CN111068102B - 酶促凝血抗菌可控的明胶基水凝胶及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种用皮革废弃物中提取的副产物明胶为原料来制备抗菌凝血可控且具有良好生物相容性和一定自修复性能生物材料的方法。该方法用谷氨酰胺转氨酶对明胶进行改性,并与聚赖氨酸和葫芦脲[7]共混来制备一种满足人体不同环境需求的生物材料。本方法制备过程简单,易于操作,且整个过程没有加入任何有害的化学物质,对环境不会造成二次污染,该生物材料有望在未来具有较好的应用前景。
Description
技术领域
本发明涉及明胶的改性及合成多功能水凝胶的应用领域,尤其涉及一种满足人体不同需求的生物材料的制备方法。
背景技术
一种合格的生物材料往往具有一定的力学性能、自修复性能、抗菌性能以及生物相容性等,设计并合成这种多功能的生物材料仍然是人们的研究热点。到目前为止,已经有很多的多功能生物材料被报导出来,但是,由于人体环境十分复杂,对于人体不同部位和不同需求的生物材料对于抗菌性能以及血液控制等均具有不同的要求。如果抗菌性能过强,可能会对人体产生一定的副作用,而抗菌性过弱则容易引发细菌感染。且细菌感染性疾病是人体常见的疾病之一,因在医疗过程中发生细菌感染而造成患者死亡的数目与日俱增。同样,如果设计出的生物材料凝血性能较强,在某些应用中会导致血栓的发生。而如果凝血性能过弱,则在某些应用中会存在伤口无法愈合的隐患。因此,设计出可以通过调控而满足人体不同需求的多功能生物材料仍然存在巨大的挑战。
发明内容
本发明的目的在于对明胶基抗菌水凝胶的抗菌性和凝血性进行可控的调节,以便根据实际需求制备出具有特定强度的杀菌能力的抗菌水凝胶。
本发明涉及一种基于皮革废弃物中提取的明胶为原料制备的凝血抗菌可控的生物材料的合成方法。该方法基于可以与明胶分子链上的活性基团氨基、酰胺键反应的官能团在谷氨酰胺转氨酶的作用下实现交联以此对明胶进行改性,并与阳离子聚合物聚赖氨酸和大环笼状化合物葫芦脲混合,通过调控葫芦脲与聚赖氨酸的摩尔比,实现所制备生物材料的抗菌凝血可控。
为实现上述目的,本发明采用技术方案的主要原理是:
1)在谷氨酰胺转氨酶的特异性识别作用下,明胶分子链上的活性基团氨基和酰胺基交联形成多肽交联网络。
2)通过调控葫芦脲与聚赖氨酸的摩尔比,制备出不同抗菌凝血性能的水凝胶材料。
进一步地,所述特异性谷氨酰胺转氨酶的酶活为100~200 u/g,该酶能将明胶侧链上的赖氨酸与谷氨酰胺进行连接,实现明胶分子内和分子间的交联改性。
具体地,一种酶促凝血抗菌可控的明胶基水凝胶生物材料的制备方法,包括以下步骤:
步骤1:将明胶用磷酸盐缓冲液溶解,得到明胶水溶液。
步骤2:将葫芦脲与聚赖氨酸按照一定的摩尔比混合,并用磷酸盐缓冲液溶解,并使用超声分散均匀,得到混合溶液。
步骤3:将谷氨酰胺转氨酶用磷酸盐缓冲液溶解,得到酶溶液。
步骤4:将步骤1得到的明胶溶液和步骤2的混合溶液相混合,并滴加步骤3的酶溶液,在适宜的温度中反应直至成为凝胶。
所述的反应温度为37℃~60℃,所述的反应时间为2~10 h。
反应所需的葫芦脲为葫芦脲[8]或葫芦脲[7]。
反应所需的聚赖氨酸分子量小于5000。
所述明胶为分子量3000~10,000的食品级明胶。
所用溶剂为磷酸盐缓冲溶液,其pH为5~8。
与现有技术相比,本发明具有以下优点:
1)本发明方法制备的酶促凝血抗菌可控的明胶基水凝胶采用谷氨酰胺转氨酶对明胶进行改性,相比与物理改性,酶改性的明胶机械强度更高,化学稳定性更好,相比于化学改性,酶改性生物相容性更好,对生物体无毒无害,体现了绿色化学的理念。
2)本发明方法制备的酶促凝血抗菌可控的明胶基水凝胶含有阳离子聚合物,阳离子,避免了使用抗生素带来的耐药性风险。
3)本发明方法制备的酶促凝血抗菌可控的明胶基水凝胶中含有动态化学键,具有一定的自修复性,水凝胶破损后能够在氢键和化学键的作用下实现自我修复,延长了材料的使用寿命。
4)本发明方法制备的酶促凝血抗菌可控的明胶基水凝胶中采用皮革废弃物中提取的明胶为原料,成本低,有效的减少了环境污染,并且能带来一定的经济效益,实现了皮革的资源化利用。
5)本发明方法制备的酶促凝血抗菌可控的明胶基水凝胶中通过控制加入葫芦量的多少来调节聚赖氨酸表面的正电荷数目,以此来控制水凝胶的抗菌性能和凝血性能来满足人体不同环境的需求。
6)本发明方法制备的酶促凝血抗菌可控的明胶基水凝胶制备工艺简单,易于操作,且合成的水凝胶对生物体无毒无害,有良好的生物相容性和生物可降解性,符合清洁化生产的理念。这种优异的性能有望在生物组织工程领域有潜在的应用。
附图说明
图1为葫芦脲与聚赖氨酸不同摩尔比时水凝胶对大肠杆菌的抗菌性图;
图2为葫芦脲与聚赖氨酸不同摩尔比时水凝胶对对金黄色葡萄球菌的抗菌性图。
图3为葫芦脲[7]、聚赖氨酸和葫芦脲[7]和聚赖氨酸混合后的核磁共振氢谱图。
图4为葫芦脲与聚赖氨酸不同摩尔比时的凝血性图。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步详细说明,但是本发明不局限于以下实施例。
实施例1:
1)称取明胶5 g于离心管中,加入1.5 ml磷酸盐缓冲溶液,置于恒温水浴锅中,调整温度为50℃,并搅拌至完全溶解得到明胶溶液;
2)称取葫芦脲[7]0.04 g与聚赖氨酸0.02 g于离心管中,加入2 ml磷酸盐缓冲液溶解,将混合溶液置于超声中10 min,使之分散均匀;
3)称取0.04 g谷氨酰胺转氨酶于离心管中,加入1 ml磷酸盐缓冲液溶解,得到谷氨酰胺转氨酶溶液;
4)将步骤1)获得的明胶溶液与步骤2)获得的混合溶液相混合,并搅拌使之混合均匀;
5)将步骤3)得到的酶溶液加入上述混合均匀的步骤4)溶液中,并搅拌使之混合均匀,并将上述溶液转移到水凝胶模具中,置于恒温振荡器中,调整温度为45℃,反应8 h,得到水凝胶材料。
实施例2:
1)称取明胶5 g于离心管中,加入1.5 ml磷酸盐缓冲溶液,置于恒温水浴锅中,调整温度为50℃,并搅拌至完全溶解得到明胶溶液;
2)称取聚赖氨酸0.02 g于离心管中,加入2 ml磷酸盐缓冲液溶解,得到聚赖氨酸溶液;
3)称取0.04 g谷氨酰胺转氨酶于离心管中,加入1 ml磷酸盐缓冲液溶解,得到谷氨酰胺转氨酶溶液;
4)将步骤1)获得的明胶溶液与步骤2)获得的聚赖氨酸溶液相混合,并搅拌使之混合均匀;
5)将步骤3)得到的酶溶液加入上述混合均匀的步骤4)溶液中,并搅拌使之混合均匀,并将上述溶液转移到水凝胶模具中,置于恒温振荡器中,调整温度为45℃,反应8 h,得到水凝胶材料。
实施例3:
1)称取明胶5 g于离心管中,加入1.5 ml磷酸盐缓冲溶液,置于恒温水浴锅中,调整温度为50℃,并搅拌至完全溶解得到明胶溶液;
2)称取葫芦脲[7]0.06 g与聚赖氨酸0.02 g于离心管中,加入2 ml磷酸盐缓冲液溶解,将混合溶液置于超声中10 min,使之分散均匀;
3)称取0.04 g谷氨酰胺转氨酶于离心管中,加入1 ml磷酸盐缓冲液溶解,得到谷氨酰胺转氨酶溶液;
4)将步骤1)获得的明胶溶液与步骤2)获得的混合溶液相混合,并搅拌使之混合均匀;
5)将步骤3)得到的酶溶液加入上述混合均匀的步骤4)溶液中,并搅拌使之混合均匀,并用将上述溶液转移到水凝胶模具中,置于恒温振荡器中,调整温度为45℃,反应8 h,得到水凝胶材料。
实施例4:
1)称取明胶5 g于离心管中,加入1.5 ml磷酸盐缓冲溶液,置于恒温水浴锅中,调整温度为50℃,并搅拌至完全溶解得到明胶溶液;
2)称取葫芦脲[7]0.018 g与聚赖氨酸0.02 g于离心管中,加入2 ml磷酸盐缓冲液溶解,将混合溶液置于超声中10 min,使之分散均匀;
3)称取0.04 g谷氨酰胺转氨酶于离心管中,加入1 ml磷酸盐缓冲液溶解,得到谷氨酰胺转氨酶溶液;
4)将步骤1)获得的明胶溶液与步骤2)获得的混合溶液相混合,并搅拌使之混合均匀;
5)将步骤3)得到的酶溶液加入上述混合均匀的步骤4)溶液中,并搅拌使之混合均匀,并将上述溶液转移到水凝胶模具中,置于恒温振荡器中,调整温度为45℃,反应8 h,得到水凝胶材料。
实施例5:
1)称取明胶5 g于离心管中,加入1.5 ml磷酸盐缓冲溶液,置于恒温水浴锅中,调整温度为50℃,并搅拌至完全溶解得到明胶溶液;
2)称取0.04 g谷氨酰胺转氨酶于离心管中,加入1 ml磷酸盐缓冲液溶解,得到谷氨酰胺转氨酶溶液;
3)将步骤2)得到的酶溶液加入步骤1)得到的明胶溶液中,并搅拌使之混合均匀,并将上述溶液转移到水凝胶模具中,置于恒温振荡器中,调整温度为45℃,反应8 h,得到水凝胶材料。
实施例6:
1)称取明胶5 g于离心管中,加入1.5 ml磷酸盐缓冲溶液,置于恒温水浴锅中,调整温度为50℃,并搅拌至完全溶解得到明胶溶液;
2)称取葫芦脲[8]0.04 g与聚赖氨酸0.02 g于离心管中,加入2 ml磷酸盐缓冲液溶解,将混合溶液置于超声中10 min,使之分散均匀;
3)称取0.04 g谷氨酰胺转氨酶于离心管中,加入1 ml磷酸盐缓冲液溶解,得到谷氨酰胺转氨酶溶液;
4)将步骤1)获得的明胶溶液与步骤2)获得的混合溶液相混合,并搅拌使之混合均匀;
5)将步骤3)得到的酶溶液加入上述混合均匀的步骤4)溶液中,并搅拌使之混合均匀,并将上述溶液转移到水凝胶模具中,置于恒温振荡器中,调整温度为45℃,反应8 h,得到水凝胶材料。
实施例7:
1)称取明胶5 g于离心管中,加入1.5 ml磷酸盐缓冲溶液,置于恒温水浴锅中,调整温度为50℃,并搅拌至完全溶解得到明胶溶液;
2)称取葫芦脲[8]0.04 g与聚赖氨酸0.02 g于离心管中,加入2 ml磷酸盐缓冲液溶解,将混合溶液置于超声中10 min,使之分散均匀;
3)称取0.04 g谷氨酰胺转氨酶于离心管中,加入1 ml磷酸盐缓冲液溶解,得到谷氨酰胺转氨酶溶液;
4)将步骤1)获得的明胶溶液与步骤2)获得的混合溶液相混合,并搅拌使之混合均匀;
5)将步骤3)得到的酶溶液加入上述混合均匀的步骤4)溶液中,并搅拌使之混合均匀,并将上述溶液转移到水凝胶模具中,置于恒温振荡器中,调整温度为50℃,反应8 h,得到水凝胶材料。
实施例8:
1)称取明胶5 g于离心管中,加入1.5 ml磷酸盐缓冲溶液,置于恒温水浴锅中,调整温度为50℃,并搅拌至完全溶解得到明胶溶液;
2)称取葫芦脲[8]0.06 g与聚赖氨酸0.02 g于离心管中,加入2 ml磷酸盐缓冲液溶解,将混合溶液置于超声中10 min,使之分散均匀;
3)称取0.04 g谷氨酰胺转氨酶于离心管中,加入1 ml磷酸盐缓冲液溶解,得到谷氨酰胺转氨酶溶液;
4)将步骤1)获得的明胶溶液与步骤2)获得的混合溶液相混合,并搅拌使之混合均匀;
5)将步骤3)得到的酶溶液加入上述混合均匀的步骤4)溶液中,并搅拌使之混合均匀,并将上述溶液转移到水凝胶模具中,置于恒温振荡器中,调整温度为45℃,反应8 h,得到水凝胶材料。
实施例9:
1)称取重均分子量为10000的明胶5 g于离心管中,用pH=7的1.5 ml磷酸盐缓冲溶液,置于恒温水浴锅中,调整温度为50℃,并搅拌至完全溶解得到明胶溶液;
2)称取葫芦脲[8]0.06 g与聚赖氨酸0.02 g于离心管中,加入pH=8的2 ml磷酸盐缓冲液溶解,将混合溶液置于超声中10 min,使之分散均匀;其中,聚赖氨酸的重均分子量为5000;
3)称取0.04 g谷氨酰胺转氨酶于离心管中,加入1 ml磷酸盐缓冲液溶解,得到谷氨酰胺转氨酶溶液;
4)将步骤1)获得的明胶溶液与步骤2)获得的混合溶液相混合,并搅拌使之混合均匀;
5)将步骤3)得到的酶溶液加入上述混合均匀的步骤4)溶液中,并搅拌使之混合均匀,并将上述溶液转移到水凝胶模具中,置于恒温振荡器中,调整温度为37℃,反应10 h,得到水凝胶材料。
实施例10:
1)称取重均分子量为3000的明胶5 g于离心管中,加入pH=5的1.5 ml磷酸盐缓冲溶液,置于恒温水浴锅中,调整温度为50℃,并搅拌至完全溶解得到明胶溶液;
2)称取葫芦脲[8]0.06 g与聚赖氨酸0.02 g于离心管中,加入pH=5的2 ml磷酸盐缓冲液溶解,将混合溶液置于超声中10 min,使之分散均匀;
3)称取0.04 g谷氨酰胺转氨酶于离心管中,加入pH=5的1 ml磷酸盐缓冲液溶解,得到谷氨酰胺转氨酶溶液;
4)将步骤1)获得的明胶溶液与步骤2)获得的混合溶液相混合,并搅拌使之混合均匀;
5)将步骤3)得到的酶溶液加入上述混合均匀的步骤4)溶液中,并搅拌使之混合均匀,并将上述溶液转移到水凝胶模具中,置于恒温振荡器中,调整温度为55℃,反应2h,得到水凝胶材料。
测试部分
按实施例1方法分别制备葫芦脲与聚赖氨酸摩尔比为0:1(n=0)、0.3:1(n=0.3)、0.7:1(n=0.7)、1:1(n=1)的水凝胶材料,并对其进行了抗菌性能测试,结果如图1、图2所示。结果显示:当CB[7]浓度越低时,抑菌率越好。随着CB[7]浓度的逐渐增大,被屏蔽掉的正电荷数目逐渐增多,对外抑菌的正电荷数目逐渐减小,使得水凝胶的抑菌率逐渐下降。当CB[7]屏蔽掉所有的正电荷时,水凝胶对外不抗菌,显示出与纯明胶相似的性能,较易滋生细菌。且从核磁共振氢谱图中可以看出葫芦脲[7]可以嵌套在聚赖氨酸表面,因此可以通过控制CB[7]的含量控制对外抑菌性的大小,满足了其在不同条件下的需求,既不会产生强烈的副作用也不会造成细菌感染,从而制备出不同抗菌性能的水凝胶生物材料以适应不同环境的需求。
以上所述仅是本发明的优选实施方式,需要指出的是,这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围,而且,在阅读了本发明的内容之后,本领域相关技术人员可以对本发明做出各种改动或修改,这些等价形式同样落入本申请所附权利要求书所限定的范围。
Claims (8)
1.一种酶促凝血抗菌可控的明胶基水凝胶制备的方法,其特征在于,包括以下步骤:
通过谷氨酰胺转氨酶令葫芦脲及聚赖氨酸交联改性明胶分子链上的活性基团,形成具有多肽交联网络的水凝胶材料,具体步骤包括:
步骤1:将明胶用磷酸盐缓冲液溶解,得到明胶溶液;
步骤2:将葫芦脲与聚赖氨酸按照一定的摩尔比混合,并用磷酸盐缓冲液溶解,使用超声分散均匀,得到混合溶液;
步骤3:将谷氨酰胺转氨酶用磷酸盐缓冲液溶解,得到酶溶液;
步骤4:将步骤1得到的明胶溶液和步骤2的混合溶液相混合,滴加步骤3的酶溶液,在适宜的温度中反应直至成为凝胶;
葫芦脲与聚赖氨酸的摩尔比不高于0.7:1。
2.如权利要求1所述的方法,其特征在于,葫芦脲与聚赖氨酸的摩尔比为(0.3~0.7):1。
3.如权利要求1所述的方法,其特征在于,谷氨酰胺转氨酶的酶活为100~200 u/g。
4.如权利要求1所述的方法,其特征在于,所述交联改性的反应温度为37℃~55℃,反应时间为2~10 h;所述交联改性以磷酸盐缓冲溶液作为反应介质,pH值为5~8。
5.如权利要求1所述的方法,其特征在于,葫芦脲为葫芦脲[8]或葫芦脲[7]。
6.如权利要求1所述的方法,其特征在于,聚赖氨酸的重均分子量不超过5000;所述明胶为食品级明胶,明胶的重均分子量为3000~10000。
7.如权利要求1所述的方法,其特征在于,包括如下步骤:
1)称取明胶5 g于离心管中,加入1.5 ml磷酸盐缓冲溶液,置于恒温水浴锅中,调整温度为50℃,并搅拌至完全溶解得到明胶溶液;
2)称取葫芦脲0.018~0.06 g与聚赖氨酸0.02g于离心管中,加入2 ml磷酸盐缓冲液溶解,将混合溶液置于超声中10 min,使之分散均匀;
3)称取0.04 g谷氨酰胺转氨酶于离心管中,加入1 ml磷酸盐缓冲液溶解,得到谷氨酰胺转氨酶溶液;
4)将步骤1)获得的明胶溶液与步骤2)获得的混合溶液相混合,并搅拌使之混合均匀;
5)将步骤3)得到的酶溶液加入上述混合均匀的步骤4)溶液中,并搅拌使之混合均匀,并将上述溶液转移到水凝胶模具中,置于恒温振荡器中,调整温度为45-50℃,反应时间为2-8 h,得到水凝胶材料。
8.权利要求1-7任一项所述方法得到的酶促凝血抗菌可控的明胶基水凝胶。
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