CN105296431B - 肿瘤结合特异性γδTCR基因修饰的αβT细胞及其抑癌用途 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种肿瘤结合特异性γδTCR基因修饰的αβT细胞及其抑癌用途，该αβT细胞表达肿瘤结合特异性γδTCR，所述肿瘤结合特异性γδTCR包括γ4链和δ1链，所述δ1链CDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。实验证明该细胞对多种肿瘤细胞具有细胞毒作用，为肿瘤的过继性免疫治疗提供了新的方法和策略。
Description
技术领域
本发明涉及基因修饰淋巴细胞过继免疫治疗领域。特别涉及一种肿瘤结合特异性γδTCR基因修饰的αβT细胞及其抑癌用途。
背景技术
肿瘤的免疫治疗被人们寄予厚望，其原理是通过利用现代生物技术，人为的调节肿瘤患者机体的免疫功能状态，调控抗肿瘤免疫的各个环节之间的平衡，从而达到控制肿瘤或减少治疗带来的相关毒副作用的目的。在所有目前开发的免疫治疗途径中，细胞的过继免疫治疗通过体外活化和扩增自体或异体免疫效应细胞后输注患者体内，被认为是最有潜力的免疫治疗策略。
在过继免疫治疗中，常用的用于过继回输的天然的细胞有肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)、淋巴因子激活的杀伤细胞(LAK细胞)、自然杀伤细胞(NK细胞)、自然杀伤T细胞(NKT细胞)、细胞因子诱导的杀伤细胞(CIK细胞)、细胞毒性T淋巴细胞(CTL细胞)等。然而，肿瘤抗原特异性强、亲和力好的免疫细胞来源困难、数量较少，而且这些细胞经过体外长时间培养扩增，其体内的持续时间、杀瘤活性未能达到临床应用的需求，在一定程度上制约过继免疫治疗的发展。
基因修饰的免疫细胞是利用基因重组技术，按照需求对天然存在的免疫细胞进行改造，能很好的解决肿瘤特异性和体内持续杀瘤活性的问题。嵌合抗原受体 (Chimericantigen receptor，CAR)修饰的T细胞就属于一类基因修饰的T细胞，它在临床试验治疗B淋巴细胞瘤上取得突破性进展。除CAR-T细胞以外，还有一大类基因修饰的T细胞，是T细胞受体(TCR)修饰的T细胞。应用基因工程技术使所有 T淋巴细胞表达特异性识别肿瘤的TCR分子，能大大提高T细胞的抗肿瘤的能力。
作为T细胞群体的另一类，γδT细胞在抗肿瘤免疫治疗中具有独特的优势：①γδT细胞主要以MHC非限制性方式识别抗原，它克服了αβT细胞抗肿瘤免疫的MHC 限制性的局限；②抗原识别谱广泛，如肽类、非肽类、醇类等，并且可识别αβT 细胞不能识别的抗原，因此，在功能上可作为αβT细胞免疫监视的重要补充；③肿瘤浸润的γδT淋巴细胞表达Fc受体，在TCR-CD3复合体的表达或/和组装上有缺陷时，仍可传递信号，这是αβT细胞所不具备的；④通过细胞毒作用和产生细胞因子来发挥效应功能；⑤识别一些内源性应激抗原，快速活化，杀瘤谱广，对血液***肿瘤和实体瘤均有杀伤作用。
但是，由于在外周血中γδT细胞的比例很低，天然的γδT细胞制剂用于临床肿瘤的过继治疗需要在体外进行较长时间的扩增，才能达到治疗所需的剂量。而中晚期肿瘤患者或化疗后患者体内免疫抑制，导致γδT细胞数量减少和免疫活性下降；鼠源性抗体和牛血清成分的使用会导致回输的细胞引起体内免疫反应等诸多问题，致使治疗用γδT细胞的制备在方法上仍存在一些问题亟待解决。因此，利用基因工程技术，制备足够数量的具有细胞肿瘤反应特异性的、无/低毒性的γδT免疫效应细胞的研究势在必行。
γδT细胞受体(γδTCR)包含γ链(TCRγ)和δ链(TCRδ)，其抗原识别位点主要存在于δ链可变区(Vδ链)的互补决定区(CDR)，其中CDR1和CDR2区是由胚系基因V编码，而CDR3区则是通过V(D)和J基因的体细胞重组形成的。以往的研究结果表明，γδTCR与B细胞受体(BCR)和抗体在结构上高度类似。CDR3 长度分布图表明，抗体重链(H)和TCRδ链CDR3的长度变化最大，且较轻链(L) 和γ链者明显的长。这些结构基础提示与抗体识别抗原过程中抗体重链CDR3序列起着关键识别作用一样，δ链CDR3区(CDR3δ)在γδT细胞识别抗原中也起着关键作用。
已有研究对胃癌患者肿瘤浸润的γδT细胞的CDR3δ进行序列分析，发现了一条不同患者所共有的优势CDR3δ序列，并将其命名为GTM序列。人工合成的GTM 肽能特异性的与多种肿瘤组织、肿瘤细胞系及γδT细胞识别的配体MICA蛋白结合； TCRγ4/δ1(GTM)-Fc融合蛋白也能特异性的与多种肿瘤组织、肿瘤细胞系及MICA 蛋白结合；用含GTM序列的δ1链和γ4链修饰J.RT3-T3.5细胞，能增强其对多种肿瘤细胞的细胞毒活性，这些结果从不同水平上证明了GTM具有肿瘤结合特异性 (Yan Jiang,Yang Guo,Xueyan Xi,Lianxian Cui,and Wei He*,Flanking V and J sequences of complementary determining region 3of T cell receptor(TCR)δ1(CDRδ1) determining the structure and function ofTCRγ4δ1.The J.Biol.Chem,2011,286(29): 25611–25619)。
发明内容
基于以上所述问题，本发明的目的在于提供一种肿瘤结合特异性γδTCR基因修饰的αβT细胞，为肿瘤的过继性免疫治疗提供了新的方法和策略。
申请人前期对胃癌患者肿瘤浸润的γδT细胞的CDR3δ序列进行分析，发现不同个体胃癌的γδTIL的优势CDR3δ序列趋于相同。其中，三例胃癌患者的γδTIL 所共有的优势CDR3δ序列，如前所述，本说明书中，将该优势CDR3δ序列命名为 GTM序列，其氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。
αβT细胞占外周血淋巴细胞比例较高，容易获得，体外扩增时间短，如经CD3 单抗、PHA、CD3-CD28磁珠刺激等方式，短时间内即可获得大量αβT细胞。然而αβT细胞的活化需要抗原提呈细胞的提呈，一对一的针对特异性抗原，有MHC 限制性，并且协同刺激信号缺乏或者抑制性的肿瘤微环境都抑制了αβT细胞的充分快速活化，成为肿瘤免疫逃逸的途径。而γδT细胞能通过γδTCR识别一类在多种肿瘤表达的应激分子，快速活化，启动对靶细胞的细胞毒活性，具有杀瘤谱广及更易于充分活化的特点，在肿瘤的过继免疫治疗的候选细胞中具有独特的优势。
基于此，本发明一方面提供了一种肿瘤结合特异性γδTCR基因修饰的αβT细胞，所述αβT细胞表达肿瘤结合特异性γδTCR，所述肿瘤结合特异性γδTCR包括γ4 链和δ1链，所述δ1链CDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。
在本说明书中将肿瘤结合特异性γδTCR基因修饰的αβT细胞命名为γ4δ1(GTM)-αβT细胞。将该αβT细胞表达的肿瘤结合特异性γδTCR命名为γ4δ1(GTM)TCR。
优选地，所述γ4链的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示，所述δ1链的氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示。
可选地，所述αβT细胞是通过可表达所述肿瘤结合特异性γδTCR的表达载体感染或转染所得。
优选地，所述表达载体是重组慢病毒。
优选地，所述重组慢病毒的出发载体是pCDH-CMV-MCS-EF1-copGFP，***该出发载体的表达所述肿瘤结合特异性γδTCR的基因序列如SEQ ID NO:4所示，该基因是将所述γ4链的基因片段、CMV启动子的基因片段、所述δ1链的基因片段，通过限制性内切酶酶切和连接反应串联而得。
可选地，所述肿瘤结合特异性γδTCR基因修饰的αβT细胞经肿瘤细胞蛋白刺激后，IL-2和IFN-γ分泌增加。
可选地，所述肿瘤结合特异性γδTCR基因修饰的αβT细胞通过穿孔素/颗粒酶途径对肿瘤细胞起细胞毒作用。
可选地，所述的肿瘤结合特异性γδTCR基因修饰的αβT细胞是无自身免疫反应的细胞。
本发明另一方面提供了上述肿瘤结合特异性γδTCR基因修饰的αβT细胞在制备抗肿瘤细胞制剂中的用途,或者在制备含IL-2的抗肿瘤细胞制剂中的用途。
可选地，所述的肿瘤是肝细胞癌、胃癌、髓系白血病。
本发明研究发现，上述肿瘤结合特异性γδTCR基因修饰的αβT细胞与肿瘤细胞共孵育后，在体外其IL-2和IFN-γ的分泌大大增加，同时，对多种肿瘤细胞的细胞毒活性也显著性增强，颗粒酶B的表达显著增加，表明上述细胞能够被肿瘤抗原活化，且具有抗肿瘤作用。同时，上述细胞回输不会引起自身免疫反应。体内研究发现，通过荷人肝细胞癌移植瘤裸鼠模型，肿瘤局部注射所述细胞，肿瘤的生长明显受到抑制。
综上，所述细胞具有广泛的抗肿瘤作用，如针对肝细胞癌、胃癌、髓系白血病等。并且，不存在外源TCRγδ和内源TCRαβ的交叉互配情况，对正常细胞没有细胞毒活性，没有自身反应性风险，具有获得较佳的治疗效果，可以应用于制备抗肿瘤细胞制剂。为肿瘤的过继性免疫治疗提供了新的方法和策略。
附图说明
图1A-图1F：γ4δ1(GTM)-αβT细胞的构建
图1A：CDR3δ序列是GTM的基因工程γ4δ1(GTM)TCR分子示意图。图1B：包含特定具有肿瘤结合特异性的CDR3δ序列GTM的完整γ4δ1(GTM)TCR重组慢病毒载体pCDH-δ1TCR-CMV-γ4TCR结构示意图。图1C：全长γ4和δ1链及CMV 的PCR扩增电泳图。M，分子量marker；左图：全长γ4链，目的片段975bp；中图：全长δ1链，目的片段864bp；右图：全长CMV启动子，目的片段589bp。图 1D：δ1TCR-CMV-γ4TCR全长的PCR扩增电泳图。M，分子量marker，目的片段 bp。图1E：Western blotting检测γ4δ1(GTM)TCR的表达。1为转染 pCDH-δ1TCR-CMV-γ4TCR重组质粒的293T细胞蛋白提取物；2：为转染空载体的细胞蛋白提取物(阴性对照)。δ1链分子量为36KD。图1F：慢病毒感染的αβT 细胞表面外源γ4δ1(GTM)TCR的表达情况。左：同型对照；中：空载体对照；右：γ4δ1(GTM)-αβT细胞。双阳性细胞比例为35.9％。
图2A-图2F3：γ4δ1(GTM)-αβT细胞的体外肿瘤杀伤功能检测
图2A：γ4δ1(GTM)-Fc分子结构示意图。图2B1-图2B3：流式检测γ4δ1(GTM)-Fc 分子与HepG2(图2B1)、BGC-803(图2B2)和K562(图2B3)细胞的结合情况。对照分子为无关的hIgG-Fc。图2C1-图2C3：激光共聚焦显微镜检测γ4δ1(GTM)-Fc 分子与HepG2(图2C1)、BGC-803(图2C2)和K562(图2C3)细胞的结合情况。对照分子为无关的hIgG-Fc。图2D：LDH法检测γ4δ1(GTM)-αβT细胞对肿瘤细胞的细胞毒活性。γ4δ1(GTM)-αβT细胞和空载体对照细胞为效应细胞，与肿瘤细胞 (HepG2、BGC-803和K562)在不同的效靶比37℃孵育6小时，计算各组杀伤效率。*，p<0.05vs空载体对照；**，p<0.01vs空载体对照。图2E1-图2E2：γ4δ1(GTM)-αβT细胞与肿瘤细胞接触后杀伤相关分子的表达情况检测。用流式细胞技术检测了与肿瘤细胞接触后γ4δ1(GTM)-αβT细胞及对照细胞表面的FasL(图 2E1)和胞内的颗粒酶B(Granzyme B)(图2E2)的表达情况。图2F1-图2F3：γ4δ1(GTM)-αβT细胞与肿瘤细胞接触后细胞因子分泌情况检测。流式细胞技术所检测的细胞因子依次是IL-2(图2F1)，IFN-γ(图2F2)和IL-4(图2F3)。左行为对照细胞，右行为γ4δ1(GTM)-αβT细胞。
图3A1-图3D4：γ4δ1(GTM)-αβT细胞的自身反应性研究
图3A1-图3A3：外源γ4和δ1链与内源TCRαβ交叉互配检测。分别以 pCDH-δ1TCR和pCDH-γ4TCR感染αβT细胞，用流式检测感染细胞表面γδTCR 的表达情况。左行：空载体对照，右行：实验组，依次为感染pCDH-δ1TCR(图 3A1)、pCDH-γ4TCR(图3A2)以及感染pCDH-δ1TCR-CMV-γ4TCR(阳性对照) (图3A3)。图3B1-图3B4：γ4δ1(GTM)–Fc分子与正常细胞的结合情况。所用到的正常细胞包括PBMCs(图3B1)，1308.1.86(图3B2)，ccc-HEL-1(图3B3) 和293T(图3B4)细胞。对照分子为无关的hIgG-Fc。图3C：用LDH法检测γ4δ1(GTM)-αβT细胞对正常细胞的细胞毒活性。ns：没有统计学差异。图3D1-图 3D4：γ4δ1(GTM)-αβT细胞与正常细胞作用后IFN-γ的表达情况。上行为对照细胞，下行为γ4δ1(GTM)-αβT细胞。所用到的正常细胞包括PBMCs(图3D1)，1308.1.86 (图3D2)，ccc-HEL-1(图3D3)和293T(图3D4)细胞。
图4A-图4C：γ4δ1(GTM)-αβT细胞体内抗肿瘤作用
HepG2细胞细胞接种后，待皮下肿瘤结节长到100mm3左右，将裸鼠随机分成两个实验组，治疗组：瘤内注射γ4δ1(GTM)-αβT细胞；空载体组：瘤内注射空载体感染的细胞。动物同时给予腹腔注射IL-2 5000U/只，每隔三天治疗一次，共进行四次。每隔3天测量肿瘤大小，计算肿瘤生长抑制率，直至30天，处死老鼠，分离皮下肿瘤。图4A：荷人肝细胞癌裸鼠的皮下肿瘤体积变化情况。箭头处为给予γ4δ1(GTM)-αβT细胞或者对照细胞治疗，**，p<0.01。图4B：给予γ4δ1(GTM)-αβT 细胞治疗组裸鼠肿瘤抑制率曲线。图4C：治疗30天后，荷瘤裸鼠皮下移植瘤大小的照片。
具体实施方式
材料和方法
实验材料：
1、细胞培养
HepG2:人肝肿瘤细胞系，以含10％FCS的DMEM培养基进行贴壁培养； BGC-803：人胃腺癌细胞系，以含10％FCS的DMEM培养基进行贴壁培养；K562，髓系白血病细胞系；以含10％FCS的RPMI-1640培养基进行悬浮培养；293T： SV40转化的人胚肾上皮细胞系，以含10％胎牛血清的DMEM培养基进行贴壁培养，用于慢病毒的包装；上述细胞系均购自中国医学科学院细胞中心，在本实验室保存。PBMC细胞：通过人淋巴细胞分离液密度梯度离心法从正常人外周血中分离得到，用于分选αβT细胞。
2、动物
BALB/c裸小鼠，鼠龄4～6周，体重15～20g，雌性，购于生物制品检定所动物中心，于中国医学科学院基础医学研究所实验动物中心无特定病原体(specific pathogenfree，SPF)条件下的层流架中饲养。
3、菌株和质粒载体
大肠杆菌DH5α，购自宝生物工程有限公司。基因型为：supE44ΔlacU169hsdR17 recA1 end1 gyr96 thi-1 relA1,用于质粒的扩增与转化。
pCDH-CMV-MCS-EF1-copGFP：用于构建外源基因δ1TCR(即δ1链)和γ4TCR (即γ4链)的慢病毒重组表达载体，该质粒为本实验保存。psPAX2和PMD2.G:分别为慢病毒包装***中的包装质粒和包膜质粒，由中国医学科学院基础医学研究所张业教授课题组馈赠。
pREP7-γ4TCR质粒和pREP9-δ1(GTM)TCR质粒:γ4TCR和δ1TCR基因来源，由本实验室姜燕博士提供。引自文献：Yan Jiang,Yang Guo,Xueyan Xi,Lianxian Cui, and WeiHe*,Flanking V and J sequences of complementary determining region 3 of Tcell receptor(TCR)δ1(CDRδ1)determining the structure and function of TCRγ4δ1.The J.Biol.Chem,2011,286(29):25611–25619。
4、引物(见表1)
表1.用于扩增γ4δ1(GTM)TCR的γ4链和δ1链基因全长的引物
以上引物由北京擎科公司合成。
实验方法：
1、重组慢病毒载体的构建
(1)TCR的γ4链、δ1链及CMV基因全长的PCR。
以pREP9δ1、pCDH-CMV-MCS-EF1-copGFP和pREP7γ4质粒为模板，PCR 扩增δ1链(氨基酸序列如SEQ ID NO:3 ；基因序列如SEQ ID NO:6所示)、巨细胞病毒启动子序列(Cytomegalovirus promoter,CMV)(其基因序列如SEQ ID NO: 5所示)和γ4链基因全长(其氨基酸序列如SEQ ID NO:2 所示；基因序列如SEQ ID NO:7所示)。
(2)PCR产物的纯化。
(3)pCDH-CMV-MCS-EF1-copGFP载体和PCR产物酶切反应。
(4)酶切产物纯化及连接反应。
酶切后的全长γ4链和δ1链基因片段分别与酶切的载体连接，中间间隔一个CMV序列，构建成重组质粒pCDH-δ1TCR-CMV-γ4TCR(***慢病毒载体的δ1TCR-CMV-γ4TCR基因序列如SEQ ID NO:4所示)。
(5)重组质粒的转化及阳性筛选。
(6)质粒DNA的小量制备。
(7)重组质粒的酶切鉴定。
(8)DNA片段的序列分析。
将酶切鉴定证明含有目的DNA***的重组质粒进行DNA序列测定(由诺塞生物技术公司完成)。用DNAMAN软件分析测序结果。
2、慢病毒表达质粒pCDH-δ1TCR-CMV-γ4TCR相应目的蛋白表达检测
(1)慢病毒表达质粒转染，按照Invitrogen Lipofectamine 2000的说明操作，将重组载体转入293T细胞。
(2)荧光显微镜观察GFP的表达。
(3)Western blotting检测δ1TCR蛋白的表达。
3、慢病毒包装
(1)质粒大量提取纯化。
按照Vigorous质粒大量提取纯化试剂盒的说明，大量提取重组载体 pCDH-δ1TCR-CMV-γ4TCR，空载体pCDH，以及病毒包装载体pMD2.G和psPAX2。
(2)慢病毒包装和纯化。
按照Invitrogen Lipofectamine 2000的说明，分别共转染重组载体 pCDH-δ1TCR-CMV-γ4TCR和病毒包装载体，以及空载体pCDH和病毒包装载体到 293T细胞中，收集培养上清，纯化病毒颗粒。
4、慢病毒感染αβT细胞及感染后γ4δ1(GTM)TCR表达情况鉴定
(1)αβT细胞的磁珠分选。
按照天津灏洋人淋巴细胞分离液的说明，密度梯度离心，分离健康人外周血单个核细胞。计数后，按照Miltenyi TCRαβ阳性分选试剂盒说明，分离αβT细胞。
(2)慢病毒感染αβT细胞。
将分选得到的αβT细胞在固相化抗CD3抗体刺激活化的环境中培养24小时； 25μl无血清RPMI-1640培养基与4μl慢病毒感染增强剂Envirus轻轻混匀后置于4℃孵育5分钟，在混合液中加入浓缩的慢病毒颗粒并将其置于4℃孵育15分钟；混合液与含有200IU/mlIL-2的细胞悬液(2×106个/ml)混匀，接种到事先包被anti-CD3 抗体的24孔板中，32℃下，培养板1200×g离心120分钟，然后细胞置于37℃、5％ CO2孵箱培养。这个感染过程重复两遍，每隔2～3天更换新鲜的含有200IU/ml IL-2 的完全RPMI-1640培养基继续培养8～10天。
(3)感染后的αβT细胞的鉴定。
空载体对照组与实验组相应的慢病毒感染αβT细胞第7天后，分别收集细胞，用流式细胞技术检测其表面γδTCR的表达情况。
5、γ4δ1(GTM)-αβT细胞体外抗肿瘤功能研究
(1)γ4δ1(GTM)-Fc分子与肿瘤细胞的结合情况。
用流式细胞术与激光共聚焦扫描显微镜检测γ4δ1(GTM)-Fc分子与HepG2、 BGC-803和K562细胞的结合情况。
(2)乳酸脱氢酶释放法(Lactate dehydrogenase,LDH)检测γ4δ1(GTM)-αβT 细胞对肿瘤细胞的细胞毒活性。
分别制备靶细胞HepG2，BGC-803和K562和效应细胞空载体感染的αβT细胞和γ4δ1(GTM)-αβT细胞。调整效应细胞浓度，按不同效靶比(10：1，20：1， 40：1)加入50μl效应细胞；同时设靶细胞自发释放组、靶细胞最大释放组、效应细胞自发释放组以及只加培养基的空白对照组；每组均设4个复孔；平板于室温400×g离心3分钟，然后置于37℃，5％CO2共孵育6小时。按照Promega cytoTox 非放射性细胞毒性检测试剂盒说明，检测计算各组的杀伤效率。
(3)γ4δ1(GTM)-αβT细胞与肿瘤细胞接触后杀伤相关分子的表达情况检测。
效应细胞、靶细胞制备及效靶混合如前所述。用流式细胞技术检测作用后效应细胞表面的FasL和胞内Granzyme B的变化。
(4)γ4δ1(GTM)-αβT细胞与肿瘤细胞接触后细胞因子分泌情况检测。
分别制备靶细胞HepG2和效应细胞空载体感染的αβT细胞和γ4δ1(GTM)-αβT 细胞。调整效应细胞浓度，按效靶比3:1加入100μl效应细胞并添加蛋白转运抑制剂BFA(1000X)，同时设对照组和实验组；将平板于400×g离心3分钟。而后置于37℃，5％CO2共孵育8小时；收集细胞，破膜固定，用流式细胞技术检测效应细胞胞内细胞因子IL-2，IFN-γ和IL-4的表达变化。
6、γ4δ1(GTM)-αβT细胞自身反应性检测
(1)外源γ4和δ1链与内源TCRαβ交叉互配检测。
以pREP7-γ4TCR质粒和pREP9-δ1(GTM)TCR质粒为模板，PCR构建分别包含γ4和δ1链的重组慢病毒载体pCDH-δ1TCR和pCDH-γ4TCR。分别包装病毒，并感染αβT细胞，用流式细胞技术检测病毒感染细胞表面γδTCR的表达情况。上述过程如前所述。
(2)γ4δ1(GTM)-αβT细胞对正常细胞的反应性研究。
用流式细胞术检测γ4δ1(GTM)-Fc与正常细胞，包括PBMCs，1308.1.86， ccc-HEL-1和293T细胞的结合情况；用LDH法检测γ4δ1(GTM)-αβT细胞对这些细胞的细胞毒活性，以及用流式细胞技术检测γ4δ1(GTM)-αβT细胞在与这些细胞作用后IFN-γ的表达情况。上述过程如前所述。
7、γ4δ1(GTM)-αβT细胞体内抗肿瘤作用研究
建立了荷人肝癌细胞HepG2移植瘤裸鼠模型。将HepG2细胞用0.25％胰酶消化计数后，用PBS洗涤3次，悬于PBS中，接种在裸鼠右肩背部皮下(1×106，100μl体积)。待肿瘤结节长到100mm3左右，将裸鼠随机分成两组。治疗组，瘤内注射γ4δ1(GTM)-αβT细胞(1×106细胞/只)；空载体组，瘤内注射空载体感染的同样数目的αβT细胞，每隔三天治疗一次，共进行四次。动物同时给予腹腔注射IL-2 5000U/ 只。每隔3天测量肿瘤大小，计算肿瘤生长抑制率，直至30天，处死老鼠，分离皮下肿瘤。肿瘤大小计算公式为：瘤体体积(mm3)＝a×b2×0.5。a：瘤体长径(mm)， b：瘤体短径(mm)。肿瘤抑制率计算公式为：(对照组的肿瘤体积-实验组的肿瘤体积)/对照组的肿瘤体积。
实施例1：重组慢病毒载体pCDH-δ1TCR-CMV-γ4TCR的构建
由于GTM序列具有肿瘤结合特异性，本发明将其放入完整的δ1链中，替代原有的CDR3δ序列，再与完整的γ4链组合，形成完整的γ4δ1(GTM)TCR分子(图1A)，使其表达于αβT细胞表面，这种包含肿瘤结合特异性CDR3δ序列(GTM)的γ4δ1(GTM)TCR基因修饰的αβT淋巴细胞将会具有GTM相似的肿瘤结合特异性，能用于肿瘤的过继免疫治疗。
为了使外源的γ4链和δ1链在αβT淋巴细胞中表达水平相当，以便成功组合，形成完整的γ4δ1(GTM)TCR分子，本发明将完整γ4链和δ1链(CDR3δ序列为GTM)的基因片段串联在一个慢病毒载体上，因为载体上含有一个CMV启动子，因此在两个基因片段中间又***一个CMV启动子，构建重组慢病毒载体 pCDH-δ1TCR-CMV-γ4TCR(图1B)。
分别以pREP9δ1、pCDH-CMV-MCS-EF1-copGFP和pREP7γ4质粒为模板，PCR 扩增δ1链、CMV和γ4链基因片段(图1C)，通过特定限制性内切酶酶切和连接反应，将三个基因片段顺次连接，***到慢病毒载体pCDH-CMV-MCS-EF1-copGFP 中，得到重组慢病毒载体pCDH-δ1TCR-CMV-γ4TCR。经过酶切鉴定显示， pCDH-δ1TCR-CMV-γ4TCR载体构建成功(图1D)。
实施例2：重组慢病毒载体pCDH-δ1TCR-CMV-γ4TCR相应目的蛋白γ4δ1(GTM)TCR分子表达检测
将实施例1得到的重组慢病毒载体pCDH-δ1TCR-CMV-γ4TCR转入293T细胞，荧光显微镜观察GFP表达，并收集细胞，裂解，用Western blotting检测全细胞裂解液中δ1TCR的表达情况。结果如图1E所示，以鼠抗人δ1的单克隆抗体为一抗， HRP酶标羊抗鼠抗体作为二抗，与空载体对照相比，δ1TCR蛋白在293T细胞中得到了很好的表达。进而证明γ4δ1(GTM)TCR分子在293T细胞中表达。
实施例3：慢病毒感染αβT细胞及感染后αβT细胞的γ4δ1(GTM)TCR表达情况鉴定
将实施例1中得到的重组慢病毒载体pCDH-δ1TCR-CMV-γ4TCR包装为重组慢病毒。
分离健康人PBMC，分选αβT细胞，并在固相化抗CD3抗体刺激活化的环境中，使用上述重组慢病毒进行感染。感染后第7天，收集细胞，用流式细胞技术检测其表面γ4δ1(GTM)TCR的表达情况。如图1F所示，与空载体感染对照相比，35.9％的αβT细胞同时表达γ4δ1(GTM)TCR，即成功获得表达肿瘤结合特异性γδTCR基因修饰的αβT细胞，即γ4δ1(GTM)-αβT细胞。
实施例4：γ4δ1(GTM)-αβT细胞体外生物学功能鉴定
1)γ4δ1(GTM)-Fc分子与肿瘤细胞的结合情况
γ4δ1(GTM)-αβT细胞对肿瘤杀伤的前提是γ4δ1(GTM)TCR与肿瘤细胞表面相应肿瘤相关抗原的结合。表达了γ4δ1(GTM)-Fc分子(图2A)，将γ4δ1(GTM)TCR胞外区与抗体Fc分子相连，并检测其与肿瘤细胞的结合情况。流式细胞技术(图2B1- 图2B3)和激光扫描共聚焦显微镜(图2C1-图2C3)的结果均显示，与同型对照组(hIgG1-Fc)相比，γ4δ1(GTM)-Fc与HepG2、BGC-803及K562肿瘤细胞都能特异性的结合。
2)γ4δ1(GTM)-αβT细胞对肿瘤细胞的细胞毒活性
以HepG2、BGC-803及K562细胞为靶细胞，以实施例3中所获得的γ4δ1(GTM)-αβT细胞为效应细胞，用LDH法检测γ4δ1(GTM)-αβT细胞对靶细胞的杀伤活性(以杀伤率表示)，结果如图2D所示。与空载体对照细胞相比，γ4δ1(GTM)-αβT细胞对这些肿瘤细胞的杀伤效率都显著提高。
3)γ4δ1(GTM)-αβT细胞对肿瘤细胞的杀伤途径
γδT细胞对肿瘤细胞的杀伤主要通过两条途径：Fas-FasL途径和穿孔素-颗粒酶途径。采用流式细胞术检测与HepG2孵育后γ4δ1(GTM)-αβT细胞FasL和 Granzyme B的表达情况。结果显示，与肿瘤细胞孵育后，γ4δ1(GTM)-αβT细胞的 FasL表达水平与空载体对照细胞没有差异，而Granzyme B的表达水平(40.7％) 明显高于对照组(25.7％)(图2E1-图2E2)，表明γ4δ1(GTM)-αβT细胞是通过穿孔素-颗粒酶途径发挥对肿瘤的杀伤。
4)γ4δ1(GTM)-αβT细胞细胞因子的分泌能力
除了直接发挥细胞毒活性以外，γδT细胞的抗肿瘤免疫功能还包括分泌细胞因子。用流式细胞技术检测了在与肿瘤细胞HepG2接触8小时后，γ4δ1(GTM)-αβT 细胞细胞因子的分泌能力，细胞因子包括子IL-2，IFN-γ和IL-4。结果如图2F1-2F3 所示，γ4δ1(GTM)-αβT细胞分泌IL-2，IFN-γ能力显著高于空载体对照细胞，而IL-4 的分泌能力两者没有显著性差异。
实施例5：γ4δ1(GTM)-αβT细胞自身反应性检测
1)外源γ4和δ1链与内源TCRαβ交叉互配检测
研究表明，外源α链和β链与αβT细胞中内源的TCRαβ会发生交叉互配，这种交叉互配形成的新型TCR极可能引起自身免疫反应。如果外源γ4δ1(GTM)TCR 受体在αβT细胞中表达时也出现类似的交叉互配现象，就有可能引起自身反应性。因此，用外源δ1链和γ4链分别修饰αβT细胞，检测细胞表面是否有γδ(GTM)TCR 表达。结果如图3A1-图3A3所示，δ1TCR修饰的αβT细胞和γ4TCR链修饰的αβT 细胞都检测不到γδTCR的表达，而pCDH-δ1TCR-CMV-γ4TCR修饰的αβT细胞作为阳性对照，能检测到γδTCR的表达，说明外源δ1链或γ4链不与αTCR链或βTCR 链发生交叉互配，形成完整的TCR分子，被运送到细胞膜表面，因此γ4δ1(GTM)-αβT细胞没有产生新的TCR而带来的自身免疫反应风险。
2)γ4δ1(GTM)-αβT细胞对正常细胞的反应性研究
除了交叉互配以外，外源的γδTCR本身如果能与正常细胞结合，也会引起γ4δ1(GTM)-αβT细胞的自身反应性。首先用流式细胞术检测γ4δ1(GTM)-Fc分子与正常细胞，包括PBMCs,1308.1.86,ccc-HEL-1和293T细胞的结合情况。结果如图 3B1-图3B4所示，γ4δ1(GTM)-Fc分子不与正常细胞结合。与空载体对照细胞相比，γ4δ1(GTM)-αβT细胞对正常细胞的杀伤作用没有改变(图3C)，而且在与正常细胞共孵育后，γ4δ1(GTM)-αβT细胞分泌IFN-γ的能力也没有显著提高(图3D1-图 3D4)。
实施例6：γ4δ1(GTM)-αβT细胞体内抗肿瘤作用
建立了荷人肝癌细胞HepG2移植瘤裸鼠模型。待肿瘤结节长到100mm3左右，将裸鼠随机分成两组。治疗组，瘤内注射γ4δ1(GTM)-αβT细胞(1×106细胞/只)；空载体组，瘤内注射空载体感染的同样数目的αβT细胞，每隔三天治疗一次，共进行四次。动物同时给予腹腔注射IL-2 5000U/只。图4A显示了不同组裸鼠的皮下肿瘤体积变化情况，γ4δ1(GTM)-αβT细胞治疗组裸鼠的肿瘤显著小于对照组。图4B为计算出的肿瘤生长抑制率曲线。从第3天开始，γ4δ1(GTM)-αβT细胞治疗对肿瘤生长的抑制率就达到40％，并且随着时间推移，增长至70％，并且在30天时间内一直维持在这个水平上。图4C是30天后，处死老鼠，分离到的皮下肿瘤的大小。以上结果充分显示，γ4δ1(GTM)-αβT细胞在体内明显抑制了小鼠肿瘤的生长。
从上面所述可以看出，本发明所提供的肿瘤结合特异性γδTCR基因修饰的αβT 细胞具有广泛的抗肿瘤作用，如肝细胞癌、胃癌、髓系白血病等。并且，不存在外源TCRγδ和内源TCRαβ的交叉互配情况，对正常细胞没有细胞毒活性，没有自身反应性风险，具有获得较佳的治疗效果，可以应用于制备抗肿瘤细胞制剂。为肿瘤的过继性免疫治疗提供了新的方法和策略。
Claims (9)
1.一种肿瘤结合特异性γδTCR基因修饰的αβT细胞，该αβT细胞表达肿瘤结合特异性γδTCR，所述肿瘤结合特异性γδTCR包括γ4链和δ1链，所述δ1链CDR3的氨基酸序列如SEQ IDNO:1所示，所述γ4链的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示，所述δ1链的氨基酸序列如SEQ IDNO:3所示。
2.根据权利要求1所述的肿瘤结合特异性γδTCR基因修饰的αβT细胞，其特征在于，所述αβT细胞是通过可表达所述肿瘤结合特异性γδTCR的表达载体感染或转染所得。
3.根据权利要求2所述的肿瘤结合特异性γδTCR基因修饰的αβT细胞，其特征在于，所述表达载体是重组慢病毒。
4.根据权利要求3所述的肿瘤结合特异性γδTCR基因修饰的αβT细胞，其特征在于，所述重组慢病毒的出发载体是pCDH-CMV-MCS-EF1-copGFP，***该出发载体的表达所述肿瘤结合特异性γδTCR的基因序列如SEQ ID NO:4所示。
5.根据权利要求1-4中任一项所述的肿瘤结合特异性γδTCR基因修饰的αβT细胞，其特征在于，所述αβT细胞经肿瘤细胞蛋白刺激后，IL-2和IFN-γ分泌增加。
6.根据权利要求1-4中任一项所述的肿瘤结合特异性γδTCR基因修饰的αβT细胞，其特征在于，所述αβT细胞通过穿孔素/颗粒酶途径对肿瘤细胞起细胞毒作用。
7.根据权利要求1-4中任一项所述的肿瘤结合特异性γδTCR基因修饰的αβT细胞，其特征在于，所述αβT细胞是无自身免疫反应的细胞。
8.根据权利要求1-4中任一项所述的肿瘤结合特异性γδTCR基因修饰的αβT细胞在制备抗肿瘤细胞制剂中的用途，或者在制备含IL-2的抗肿瘤细胞制剂中的用途。
9.根据权利要求8所述的用途，其特征在于，所述的肿瘤选自肝细胞癌、胃癌、髓系白血病。
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