CN108018245A

CN108018245A - 一株产壳聚糖酶的枯草芽孢杆菌及其应用

Info

Publication number: CN108018245A
Application number: CN201810030676.3A
Authority: CN
Inventors: 王刚刚; 苟艳; 谢天; 刘忠川
Original assignee: Chengdu Institute of Biology of CAS
Current assignee: Chengdu Institute of Biology of CAS
Priority date: 2018-01-12
Filing date: 2018-01-12
Publication date: 2018-05-11

Abstract

本发明属于生物技术领域，具体涉及一株产壳聚糖酶枯草芽孢杆菌及其应用。本发明提供的枯草芽孢杆菌，其所产的壳聚糖酶产量高、酶活力强，具有与普通壳聚糖酶不同的蛋白结构，为壳聚糖酶分子机构的深入研究提供了新思路。普通的壳聚糖酶只在弱碱性至弱酸性时具有较好的活性，而本发明发现的壳聚糖酶在弱碱性、中性、弱酸性和较强酸性条件下均具有较好活性。同时，本发明发现的壳聚糖酶，不仅可作用于能够溶解的壳聚糖，还可作用于不可溶的高聚壳聚糖，省略了壳聚糖降解前的处理；反应终产物为二聚氨基葡萄糖和三聚氨基葡萄糖，成分简单，便于后续进一步加工应用，极大地节省了生产成本。

Description

一株产壳聚糖酶的枯草芽孢杆菌及其应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一株产壳聚糖酶的枯草芽孢杆菌及其应用。

背景技术

氨基葡萄糖是重要的医药前体和化工原料,具有广泛的用途。虾蟹壳来源的壳聚糖(Chitosan)是由D-氨基葡萄糖(或少量N-乙酰-D-氨基葡萄糖)通过β-1,4-糖苷键连接形成的聚合物,全球每年产生的壳聚糖超过1000亿吨,通过水解壳聚糖可以生产大量的氨基葡萄糖。

目前，常用的壳聚糖水解方法分别有：酸法水解、氧化降解、物理降解法和酶法水解。其中酶法降解壳聚糖具有环境污染低、反应条件温和、无副产物等优点，是目前应用前景最广的壳聚糖降解方法，近年来已经逐渐用于工业化生产，而酶法水解壳聚糖的关键在于壳聚糖酶。

尽管酶法制备壳寡糖存在许多优势，但现有的壳聚糖酶普遍存在：适用的pH范围狭窄、只能作用于可溶解壳聚糖、降解产物多为五糖(G5)至以上的寡糖等问题。如一篇名为“微生物壳聚糖酶的研究概况”的报道中提出：现有的各类壳聚糖酶，多数为碱性蛋白，最适pH普遍集中在5～8之间，偶有几个酶的最适pH为4，但其对应的最适温度偏高，造成在实际生产应用中能耗较高、适用范围不广的情况。

因此，开发一种适宜pH范围广、最适温度相对偏低、可将不可溶壳聚糖降解为二糖(G2)、三糖(G3)等低聚糖的壳聚糖酶，可有效推动海洋虾蟹来源壳聚糖的深度利用，具有重要的现实意义。

发明内容

本发明的目的是提供一株产壳聚糖酶的枯草芽孢杆菌及其应用。

为实现上述发明目的，本发明所采用的技术方案是：一株枯草芽孢杆菌，2017年10月30日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心,菌种名称:枯草芽孢杆菌，Bacillus subtilis，MY002，保藏编号为CGMCC No.14841。

相应的，一株枯草芽孢杆菌，其16SrDNA测序结果如SEQ ID NO 1所示；其gyrA测序结果如测序结果如SEQ ID NO 2所示；其gyrB测序结果如SEQ ID NO 3所示。

相应的，所述枯草芽孢杆菌在水解壳聚糖中的应用。

优选的，所述应用的pH范围为2.5～7.5。

优选的，所述应用的pH为：3或6。

优选的，所述应用的温度范围为35～65℃。

相应的，一种壳聚糖酶CsnMY002，其特征在于：其核苷酸序列如SEQ ID NO 4所示，其氨基酸序列如SEQ ID NO 5所示。

相应的，所述壳聚糖酶CsnMY002在水解壳聚糖中的应用。

优选的，所述应用的pH范围为：2.5～7.5。

优选的，所述应用的温度为35～65℃。

本发明具有以下有益效果：

1、本发明提供了一株产壳聚糖酶的枯草芽孢杆菌，其所产的壳聚糖酶具有产量高、酶活力强等优点。

2、本发明发现的壳聚糖酶，具有与普通壳聚糖酶不同的蛋白结构，其蛋白质的氨基酸序列TRDEWR片段，呈螺旋结构；而在其它壳聚糖酶中并无此段序列，相应位置为无规则的Loop结构。这为壳聚糖酶分子机构的深入研究提供了新思路。

3、普通的壳聚糖酶只在弱酸至弱碱时具有较好的活性，而本发明发现的壳聚糖酶不仅在常规条件下活力较好，在较强的酸性条件下也具有很好的酶活力。这使得该酶的应用范围和前景远大于普通的壳聚糖酶。

4、本发明发现的壳聚糖酶，不仅可作用于能够溶解的壳聚糖，还可作用于不可溶的高聚壳聚糖甚至未经处理的壳聚糖粗原料，省略了壳聚糖降解前的处理，极大地节省了生产成本。

5、本发明发现的壳聚糖酶水解壳聚糖的产物主要为二聚氨基葡萄糖和三聚氨基葡萄糖,产物成分简单，便于进一步加工应用。

附图说明

图1为未接种菌株的水解圈空白对照；

图2为筛选菌株在选择培养基上形成的透明水解圈；

图3为D-葡萄糖盐酸盐标准曲线图；

图4为菌株MY002的16SrDNA***进化树；

图5为菌株MY002的gyrA***进化树；

图6为菌株MY002的gyrB***进化树；

图7为去信号肽的壳聚糖酶凝胶过滤层析结果；

图8为壳聚糖酶CsnMY002在不同温度下作用效果对比图；

图9为壳聚糖酶CsnMY002在不同pH下作用效果对比图；

图10为壳聚糖酶CsnMY002水解胶体壳聚糖产物分析；

图11为壳聚糖酶CsnMY002水解不可溶高聚壳聚糖产物分析。

具体实施方式

实施例1：产壳聚糖酶菌株的筛选

1、材料准备：

(1)土壤样品：从绵阳芦笋种植区采集土样。

(2)培养基：

1)壳聚糖酶筛选培养基(g/L)：胶体壳聚糖2.0，K₂HPO₄ 0.7，KH₂PO₄ 0.3，(NH₄)₂SO₄5,MgSO₄﹒7H₂O 0.5，FeSO₄﹒7H₂0 0.01，琼脂12.0，pH＝7.0；

2)肉汤培养基(g/L)：蛋白胨10.0，牛肉膏3.0,NaCl 5.0,pH＝7.0。

3)壳聚糖酶诱导培养基(g/L)：胶体壳聚糖5.0，K₂HPO₄ 0.7，KH₂PO₄ 0.3，(NH₄)₂SO₄1.0,MgSO₄﹒7H₂O 0.5，FeSO₄﹒7H₂0 0.01，pH＝7.0；

4)LB培养基(g/L):蛋白胨10.0，酵母抽提物5.0，NaCl 10.0。

(3)试剂：

1)胶体壳聚糖:称取高聚细粉壳聚糖10g,加入适量浓盐酸,并在磁力搅拌器上搅拌4～6h使其充分溶解,再用去离子水反复清洗离心(4000r/min)，最后形成胶状物后一边搅拌一般缓慢地加入NaOH调节pH至中性，即得到胶体壳聚糖，于4℃保存备用。

2)3,5-二硝基水杨酸(DNS):取50ml的蒸馏水在80℃的水浴锅中加热，待加热之后加入26.2ml的2mol/L NaOH和0.63g的3，5-二硝基水杨酸，待搅拌溶解后加入18.2g的酒石酸钾钠，搅拌溶解后再加入0.5g结晶苯酚和0.5g Na₂SO₃，搅拌溶解，待冷却之后用蒸馏水定容至100ml，贮存于棕色瓶中，4℃保存备用。

(4)试剂盒、酶及细胞

1)BamHI、SalI购买于New England Biolabs,Inc.；

2)质粒抽提试剂盒购买于北京全式金生物技术有限公司；

3)T4连接酶购买于Takara Bio.Inc.；

4)感受态细胞DH5α和大肠杆菌BL21为本实验室保存。

2、菌株初筛

(1)称取5g土样放入盛有45ml蒸馏水的锥形瓶(250m)中,搅拌溶解，煮沸30min，然后取上清液进行梯度稀释(10^-1,10^-2,10^-3,10^-4,10^-5共5个浓度)，各取100ul分别涂布于壳聚糖酶筛选培养基中(每个梯度设置2个平行)，置于37℃恒温培养箱中培养2～4d。

(2)挑取在选择培养平板上生长且周围有明显透明水解圈的菌落，划线接种于新的选择培养平板上，置于37℃恒温培养箱中培养2d，再挑菌落划线接种，如此进行3代筛选，以保证得到纯种菌株。

(3)经连续3代分纯后挑取单菌落于牛肉膏蛋白胨培养基中液体培养，然后取5ul加在直径为6mm滤纸片上，滤纸片置于选择培养基上，37℃恒温培养2d，水解圈如图1、2所示。测量透明圈的大小，如表1所示。

表1筛选菌株产生水解圈的大小

(4)将分纯，且能产生透明水解圈的菌株进行保种，并于-80℃下贮存。

3、菌株复筛及壳聚糖酶酶活测定

(1)绘制5umol/L D-葡萄糖盐酸盐标准曲线

取30支200ul的离心管，均匀分为等量的3组，如表2所示，分别加入5μmol/ml的D-葡萄糖盐酸盐标准液、蒸馏水和3,5-二硝基水杨酸(DNS)试剂，配制成不同含量的D-葡萄糖盐酸盐标准反应液。将各个离心管摇匀，置于沸水浴中准确加热5min显色，然后在冰浴中迅速冷却，充分冷却后，再使用酶标仪在540nm波长下测定吸光值。将三组数据取平均值，填入表2中。采用Excel绘出标准曲线，即为D-葡萄糖盐酸盐标准曲线图，如图3所示。

表2 D-葡萄糖盐酸盐标准曲线

(2)DNS法测酶活

1)获取菌株发酵液：将所选菌株用肉汤培养基培养过夜，作为种子液，再将种子液以5％的接种量接种于壳聚糖酶诱导培养基中，于37℃，220r/min条件下培养2d，然后12000g，30min离心，取上清液。

2)取200ul步骤1)所述上清液，与200ul含1.0％胶体壳聚糖的磷酸缓冲液(6.1ml20mM Na₂HPO₄溶液与3.9ml 20mM NaH₂PO₄溶液混合，pH＝7.0)混合。37℃保温1h，然后沸水浴10min以终止反应，再待冰浴冷却，加入DNS试剂400ul。沸水浴5min后迅速冰浴冷却，12000r/min离心5min，取上清液在波长540nm处测吸光度(OD值)。以D-葡萄糖盐酸盐标准曲线为对照，计算出还原糖的释放量U：U＝(3.6842*平均吸光值+0.3692)*2。

酶活力单位定义:在上述条件下，每小时产生1umol还原糖所需酶量定义为1个酶活力单位。

筛选菌株的酶活测定结果如表3所示。

表3筛选菌株的酶活力大小

实施例2：菌株鉴定

1、16SrDNA测序鉴定

提取待测菌株的基因组DNA，然后以细菌16SrDNA的通用引物从基因组DNA中克隆16SrDNA。

通用引物为：

27F:AGA GTT TGA TCC TGG CTC AG；

1492R:TAC GGT TAC CTT GTT ACG ACT T。

PCR结果送生工生物公司测序，将测序结果在Gene Bank网站(http://www.nicbi.nlm.nih.gov/)进行BLAST对比，找到并下载标准菌株的基因序列，测序结果如SEQ ID NO 1所示。利用MEGA7.0计算不同菌株之间的遗传距离，绘制细菌的***发育树，如图4所示。

将待测菌株与芽孢杆菌模式菌株的16SrDNA进行比对，与枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)、解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)和地衣芽孢杆菌(Bacillusamyloliquefaciens)的遗传距离最近，分别为:0.002、0.005和0.015。

2、gyrA和gyrB测序鉴定

促旋酶的A亚基和B亚基，作为看家蛋白，在进化上保守，大约每100万年基因进化0.7～0.8％，它相比于16SrDNA每5000万年进化1％的速度要快，所以它经常被用于鉴定亲缘关系更近，无法用16SrDNA区分开的菌株。同样以待测菌株的基因组DNA为模板，扩增细菌的促旋酶A和B基因。

(1)gyrA使用通用引物扩增，引物为：

gyrA-F：5’-CAG TCA GGA AAT GCG TAC GTC CTT-3’；

gyrA-R：5’-CAA GGT AAT GCT CCA GGC ATT GCT-3’。

gyrA的测序结果如测序结果如SEQ ID NO 2所示。将PCR测序结果与该种不同属的标准菌株的促旋酶A基因进行比对，并利用MEGA 7.0构建***进化树，并计算遗传距离，结果如图5所示。其中待测菌株与枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)的遗传距离最近，为0.010(与其他菌株的遗传距离均在0.2以上)。

(2)gyrB是根据16SrDNA鉴定结果,根据几种近缘种的gyrB序列的保守区设计的引物，引物为：

gyrB-F：5’-AAC AGC AAA GGC CTT CAC CA-3’；

gyrB-R：5’-GCA GAG TCA CCC TCT ACG ATA TA-3’。

gyrB的测序结果如测序结果如SEQ ID NO 3所示。将PCR测序结果与该种不同属的标准菌株的促旋酶B基因进行比对，并利用MEGA 7.0构建***进化树，并计算遗传距离，结果如图6所示。待测菌株与枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)的遗传距离最近，为0.016，与Bacillus subtilis subsp.spizizenii的遗传距离为0.087(与其他菌株的遗传距离在0.2以上)。

3、综合以上结果，确定待测菌株MY002为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)。该菌株已于2017年10月30日，在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(ChinaGeneral Microbiological Culture Collection Center)保藏,菌种名称:枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)MY002，保藏编号为CGMCC No.14841。

实施例3：构建重组壳聚糖酶CsnMY002

1、壳聚糖酶的重组表达与纯化

(1)壳聚糖酶基因克隆与测序

通过对Genebank(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank/)中已知的枯草芽孢杆菌壳聚糖酶基因进行多序列比对,设计引物如下：

F:5’-CGC GGA TCC ATG AAA ATC AGT ATG CAA AAA GC-3’；

R:5’-A CGC GTC GAC TTA TTT GAT TAC AAA ATT ACC G-3’。

利用细菌全基因组DNA提取试剂盒提取该菌株的全基因组，并以此为模板进行聚合酶链式反应(PCR)，成功的克隆出该菌株的壳聚糖酶基因(CsnMY002)，其基因核苷酸序列如SEQ ID NO 4所示，蛋白氨基酸序列如SEQ ID NO 5所示。

测序结果显示：枯草芽孢杆菌MY002的壳聚糖酶基因全长为834bp，共编码277个氨基酸。将上述氨基酸序列通过SignalP 4.1 Server(http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)进行预测，发现前35个氨基酸为信号肽序列。

发明人发现：在CsnMY002的氨基酸序列中有一段特殊的序列：TRDEWR(对应序列SEQ ID NO 5中的：Thr Arg Asp Glu Trp Arg)，形成螺旋结构；而在其它壳聚糖酶中并无此段序列，其相应位置为无规则的Loop结构。

(2)构建重组质粒

以PET-28a为载体，构建了去信号肽壳聚糖酶的重组质粒(在蛋白N端具有6个组氨酸标签)。设计引物如下：

F:5’-CGC GGA TCC GCG GGA CTG AAT AAA GAT CAA AAG-3’；

R:5’-A CGC GTC GAC TTA TTT GAT TAC AAA ATT ACC G-3’。

其中，上述引物中的划线碱基分别引入BamHI(GGA TCC)和SalI(GTC GAC)酶切位点。并以枯草芽孢杆菌MY002全基因组DNA为模板，进行PCR反应。利用PCR产物回收试剂盒回收PCR产物。

同时，利用质粒抽提试剂盒提取PET-28a质粒，将其与PCR回收产物分别在37℃温度下过夜，进行BamHI、SalI双酶切反应，然后将酶切回收产物按基因：质粒＝10：1(摩尔比)构建连接体系，采用T4连接酶在4℃条件下连接16h。再将连接体系转入感受态细胞DH5α中，筛选出阳性克隆之后再将其中的质粒转入表达宿主大肠杆菌BL21中。

(3)重组壳聚糖酶(CsnMY002)的表达与纯化

将上述含有质粒的大肠杆菌BL21菌株接种于含有60ug/ml卡那霉素的LB培养基中，于37℃，220rpm条件下培养至OD600为0.4～0.6，然后降温至16℃，加入终浓度为0.2mM的IPTG进行低温过夜，诱导表达重组壳聚糖酶。然后5600r/min，离心30min收集菌体。

配制裂解缓冲液(50mM MES，500Mm NaCl，20mM咪唑，pH＝6.0)，用其将沉淀悬浮，再利用超声进行细胞破碎，破碎后溶液在12000rpm，4℃条件下离心30min，收集上清进行Ni柱亲和层析，然后以洗脱缓冲液(50mM MES，500Mm NaCl，100mM咪唑，pH＝6.0)进行洗脱。亲和层析得到的洗脱液再利用Resource S阳离子柱进行离子交换层析，利用Superdex 75凝胶过滤柱进行凝胶过滤层析。最终得到了稳定且具有活性的高纯度壳聚糖酶。

去信号肽的壳聚糖酶凝胶过滤层析结果如图7所示，该酶的相对分子量大小为27.42kDa。

在摇瓶中培养过夜，再经过镍柱亲和层析纯化。该酶的产量达100mg/L。在37℃，pH＝6.0条件下，酶活力为547±23U/mg(如表4所示)。

表4重组壳聚糖酶的酶活力测定结果

从上述结果可以看出：重组壳聚糖酶CsnMY002产量高、活性高。

实施例4：枯草芽孢杆菌MY002壳聚糖酶的最适反应条件分析

1、最适反应温度分析

(1)准备缓冲液：50mM的MES缓冲液(pH＝6)

(2)配制酶制剂：利用Bradford法，测定实施例3所述纯化后重组壳聚糖酶CsnMY002的浓度。取31.25μg酶液，用缓冲液(50mM MES，pH＝6)补齐至500μl，最终酶制剂浓度为0.0625μg/μl。

(3)配制底物溶液：取10ml胶体壳聚糖(1％,w/v)，离心(12000g，5min)后去上清液，加入9.5ml的缓冲液(50mM MES，pH＝6)。

(4)测定：取24支离心管，每管的反应体系为400μl，分别向每管中加入380μl底物溶液和20μl酶制剂。设置10℃、20℃、30℃、40℃、50℃、60℃、70℃、80℃，共计8个温度处理，每个处理设3个平行。将各处理分别在各个温度梯度下孵育5min，而后用沸水煮10min以终止反应。待冷却后，再分别加入400μl DNS，再在沸水中煮5min显色，并迅速冷却。待冷却后，在12000g转速下离心5min，去除壳聚糖沉淀。

(5)结果：各反应体系各取200μl上清液测定吸光值，再根据D-葡萄糖盐酸盐标准曲线，计算出还原糖的释放量，从而体现重组壳聚糖酶CsnMY002在各温度下的水解活性。结果如图8所示。

结果显示：重组壳聚糖酶CsnMY002在35℃～65℃下，均具有较好的酶活，最适反应温度为50℃。为操作方便，下述试验中温度全部采用37℃；实际生产中，可根据情况选择所需温度。

2、最适pH的分析

(1)准备缓冲液：50mM的甘氨酸-盐酸缓冲液(pH＝2～4)、50mM的MES缓冲液(pH＝5～6)、50mM的Tris-HCl缓冲液(pH＝7～9)。

(2)按照步骤1中的方法，将MES缓冲液分别换为上述三组缓冲液，配制三组不同pH值的酶制剂和底物溶液，对应三个pH处理，每个处理设三个平行。并按步骤1的测定方法，在37℃条件下反应，计算还原糖的释放量，得出重组壳聚糖酶CsnMY002在不同pH下的水解活性。结果如图9所示。从图中可以看出：重组壳聚糖酶CsnMY002在pH＝2.5～7.5时，均有不错的活性，且在pH＝3时，活性最佳；在pH＝6时，活性优良。这与目前已报道的壳聚糖酶高活性区间主要集中在pH＝5～7明显不同。本发明的重组壳聚糖酶CsnMY002不仅可以在弱碱性、中性和弱酸性条件下水解壳聚糖底物，还可以在酸性较强的条件下发生作用。

实施例5：重组壳聚糖酶CsnMY002水解性能分析

1、以可溶的壳聚糖为底物。

(1)向7支离心管中分别加入90μl的胶体壳聚糖溶液(1％，w/v)，12000g转速下离心5min，除上清，用50mM,pH＝6的MES缓冲液重悬。再向其中6支离心管内加入浓度为0.5mg/ml的壳聚糖酶CsnMY002溶液(50mM,pH＝6的MES缓冲液配制)，作为实验组；1支离心管内加入等量50mM,pH＝6的MES缓冲液，作为空白组。

(2)将上述实验组分别在37℃下，进行30s、1min、3min、5min、10min、1h的水解反应；空白组置于相同条件下1h。然后在沸水中煮10min以终止反应。

(3)将G1～G6混装标准品点样于硅胶板(Silica gel 60 F₂₅₄，1.05554.0001，购买于德国默克公司)作为标准参照(图10中的std)；待反应结束之后，再从各处理中分别取1μl离心上清液，点样于上述硅胶板，进行TLC分析。TLC采用的展开体系为：乙酸乙酯/乙醇/水/28％氨水＝5/5/4/0.5(v/v),经过大约2h后完全展开，将硅胶板风干后浸入0.1％的茚三酮(溶剂为乙醇)中，再在90℃下烘烤5min显色。水解结果如图10所示。

(4)结果显示：反应30s左右即能够检测到G3、G4、G5、G6，随着反应的进行，较长的壳寡糖逐渐水解成较短的寡糖，最终的水解产物为G2和G3。

其中，全文所述的G1、G2、G3等均表示低聚糖(寡糖)，G后面的数字表示氨基葡萄糖的聚合度。如：G1为氨基葡萄糖，G2为二聚氨基葡萄糖，G3为三聚氨基葡萄糖。

2、以不可溶的高聚壳聚糖为底物。

操作步骤与步骤1相同。其中，将胶体壳聚糖溶液等量替换为不可溶壳聚糖悬浮液，其制备方法为：称取粉末壳聚糖0.2g，加入10ml缓冲液(50mM MES，pH＝6.0)；充分震荡，使粉末悬浮。未设置空白组，水解时间分别为4h、8h、12h。水解结果如图11所示。

结果显示：重组壳聚糖酶对不可溶高聚壳聚糖的水解作用相对较慢，过夜孵育后检测到水解产物的形成，其产物仍然为G2和G3。

上述结果显示：本发明发现的壳聚糖酶CsnMY002不仅可水解可溶的壳聚糖，还可水解不可溶的高聚壳聚糖。同时，与常规壳聚糖酶的终产物一般为G5、G6甚至更长链的寡糖混合物所不同的是：壳聚糖酶CsnMY002的水解终产物全部为G3和G2的短链糖，成份更简单，便于后续应用，这可能是酶本身特殊的蛋白结构所决定的结果。

本发明发现的壳聚糖酶，具有新型的蛋白结构，对工作环境要求更低，且有着区别于其它壳聚糖酶的作用效果，具有更广阔的应用前景，也为壳聚糖酶分子机制更深入的研究提供了理论基础。

序列表

<110> 中国科学院成都生物研究所

<120> 一株产壳聚糖酶的枯草芽孢杆菌及其应用

<160> 5

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1455

<212> DNA

<213> 枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis MY002)

<400> 1

gccattgcgg cgtgctatac atgcagtcga gcggacagat gggagcttgc tccctgatgt 60

tagcggcgga cgggtgagta acacgtgggt aacctgcctg taagactggg ataactccgg 120

gaaaccgggg ctaataccgg atggttgttt gaaccgcatg gttcaaacat aaaaggtggc 180

ttcggctacc acttacagat ggacccgcgg cgcattagct agttggtgag gtaacggctc 240

accaaggcaa cgatgcgtag ccgacctgag agggtgatcg gccacactgg gactgagaca 300

cggcccagac tcctacggga ggcagcagta gggaatcttc cgcaatggac gaaagtctga 360

cggagcaacg ccgcgtgagt gatgaaggtt ttcggatcgt aaagctctgt tgttagggaa 420

gaacaagtac cgttcgaata gggcggtacc ttgacggtac ctaaccagaa agccacggct 480

aactacgtgc cagcagccgc ggtaatacgt aggtggcaag cgttgtccgg aattattggg 540

cgtaaagggc tcgcaggcgg tttcttaagt ctgatgtgaa agcccccggc tcaaccgggg 600

agggtcattg gaaactgggg aacttgagtg cagaagagga gagtggaatt ccacgtgtag 660

cggtgaaatg cgtagagatg tggaggaaca ccagtggcga aggcgactct ctggtctgta 720

actgacgctg aggagcgaaa gcgtggggag cgaacaggat tagataccct ggtagtccac 780

gccgtaaacg atgagtgcta agtgttaggg ggtttccgcc ccttagtgct gcagctaacg 840

cattaagcac tccgcctggg gagtacggtc gcaagactga aactcaaagg aattgacggg 900

ggcccgcaca agcggtggag catgtggttt aattcgaagc aacgcgaaga accttaccag 960

gtcttgacat cctctgacaa tcctagagat aggacgtccc cttcgggggc agagtgacag 1020

gtggtgcatg gttgtcgtca gctcgtgtcg tgagatgttg ggttaagtcc cgcaacgagc 1080

gcaacccttg atcttagttg ccagcattca gttgggcact ctaaggtgac tgccggtgac 1140

aaaccggagg aaggtgggga tgacgtcaaa tcatcatgcc ccttatgacc tgggctacac 1200

acgtgctaca atggacagaa caaagggcag cgaaaccgcg aggttaagcc aatcccacaa 1260

atctgttctc agttcggatc gcagtctgca actcgactgc gtgaagctgg aatcgctagt 1320

aatcgcggat cagcatgccg cggtgaatac gttcccgggc cttgtacaca ccgcccgtca 1380

caccacgaga gtttgtaaca cccgaagtcg gtgaggtaac cttttaggag ccagccgccg 1440

aaggtgaaca agaga 1455

<210> 2

<211> 959

<212> DNA

<213> 枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis MY002)

<400> 2

tcccgtcagc atgagcgtta tcgtgtccgt gctcttccag atgttcgaga cggtttaaaa 60

ccggttcata gacggatttt gtatgcaatg aatgatttag gcatgacaag tgacaagcct 120

tataaaaaat ccgcgcgtat cgttggagaa gttatcggga aataccaccc gcacggtgat 180

tcagcggtat atgaatccat ggtcagaatg gctcaggatt tcaactaccg ttatatgctc 240

gttgacggtc acggaaactt cggttctgtt gacggagact cagcggcggc catgcgttat 300

acagaagcaa gaatgtctaa aatctcaatg gagattcttc gtgacatcac aaaagacaca 360

atcgattacc aggataacta tgacgggtca gaaagagaac ctgtcgttat gccttcaagg 420

ttcccgaatc tgctcgtgaa cggtgctgcc ggcattgcgg taggtatggc aacaaacatt 480

cctccgcacc agctgggaga aatcattgac ggtgtacttg ctgtcagtga gaatccggac 540

attacaattc cagagcttat ggaagtcatt ccagggcctg atttcccgac cgcgggtcaa 600

atcttgggac gcagcggtat ccggaaagca tacgaatcag gccgaggctc tatcacgatc 660

cgggcaaaag ctgagatcga acaaacatct tcgggtaaag aaagaattat cgttacagag 720

ttaccttacc aagtgaataa ggcgaaatta attgagaaaa ttgctgatct cgtaagggac 780

aaaaagatag agggtatcac agatctgcgt gatgagtcag atcgtacagg tatgagaatt 840

gtcattgaaa tcagacgcga cgccaatgca aatgtcatct taaacaatct gtacaaacaa 900

actgctctac aaacatcttt tggcatcaac ctgcttgcac ttgtgatggc cagccgaaa 959

<210> 3

<211> 1142

<212> DNA

<213> 枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis MY002)

<400> 3

ccggagcatg tcgaatagta ttgacgaagc ccttgccggt tattgtacgg atatcaatat 60

ccaaatcgaa aaagacaaca gtatcacggt tgtagataat ggccgcggta ttccagtcgg 120

tattcatgaa aaaatgggcc gtcctgcggt agaagtcatt atgacggtgc ttcatgccgg 180

aggaaaattt gacggaagcg gctataaagt atccggagga ttacacggtg taggtgcttc 240

ggtcgtaaac gcactatcca cagagcttga tgtgacggtt caccgtgacg gtaaaattca 300

ccgccaaacc tataaacgcg gagttccggt tacagacctt gaaatcattg gcgaaacgga 360

tcatacagga acgacgacac attttgtccc ggaccctgaa attttctcag aaacaaccga 420

gtatgattac gatctgcttg ccaaccgcgt gcgtgaatta gcctttttaa caaagggcgt 480

aaacatcacg attgaagata aacgtgaagg acaagagcgc aaaaatgaat accattacga 540

aggcggaatt aaaagttatg tagagtattt aaaccgctct aaagaggttg tccatgaaga 600

gccgatttac attgaaggcg aaaaggacgg cattacggtt gaagtggctt tgcaatacaa 660

tgacagctat acaagcaaca tttactcgtt tacaaacaac attaacacgt acgaaggcgg 720

tacccatgaa gctggcttca aaacgggcct gactcgtgtt atcaacgatt acgccagaaa 780

aaaagggctt attaaagaaa atgatccaaa cctaagcgga gatgacgtaa gggaagggct 840

gacagcgatt atttcaatca aacaccctga tccgcagttt gagggccaaa caaaaacaaa 900

gctgggcaac tcagaagcac ggacgatcac cgatacgtta ttttctacag cgatggaaac 960

atttatgctg gaaaatccag atgcagccaa aaaaattgtc gataaaggct taatggcggc 1020

aagagcaaga atggctgcga aaaaagcccg tgaactaaca cgccgtaaga gtgctttgga 1080

aatttccaac ttgcccggta agttagcgga ctgctctcaa aagatccgag catccccgag 1140

tg 1142

<210> 4

<211> 834

<212> DNA

<213> 枯草芽孢杆菌壳聚糖酶(CsnMY002)

<400> 4

atgaaaatca gtatgcaaaa agcagatttt tggaaaaagg cagcgatctc attacttgtt 60

ttcaccatgt tttttaccct gataatgagc gaaacggttt ttgcggcggg actgaataaa 120

gatcaaaagc gccgggcgga acagctgaca agtatctttg aaaacggcac aacggagatc 180

caatatggat atgtagagcg attggatgat gggcgaggct atacatgcgg acgggcaggc 240

tttacaacgg ctaccgggga tgcattggaa gtagtggaag tatacacaaa ggcagttccg 300

aataacaaac tgaaaaagta tctgcctgaa ttgcgccgtc tggccaagga agaaagcgat 360

gatacaagca atctcaaggg attcgcttct gcctggaagt cgcttgcaaa tgataaggaa 420

tttcgcgccg ctcaagacaa agtaaatgac catttgtatt atcagcctgc catgaaacga 480

tcggataatg ccggactaaa aacagcattg gctagagctg tgatgtacga tacggttatt 540

cagcatggcg atggtgatga ccctgactct ttttatgcct tgattaaacg tacgaacaaa 600

aaagcgggcg gatcacctaa agacggaata gacgagaaga agtggttgaa taaattcttg 660

gacgtacgct atgacgatct gatgaatccg gccaatcatg acacccgtga cgaatggaga 720

gaatcagttg cccgtgtgga cgtgcttcgc tctatcgcca aggagaacaa ctataatcta 780

aacggaccga ttcatgttcg ttcaaacgag tacggtaatt ttgtaatcaa ataa 834

<210> 5

<211> 277

<212> PRT

<213> 枯草芽孢杆菌壳聚糖酶(CsnMY002)

<400> 5

Met Lys Ile Ser Met Gln Lys Ala Asp Phe Trp Lys Lys Ala Ala Ile

1 5 10 15

Ser Leu Leu Val Phe Thr Met Phe Phe Thr Leu Ile Met Ser Glu Thr

20 25 30

Val Phe Ala Ala Gly Leu Asn Lys Asp Gln Lys Arg Arg Ala Glu Gln

35 40 45

Leu Thr Ser Ile Phe Glu Asn Gly Thr Thr Glu Ile Gln Tyr Gly Tyr

50 55 60

Val Glu Arg Leu Asp Asp Gly Arg Gly Tyr Thr Cys Gly Arg Ala Gly

65 70 75 80

Phe Thr Thr Ala Thr Gly Asp Ala Leu Glu Val Val Glu Val Tyr Thr

85 90 95

Lys Ala Val Pro Asn Asn Lys Leu Lys Lys Tyr Leu Pro Glu Leu Arg

100 105 110

Arg Leu Ala Lys Glu Glu Ser Asp Asp Thr Ser Asn Leu Lys Gly Phe

115 120 125

Ala Ser Ala Trp Lys Ser Leu Ala Asn Asp Lys Glu Phe Arg Ala Ala

130 135 140

Gln Asp Lys Val Asn Asp His Leu Tyr Tyr Gln Pro Ala Met Lys Arg

145 150 155 160

Ser Asp Asn Ala Gly Leu Lys Thr Ala Leu Ala Arg Ala Val Met Tyr

165 170 175

Asp Thr Val Ile Gln His Gly Asp Gly Asp Asp Pro Asp Ser Phe Tyr

180 185 190

Ala Leu Ile Lys Arg Thr Asn Lys Lys Ala Gly Gly Ser Pro Lys Asp

195 200 205

Gly Ile Asp Glu Lys Lys Trp Leu Asn Lys Phe Leu Asp Val Arg Tyr

210 215 220

Asp Asp Leu Met Asn Pro Ala Asn His Asp Thr Arg Asp Glu Trp Arg

225 230 235 240

Glu Ser Val Ala Arg Val Asp Val Leu Arg Ser Ile Ala Lys Glu Asn

245 250 255

Asn Tyr Asn Leu Asn Gly Pro Ile His Val Arg Ser Asn Glu Tyr Gly

260 265 270

Asn Phe Val Ile Lys

275

Claims

1.一株枯草芽孢杆菌，其特征在于：2017年10月30日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心,菌种名称:枯草芽孢杆菌，Bacillus subtilis，MY002，保藏编号为CGMCC No.14841。

2.一株枯草芽孢杆菌，其特征在于：其16SrDNA测序结果如SEQ ID NO 1所示；其gyrA测序结果如测序结果如SEQ ID NO 2所示；其gyrB测序结果如SEQ ID NO 3所示。

3.权利要求1或2所述的枯草芽孢杆菌在水解壳聚糖中的应用。

4.如权利要求3所述的枯草芽孢杆菌在水解壳聚糖中的应用，其特征在于：所述应用的pH范围为：2.5～7.5。

5.如权利要求3所述的枯草芽孢杆菌在水解壳聚糖中的应用，其特征在于：所述应用的pH＝3或6。

6.如权利要求3所述的枯草芽孢杆菌在水解壳聚糖中的应用，其特征在于：所述应用的温度范围为：35～65℃。

7.一种壳聚糖酶CsnMY002，其特征在于：其核苷酸序列如SEQ ID NO 4所示，其氨基酸序列如SEQ ID NO 5所示。

8.权利要求7所述的壳聚糖酶CsnMY002在水解壳聚糖中的应用。

9.如权利要求8所述的壳聚糖酶CsnMY002在水解壳聚糖中的应用，其特征在于：所述应用的pH范围为：2.5～7.5。

10.如权利要求8所述的壳聚糖酶CsnMY002在水解壳聚糖中的应用，其特征在于：所述应用的温度范围为：35～65℃。