CD3/CD28抗体偶联磁珠激活T淋巴细胞，其中CD3/CD28抗体偶联磁珠与T淋巴细胞的比例为1:1，在上述培养体系中添加重组人IL-2使其终浓度为500IU/mL，同时添加重组人IL-7与重组人IL-15使其终浓度均为8ng/mL。将细胞置于37℃、5％CO2培养箱中培养。
S2、携带CAR的重组慢病毒感染T淋巴细胞，制备CAR-T细胞
从T淋巴细胞激活操作开始计时的第3天，用携带EGFRvIII-CAR的重组慢病毒感染T淋巴细胞，感染时添加Polybrene，使其终浓度为10μg/mL，制备CAR-T细胞。病毒感染后14天，有限稀释法筛选阳性克隆细胞株。将CAR-T细胞与转导了EGFRvIII的U87细胞按1:1的比例共培养5天，用CFSE染色法检测细胞增殖率。
所述携带EGFRvIII CAR的重组慢病毒制备，包括以下步骤：
1、CAR基因序列构建
EGFRvIII CAR基因结构：Leader-EGFRvIII scfv-hinge-CD28TM-CD28胞内区-linker-4-1BB胞内区-CD3zeta，序列见附录。
2、携带EGFRvIII CAR重组慢病毒制备
通过基因合成获得EF1α-EGFRvIII CAR基因，连接到pMD18-T载体，通过PCR扩增得到EF1α-EGFRvIII CAR片段，基因片段两端分别带有BstXI/BamHI酶切位点。所述EF1α基因的核苷酸序列如SEQ ID1所示。BstXI/BamHI双酶切pRRLSIN.cPPT.PGK-GFP.WPRE载体，将PGK启动子替换为EF1α启动子，通过In-Fusion法将EF1α-EGFRvIII CAR片段克隆至载体中。挑选阳性克隆测序。正确的质粒扩大培养。采用pMD2.G、pRSVRev、pMDLg/pRRE辅助质粒用lipo2000法转染293FT细胞，于24小时后收集病毒颗粒。
本发明实施例二的对照实验操作如下：除携带EGFRvIII CAR的重组慢病毒中EGFRvIII CAR基因结构为Leader-EGFR scfv-hinge-CD28TM-CD28胞内区-CD3zeta外，其他步骤均与实施例二相同。
用CFSE染色法检测本发明实施例二和对照实验二制备的CAR-T细胞增殖情况，结果如下：
对照实验二制备的CAR-T细胞增殖效率为20％，本发明实施例二制备的CAR-T细胞增殖率36％。
从上述结果可以看出，采用本发明方法制备的CAR-T细胞增殖率比对照实验二采用常规方法制备的CAR-T细胞增殖率高出80％。
本发明的实施例三为：一种CAR-T细胞的制备方法，包括以下步骤：
S1、T淋巴细胞的分离、激活和扩增
无菌条件下采集外周血50mL，将血液标本送至实验室，进行外周血单个核细胞的分离。将外周血2000rpm，l0min离心，收集上层自体血浆。余下血液与0.01mol/L PBS液按1:1稀释吹打均匀，利用淋巴细胞分离液分离单个核细胞，PBS洗涤细胞，将细胞沉淀用含10％自体血浆的GTT551无血清培养基重悬，按Pan T Cell Isolation Kit II(可直接市购于美天旎公司)的操作说明，从外周血单个核细胞中分离T淋巴细胞。采用抗-CD3、抗-CD8抗体，通过流式细胞术分选出CD3+CD8+T淋巴细胞。
在分离得到的CD3+CD8+T淋巴细胞悬液中，添加CD3/CD28抗体偶联磁珠激活T淋巴细胞，其中CD3/CD28抗体偶联磁珠与T淋巴细胞的比例为3:1，在上述培养体系中添加重组人IL-2使其终浓度为400IU/mL，同时添加重组人IL-7与重组人IL-15使其终浓度均为5ng/ml。将细胞置于37℃、5％CO2培养箱中培养。
S2、携带CAR的重组慢病毒感染T淋巴细胞，制备CAR-T细胞
从T淋巴细胞激活操作开始计算的第3天，用携带CD19-CAR的重组慢病毒感染T淋巴细胞，感染时添加Polybrene，使其终浓度为5μg/mL，制备CAR-T细胞。重组慢病毒感染后20天，用有限稀释法筛选阳性克隆细胞株。将CAR-T细胞与转导了CD19的K562细胞按1:1的比例共培养5天，采用CFSE染色法检测细胞增殖率。
所述携带CD19CAR的重组慢病毒制备步骤如下：
1、CAR基因序列构建
CD19CAR基因结构：Leader-CD19scfv-hinge-CD28TM-CD28胞内区-linker-4-1BB胞内区-CD3zeta，序列见附录。
2、携带CD19CAR重组慢病毒制备
通过基因合成获得EF1α-CD19CAR基因，连接到pMD18-T载体，通过PCR扩增得到EF1α-CD19CAR片段，且基因片段两端分别带有BstXI/BamHI酶切位点。所述EF1α基因的核苷酸序列如SEQ ID1所示。BstXI/BamHI双酶切pRRLSIN.cPPT.PGK-GFP.WPRE载体，将PGK启动子替换为EF1α启动子，通过In-Fusion法将EF1α-CD19CAR片段克隆至载体中。挑选阳性克隆测序。鉴定正确的质粒扩大培养。采用pMD2.G、pRSVRev、pMDLg/pRRE辅助质粒用lipo2000法转染293FT细胞，于24小时后收集病毒颗粒。
对照实验三操作如下：除携带CD19CAR的重组慢病毒中CD19CAR基因结构为Leader-CD19scfv-hinge-CD28TM-CD28胞内区-CD3zeta外，其他步骤均与实施例三相同。
用CFSE染色法检测本发明实施例三和对照实验三制备的CAR-T细胞增殖情况，结果如下：
对照实验三制备的CAR-T细胞增殖效率为22％，本发明实施例三制备的CAR-T细胞增殖率40％。
从上述结果可以看出，采用本发明方法制备的CAR-T的细胞增殖率比对照实验三采用常规方法制备的CAR-T的细胞增殖率高出82％。
综上所述，本发明提供的一种CAR-T细胞的制备方法、制得的CAR-T细胞及其应用，本发明方法制备的CAR-T细胞增殖率相比于常规方法得到了显著提高。
以上所述仅为本发明的实施例，并非因此限制本发明的专利范围，凡是利用本发明说明书内容所作的等效结构或等效流程变换，或直接或间接运用在其他相关的技术领域，均同理包括在本发明的专利保护范围内。

Claims (10)

1.一种CAR-T细胞的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：
S1、T淋巴细胞的分离、激活和扩增：将分离的CD3+CD8+T淋巴细胞激活后培养扩增；
S2、携带CAR的重组慢病毒感染所述步骤S1处理后的T淋巴细胞，制得所述CAR-T细胞，其中，所述携带CAR的重组慢病毒中携带的CAR基因包含CD28胞内区和4-1BB胞内区，所述CD28胞内区和4-1BB胞内区的核苷酸序列分别如SEQ ID7和SEQ ID9所示。
2.根据权利要求1所述的CAR-T细胞的制备方法，其特征在于：所述步骤S2中，携带CAR的重组慢病毒感染T淋巴细胞时，添加Polybrene，所述Polybrene的添加浓度范围为5～10μg/ml。
3.根据权利要求1所述的CAR-T细胞的制备方法，其特征在于：所述步骤S2中，病毒感染的时间为10～20天。
4.根据权利要求1所述的CAR-T细胞的制备方法，其特征在于：将所述步骤S1中的T淋巴细胞激活后第3天进行所述步骤S2。
5.根据权利要求1所述的CAR-T细胞的制备方法，其特征在于：所述重组慢病毒携带的CAR基因为CD19CAR基因，所述CD19CAR基因包含Leader-CD19scfv-hinge-CD28TM-CD28胞内区-linker-4-1BB胞内区-CD3zeta片段或由上述片段组成，所述Leader-CD19scfv-hinge-CD28TM-CD28胞内区-linker-4-1BB胞内区-CD3zeta片段由Leader基因片段、CD19scfv基因片段、hinge基因片段、CD28TM基因片段、CD28胞内区基因片段、linker基因片段、4-1BB胞内区基因片段和CD3zeta基因片段依次拼接而成，所述Leader基因片段、CD19scfv基因片段、hinge基因片段、CD28TM基因片段、CD28胞内区基因片段、linker基因片段、4-1BB胞内区基因片段和CD3zeta基因片段的核苷酸序列依次如SEQ ID2、SEQ ID3、SEQ ID5、SEQ ID6、SEQID7、SEQ ID8、SEQ ID9和SEQ ID10所示。
6.根据权利要求1所述的CAR-T细胞的制备方法，其特征在于：所述重组慢病毒携带的CAR基因为EGFRvIII CAR基因，所述EGFRvIII CAR基因包含Leader-EGFRvIII scfv-hinge-CD28TM-CD28胞内区-linker-4-1BB胞内区-CD3zeta片段或由上述片段组成，所述Leader-EGFRvIII scfv-hinge-CD28TM-CD28胞内区-linker-4-1BB胞内区-CD3zeta片段由Leader基因片段、EGFRvIII scfv基因片段、hinge基因片段、CD28TM基因片段、CD28胞内区基因片段、linker基因片段、4-1BB胞内区基因片段和CD3zeta基因片段依次拼接而成，所述Leader基因片段、EGFRvIII scfv基因片段、hinge基因片段、CD28TM基因片段、CD28胞内区基因片段、linker基因片段、4-1BB胞内区基因片段和CD3zeta基因片段的核苷酸序列依次如SEQID2、SEQ ID4、SEQ ID5、SEQ ID6、SEQ ID7、SEQ ID8、SEQ ID9和SEQ ID10所示。
7.根据权利要求1所述的CAR-T细胞的制备方法，其特征在于：所述步骤S1中的激活操作如下：在分离得到的CD3+CD8+T淋巴细胞悬液中，添加CD3/CD28抗体偶联磁珠激活T淋巴细胞，所述CD3/CD28抗体偶联磁珠与T淋巴细胞的比例为1:1～3:1。
8.根据权利要求7所述的CAR-T细胞的制备方法，其特征在于：所述步骤S1中的培养扩增操作如下：从外周血单个核细胞中分离T淋巴细胞后的第2天起，添加最终浓度为300～500IU/ml的重组人IL-2、最终浓度为5～8ng/ml的重组人IL-7和最终浓度为5～8ng/ml的重组人IL-15。
9.根据权利要求1～8任一项所述的制备方法制得的CAR-T细胞。
10.根据权利要求9所述的CAR-T细胞应用于制备治疗或预防癌症的药物中。
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Cited By (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN109337930A (zh) * 2018-09-30 2019-02-15 北京鼎成肽源生物技术有限公司 一种afft1细胞
CN110157683A (zh) * 2019-05-29 2019-08-23 南京艾德免疫治疗研究院有限公司 一种治疗白血病的car-t细胞制剂的制备方法
CN110964121A (zh) * 2019-12-20 2020-04-07 山东省齐鲁细胞治疗工程技术有限公司 一种分泌il-7、il-15因子的cd19-car-t细胞及其应用
CN111909271A (zh) * 2020-08-12 2020-11-10 深圳市茵冠生物科技有限公司 一种基于单域抗体的bcma嵌合抗原受体及其应用
WO2021108613A1 (en) 2019-11-26 2021-06-03 Novartis Ag Cd19 and cd22 chimeric antigen receptors and uses thereof
WO2022254337A1 (en) 2021-06-01 2022-12-08 Novartis Ag Cd19 and cd22 chimeric antigen receptors and uses thereof
WO2024040980A1 (zh) * 2022-08-25 2024-02-29 深圳市先康达生命科学有限公司 一种慢病毒转染助转剂及转染方法

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN105358576A (zh) * 2013-02-20 2016-02-24 诺华股份有限公司 使用人源化抗EGFRvIII嵌合抗原受体治疗癌症
CN106163547A (zh) * 2014-03-15 2016-11-23 诺华股份有限公司 使用嵌合抗原受体治疗癌症
WO2017117112A1 (en) * 2015-12-28 2017-07-06 Novartis Ag Methods of making chimeric antigen receptor -expressing cells

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN105358576A (zh) * 2013-02-20 2016-02-24 诺华股份有限公司 使用人源化抗EGFRvIII嵌合抗原受体治疗癌症
CN106163547A (zh) * 2014-03-15 2016-11-23 诺华股份有限公司 使用嵌合抗原受体治疗癌症
WO2017117112A1 (en) * 2015-12-28 2017-07-06 Novartis Ag Methods of making chimeric antigen receptor -expressing cells

Non-Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
ACCESSION ID: NM_000734.3: "Homo sapiens CD247 molecule (CD247), transcript variant 2, mRNA", 《GENBANK》 *
ACCESSION ID: NM_001561.5: "Homo sapiens TNF receptor superfamily member 9 (TNFRSF9), mRNA", 《GENBANK》 *
ACCESSION ID: NM_006139.2: "Homo sapiens CD28 molecule (CD28), mRNA", 《GENBANK》 *
XIAO-SONG ZHONG等: "Chimeric Antigen Receptors Combining 4-1BB and CD28 Signaling Domains Augment PI3kinase/AKT/Bcl-XL Activation and CD8+ T Cell–mediated Tumor Eradication", 《MOLECULAR THERAPY》 *
窦肇华等主编: "《免疫细胞学与疾病》", 30 September 2004, 中国医药科技出版社 *

Cited By (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN109337930A (zh) * 2018-09-30 2019-02-15 北京鼎成肽源生物技术有限公司 一种afft1细胞
CN109337930B (zh) * 2018-09-30 2020-10-30 北京鼎成肽源生物技术有限公司 一种afft1细胞
CN110157683A (zh) * 2019-05-29 2019-08-23 南京艾德免疫治疗研究院有限公司 一种治疗白血病的car-t细胞制剂的制备方法
WO2021108613A1 (en) 2019-11-26 2021-06-03 Novartis Ag Cd19 and cd22 chimeric antigen receptors and uses thereof
CN110964121A (zh) * 2019-12-20 2020-04-07 山东省齐鲁细胞治疗工程技术有限公司 一种分泌il-7、il-15因子的cd19-car-t细胞及其应用
CN110964121B (zh) * 2019-12-20 2022-09-16 山东省齐鲁细胞治疗工程技术有限公司 一种分泌il-7、il-15因子的cd19-car-t细胞及其应用
CN111909271A (zh) * 2020-08-12 2020-11-10 深圳市茵冠生物科技有限公司 一种基于单域抗体的bcma嵌合抗原受体及其应用
WO2022254337A1 (en) 2021-06-01 2022-12-08 Novartis Ag Cd19 and cd22 chimeric antigen receptors and uses thereof
WO2024040980A1 (zh) * 2022-08-25 2024-02-29 深圳市先康达生命科学有限公司 一种慢病毒转染助转剂及转染方法

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