CN108064262B - 核酸提取的装置和方法 - Google Patents

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Abstract

核酸提取的装置和方法，包括供液体引导经过的空心体，优选为吸移管尖端，其特征在于，在该空心体内设置具有粗糙表面或结构化表面的材料，从而该材料可被液体洗涤。在样品裂解且调节出使核酸吸附于载体材料所需的结合条件后，配料借助吸移过程多次“吸移经过”竖向安置于吸移管尖端内的核酸结合材料。核酸与所述材料结合。接着，洗涤缓冲液也“吸移经过”核酸结合材料。随后进行干燥步骤。最后，洗脱剂又多次“吸移经过”竖向安置的核酸结合材料，此时，结合核酸被脱出。核酸现在可用于所需的下游应用。

Description

核酸提取的装置和方法
技术领域
本发明的主题是一种新型装置，借此能快速、高效以及大量分离或洗涤核酸。核酸提取用新型装置不仅可被用于实验室人工提取，也可被用在现场条件。与核酸提取自动化相关地公开了突出的优点。
背景技术
在典型条件下如下所述地从细胞和组织中分离DNA：含核酸的原始材料在强烈变性及还原条件下、有时也在采用蛋白分解酶情况下被分解，出现的核酸片段通过苯酚/氯仿提取步骤被纯化且核酸借助透析或乙醇沉淀从水相中获得(Sambrook,J.、Fritsch,E.F.和Maniatis,T.，1989，CSH，“分子克隆”)。从细胞且尤其是组织中分离核酸的此种“经典方法”是很费时间的(有时超过48小时)，需要显著的设备成本，此外也无法在现场条件实现。另外，这样的方法因为所用化学物质如苯酚和氯仿的量不少而对健康有害。
下一代核酸分离法依据由福格施坦恩和吉尔斯皮(Proc.Natl.Acad.Sei.美国,1979,76,615-619)研发并首次描述的、从琼脂糖凝胶中准备并分解纯化DNA片段的方法。该方法将“包含待分离DNA带的琼脂糖溶解在离液序列高的盐(NaJ)的饱和溶液中”与“将DNA结合至玻璃珠”进行了结合。固着至玻璃珠的DNA随后用洗涤液(20mM的三羟甲基氨基甲烷(Tris-HCl)[pH7.2]；200mM的氯化钠；2mM的EDTA；50％v/v乙醇)被洗涤，随后脱离载体颗粒。该方法迄今经历一系列改变且当前被用于自不同来源提取纯化核酸的不同方法，最后成为几乎所有商业可用的人工和自动核酸分离用试剂盒的基础。此外存在涉及核酸分离基本原理的许多专利和公开文献，所述基本原理由福格施坦恩和吉尔斯皮初次公开且或许还拥有其它的优点。
这些变型不仅涉及使用不同的矿物载体材料，也涉及核酸结合用缓冲液的类型。例子尤其是在有不同的离液序列高的盐的溶液情况下将核酸结合至矿物载体，此时作为载体材料采用细磨玻璃粉(BIO101,La Jolla,CA)、硅藻土(Sigma公司)或者硅胶或硅酸盐悬浮体或者玻璃纤维过滤器或矿土(DE4139664A1、US5,234,809、WO-A95/34569、DE4321904、DE20207793)。所有这些专利基于在有离液序列高的盐溶液情况下将核酸结合至基于玻璃或硅的矿物载体材料。在新近的专利文献中公开了，为了将核酸吸附至技术人员所已知且采用的矿物材料，也可以很高效且成功地采用所谓的反离液盐作为裂解/结合缓冲液体系的组成(EP1135479)。概括而言，人们于是可以如下所述地描述现有技术，在有含有离液序列高的盐或反离液盐的缓冲液情况下，或者在含有离液序列高的盐和反离液盐的混合物的缓冲液情况下，使核酸结合至矿物材料，然后在此过程中也能分离核酸。此时也出现以下优选变型，在此采用附加的脂肪族醇来促成结合。技术人员也知道了所有常见的用于核酸分离纯化的商业产品都基于此。所用矿物载体在此以松散料形式、滤膜形式或悬浮体形式存在。为了执行自动提取过程，通常采用顺磁珠或磁珠。在此，它例如是硅酸盐物质，其具备磁芯或顺磁芯，或者是氧化铁颗粒，其表面被改性以拥有核酸结合所需的功能性。为了尤其能简单执行自动提取，采用经改进的吸移管尖端。它的特点是其已包含核酸结合所需的载体材料(多孔矿物载体材料或多孔阴离子交换剂等)。例如，专利文献DE3717211描述一种带有核酸分离用多孔层析材料的吸移管尖端。专利文献EP1951904公开一种吸移管尖端，其由上部和下部组成，两者之间也有多孔层析载体材料，且它们应被用于自动核酸分离。经改进的核酸提取用吸移管尖端也在专利文献US2013/0078619中被公开。在吸移管尖端内也有多孔矿物载体材料(多孔玻璃)用于直接结合核酸。所有这些经改进的吸移管尖端的共同点是，它是多孔层析材料(松散料或多孔固体)。该载体材料总是水平位于吸移管尖端内。待处理液体流过所用的多孔材料。提取过程所依据的是，在样品裂解且调节出用于将核酸吸附至载体材料所需要的相应结合条件后，配料借助吸移过程被吸引经过多孔载体材料。核酸结合至载体材料。接着，洗涤缓冲液被吸移穿过载体材料。接着进行干燥步骤(频繁吸排或施加真空)。最后，洗脱剂被吸移经过载体材料。在此使结合的核酸脱离载体材料。含载体材料的吸移管尖端的使用应显著简化核酸(尤其)自动提取过程。虽然该设想已经有一些年头了(1987年5月22日的专利文献DE3717211)，但这种方法并未得以实现。在这里，原因在于以下的几个根本问题：
1)含核酸的高黏度裂解产物的吸移只能有限起效或者导致层析材料完全堵塞。因此无法实现提取。
2)裂解产物吸移经过多孔材料导致了泡沫形成。这随着越来越多的吸移步骤而强，可能也使得提取过程无法实现。
3)从多孔材料中除去乙醇成分是困难的且通常不能令人满意地解决。
公开出版物WO 01/05510A1也属于现有技术。在此描述了装有磁珠的空心体。关于磁珠表面性能未作说明。借助磁珠的核酸结合通常借助光滑铁粒实现。表面性能在现有技术中未起作用，只有磁性起作用。
发明内容
因此，本发明基于以下任务，解决已知的问题并允许借助经改进的吸移管尖端实现简单快速的核酸提取方法。
该任务根据权利要求书的特征来完成。根据权利要求1，提供一种核酸提取装置，包括供液体引导经过的空心体，其中，在该空心体中设置具有粗糙表面或结构化表面的材料，从而该材料可被液体冲洗。在一个优选实施方式中，吸移管尖端用作空心体。具有粗糙表面或结构化表面的材料所具有的尺寸不会使它向下离开吸移管尖端，因此不同于现有技术所述的磁珠(WO 01/05510A1)。权利要求2-6描述了该装置的优选实施方式。本发明也包括一种根据walk-away原理的仪器，其采用所述装置。此外，描述了一种借助该装置分离核酸的方法。所述方法的特点是有以下步骤：
a)在已裂解的生物样品中至少被加入降低水溶液极性的物质或者用于将核酸结合至固相的物质，
b)用吸移管尖端吸起a)中的混合物，在吸移管尖端中有根据权利要求1至5之一的粗糙材料或结构化材料并且多次吸排，其中，液体在此在所述材料旁经过且核酸沉淀在粗糙材料或结构化材料上，进而结合至固相，
c)使吸移管尖端离开样品，
d)使吸移管尖端进入洗涤缓冲液并多次吸排，其中，该液体在此在所述材料旁经过，
e)干燥该吸移管尖端以从洗涤缓冲液中除去残余乙醇，
f)用洗脱缓冲液通过多次吸排洗脱缓冲液来脱出核酸，其中，该洗脱缓冲液在此在该材料旁经过。
出乎意料地，这可利用简单手段做到。已经发现人们没有将核酸结合材料水平加入吸移管尖端，而是竖向加入，从而在核酸结合材料的一侧或两侧，液体可顺利流过。在另一个实施方式中，吸移管尖端也可填充有下述类型的结合核酸的颗粒材料，在所述材料之间有足够大的空隙以致液体也在该材料旁流过，并未穿过该材料。另一个可能的实施方式在于，表面结构化材料位于吸移管尖端中。在此情况下液体也在该材料的“结构”旁流过。所有这些实施方式最后意味着：核酸分离用液体未穿过层析材料，而是在核酸结合材料旁经过。在此，用本发明装置从液态样品中分离出核酸的基础基于一种全新原理。它从根本上不同于在层析载体材料上分离核酸的已知原理。事实表明，重要的是核酸结合用材料具有粗糙表面或它是表面结构化的材料，这通过表面上的结构(这可以是有序的或无序的)消除光滑性。总之，需要在吸移管尖端内通过所加入的材料形成二维/三维结构，核酸可吸附在所述二维/三维结构上。核酸结合看上去依据的是样品所含核酸在样品接触到粗糙表面后沉淀在粗糙表面、结构化表面或二维/三维网状结构上。这在此如此进行，即，通过加入例如乙醇使环境极性降低并由此降低核酸可溶性。出乎意料地，核酸“沉淀”于所述表面在高收得量和高纯度情况下极其高效地发挥作用。
因此，本发明的核心在于，游离的或裂解释放的核酸处于含水环境，其极性借助有机物质被调节，从而核酸可溶性被降低，接着该含水环境被吸入本发明的吸移管尖端，从而核酸随后在被置入吸移管尖端内的材料/网状结构旁经过(它可通过多次吸移来实现)且沉淀在材料/网状结构的表面上，接着又使沉淀的DNA脱离该表面并可供使用。可选地，沉淀于表面的核酸也可被洗涤且在洗涤步骤后被分离。
借助本发明方法的实际提取过程为此基于以下步骤。在提供包含核酸的呈含水形式的样品后，出现核酸沉淀所需要的条件，从而核酸可以沉淀到被置入吸移管尖端中的材料上。配料(Ansatz)借助吸移过程在竖直置入吸移管尖端内的核酸结合材料旁移送经过。核酸沉淀到该材料上。接着，洗涤缓冲液可选地也可在核酸结合材料旁移送经过。接着进行干燥步骤(例如频繁吸排)。最后，又多次使洗脱剂在竖向设置的核酸结合材料旁移送经过，同时使结合核酸分离。现在，针对所需的下游应用存在核酸。该方法执行起来非常快速简单且允许以很高的收得量和纯度分离核酸。未出现就像在采用水平安置的多孔载体材料时或者在填充有多孔层析材料时的吸移管尖端中所出现的、与粘胶溶液相关的问题以及与除去乙醇成分或形成很多泡沫相关的问题。该方法可通用且不仅可自动执行，也可人工执行。它以理想方式适合采用自动核酸提取，因为用于核酸结合、结合核酸洗涤及核酸脱离所需要的步骤仅还是多个吸移步骤。在此，本发明的吸移管尖端避免了从现有技术中知道的、由迄今的结构布置或给吸移管尖端填充多孔层析材料所决定的缺点。
待采用的被竖向置入吸移管尖端中的核酸结合用材料可以是截然不同的。除了矿物材料外，也可以采用经过改性的塑料材料，其表面不是光滑的，而是粗糙的或结构化的。所谓的复合材料、由聚合物和例如有机成分还有无机成分构成的混合物以及组合材料也属于此。重要的只是提供打毛表面或结构化表面(无光滑面)或者将材料置入吸移管尖端中，其导致二维/三维网状结构的形成，在此，核酸于是沉淀在该结构上。材料结构也不是限制性的(圆形、矩形等)。在此，它也可以是许多材料(如许多颗粒)。在简单的实施方式中，被置入吸移管尖端中的螺钉已经可以单独被用于核酸分离。
重要的只是，该材料被置入吸移管尖端中且随时可被液体冲洗，而液体不必穿过置入材料。也可以采用下述的吸移管尖端，结合材料(由注塑件制造)已经位于其中并且不必再被置入所述尖中。采用粗糙磁性材料也是有利的。这样的材料作为以商标名
Figure BDA0001517728280000061
的颗粒而已知。
术语“粗糙表面”是指可通过表面触摸或表面外观来鉴别该表面并不光滑。但它在此也可以是下述表面，其具有结构(如沟)。通过所述结构消除了表面的光滑性，即便该结构即沟本身可能是光滑的。根据本发明，这样的表面被称为“结构化表面”。如果通过表面的外观或触摸无法鉴别表面是否光滑或粗糙，则可以执行测试，在此使激光对准该表面。在光滑表面情况下，激光只在主方向上在表面被反射。在粗糙表面情况下进行在所有空间方向的散射。这样的测试在基尔大学的网页上有所描述(http://www.tf.uni-kiel.de/matwis/amat/semitech_cn/kap_3/illustr/oberflaechenstrukture.pdf)。
具体实施方式
应结合实施例来详述本发明。所述实施例在此并非限制本发明。
实施方式
实施例1：借助本发明方法且采用经改进的吸移管尖端自NIH 3T3细胞人工提取核 酸。
在1毫升吸移管尖端(Sarstedt公司)的后三分之一中竖直固定聚乙烯圆片。
将5x105NIH 3T3细胞加入。在此，分离核酸所采用的提取化学品从商业提取试剂盒innuPREP血液DNAKit/IPC16X(Analytik Jena AG)获得。借助裂解缓冲液(裂解液CBV)及蛋白酶K，细胞在60℃被裂解15分钟。裂解在2.0毫升反应容器中进行。在裂解后，在配料中加入400微升异丙醇。接着，借助吸移管使用经改进的吸移管尖端对配料进行20次吸排。接着，给另外三个2毫升反应容器填充乙醇洗涤缓冲液(洗涤液LS，80％的乙醇，80％的乙醇)。吸移管尖端随后被相继***各洗涤缓冲液并分别进行5次吸排。在最后洗涤步骤之后，该尖端被干燥，进而除去残余乙醇。结合核酸洗脱以100微升洗脱缓冲液进行。它又被加入2毫升反应容器中。进行30次吸排。在移除吸移管尖端之后，分离核酸存在于反应容器内。该方法极其简单快速。
分离核酸的证明借助分光光度测量进行。
分光光度测量结果
Figure BDA0001517728280000071
如结果所示，利用本发明的装置可在只采用标准提取化学品的情况下借助利用标准吸移管的少量吸移步骤结合并分离核酸。事实表明收得量很高。
实施例2：借助本发明方法在采用经改进的吸移管尖端及商业可用的自动提取仪 的情况下自NIH 3T3细胞自动提取核酸。
自动提取用自动提取仪InnuPure C16(Analytik Jena AG)进行。自动提取仪基于磁珠核酸提取。为了根据本发明方法执行核酸提取，自动提取仪所用的吸移管尖端被如此改动，即它们相当于本发明的装置。在吸移管尖端的下三分之一中竖向装入由打毛聚合物制造的圆片，其未封闭内腔，因而保持获得吸移管尖端的吸移功能。在此采用由各种物质构成的打毛圆片。为了核酸提取，分别采用5×l05NIH 3T3细胞。核酸分离用提取化学品在此部分地来自商业提取试剂盒innuPREP血液DNA Kit/PC16X(Analytik Jena AG)。借助裂解缓冲液(裂解液CBV)及蛋白酶K，细胞在2.0毫升反应容器内在60℃被裂解15分钟。
以下，采用Innupure C16的自动化核酸洗涤方法。提取所需的溶液存在于预填充的深孔板中。上述裂解产物被加入腔中，所述腔填充有400微升异丙醇。该溶液随后借助吸移管尖端被如此混匀，即溶液在被置入尖端中的圆片旁流过。对此重复100次。
随后，相继地在含有乙醇洗涤缓冲液(洗涤液LS，80％的乙醇，80％的乙醇)的另外三个腔中分别混合5次。
在最后洗涤步骤之后，本发明的尖端及其所含的圆片通过200次吸移空气被干燥，进而残余乙醇被除去。核酸洗脱通过120次混加100微升洗脱缓冲液进行，其通过仪器被事先加热到50℃。洗脱缓冲液的总体积为200微升。
该方法极其简单快速且表明商业可用的自动提取仪可被用于借助与之对应的本发明装置执行本发明方法。相比于磁珠提取，用时很短。分离核酸的证明借助分光光度测量进行。
分光光度测量的结果：
Figure BDA0001517728280000081
Figure BDA0001517728280000091
图2示出了分离核酸的电泳分析结果。
示出了在0.8％琼脂糖中电泳分离的核酸，其借助本发明方法被分离。样品从左到右从样品1开始被列出。
如结果所示，利用可由不同聚合物构成的本发明装置，可以在只采用标准提取化学品情况下借助利用标准吸移平台的较少吸移步骤结合和分离核酸。事实表明收得量极高。
实施例3：借助本发明方法并采用吸移管尖端及采用商业可用的自动提取仪自血 细胞自动提取核酸，吸移管尖端包含不同的核酸分离用材料。
自动化提取用自动提取仪InnuPure C16(Analytik Jena AG)进行。自动提取仪基于磁珠核酸提取。为了按照本发明方法执行核酸提取，被用于自动提取仪的吸移管尖端被改变，从而它们相当于本发明装置。采用三种不同的尖端：
第一种：吸移管尖端包含三维金属网状结构(为此采用商业可用的所谓金属擦洗海绵(不锈钢螺旋体)，大致从中裁剪出材料。该材料被塞入吸移管尖端。出现三维网状结构，溶液在移送经过它)。
第二种：吸移管尖端具有两个相互插合的涂锌木螺钉(它们根据说明书体现出结构化表面)。
第三种：吸移管尖端具有四个塑料颗粒，其表面被事先打毛。根据说明书，这些聚乙烯塑料颗粒是具有粗糙表面的材料。带有聚丙烯的铁磁性材料。
为了核酸提取，分别采用来自2毫升全血的血细胞，其事先已被分离出。血细胞在200微升PBS中被打散。核酸分离用提取化学品在此部分来自商业提取试剂盒innuPREP血液DNA Kit/IPC16(Analytik Jena AG)。整个提取过程借助仪器Innupure C16(AnalytikJena AG)自动进行。该仪器基于walk-away原理。为此给深孔板预填充所需的试剂。接着，吸移管尖端(利用本发明改进)被引入若干单独腔中且各溶液借助吸排被吸入吸移管尖端并被移送经过吸移管尖端所含的材料。
首先，细胞悬浮液被转移入预填充的深孔板的第一腔中。在该腔内有裂解缓冲液及蛋白酶K。此时如此进行裂解，即裂解产物借助本发明的吸移管尖端被多次吸排。在裂解后，裂解产物被转移入下一个腔。异丙醇位于所述腔中。又进行多次吸排，因而液体被永久吸入吸移管尖端，同时经过位于吸移管尖端内的材料。在此步骤中，核酸结合至该材料。在此步骤之后，吸移管尖端移入下一腔。乙醇洗涤缓冲液位于该腔中。结合核酸因此又通过多次吸移过程被洗涤。吸移管尖端在干燥之后又移入另一个腔中，水位于该另一个腔中。借助吸排，使核酸脱离该材料且最终以分离形式存在。因此，整个提取过程完全自动化工作。
该方法极其简单快速且表明商业可用的自动提取仪可被用于借助与之对应的本发明装置执行本发明方法。相比于磁珠提取，用时短了许多。
分离核酸的证明借助分光光度测量进行。
分光光度测量结果：
Figure BDA0001517728280000101
图1示出了被竖向置入空心体中的由核酸结合聚合物材料构成的圆片的示例性视图，示出了本发明装置的示例性实施方式，其可以被应用于根据本发明方法的核酸提取。

Claims (9)

1.一种核酸提取的装置，包括供液体引导经过的空心体，在所述空心体中设置有材料，使得所述材料能被液体洗涤，其特征在于，所述材料是金属螺钉或金属海绵或粗糙的聚合物的圆片或粗糙的塑料颗粒，其中所述圆片或塑料颗粒的粗糙能通过触摸或外观来鉴别。
2.根据权利要求1所述的装置，其特征在于，所述空心体是吸移管尖端，且所述材料的尺寸阻止所述材料从所述吸移管尖端脱离。
3.根据权利要求1或2所述装置，其特征在于，所述空心体是吸移管尖端，它在内壁上打毛或者所置入的材料在其内壁上稳固不动。
4.一种按照walk-away原理的自动核酸提取仪器，包括至少一个根据权利要求1至3中任一项所述的装置。
5.根据权利要求4所述的仪器，其特征在于，所述仪器是自动吸移仪或自动提取仪。
6.一种自动核酸提取的方法，其特征在于以下步骤：
a)在裂解的生物样品中至少加入降低水溶液极性的一种物质，从而得到混合物，
b)用吸移管尖端吸入a)中的所述混合物，其中，所述吸移管尖端中布置有材料，所述材料是金属螺钉或金属海绵或粗糙的聚合物的圆片或粗糙的塑料颗粒，其中所述圆片或塑料颗粒的粗糙能通过触摸或外观来鉴别，并且多次用所述吸移管吸排，其中，所述混合物由此移动经过所述材料且核酸沉淀在所述材料上，
c)使所述吸移管尖端离开所述混合物，
d)将所述吸移管尖端浸入洗涤缓冲液中并多次吸排，其中，所述洗涤缓冲液由此移动经过所述材料，
e)干燥所述吸移管尖端以除去源自所述洗涤缓冲液的残余乙醇，
f)通过洗脱缓冲液的多次吸排，用所述洗脱缓冲液脱出核酸，其中，所述洗脱缓冲液经过所述材料。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，使用有机溶剂作为用于降低水溶液极性的物质。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述有机溶剂为乙醇。
9.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述方法是使用自动吸移仪或自动提取仪的自动方法。
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