CN108066805B

CN108066805B - 一种ε-聚赖氨酸仿生抑菌膜及其制备和应用

Info

Publication number: CN108066805B
Application number: CN201611011882.7A
Authority: CN
Inventors: 孙广炜; 刘洋; 张英; 赵姗
Original assignee: Dalian Minhui Lean Technology Co ltd
Current assignee: Dalian Minhui Lean Technology Co., Ltd.
Priority date: 2016-11-17
Filing date: 2016-11-17
Publication date: 2021-06-01
Anticipated expiration: 2036-11-17
Also published as: CN108066805A

Abstract

本发明涉及一种ε‑聚赖氨酸仿生抑菌膜及其制备方法，其特征在于制备含有ε‑聚赖氨酸、壳聚糖、透明质酸、明胶、聚乙烯醇及甘油的成胶水溶液，之后加入交联剂在图案化模板中进行交联反应，获得凝胶，再经过中和、清洗及干燥后即得到ε‑聚赖氨酸仿生抑菌膜。该ε‑聚赖氨酸仿生抑菌膜具有良好的抑菌和保湿特性，另外其组成近似细胞外基质并具有图案化的表面，能促进上皮细胞粘附、生长和迁移。因此，该ε‑聚赖氨酸仿生抑菌膜可作为皮肤创面敷料使用，提高创面修复的效果。

Description

一种ε-聚赖氨酸仿生抑菌膜及其制备和应用

技术领域

本发明涉及再生医学领域，特别涉及一种ε-聚赖氨酸仿生抑菌膜及其制备和应用。

背景技术

皮肤是身体表面包在肌肉外面的组织，是人体最大的器官，它覆盖全身，使体内各种组织和器官免受物理性、机械性、化学性和病原微生物性的侵袭。烧伤、烫伤、创伤是常见的皮肤损伤，这些损伤造成了皮肤局部屏障作用丧失，外界病原菌容易直接进入体内，引起皮肤感染，甚至坏死，大面积的皮肤损伤后果更为严重。

皮肤创面敷料是皮肤损伤常用的治疗手段，其具有吸水、保湿、透气的特点，能够在创面处形成临时屏障，将皮肤创面与外界环境隔开，为皮肤修复提供一个湿润、透气的环境。壳聚糖具有良好的生物相容性和可降解性，并具有一定的抗菌、消炎、止血作用，另外还具有良好的成膜性，因此是皮肤创面敷料的主要原料之一，多种基于壳聚糖的创面修复膜已经上市，如人福医药集团医疗用品有限公司的“壳聚糖医用生物创面修复敷料”、武汉大正高科生物医药有限公司的“苏肤医用壳聚糖创面修复膜”、广东泰宝医疗科技股份有限公司的“壳聚糖功能性敷料”等。然而，目前基于壳聚糖的创面敷料还存在两个严重缺陷：1)壳聚糖广泛存在于自然界，菌群对其具有耐受作用，因此现有敷料的抑菌作用有限；2)敷料组成与界面形貌与细胞外基质相差很大，不能有效引导创面周围的皮肤上皮细胞粘附、生长、迁移及融合。

为了克服上述现有技术的瓶颈，本发明公开了一种ε-聚赖氨酸仿生抑菌膜。ε-聚赖氨酸是一种微生物产生的赖氨酸同聚物，是一种对人体安全无毒的聚阳离子多肽，能够抑制革兰氏阴性细菌、革兰氏阳性菌、真菌等，甚至是某些病毒，抑菌谱广泛，我国、日本、韩国、美国等国家已经将其作为食品防腐剂广泛应用。然而，尽管ε-聚赖氨酸具有很好的抑菌性，但其还未应用于皮肤表面创面敷料上。本发明将ε-聚赖氨酸与壳聚糖复合使用，制备了ε-聚赖氨酸仿生抑菌膜，进一步提高了创面敷料的抑菌性。另外，除了ε-聚赖氨酸与壳聚糖，本发明的仿生抑菌膜还含有透明质酸与明胶。透明质酸是细胞外基质的重要成分之一，而明胶是胶原水解的产物，它具有类似胶原的功能，因此透明质酸与明胶的添加能够使得ε-聚赖氨酸仿生抑菌膜在成分上更加接近细胞外基质，与皮肤亲和性更好，利于皮肤上皮细胞粘附、生长、迁移。此外，本发明的ε-聚赖氨酸仿生抑菌膜还具有图案化表面，进一步改善了敷料的界面特性，能够更好地引导创面周围的皮肤上皮细胞沿膜爬行，进一步促进创面愈合。因此，本发明克服了已有技术的缺陷，在皮肤创面修复领域中将发挥重要作用。

发明内容

本发明公开了一种ε-聚赖氨酸仿生抑菌膜。

本发明的ε-聚赖氨酸仿生抑菌膜通过以下具体技术方案予以制备：制备含有ε-聚赖氨酸、壳聚糖、透明质酸、明胶、聚乙烯醇及甘油的成胶水溶液，之后加入交联剂在图案化模板中进行交联反应，获得凝胶，再经过中和、清洗及干燥后即得到ε-聚赖氨酸仿生抑菌膜。

所述ε-聚赖氨酸的分子量为3000-6000kDa，其在成胶水溶液中的浓度为1-10％(w/v,g/ml)；

所述壳聚糖的分子量为5000-300000kDa，其在成胶水溶液中的浓度为1-10％(w/v,g/ml)；

所述透明质酸的分子量为1000000-4000000kDa，其在成胶水溶液中的浓度为0.1-1％(w/v,g/ml)。

所述明胶，包括碱性明胶、酸性明胶的一种或两种混合；

所述明胶的胶冻强度为大于100Bloom g，其在成胶水溶液中的浓度为3-15％(w/v,g/ml)。

所述聚乙烯醇的聚合度为2-5万，其在成胶水溶液中的浓度为1-5％(w/v,g/ml)；

所述甘油在成胶水溶液中的体积比例为1-10％(v/v)；

所述交联剂为甲醛、戊二醛、京尼平、碳二亚胺的一种；

所述交联剂与成胶水溶液混合后的交联剂浓度为0.01-3％(w/v,g/ml)。

所述图案化模板的材质为聚四氟乙烯；

所述图案化模板为一上端开口、下端密闭的容器，容器的底部表面具有由向上的突起和/或向下凹陷的沟槽构成所需的图案；

所述突起与沟槽的宽度分别为20-100微米，突起的高度与沟槽的深度分别为20-100微米。

所述交联条件为温度18-25℃，湿度50-80％。

所述中和过程为使用0.1M甘氨酸溶液浸泡交联形成的凝胶。

所述干燥的条件为温度18-25℃，湿度20％。

一种ε-聚赖氨酸仿生抑菌膜包括ε-聚赖氨酸、壳聚糖、透明质酸、明胶、聚乙烯醇、甘油及交联剂，其各自质量百分比为2.2-62.1％(w/w)、2.2-62.1％(w/w)、0.2-6.2％(w/w)、6.6-93％(w/w)、2.2-31％(w/w)、2.2-62.1％(w/w)及0.02-18.6％(w/w)。

一种ε-聚赖氨酸仿生抑菌膜作为皮肤表面创面敷料的应用。

本发明的优点

1.本发明将ε-聚赖氨酸与壳聚糖复合使用，制备了ε-聚赖氨酸仿生抑菌膜，进一步提高了膜的抑菌能力；

2.除了ε-聚赖氨酸与壳聚糖，本发明的仿生抑菌膜还含有透明质酸与明胶。透明质酸是细胞外基质的重要成分之一，而明胶是胶原水解的产物，它具有类似胶原的功能，因此透明质酸与明胶的添加能够使得ε-聚赖氨酸仿生抑菌膜在成分上更加接近细胞外基质，与皮肤亲和性更好，利于皮肤上皮细胞粘附、生长、迁移；

3.本发明的ε-聚赖氨酸仿生抑菌膜还具有交叉型图案化表面，进一步改善了膜的界面特性，能够更好地引导创面周围的皮肤上皮细胞沿膜爬行，进一步促进创面愈合。

附图说明

图1为图案化模板底部表面所具有的由向下凹陷的沟槽构成的交叉型图案。

具体实施方式

实施例1：

制备含有10％(w/v,g/ml)ε-聚赖氨酸(分子量为3000kDa)、1％(w/v,g/ml)壳聚糖(分子量为300000kDa)、1％(w/v,g/ml)透明质酸(1000000kDa)、15％(w/v,g/ml)酸性明胶(胶冻强度为150Bloom g)、1％(w/v,g/ml)聚乙烯醇(聚合度为2万)、10％(v/v)甘油的成胶水溶液。之后，在成胶水溶液中加入交联剂戊二醛，戊二醛的终浓度为3％(w/v,g/ml)，并在图案化模板(图1为底部表面图案，沟槽宽度为40微米，沟槽深度为60微米)中进行交联反应，获得凝胶。交联条件为温度23℃，湿度80％。之后，使用0.1M甘氨酸溶液浸泡交联形成的凝胶，进行中和，并用水清洗。然后在温度20℃，湿度20％的环境中进行干燥，获得ε-聚赖氨酸仿生抑菌膜。设置两个对照组：对照组1为不添加ε-聚赖氨酸的膜(常规壳聚糖膜)，其它条件与上述条件一致；对照组2为不添加透明质酸和明胶的膜，其它条件与上述条件一致。

将上述制备的ε-聚赖氨酸仿生抑菌膜及两个对照组膜剪成直径1cm的圆片，利用抑菌圈方法分别统计它们对金黄色葡萄球菌的抑菌环的直径，比较其抑菌能力。另外，制备兔皮肤擦伤模型，将同样形状及尺寸(3×3cm²)的上述ε-聚赖氨酸仿生抑菌膜及两个对照组膜贴附在相同面积(4cm²)及损伤程度的创面上，定期取样观察，记录皮肤愈合的时间。

实验发现，ε-聚赖氨酸仿生抑菌膜、对照组1及对照组2膜对金黄色葡萄球菌的抑菌圈直径分别为8.2cm、2.3cm及7.8cm，说明添加10％(w/v,g/ml)ε-聚赖氨酸的仿生抑菌膜比不添加ε-聚赖氨酸的常规壳聚糖膜具有更好的抑菌能力；而不添加透明质酸和明胶没有显著影响ε-聚赖氨酸仿生抑菌膜的抑菌能力。另外，动物模型实验发现，ε-聚赖氨酸仿生抑菌膜、对照组1及对照组2膜的皮肤创面愈合时间分别为8天、10天及15天，说明添加10％(w/v,g/ml)ε-聚赖氨酸的仿生抑菌膜及不添加ε-聚赖氨酸的常规壳聚糖膜均含有透明质酸和明胶，因此具有同样的支持上皮细胞融合的能力，而不添加透明质酸和明胶的膜创面愈合则明显减慢。

实施例2：

制备含有1％(w/v,g/ml)ε-聚赖氨酸(分子量为6000kDa)、10％(w/v,g/ml)壳聚糖(分子量为5000kDa)、0.1％(w/v,g/ml)透明质酸(4000000kDa)、3％(w/v,g/ml)碱性明胶(胶冻强度为220Bloom g)、5％(w/v,g/ml)聚乙烯醇(聚合度为5万)、1％(v/v)甘油的成胶水溶液。之后，在成胶水溶液中加入交联剂戊二醛，戊二醛的终浓度为0.01％(w/v,g/ml)，并在图案化模板(图1，同实施例1)中进行交联反应，获得凝胶。交联条件为温度25℃，湿度50％。之后，使用0.1M甘氨酸溶液浸泡交联形成的凝胶，进行中和，并用水清洗。然后在温度22℃，湿度20％的环境中进行干燥，获得ε-聚赖氨酸仿生抑菌膜。设置4个对照组：

对照组1为不添加ε-聚赖氨酸的膜(常规壳聚糖膜)，其它条件与上述条件一致；

对照组2为添加0.8％(w/v,g/ml)ε-聚赖氨酸的膜，其它条件与上述条件一致；

对照组3为添加10％(w/v,g/ml)ε-聚赖氨酸的膜，其它条件与上述条件一致。

对照组4为添加12％(w/v,g/ml)ε-聚赖氨酸的膜，其它条件与上述条件一致。

将上述制备的ε-聚赖氨酸仿生抑菌膜及4个对照组膜剪成直径1cm的圆片，利用抑菌圈方法分别统计它们对革兰氏阴性细菌的抑菌环的直径，比较其抑菌性。

实验发现，ε-聚赖氨酸仿生抑菌膜及对照组1-4对革兰氏阴性细菌的抑菌圈直径分别为7.7cm、4.1cm、4.5cm、10.5cm及5.2cm。结果说明：1)添加0.8％(w/v,g/ml)ε-聚赖氨酸的仿生抑菌膜和常规壳聚糖膜具有同样的较低的抑菌能力，均低于添加1％(w/v,g/ml)ε-聚赖氨酸的仿生抑菌膜；2)添加10％(w/v,g/ml)ε-聚赖氨酸的仿生抑菌膜抑菌能力最高，表明在一定范围内膜抑菌能力随着ε-聚赖氨酸浓度的提高而增强；3)而进一步提高ε-聚赖氨酸的浓度反而使得抑菌能力显著降低，即添加12％(w/v,g/ml)ε-聚赖氨酸的仿生抑菌膜的抑菌能力甚至低于添加1％(w/v,g/ml)ε-聚赖氨酸的仿生抑菌膜，这是由于ε-聚赖氨酸浓度过高，导致其与酸性多糖发生了显著的结合效应，反而显著降低了膜的抑菌能力。因此，本发明最优抑菌能力的膜的制备条件为：成胶水溶液中ε-聚赖氨酸的浓度为1-10％(w/v,g/ml)，即干燥后膜中ε-聚赖氨酸的质量百分比为2.2-62.1％(w/w)。

Claims

1.一种ε-聚赖氨酸仿生抑菌膜的制备方法，其特征在于：制备含有ε-聚赖氨酸、壳聚糖、透明质酸、明胶、聚乙烯醇及甘油的成胶水溶液，之后加入交联剂在图案化模板中进行交联反应，获得凝胶，再经过中和、清洗及干燥后即得到ε-聚赖氨酸仿生抑菌膜；

所述ε-聚赖氨酸在成胶水溶液中的重量体积浓度为1-10% g/ml；

所述壳聚糖在成胶水溶液中的重量体积浓度为1-10% g/ml；

所述透明质酸在成胶水溶液中的重量体积浓度为0.1-1% g/ml；

所述明胶在成胶水溶液中的重量体积浓度为3-15% g/ml；

所述聚乙烯醇在成胶水溶液中的重量体积浓度为1-5% g/ml；

所述甘油在成胶水溶液中的体积比例为1-10%；

所述ε-聚赖氨酸的分子量为3000-6000Da，；

所述壳聚糖的分子量为5000-300000Da；

所述透明质酸的分子量为1000000-4000000 Da；

所述明胶的胶冻强度为大于100 Bloom g；

所述聚乙烯醇的聚合度为2-5万；

所述交联剂与成胶水溶液混合后的交联剂重量体积浓度为0.01-3% g/ml；

所述交联条件为温度18-25℃，湿度50-80%。

2.按照权利要求1所述的方法，其特征在于：

所述明胶，包括碱性明胶、酸性明胶的一种或两种混合。

3.按照权利要求1所述的方法，其特征在于：

所述交联剂为甲醛、戊二醛、京尼平、碳二亚胺的一种。

4.按照权利要求1所述的方法，其特征在于：

所述图案化模板的材质为聚四氟乙烯；

5.按照权利要求1所述的方法，其特征在于：

所述中和过程为使用0.1M甘氨酸溶液浸泡交联形成的凝胶。

6.按照权利要求1所述的方法，其特征在于：

所述干燥的条件为温度18-25℃，湿度20%。

7.一种权利要求1-6任一所述方法制备获得的ε-聚赖氨酸仿生抑菌膜。