CN103261400A

CN103261400A - 在生物质水解产物培养基中具有改善的乙醇生产的利用木糖的运动发酵单胞菌

Info

Publication number: CN103261400A
Application number: CN2011800589843A
Authority: CN
Inventors: P.G.凯米; W.D.希茨
Original assignee: EI Du Pont de Nemours and Co
Current assignee: EIDP Inc
Priority date: 2010-12-17
Filing date: 2011-12-13
Publication date: 2013-08-21
Also published as: EP2652121A1; BR112013014912B1; US8476048B2; AU2011344023A1; US20120329114A1; CA2821135A1; JP2013545491A; US20130177958A1; BR112013014912A2; US8569458B2; WO2012082711A1

Abstract

使用驯化方法分离了在包含生物质水解产物的培养基中具有改善性能的利用木糖的、产生乙醇的运动发酵单胞菌（Zymomonas mobilis）菌株。据发现，独立分离的菌株在相同的编码区中具有独立的突变。在这一编码中的突变可经工程改造以产生改善的表型。

Description

在生物质水解产物培养基中具有改善的乙醇生产的利用木糖的运动发酵单胞菌

政府权利声明

本发明由美国政府支持，以资助号DE-C36-07GO17056受到能源部资助。美国政府拥有本发明的必然权利。

技术领域

本发明涉及微生物学和发酵领域。更具体地，本发明分离并表征了在生物质水解产物培养基中具有改善的生长和乙醇生产的突变的发酵单胞菌（Zymomonas）菌株。

背景技术

通过微生物生产乙醇提供了一种替代化石燃料的可供选择的能源，因此成为当前研究的重要领域。希望产生乙醇以及其它有用产物的微生物能够在不影响人类食品供应的培养基中生长并产生乙醇，诸如避免使用通过玉米谷粒产生的糖类。由于纤维素生物质加工中的进展，可将高浓度的葡萄糖、木糖和其它糖类释放于发酵中使用的生物质水解产物中。这样，生物质向乙醇的转化为通过使用可再生非食品资源提供化石燃料替代品来改善环境影响提供了很大的可能性。

已经对在天然情况下并不利用木糖的运动发酵单胞菌（Zymomonasmobilis）和其它细菌产乙醇生物进行针对木糖利用的基因工程改造，从而通过使用生物质水解产物中的更多糖类来改善生长和乙醇生产。但是，在包含生物质水解产物的培养基中的生长和乙醇生产通常并不理想，这是由于对微生物具有抑制性的乙酸酯和其它化合物的存在所导致的。在共同拥有并且共同未决的美国专利公布US20110014670A1中公开了制备对培养基中的乙酸酯和乙醇更具耐受性的改善的利用木糖的发酵单胞菌菌株的方法以及通过所述方法而分离的菌株。

在经预处理的生物质的水解产物中有可能存在的单化合物的毒性作用描述于Delegenes等人（（1996）Enzymes and Microbial Technology19:220-224）中。木糖发酵型运动发酵单胞菌对条件化稀酸黄杨半纤维素水解产物的驯化描述于Lawford等人（（1999），Applied Biochemistry andBiotechnology77:191-204）中。

仍然需要在生物质水解产物培养基中进行发酵期间具有改善的乙醇生产的分离的利用木糖的发酵单胞菌产乙醇生物菌株以及产生改善菌株的基因工程方法。

发明内容

本发明提供了在生物质水解产物培养基中具有改善的生长和乙醇生产的重组的利用木糖的发酵单胞菌菌株。此外，本发明提供了制备在水解产物培养基中使用的改善的发酵单胞菌菌株的方法以及使用所述菌株制备乙醇的方法。

因此，本发明提供了重组的、利用木糖的、产生乙醇的发酵单胞菌属微生物，所述微生物在zmo1432开放阅读框中具有至少一种基因修饰。

在一个方面，本发明提供了多肽和编码所述多肽的多核苷酸，所述多肽具有选自SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4的氨基酸序列。

在另一方面，本发明提供了制备重组发酵单胞菌产乙醇生物的方法，其包括：

a)提供利用木糖的、产生乙醇的发酵单胞菌属微生物；

b)提供多核苷酸，所述多核苷酸编码具有选自SEQ ID NO:3和SEQID NO:4的氨基酸序列的蛋白；以及

c)将b）的多核苷酸引入a）的微生物中；其中内源性zmo1432编码区受到破坏。

在替代性的方面，本发明提供了制备重组发酵单胞菌产乙醇生物的方法，其包括：

a)提供利用木糖的、产生乙醇的发酵单胞菌属微生物，所述微生物包含zmo1432开放阅读框，所述zmo1432开放阅读框编码具有如SEQ ID NO:2中所示的氨基酸序列的多肽，以及

b)在a）的zmo1432开放阅读框中引入突变，使得所述突变的开放阅读框的表达表达了具有选自SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4的氨基酸序列的多肽。

在另一方面，本发明提供了生产乙醇的方法，其包括：

a)提供本发明的重组发酵单胞菌；

b)提供包含木糖的生物质水解产物培养基；以及

c)使a）的发酵单胞菌在b）的生物质水解产物培养基中生长，其中产生乙醇。

附图说明、生物保藏和序列描述

申请人已经按照国际承认的用于专利程序目的的微生物保藏的布达佩斯条约的有关条款进行了以下生物保藏：

保藏菌株信息

保***鉴定参考	国际保藏所命名	保藏日期
			发酵单胞菌（Zymomonas）ZW658	ATCC No PTA-7858	2006年9月12日

图1示出了玉米棒水解产物随时间发酵的示图，其在发酵单胞菌菌株和驯化株7-31之间比较了葡萄糖和木糖利用以及乙醇生产。

图2示出了玉米棒水解产物随时间发酵的示图，其在发酵单胞菌菌株ZW705、驯化株7-31和驯化株5-6之间比较了葡萄糖和木糖利用以及乙醇生产。

图3示出了由zmo1432编码的蛋白和新洋葱伯克霍尔德菌（Burkholderia cenocepacia）的Bcemn03_1426蛋白之间的比对。

图4示出了由zmo1432编码的蛋白和大肠杆菌（E.coli）的AaeB蛋白之间的比对。

下列序列符合37C.F.R.§§1.821-1.825（“对含有核酸序列和/或氨基酸序列公开的专利申请的要求—序列规则”），并且与世界知识产权组织（WIPO）标准ST.25（2009）和EPO和PCT的序列列表要求（规则5.2和49.5（a-bis），以及行政指导的208节和附录C）相一致。用于核苷酸和氨基酸序列数据的符号和格式遵循如37C.F.R.§1.822所示的规定。

SEQ ID NO:1是在公开的运动发酵单胞菌基因组序列（NCBI参考号：NC_006526.2）中命名为zmo1432的编码区的核苷酸序列。

SEQ ID NO:2是在公开的运动发酵单胞菌基因组序列（NCBI参考号：NC_006526.2）中命名为zmo1432的编码区编码的氨基酸序列。

SEQ ID NO:3是SEQ ID NO:2的氨基酸序列，但在位置366处的氨基酸变为精氨酸。

SEQ ID NO:4是SEQ ID NO:2的氨基酸序列，但在位置117处的氨基酸变为苯丙氨酸。

SEQ ID NO:5是由fusC（登录号：P24128）编码的新洋葱伯克霍尔德菌蛋白的氨基酸序列。

SEQ ID NO:6是产酸克雷伯菌（Klebsiella oxytoca）的镰刀菌酸解毒蛋白的氨基酸序列（登录号：Q48403）。

SEQ ID NO:7是由Bcenmc03_1426编码的新洋葱伯克霍尔德菌蛋白的氨基酸序列。SEQ ID NO:8是大肠杆菌AaeB蛋白的氨基酸序列。

SEQ ID NO:9是未成熟的Xyn3的氨基酸序列，其并入了对应于位置1至16的预测信号序列。

SEQ ID NO:10是未成熟的Fv3A的氨基酸序列，其并入了对应于位置1至23的预测信号序列。

SEQ ID NO:11是未成熟的Fv43D的氨基酸序列，其并入了对应于位置1至20的预测信号序列。

SEQ ID NO:12是未成熟的Fv51A的氨基酸序列，其并入了对应于位置1至19的预测信号序列。

具体实施方式

本发明描述了对利用木糖的发酵单胞菌细胞在生物质水解产物培养基中的驯化，用以改善生长和乙醇生产。在驯化株中对突变的表征鉴定出了所述改善所特有的突变，其可在未驯化的利用木糖的发酵单胞菌菌株进行工程改造而得。这些菌株用于更为有效地制造乙醇，从而产生乙醇以作为化石燃料替代品。

下述的缩写和定义将用于解释说明书和权利要求。

如本文所用，术语“包含”、“包括”、“具有”或“含有”，或者其任何其他变型旨在包括非排他的包括。例如，包含一系列元素的组合物、混合物、工艺、方法、制品或设备不必仅限于那些元素，而可以包括其他未明确列出的元素，或此类组合物、混合物、工艺、方法、制品或设备固有的元素。此外，除非有相反的明确说明，“或”是指包含性的“或”，而不是指排他性的“或”。例如，以下任何一个均表示满足条件A或B：A为真实（或存在）的且B为虚假（或不存在）的，A为虚假（或不存在）的且B为真实（或存在）的，以及A和B都是真实（或存在）的。

同样，涉及元素或组分例证（即出现）次数的位于本发明元素或组分前的不定冠词“一个”或“一种”旨在是非限制性的。因此，应将“一个”或“一种”理解为包括一个或至少一个，并且元素或组分的词语单数形式也包括复数形式，除非有数字明显表示单数。

如本文所用，“一个或多个利用木糖的发酵单胞菌细胞”是指经遗传工程改造以表达产生使用木糖作为用于发酵的碳水化合物来源的能力的酶的一个或多个菌株细胞。

术语“驯化株”是指经选择在特定的条件下生长来改善其在这些条件下生长并产生产物的能力的微生物。

如本文所用，“对应的未驯化菌株”是指原始的利用木糖的发酵单胞菌菌株，其是使用本文所公开的生物质水解产物驯化方法由其制备改善的菌株的菌株。

如本文所用，“饲养生长培养基”是指添加到连续培养器皿中的培养基。

术语“木质纤维素生物质”或“生物质”是指任何木质纤维素材料并且包括含有纤维素、半纤维素、木质素、淀粉、寡糖和/或单糖的材料。生物质还可包含附加组分，如蛋白质和/或脂类。生物质可来源于单一来源，或者生物质可包括来源于一种以上来源的混合物；例如，生物质可包括玉米棒和玉米秸秆的混合物，或草和叶片的混合物。木质纤维素生物质包括但不限于生物能源作物、农业残留物、市政固体垃圾、工业固体垃圾、来自造纸业的淤渣、庭院垃圾、木材和林业垃圾。生物质的例子包括但不限于玉米棒、作物残留物如玉米壳、玉米秸秆、小草、小麦秸秆、大麦秸秆、干草、稻秆、柳枝稷、废纸、甘蔗渣、高粱植物材料、大豆植物材料、从谷物的研磨中获得的组分、树、枝、根、叶、木片、锯末、灌木和灌丛、蔬菜、水果和花。

如本文所用，“生物质水解产物”和“纤维素水解产物”是指通常通过预处理和糖化过程由生物质产生的产物，所述生物质是纤维素材料。可发酵的糖存在于水解产物中，也存在其它产物。

如本文所用，“生物质水解产物培养基”是指包含至少约50%的通过纤维素和/或木质纤维素生物质制备的水解产物的培养基。水解产物通过生物质的糖化来制备，通常先经过预处理。除所述水解产物外，所述培养基还包括用于生物催化剂生长和生产的确定组分

“Xyn3”是来自里氏木霉（Trichoderma reesei）木聚糖酶GH10家族。当所述酶作用于预处理的生物质或分离的半纤维素时，根据其在木乙糖酶存在下催化增加的木糖单体产量的能力的观察结果所间接显示，Xyn3（SEQ ID NO:9）具有木聚糖内切酶活性。

“Fv3A”是来自轮枝镰孢菌（Fusarium verticillioides）GH3家族酶。Fv3A（SEQ ID NO:10）在，例如，使用p-硝基苯基-β-木吡喃糖苷、木乙糖、混合的线型木聚糖低聚物、来自半纤维素的具支链的阿糖基木聚糖低聚物或者经稀氨水预处理的玉米棒作为底物的酶分析法中据显示具有β-木糖苷酶活性。

“Fv43D”是来自轮枝镰孢菌GH43家族酶。Fv43D（SEQ ID NO:11）在，例如，使用p-硝基苯基-β-木吡喃糖苷、木乙糖和/或混合的线型木聚糖低聚物作为底物的酶分析法中据显示具有β-木糖苷酶活性。

“Fv51A”是来自轮枝镰孢菌GH51家族酶。Fv51A（SEQ ID NO:12）在，例如，使用4-硝基苯基-α-L***呋喃糖苷作为底物的酶分析法中据显示具有L-α-***呋喃糖酶活性。

“基因”指表达特定蛋白质或功能性RNA分子的核酸片段，其可任选地包括位于编码序列之前的调控序列（5'非编码序列）和之后的调控序列（3'非编码序列）。“天然基因”或“野生型基因”指具有其自身调控序列的天然存在的基因。“嵌合基因”指不是天然基因的任何基因，包含在天然情况下不是一起存在的调控序列和编码序列。因此，嵌合基因可包含源自不同来源的调控序列和编码序列，或者源自相同来源、但排列方式与天然存在的排列方式不同的调控序列和编码序列。“内源性基因”指位于生物的基因组内它的天然位置的天然基因。“外来基因”指正常情况下不存在于宿主生物中的基因，它通过基因转移导入宿主生物。外来基因可以包含***到非天然生物体内的天然基因或嵌合基因。

术语“基因构建体”是指编码表达一种或多种特定蛋白质或功能性RNA分子的核酸片段。在基因构建体中基因可以是天然的、嵌合的、或外来的。通常基因构建体应包含“编码序列”。“编码序列”指编码特定氨基酸序列的DNA序列。

“启动子”或“启动控制区”指能够控制编码序列或功能RNA的表达的DNA序列。一般来讲，编码序列位于启动子序列的3'端。启动子可整个源于天然基因，或者由源于天然存在的不同启动子的不同元件构成，或者甚至包含合成的DNA片段。本领域内的技术人员应当理解，不同的启动子可在不同的组织或细胞类型中，或者在不同的发育阶段，或者响应不同的环境条件而引导基因的表达。通常将在大多数细胞类型中、在大多数情况下引起基因表达的启动子称为“组成型启动子”。

如本文所用，术语“表达”指衍生自基因的编码（mRNA）或功能性RNA的转录和稳定积聚。表达还可以指mRNA向多肽的翻译。“过表达”是指基因产物在转基因生物体内的生产，其超过了在正常或非转化生物体内的生产。

如本文所用，术语“转化”指将核酸片段转移至宿主生物体内，导致在基因上稳定遗传。转化的核酸可以是宿主细胞中保留的质粒形式，或者一些转化的核酸可以被整合进宿主细胞基因组中。含有转化核酸片段的宿主生物被称为“转基因”或“重组”或“转化”生物体。

如本文所用，术语“质粒”和“载体”是指通常携带有不属于细胞中心代谢的部分的基因的染色体外元件，并且常常是环状双链DNA分子的形式。这类元件可以是源自任何来源的自主复制序列、基因组整合序列、噬菌体或单链或双链DNA或RNA的核苷酸序列（线性或环状），其中多个核苷酸序列已连接或重组进入一种独特构建体中，该独特构建体能够将所选基因产物的启动子片段和DNA序列与相应的3'末端非翻译序列一起引入细胞中。

术语“可操作地连接”指单个核酸片段上的核酸序列的关联，使得其中一个核酸序列的功能受到另一个核酸序列的影响。例如，当启动子能够影响编码序列的表达（即，该编码序列受到该启动子的转录控制）时，则该启动子与该编码序列可操作地连接。编码序列可以按有义或反义的取向可操作地连接至调控序列。

术语“选择性标记”指一种鉴定因子，通常是抗生素或化学药品抗性基因，该因子能基于标记基因的效应，即，对抗生素的抗性进行选择，其中所述效应用于追踪遗传的受关注核酸和/或用于鉴定遗传了受关注核酸的细胞或生物。

如本领域已知的，术语“%同一性”是两条或更多条多肽序列之间或两条或更多条多核苷酸序列之间的关系，该关系通过对序列进行比较确定。在本领域中，“同一性”还表示多肽或多核苷酸序列之间序列关联的程度，根据具体情况，它由这些序列的序列串之间的匹配程度确定。“同一性”和“相似性”可容易地通过已知方法计算出来，所述的方法包括但不限于以下文献中所描述的那些：1.）Computational Molecular Biology（Lesk，A.M.编辑）Oxford University：NY（1988）；2.）Biocomputing： Informatics and Genome Projects（Smith，D.W.编辑）Academic：NY（1993）；3.）Computer Analysis of Sequence Data，部分I（Griffin，A.M.和Griffin，H.G.编辑）Humania：NJ（1994）；4.）Sequence Analysis in Molecular Biology（von Heinje，G.编辑）Academic（1987）；和5.）Sequence Analysis Primer（Gribskov，M.和Devereux，J.编辑）Stockton：NY（1991）。

设定确定同一性的优选方法来用于给出待测试序列之间的最佳匹配。确定同一性和相似性的方法在可公开获得的计算机程序中编成了代码。序列比对和%同一性计算可以用LASERGENE生物信息学计算软件包（LASERGENE bioinformatics computing suite（DNASTAR Inc.，Madison，WI））中的MegAlign^TM程序进行。序列的多重比对使用“Clustal比对方法”进行，该方法涵盖若干个不同的算法，包括对应于称为Clustal V比对方法的“Clustal V比对方法”，该方法描述于Higgins和Sharp，（CABIOS.5:151-153（1989）；Higgins，D.G.等人，Comput.Appl.Biosci.，8:189-191（1992））中，并且可以在LASERGENE生物信息学计算软件包（DNASTAR Inc.）中的MegAlign^TM程序中找到的比对方法。对于多重比对，默认值对应于GAP PENALTY=10、以及GAP LENGTHPENALTY=10。用Clustal方法进行成对比对和蛋白质序列的百分比同一性计算的默认参数为KTUPLE=1、GAP PENALTY=3、WINDOW=5、以及DIAGONALS SAVED=5。对于核酸，这些参数为KTUPLE=2、GAPPENALTY=5、WINDOW=4、以及DIAGONALS SAVED=4。在用ClustalV程序进行序列比对后，有可能通过观察相同程序中的“序列距离”表来获得“%同一性”。此外，也可以使用“Clustal W比对方法”，该方法相当于称为Clustal W（描述于Higgins和Sharp，CABIOS；5:151-153（1989）；Higgins，D.G.等人，Comput.Appl.Biosci.8:189-191（1992）中），并且可以在LASERGENE生物信息学计算软件包（DNASTAR Inc.）中的MegAlign^TMv6.1程序中找到的比对方法。用于多重比对的默认参数（GAP PENALTY=10、GAP LENGTH PENALTY=0.2、Delay Divergen Seqs（%）=30、DNA Transition Weight=0.5、Protein Weight Matrix=Gonnet系列、以及DNA Weight Matrix=IUB）。在使用Clustal W程序对序列进行比对之后，可通过查看同一程序中的“序列距离”表来获得“%同一性”。

制备在水解产物培养基中具有改善的发酵的发酵单胞菌菌株

本发明提供了重组的、利用木糖的、产生乙醇的发酵单胞菌微生物，所述微生物在zmo1432开放阅读框中具有至少一种基因修饰。这一突变的效果在于表达了改善该菌株在水解产物培养基中的性能的多肽，由此提高了该菌株对水解产物中的多种生长抑制物的耐受并且提高了乙醇产量。发酵活性的改善已被关联于发酵单胞菌基因组（NCBI参考号：NC_006526.2）的zmo1432区中的突变，其在本文定义为SEQ ID NO:1，该序列编码了SEQ ID NO:2的多肽。

因此在此提出，可使发酵单胞菌菌株具有在水解产物培养基中的改善的发酵，所述菌株通过在开放阅读框（ORF）内引入至少一种基因修饰而能够利用木糖作为碳源并且产生乙醇，所述开放阅读框编码了在修饰前与SEQ ID NO:2具有至少约95%的氨基酸同一性的蛋白质的基因。所述蛋白质可与SEQ ID NO:2具有95%、96%、96%、98%、99%或100%的同一性。可制成所述蛋白质中的任何基因修饰，所述基因修饰在水解产物培养基存在的情况下提高了由携带所述突变蛋白的菌株进行的乙醇生产。乙醇生产中的提高通过在相同的发酵条件下与缺乏所述基因修饰的发酵单胞菌菌株的生产进行比较而测定。通过本文实例3中描述的方法，本领域的技术人员可容易地对在所述ORF中具有基因修饰的菌株进行分析以估测在生物质水解产物存在情况下的提高的乙醇生产。所述的改善菌株对生物质水解产物以及生物质水解产物中存在的抑制物具有更高的耐受性，其中的耐受性是指与具有较少或不含水解产物的培养基中相比，所述菌株在具有标明水平的水解产物（耐受度水平）的培养基中进行类似地生长并且产生乙醇的能力。通过与缺乏所述基因修饰的发酵单胞菌菌株进行比较而测定更高的耐受性。

在一个实施例中，所述基因修饰导致了在SEQ ID NO:2的氨基酸序列的位置366处的变异，其以精氨酸取代苏氨酸。在另一个实施例中，所述基因修饰导致了在SEQ ID NO:2的氨基酸序列的位置117处的变异，其以苯丙氨酸取代丝氨酸。可在所述核苷酸序列中制出使密码子366变成编码精氨酸或使密码子117变成编码苯丙氨酸的任何变化。编码精氨酸的密码子是CGT、CGC、CGA、CGG、AGA和AGG。编码苯丙氨酸的密码子是TTT和TTC。

在一个实施例中，所述基因修饰处于与ORF zmo1432具有至少95%的序列同一性的编码区内，所述ORF zmo1432得名于公开的运动发酵单胞菌基因组序列（NCBI参考号：NC_006526.2），其为具有SEQ ID NO:1的核苷酸1446603至1448633的互补序列。可对SEQ ID NO:1的ORF称呼代用名，但是在任何情况下其可通过与SEQ ID NO:1的序列进行比较而鉴定为zmo1432。在发酵单胞菌菌种或菌株中鉴定为zmo1432的编码区序列中可能存在某些变异。因此，鉴定为zmo1432的编码区可与SEQ ID NO:1具有至少约95%、96%、97%、98%、99%或100%的序列同一性，并且具有基因修饰的编码区在基因修饰前可与SEQ ID NO:1具有至少约95%、96%、97%、98%、99%或100%的序列同一性。在修饰前，这一编码区是基因修饰的目标。

可通过本领域的技术人员已知的任何方法在发酵单胞菌菌株中产生至少一种所描述的基因修饰，所述菌株能够利用木糖作为碳源并且产生乙醇。这类方法包括通过下文以及在本文实例1和2中所述的驯化，通过化学诱变和筛选，以及通过基因工程。

用于在靶编码区中引入基因修饰的基因工程可通过包括使用双交换同源重组来将内源性靶编码区替换为携带上述突变的相同编码区在内的方法来进行。在同源重组中，侧连于靶整合位点的DNA序列结合奇放线菌素抗性基因或其它选择性标记而安置，并且对突变序列的替换导致了所述选择性标记的***以及突变序列替换进入所述靶基因组位点。所述选择性标记处于编码区外从而使编码区在产物内表达。此外，选择性标记可结合位点特异性重组结合位点，以便在对应的位点特异性重组酶表达后将所述抗性基因从基因组中切除。使用

的EZ::Tn体外转座***进行的转座特别适用于整合替换的突变序列，其在美国专利公布US-2009-0246846-A1的实例1和6中使用。

作为另外一种选择，可通过诸如***、突变或删除这样的操作在细胞中破坏靶内源性编码区的表达，并且可如上所述将表达携带突变的编码区的基因引入该细胞。在发酵单胞菌中用于使编码区失活的双交换同源重组的一个例子描述于美国专利7,741,119中。所引入的基因可以是包括其天然启动子的内源性基因（具有突变编码区），或者所引入的基因可以是嵌合基因，其包含可操作地连接的启动子和与所破坏的编码区具有至少约95%、96%、97%、98%或99%的同一性的编码区。嵌合基因中通常包括3'终止区。可用于发酵单胞菌的启动子包括ZmPgap和发酵单胞菌烯醇酶基因的启动子。

可将所引入的基因保持在质粒中，或者使用例如同源重组、定点整合或随机整合的方法整合进基因组中。用于引入的基因通常构建在载体中或转移入载体中以用于进一步的操作。载体是本领域熟知的。特别可用于在发酵单胞菌中表达的是能在大肠杆菌和发酵单胞菌中复制的载体，例如描述于美国专利5,514,583中的pZB188。载体可包括在细胞中自主复制的质粒和携带载体整合进细菌基因组的质粒。用于DNA整合的质粒可包括转座子、与靶细菌基因组同源的核酸序列区或其它支持整合的序列。其它类型的载体还可是转座体，其使用，例如，可通过

市售获得的***而产生。如何为所需靶宿主和所需功能选择适当的载体是众所周知的。

宿主菌株

能够利用木糖作为碳源并且产生乙醇的任何发酵单胞菌菌株均可是本发明的起始菌株。将这类菌株用于在水解产物培养基中的驯化，用于化学诱变和筛选，或者进行基因工程以产生本文所述的改善菌株。可进行工程改造以表达木糖至乙醇的发酵通路的发酵单胞菌菌株（诸如运动发酵单胞菌（Z.mobilis））是特别有用的。内源性基因可提供部分代谢途径，或者可以通过任何已知的基因操纵技术进行改变以提供具有酶活性的蛋白用于木糖代谢。例如，内源性转酮醇酶可在建立木糖代谢途径时补充其它导入的酶活性。通常为了木糖代谢中所涉及的四种酶的表达，可如美国专利5,514,583所述（其以引用方式并入本文）中所述将四个基因引入发酵单胞菌菌株如运动发酵单胞菌中。这些基因包括编码木糖异构酶的基因，该酶催化木糖转化成木酮糖，以及木酮糖激酶，该酶磷酸化木酮糖以形成5-磷酸木酮糖。此外，转酮醇酶和转醛醇酶，戊糖磷酸化途径中的两种酶，将5-磷酸木酮糖转化成连接戊糖代谢与Entner-Douderoff糖酵解途径的中间体，该途径使木糖代谢成乙醇。编码这些酶的DNA序列可从能够代谢木糖的多种微生物中的任何一种获得，例如肠细菌和一些酵母以及真菌。编码区的来源包括黄单胞菌、克雷伯氏菌、埃希氏菌、红细菌、黄杆菌、醋杆菌、葡糖杆菌、根瘤菌、农杆菌、沙门氏菌、假单胞菌和发酵单胞菌。特别有用的是大肠杆菌的编码区。

将编码DNA序列可操作地连接至运动发酵单胞菌细胞中表达的启动子如运动发酵单胞菌甘油醛-3-磷酸脱氢酶启动子（GAP启动子）和运动发酵单胞菌烯醇酶启动子（ENO启动子）。编码区可从启动子开始单个表达，或者两个或更多个编码区可接合到一个操纵子中，从相同启动子开始一起表达。可将所得的嵌合基因导入发酵单胞菌并保持在质粒中，或者使用例如同源重组、定点整合、或随机整合的方法整合进基因组中。特别有用的利用木糖的菌株包括ZM4（pZB5）（描述于美国专利U.S5,514,583、U.S.6,566,107和U.S.5,571,2133中并且以引用的方式并入本文）、8b（美国专利申请U.S.2003/0162271；Mohagheghi等人，（2004）Biotechnol.Lett.25；321-325）以及ZW658（ATCC PTA-7858）、ZW800、ZW801-4、ZW801-5和ZW801-6（描述于共同拥有且共同未决的美国专利申请公布号为U.S.2008-0286870A1中，该专利以引用方式并入本文）。

还可将受到另外工程改造以利用其它非天然底物的糖的发酵单胞菌菌株用于本发明方法中。一个例子是针对***糖利用而工程化的运动发酵单胞菌的菌株，其描述于美国专利5,843,760中，该专利以引用方式并入本文。

驯化

为进行驯化，将利用木糖的发酵单胞菌菌株（上文所述的起始菌株）连续地生长于包含生物质水解产物的培养基中。生物质水解产物通过生物质的糖化而产生。所述生物质通常在糖化前进行了预处理。本领域技术人员可用任何已知的方法处理生物质，在水解产物中产生可发酵糖。通常所述生物质采用物理的和/或化学的处理，以及酶促糖化进行预处理。物理的和化学的处理可包括碾磨、铣削、切割、碱处理如用氨或氢氧化钠、以及酸处理。低氨预处理是特别有用的，其中生物质与包含氨的水溶液接触，形成生物质-氨水混合物，其中氨的浓度足够维持生物质-氨水混合物的碱性pH，但相对于生物质干重其小于约12重量%，并且生物质的干重至少约为15重量%固体（相对于生物质-氨水混合物的重量），如共同申请和共同拥有的美国专利申请公布US-20070031918-A1所公开的，其以引用方式并入本文。

酶解糖化通常利用酶组合物或共混物来降解纤维素和/或半纤维素并且产生水解产物，其包含糖，诸如葡萄糖、木糖和***糖。糖化酶见Lynd，L.R.等人的综述。（Microbiol.Mol.Biol.Rev.，66:506-577，2002）。使用至少一种酶，并且通常使用糖化酶共混物，其包括一种或更多种糖苷酶。糖苷酶水解二糖、低聚糖和多糖的醚键，并且存在于广义“水解酶”（EC3.）的酶分类EC3.2.1.x（Enzyme Nomenclature1992，Academic Press，San Diego，CA，以及增补1（1993）、增补2（1994）、增补3（1995）、增补4（1997）和增补5[分别在Eur.J.Biochem.，223:1-5，1994；Eur.J.Biochem.，232:1-6，1995；Eur.J.Biochem.，237:1-5，1996；Eur.J.Biochem.，250:1-6，1997；和Eur.J.Biochem.，264:610-6501999中]）。本发明的方法中可用的糖苷酶能根据它们水解的生物质组分进行分类。可用于本发明方法中的糖苷酶包括纤维素水解糖苷酶（例如，纤维素酶、内切葡聚糖酶、外切葡聚糖酶、纤维二糖水解酶、β-葡萄糖苷酶）、半纤维素水解糖苷酶（例如木聚糖酶、内切木聚糖酶、外切木聚糖酶、β-木糖苷酶、***木聚糖酶、甘露聚糖酶、半乳糖酶、果胶酶、葡萄糖醛酸糖苷酶）和淀粉水解糖苷酶（例如淀粉酶、α淀粉酶、β淀粉酶、葡萄糖淀粉酶、α-葡萄糖苷酶、异淀粉酶）。此外，将其它活性加入糖化酶聚生体（如肽酶（EC3.4.x.y）、脂肪酶（EC3.1.1.x和3.1.4.x）、木素酶（EC1.11.1.x）或阿魏酸酯酶（EC3.1.1.73））中以促进从生物质的其它组分中释放多糖是有益的。本领域熟知生产多糖水解酶的微生物常常表现出某种活性，如降解纤维素的能力，该活性由具有不同底物特异性的若干种酶或一组酶催化。因此，来自微生物的“纤维素酶”可包括一组酶、一种或更多种酶或所有酶，它们都可有助于纤维素降解活性。取决于获取酶时利用的纯化方案，商业或非商业酶制剂，如纤维素酶，可包括多种酶。

糖化酶可商购获得。这类糖化酶包括，例如，

CP纤维素酶、

木聚糖酶、

1500、以及DUET（Danisco U.S.Inc.，Genencor International，Rochester，NY）。此外，糖化酶可以是未经纯化的并以细胞提取物或全细胞制剂的形式提供。可使用已经进行工程改造以表达一种或多种糖化酶的重组微生物制备所述酶。

用于糖化的另外酶类包括，例如，糖基水解酶，诸如GH3、GH39、GH43、GH55、GH10和GH11家族的成员。GH是一组酶，其水解两个或更多个碳水化合物间的糖苷键，或碳水化合物与非碳水化合物基团间的糖苷键。GH家族基于序列类似性进行分类，并且所述分类可在碳水化合物-活性酶（CAZy）数据库中得到（Cantarel等人（2009）Nucleic Acids Res.37（数据库专刊）:D233-238）。这些酶的某一些能够作用于多种底物并且作为糖化酶表现出效能。糖苷水解酶家族3（“GH3”）的酶具有大量的已知活性，包括，例如，β-葡糖苷酶（EC:3.2.1.21）；β-木糖苷酶（EC:3.2.1.37）；N-乙酰基β-氨基葡糖苷酶（EC:3.2.1.52）；葡聚糖β-1,3-葡糖苷酶（EC:3.2.1.58）；纤维糊精酶（EC:3.2.1.74）；外切-1,3-1,4-葡聚糖酶（EC:3.2.1）；和/或β-半乳醣苷酶（EC3.2.1.23）的活性。糖苷水解酶家族39（“GH39”）酶还具有大量已知活性，包括，例如α-L-艾杜糖醛酸酶（EC:3.2.1.76）和/或β-木糖苷酶（EC:3.2.1.37）的活性。糖苷水解酶家族43（“GH43”）的酶具有大量已知活性，包括，例如，L-α-***呋喃糖酶（EC3.2.1.55）；β-木糖苷酶（EC3.2.1.37）；聚***糖内切酶（EC3.2.1.99）；和/或半乳聚糖1,3-β-半乳醣苷酶（EC3.2.1.145）的活性。糖苷水解酶家族51（“GH51”）的酶已知具有，例如，L-α-***呋喃糖酶（EC3.2.1.55）和/或内切葡聚糖酶（EC3.2.1.4）的活性。糖苷水解酶家族10（“GH10”）详细的描述于Schmidt等人，1999，Biochemistry38:2403-2412和Lo Leggio等人，2001，FEBS Lett509:303-308中，并且糖苷糖水解酶家族11（“GH11”）描述于Hakouvainen.，1996，Biochemistry35:9617-24中。

在本发明的驯化方法中，将利用木糖的发酵单胞菌在提高比例的生物质水解产物的存在下连续生长于生长培养基中，如本文实例1和2中所述。以周期性间隔收取样品并分析其在水解产物培养基中的性能，包括木糖和葡萄糖利用和乙醇生产。在包含提高比例的水解产物以及其它胁迫组分（诸如乙酸酯和乙醇）的培养基中进行的多轮驯化可用于产生具有改善性能的菌株，诸如上文所述的菌株。

改善的利用木糖的菌株的发酵

经工程改造的具有本文所述的至少一种基因修饰的利用木糖且产生乙醇的发酵单胞菌菌株可用于发酵以产生乙醇。使运动发酵单胞菌接触包含生物质水解产物的培养基，所述生物质水解产物包括糖，其包含葡萄糖和木糖。所述糖的至少一部分来源于经预处理和糖化的纤维素或木质纤维素生物质。培养基中可包括另外的糖和/或其它培养基组分。

当糖的浓度高至足以抑制生长时，所述培养基包括山梨醇、甘露糖醇、或它们的混合物，这公开于共有的美国专利7,629,156中。半乳糖醇或核糖醇可代替或与山梨醇或甘露糖醇组合。运动发酵单胞菌培养基中生长，所述培养基中进行了发酵并且产生了乙醇。发酵在不补充空气、氧气、或其它气体（这可包括各种条件如厌氧、微氧、或微需氧发酵）的情况下运行至少约24小时，并且可运行30小时或更长时间。达到最大乙醇产量的时间是不确定的，取决于发酵条件。发酵可在介于约30℃和约37℃之间的温度和约4.5至约7.5的pH下进行。

可以在实验室规模的发酵罐中以及扩规发酵中（其中生产了商业规模量的乙醇），在包含包括木糖在内的混合糖培养基中培养本发明的运动发酵单胞菌。当需要商业生产乙醇时，可使用多种培养方法。例如，由本发明的运动发酵单胞菌菌株进行的大规模生产可以通过分批培养方法和连续培养方法进行。经典的分批培养方法是封闭***，其中培养基的组成在培养开始时设定并且在培养过程期间不进行人工改变。因此，在培养过程开始时，用所需的生物接种培养基，并且不向***中添加任何物质可以发生生长或代谢活性。然而，通常来说，“分批”培养是指碳源的添加是成批的，但经常试图控制诸如pH和氧浓度之类的因素。在分批***中，代谢产物和生物质组成持续改变直至培养结束时。在分批培养物内，细胞缓慢通过静态延滞期到达高速生长对数期，并最后达到稳定期，此时生长速率减缓或终止。如果不加以处理，稳定期中的细胞将最终死亡。处于对数期的细胞通常负责乙醇的批量生产。

标准分批式***的一种变型是补料分批***。分批补料培养方法也适用于本发明运动发酵单胞菌菌株的培养，并且其包括典型的分批***，不同的是底物随着培养进行以递增方式添加。补料-分批***中实际底物浓度的测量是困难的，并因此根据可测量因素例如pH和废气如CO₂的分压的改变来评估。分批和分批补料培养方法在本领域内是常用的且熟知的，并且例子可见于Biotechnology：A Textbook of Industrial Microbiology，Crueger，Crueger和Brock，第二版（1989）Sinauer Associates，Inc.，Sunderland，MA，或Deshpande，Mukund V.，Appl.Biochem.Biotechnol.，36，227，（1992），将其以引用方式并入本文。

乙醇的商业生产也可通过连续培养进行。连续培养是一种开放式***，其中将培养基连续加入生物反应器里，并同时移出等量条件培养基用于加工。连续培养一般使细胞维持在其中细胞主要处于对数生长期的恒定高液相密度。作为另外一种选择，连续培养可以用固定化细胞来进行，其中连续添加碳和营养素，且连续从细胞团块中取出有价值的产物、副产物或废弃物。细胞固定可使用范围广泛的固体载体进行，所述固体载体由本领域技术人员已知的天然材料和/或合成材料组成。

尤其适用于乙醇生产的发酵方法如下所述。将所需本发明运动发酵单胞菌菌株在包含半复合培养基的摇瓶中生长，培养温度为30℃至约37℃，在回旋振荡器中以约150rpm的转速振荡培养，然后将其转移到包含类似培养基的10L种子发酵罐中。种子培养物在种子发酵罐中厌氧生长直至OD₆₀₀介于3和10之间，然后将其转移到生产发酵罐中，其中的发酵参数经最优化用于乙醇生产。从种子罐转移到生产罐的典型种菌体积在约2%至约20%v/v的范围内。正如本领域的技术人员所知，用于本发明菌株的发酵培养基包含至少约50%的生物质水解产物并且可补充以其它营养物。所述培养基中存在终浓度约5mM的山梨醇和甘露醇。

使用苛性碱溶液（如氢氧化铵、氢氧化钾、或氢氧化钠）和硫酸或磷酸将发酵控制在pH5.0-6.0。将所述发酵罐的温度控制在30℃-35℃下。为使发泡最小化，根据需要向所述容器内加入消泡剂（任何类别-基于硅氧烷的、基于有机物的，等等）。可任选地将诸如卡那霉素这样的抗生素（所述菌株中存在针对其的抗生素抗性标记或者所述菌株对其有抗性）用于最小化污染。

上述任何条件组和这些条件中在本领域为人所熟知的附加变化是通过利用木糖的发酵单胞菌菌株产生乙醇的合适条件。

优选实施例说明

据本文公开，在生物质水解产物存在的情况下具有改善的葡萄糖和木糖的利用和乙醇生产的利用木糖的发酵单胞菌菌株可通过在生物质水解产物培养基中进行的驯化和筛选过程而获得。葡萄糖和木糖利用以及乙醇生产中的提高是通过与利用木糖的对应的未驯化菌株的葡萄糖和木糖利用而测量的。所对应的未驯化菌株是用作为水解产物驯化过程的起始菌株的菌株。

运动发酵单胞菌菌株是分离自水解产物驯化实验，如本文实例1和2中所述。两种分离的菌株命名为驯化株5-6（或AR25-6）和驯化株7-31（或AR37-31），并且受到进一步表征。当如本文实例3中所述在玉米棒水解产物中生长时，这些菌株对葡萄糖和木糖的利用比对应的未驯化菌株ZW705更迅速。在发酵运行21小时后，已经利用了约20%更多的葡萄糖。此外，在21小时生产了约22%更多的乙醇，而在52小时使用了约21%更多的木糖并且产生了5%更多的乙醇。一般来讲，具有驯化株5-6或驯化株7-31菌株的新型基因变化（其在下文所述）的菌株中的葡萄糖利用、木糖利用和乙醇生产中的精确百分比提高应取决于众多因素。这些因素包括发酵条件以及所述菌株除本文公开的新型基因变化以外的遗传特性。

对所述基因组进行测序以鉴定驯化株5-6或驯化株7-31菌株的基因组中的任何变化。通过将这些基因组序列与对应的其实菌株ZW705（描述于美国专利公布US20110014670A1中）、野生型菌株ZW1（ATCC31821）和公开的运动发酵单胞菌菌株ATCC31821的序列（Seo等人，Nat.Biotech.23:63-82005；NCBI参考号：NC_006526.2）之间进行的比较，测定了两种菌株在相同的编码区中均具有单一的新型突变。这一编码区鉴定为处于公开的运动发酵单胞菌基因组序列（NCBI参考号：NC_006526.2）中的zmo1432开放阅读框（ORF）并且是具有SEQ ID NO:1的核苷酸1446603至1448633的互补序列。

驯化株5-6在SEQ ID NO:1的位置1097处具有从C到G的突变。这导致了zmo1432编码的蛋白质（SEQ ID NO:2）的密码子366从编码苏氨酸的ACA变成编码精氨酸的AGA，产生了SEQ ID NO:3的蛋白质，其中精氨酸取代了苏氨酸No.366。驯化株7-31在SEQ ID NO:1的位置350处具有从C到G的突变。这导致了zmo1432编码的蛋白质（SEQ ID NO:2）的密码子117从编码丝氨酸的TCT变成编码苯丙氨酸的TTT，产生了SEQID NO:4的蛋白质，其中苯丙氨酸取代了丝氨酸No.117。

假定的编码区zmo1432（或ORF）在运动发酵单胞菌全基因组序列（NCBI参考号：NC_006526.2）中标注为编码“镰刀菌酸抗性蛋白”。其标注为具有镰刀菌酸抗性蛋白保守区，所述保守区是蛋白质基序：PFAM:PFO4632（Wellcome Trust Sanger Institute，Genome ResearchLimited，Hinxton，England）。这一基序存在于与镰刀菌酸抗性关联的蛋白质中，其来自洋葱伯克霍尔德菌（Burkholderia cepacia）（Swiss-Prot::P24128（SEQ ID NO:5）；Utsumi等人（1991）Agric.Biol.Chem.55:1913-1918；所述生物体由洋葱假单胞菌（Pseudomonas cepacia）重新命名）和产酸克雷伯菌（Klebsiella oxytoca）（Swiss-Prot::Q48403（SEQ IDNO:6）；Toyoda等人（1991）J Phytopathol.133:165-277），所述蛋白质可能是膜转运蛋白。

洋葱伯克霍尔德菌染色体1全序列中名为Bcenm03_1426区标注为编码假定的镰刀菌酸抗性转运蛋白（登录号：YP_001764723；Copeland等人于2/27/2008提交）。该蛋白质（SEQ ID NO:7）与zmo1432编码的蛋白质具有相似性，如本文实例4中所述。此外，大肠杆菌蛋白AaeB（SEQ IDNO:8）（其为芳族羧酸外排泵（VanDyk等人，J.Bact.186:7196-7204（2004））与zmo1432编码的蛋白质具有相似性，如本文实例4中所述。因此，在生长于水解产物培养基的利用木糖的发酵单胞菌菌株中，发酵单胞菌的转运蛋白可能是改善葡萄糖和木糖利用以及乙醇生产的突变的靶。

实例

本发明将在下面的实例中得到进一步阐述。应该理解，这些实例尽管说明了本发明的优选实施例，但仅是以例证的方式给出的。从上文的讨论和这些实例中，本领域的技术人员能够确定本发明的特性，并且在不脱离其实质和范围的情况下，能对本发明进行各种变化和修改以适应不同的用途和条件。

缩写的含义如下：“kb”是指千碱基，“bp”是指碱基对，“nt”是指核苷酸，“hr”是指小时，“min”是指分钟，“sec”是指秒钟，“d”是指天数，“L”是指升，“ml”是指毫升，“μL”或“μl”是指微升，“μg”是指微克，“ng”是指纳克，“mM”是指毫摩，“μM”是指微摩，“nm”是指纳摩，“μmol”是指微摩尔，“pmol”是指皮摩尔，“OD600”是指600nm下的光密度。

一般方法

恒浊器

驯化在恒浊器中进行（美国专利6,686,194；Heurisko USA，Inc.Newark，DE），其为连续流动培养装置，其中培养物中的细胞浓度通过控制培养基到培养物的流动而保持恒定，使得培养物的浊度保持在指定的狭窄限制内。培养物在连续培养装置中可利用两种培养基生长，一种为静息培养基（培养基A），一种为刺激培养基（培养基B）。培养物在生长室中的静息培养基上生长至浊度设置点，然后将其以设置以保持细胞密度的稀释速率稀释。通过每10分钟加入一次限定体积的培养基来进行稀释。当恒浊器进入培养基刺激模式时，基于在前一次培养基添加后返回设置点的速率选择加入刺激培养基或静息培养基。生长室中培养基的稳态浓度为培养基A和培养基B的混合；根据从各个培养基提取的速率决定两种培养基的比例，其为设置的稀释速率以允许维持设置的细胞密度。代表生长室中种群的细胞样品以每周的间隔从恒浊器外流液中回收（在捕获室）。所述细胞样品在MRM3G6培养基上生长一次并在-80℃作为甘油原液保存。

酶

CP-100、

CX12L和

1500来自于Danisco U.S.Inc.，Genencor（Rochester，NY）。

Novozyme188获自Novozymes（2880Bagsvaerd，Denmark）。

本文糖化加工中使用的另外酶类是糖基水解酶（GH）Xyn3、Fv3A、Fv51A和Fv43D。Xyn3（SEQ ID NO:9）来自里氏木霉的GH10木聚糖酶家族；Fv3A（SEQ ID NO:10）来自轮枝镰孢菌GH3酶家族；Fv43D（SEQID NO:11）来自轮枝镰孢菌GH43酶家族；并且Fv51A（SEQ ID NO:12）来自轮枝镰孢菌GH51酶家族。

培养基

首先通过对玉米棒粉进行稀氨水预处理来制备驯化中使用的玉米棒水解产物。将水平的Littleford Day130L反应容器加载研磨的玉米棒，所述反应容器包含围绕容器主体和一侧的传递蒸汽的夹套（Littleford Day，Inc.，Florence，KY）。在靠近容器顶部导入29重量%的氢氧化铵溶液和水以提供相对于生物质干重的6重量%的NH₃之前，应用真空使容器内压力降至0.1atm。在所述容器顶部附近引入蒸气以将内部容器温度升高至145℃。保持这一温度20分钟。在预处理结束时，将反应器压力降至大气压。随后施用真空（大约低于1atm）以降低温度至低于60℃。

随后使用酶聚生体来处理经预处理的玉米棒，从而实现使用酶混合物来对纤维素和半纤维素聚合物进行酶法水解，所述酶混合物包含：SpezymeCP-100，34mg蛋白/g经预处理的玉米棒中的葡聚糖；Multifect CX12L，12.5mg蛋白/g经预处理的玉米棒中的木聚糖；Novozymes188，6.6mg蛋白/g经预处理的玉米棒中的葡聚糖。在25%（重量/体积）的经预处理的玉米棒干物质、pH5.3和47℃下进行所述水解反应。连续搅拌所述反应并运行72小时。

使用初次连续离心从所述水解产物中除去固体，从而使该混合物部分地澄清。在18,000×G下对所述部分澄清的混合物再次离心20分钟，随后首先通过0.45微米滤器，继之以0.22微米滤器，从而产生澄清的经过滤消毒的水解产物。

通过HPLC分析测定葡萄糖、木糖和乙酸酯的各自浓度。所述澄清的水解产物具有68g/L的葡萄糖浓度、46g/L的木糖浓度和5g/L的乙酸酯浓度。对所述澄清的水解产物补充以6.2g/L的乙酸铵来提高总乙酸铵浓度，从而使该浓度处于11至12g/L的范围内。在注明的情况下，加入0.5%的酵母提取物（Difco酵母提取物，Becton，Dickinson and Co.，Sparks，MD）来提供额外的营养物。将这一培养基标为HYAc/YE。将HYAc/YE培养基的pH调节到5.8，并且对该培养基进行过滤灭菌。

使用上述方法制备了用于1L发酵测试的水解产物培养基，不同之处在于水解中使用的酶组合物变为包含

1500、Xyn3、Fv3A、Fv51A和Fv43D的酶共混物，其以21.3mg蛋白/g葡聚糖+木聚糖加入所述水解反应。将所述水解产物不经澄清处理而用于1L规模的发酵。

附加的培养基

每升MRM3包含：酵母提取物（10g）、KH₂PO₄（2g）和MgSO₄.7H₂O（1g）

MRM3G6.5X4.5NH₄Ac12.3是包含65g/L葡萄糖、45g/L木糖、12.3g/L乙酸铵的MRM3

G5或MRM3G5是包含50g/L葡萄糖的MRM3

G10或MRM3G10是包含100g/L葡萄糖的MRM3

MRM3G2是包含20g/L葡萄糖的MRM3

MRM3X2是包含20g/L木糖的MRM3

半YEMaxSM：10g/L的Difo酵母提取物、2g/L的KH₂PO₄、5g/L的MgSO₄.7H₂O、10mM的山梨醇、150g/L的葡萄糖

对于图2显示的平板研究，对MRM3G2（20g/L的葡萄糖）和MRM3X2（20g/L的木糖）补充以1.5%琼脂，加热至糖溶解，冷却至45℃并且倒入培养皿。

冷冻原液培养物的制备

对菌株ZW705、每周的恒浊器样品群体培养物和分离的突变体克隆制备了冷冻原液培养物。通过将原始冷冻原液生长于G5或G10培养基并且使用为制备新冷冻原液而产生的生物质来制备另外的冷冻原液。

种菌接种、批式驯化和恒浊器培养物

使用冷冻原液来接种过夜的G5和G10种菌培养物。使用种菌培养物来接种批式驯化培养物，其通过对所述种菌培养物培养基离心并且将细胞团块稀释于新鲜的驯化培养基而进行。对于恒浊器接种，将整个种菌团块重悬浮于10-15ml的恒浊器测试培养基中并将其用于接种恒浊器反应器或将5ml的过夜种菌用作为10%的接种物。

培养物OD600测量

为测量培养物的OD，将样品稀释于100g/L的xylose（稀释物和空白）中。在进行OD测量之前将经稀释的培养物放置15分钟。全部的OD测量均在600nm下进行。

HPLC分析

使用Waters Alliance HPLC***来实施HPLC分析。所用的色谱柱为具有BioRad Micro-Guard Cartridge Cation-H（#125-0129，Bio-Rad，Hercules，CA）的Transgenomic ION-300色谱柱（#ICE-99-9850，Transgenomic，Inc）。使用0.01N H2SO4作为溶剂，在75℃和0.4mL/min的流速下运行所述色谱柱。采用外标校准曲线，用折射率检测器测定原料糖和产物的浓度。

菌株ZW705的描述

运动发酵单胞菌菌株ZW705产自菌株ZW804-1。ZW801-4是重组利用木糖的运动发酵单胞菌菌株，描述于共同拥有的美国专利7,741,119中，该专利以引用方式并入本文。菌株ZW801-4来源于菌株ZW800，菌株ZW800来源于菌株ZW658，它们均描述于美国专利7,741,119中。ZW658通过经由序贯转座事件将两个操纵子整合到ZW1（ATCC31821）基因组中，然后通过包含木糖的选择培养基筛选进行构建（U.S7,629,156），所述操纵子是P_gapxylAB和P_gaptaltkt，它们包含编码木糖异构酶、木酮糖激酶、转醛醇酶和转酮醇酶的四个木糖利用基因。ZW658被保存为ATCCPTA-7858。在ZW658中，使用宿主媒介的基因双交换同源重组和作为选择性标记的奇放线菌素抗性使编码葡萄糖-果糖氧化还原酶的基因***失活以产生ZW800（U.S.7,741,119）。使用Cre重组酶，通过位点特异性重组移除由loxP位点束缚的奇放线菌素抗性标记以产生ZW801-4。

运动发酵单胞菌菌株ZW801-4的培养物针对在包含乙酸铵的培养基的胁迫条件下的生长进行驯化，从而产生了ZW705，正如共同拥有的美国专利公布US20110014670A1中的描述，该专利以引用方式并入本文。ZW801-4的连续培养在250ml搅拌的、pH和温度受控的发酵罐（Sixfors;Bottmingen，Switzerland）中进行。发酵基础培养基是5g/L酵母提取物，15mM磷酸铵，1g/L硫酸镁，10mM山梨醇，50g/L木糖和50g/L葡萄糖。通过在97天中逐渐提高加到上述连续培养基中的乙酸铵浓度，同时保持通过特定稀释速率测得的确定生长速率来影响在高浓度乙酸和氨的存在下的适应生长。奖乙酸铵浓度提升至160mM。通过加入磷酸铵至在连续培养139天的末期最终总铵离子浓度为210mM来实现铵离子浓度的进一步提高。通过接种单菌落并扩增一个选择的菌落来从适应种群中分离菌株ZW705。

实例1

使用自动细胞密度受控的连续培养设备针对玉米棒水解产物的驯化

将基本方法中所述的恒浊器用于将运动发酵单胞菌培养物进行在玉米棒水解产物培养基中生长的驯化。将菌株ZW705的培养物生长于基本方法中所述的恒浊器中直至任意的浊度设定点，其规定所述培养物使用了输入培养基中的全部葡萄糖和约一半的木糖以符合在设定的稀释速度下所述设定点的细胞密度。使用静息培养基，其为50%HYAc/YE和50%MRM3G6.5X4.5NH₄Ac12.3。使用刺激培养基HYAc/YE根据基本方法中的所述运行恒浊器。在6周中每周从捕集腔（trap chamber）收取细胞样品。

6周连续培养后，将每周保存的细胞原液的样品在MRM3G6中复苏并且在33℃下在10ml静态培养物中生长至约1OD600。将这些培养物用于接种12ml HYAc/YE培养基的培养物直至约0.4OD600nm，并在30℃下生长该培养物。根据表1在不同时间收取样品，对OD600、糖消耗和乙醇生产进行分析。结果示于表1中。

表1：对12ml的HYAc/YE发酵物中的每周恒浊器样品的分析

全部培养物保持了在木糖上生长的能力，但是木糖利用的速度在驯化第三周后显示出降低。从第3周结束时取样的细胞培养物分离了单菌落。通过将保存的甘油原液在MRM3G5中生长并随后涂布于MRM3X2平板来分离菌落。单菌落是印迹于MRM3X2和MRM3G2平板上的复制品。在两种碳源上选择大而密实的印片作为菌株并且作为冷冻甘油原液加以维持。根据上文所述的冷冻原液群体测试的描述，将选定的菌株生长于12ml的测试培养物上。六种菌株和ZW705的结果在表2中示出。

表2：对从生长于12ml的HYAc/YE发酵物中的ZW705的恒浊器驯化第3周分离的纯培养物的分析

全部选定菌株在12ml测试中产生了比进入驯化的菌株（ZW705）更多的乙醇。所述菌株利用了略多于亲本菌株的木糖。选择菌株12-18X-2-36用于另一回合的驯化。

实例2

使用自动细胞密度受控的连续培养设备针对外加乙醇的玉米棒水解产物的驯化

如上文针对菌株ZW705以及基本方法中所述，将菌株12-18X-2-36（描述于实例1中）的培养物生长于恒浊器中，不同之处在于静息培养基是HYAc/YE并且刺激培养基是HYAc/YE+9重量%乙醇。将恒浊器运行4周，每周对腔室外向流取样。通过所述外向流样品制备冷冻细胞原液。在MRM3G6中复苏冷冻细胞原液以用于12ml水解产物发酵，所述发酵在与第一次恒浊器运行所描述的相同条件下进行，但具有约0.5OD600的起始密度。一组发酵在相同的HYAc/YE培养基中进行，另一组发酵在加入了30g/L培养基的乙醇的HYAc/YE培养基中进行。两组发酵的结果均在表3中示出。

表3：对生长于12ml的HYAc/YE或HYAc/YE+30g/L乙醇发酵物中的每周恒浊器样品的分析

在未向HYAc/YE培养基中添加乙醇的测试发酵中，全部培养物均类似于ZW705对照。在向HYAc/YE培养基中添加30g/L乙醇的发酵中，在第1周和第2周后收取的培养物在利用葡萄糖和产生乙醇方面远远优于ZW705以及第3周和第4周的样品。在以外加乙醇起始的测试中，在第2周储存的培养物具有最高的终末乙醇滴度并且其被选择用于分离单细胞来源菌株。将针对产生12-18X-2-36菌株的筛选而描述的菌株分离工序实施两次，并且两回合筛选的结果在表4和5中示出。筛选在未添加乙醇或添加了40g/L乙醇的HYAc/YE培养基中起始。

表4：对从生长于12ml HYAc/YE或HYAc/YE+乙醇的发酵物中的12- 18X-2-36进行的恒浊器驯化第2周分离的纯培养物的分析（第1回合）

当以未添加乙醇起始时，大多数菌株利用了所述水解产物培养基中的全部葡萄糖，但并未利用全部的木糖，从而使总乙醇生产取决于木糖利用的程度。数个菌株利用了比未驯化亲本菌株ZW705更多的木糖并且产生了更多的乙醇。当将40g/L的乙醇加入起始培养基时，在全部菌株中生长和糖利用远为更低。在这一测试中，大多数情况下中木糖利用极低或者木糖完全未被消耗。三个菌株利用了比ZW705显著更多的葡萄糖并且产生了更多的乙醇。这些菌株中的最佳菌株是表4中示出的驯化株5-6。

表5：对从生长于12ml HYAc/YE或HYAc/YE+乙醇的发酵物中的12- 18X-2-36进行的恒浊器驯化第2周分离的纯培养物的分析（第2回合）

第二菌株分离实验中的结果类似。在未添加乙醇的测试中数个菌株利用了比ZW705更多的木糖，并且在添加乙醇的测试中利用了更多的葡萄糖。多个菌株在生长的最初24小时中利用了更多的葡萄糖，并且根据在最初24小时中OD600nm的测量还获得了更高的细胞量。这些菌株中，驯化株7-31被选用于进一步测试。

实例3

水解产物驯化株的性能测试

种菌发酵

种菌发酵在1L的发酵罐内（Sartorious Stedim BIOSTAT）进行。将无菌的空发酵罐填充经过滤消毒的半YEMaxSM。种菌发酵在33℃和pH5.5下实施，使用了未过滤的4N NH₄OH作为碱来控制于pH5.5。使用足以在半YEMaxSM生长7.5小时达到约2.5的OD600的冷冻原液细胞接种种菌发酵物。将细胞稀释进入所述1L发酵罐中以给出约0.025的初始OD600nm。一般情况下，在已经消耗了～120g/L的葡萄糖的时候和/或OD600达到约10的时候收集种菌发酵物。对所述种菌发酵进行定期取样以监测生长，并且在约18.5小时收集。

水解产物发酵

水解产物发酵在1L的发酵罐内（Sartorious Stedim BIOSTAT）进行。将无菌的空发酵罐填充450ml的玉米棒水解产物，其如基本方法中所述而制备。水解产物发酵在pH5.8下实施，使用了未过滤的4N NaOH作为碱来调节pH。水解产物发酵在33℃下起始。使用来自种菌发酵（参见上文）的10体积%（50ml）的种菌接种水解产物发酵物以产生约1.0的初始OD。对所述水解产物发酵进行定期取样以监测反应进程。如基本方法中所述对样品分析葡萄糖、木糖和乙醇。

两组水解产物发酵相隔一周来运行，各组发酵均以对照菌株ZW705和从驯化中选择的菌株驯化株7-31（实例2）而进行。所述发酵的时间过程在图1中示出。在所述发酵过程中，驯化株7-31利用葡萄糖比ZW705更快，并且利用了更多的总木糖以达到更高的乙醇滴度。

如上文所述运行水解产物发酵并对其分析以比较对照菌株ZW705、驯化株7-31以及驯化株5-6（参见实例2）。结果在图2中示出。驯化株5-6的性能等同于驯化株7-31。通过在发酵起始时更快地利用葡萄糖并通过在发酵结束时利用了更多的木糖，两种驯化株均获得了更高的最终乙醇滴度。

实例4

对驯化株的比较性DNA测序

野生型运动发酵单胞菌（ZM4）的全基因组序列已被描述（Jeong-SunSeo等人，Nature Biotechnology.23，2005）。对野生型起始菌株（ZW1；ATCC31821）、中间菌株（ZW658；ATCC PTA-7858）和ZW705通过高通量454技术（Shendure与Ji，Nature Biotech.26:1135（2008））进行了测序并与公开的野生型序列进行了比较。使用Ilumina技术（Shendure与Ji，Nature Biotech26:1135（2008））对驯化株5-6和驯化株7-31进行了测序。通过野生型序列、ZW658的序列以及对来自所述两种木糖利用操纵子的***和GFPR基因的敲除的蓄意序列变化的经独立测定的***位点（描述于基本方法中）而得到了共有序列，来自驯化株的序列可与所述共有序列进行比较。测序和基因组组装的描述如下。

测序

使用Illumina/Solexa和Roche-454测序技术对菌株进行测序。这些大规模平行测序方法提供了短读值的极高通量。对于Illumina，其给出了超过2亿的100bp长度的读值。对于Roche-454，输出的1百万读值长为500bp。两种方法均实现了从基因组DNA片段的两端进行的测序以产生配对末端读值。

来自驯化株5-6和7-31的数以亿计短读值与参照基因组序列进行比对，所述参照基因组序列通过野生型、ZW658和ZW705序列而制备。分析所得的比对来收集覆盖率和变异的信息。由于大量的读值与特定区比对，所述比对是读值针对参照的堆积，并且给定位点的覆盖深度是覆盖这一位点的读值数量。在某一位点如果共有碱基不同于参照碱基，则该位点被称为具有单核苷酸多态性（SNP）变异。

在驯化株5-6和驯化株7-31序列与驯化起始菌株ZW705的序列的比较中，对各驯化株均鉴定出一个单碱基变化，或SNP。驯化株5-6的SNP位于位置1453116处，其处于名为zmo1330的基因的开放阅读框内。驯化株7-31的SNP位于相同的开放阅读框内，但是该变化处于不同的位点（1453863）。驯化株5-6的变化处于编码区（SEQ ID NO:1）的位置1097处，并且为在该位置从C向G的变化。这一突变导致了氨基酸366的密码子从ACA向AGA的变化，引起了在编码的蛋白质中氨基酸366从苏氨酸向精氨酸的变化。驯化株7-31的变化处于编码区（SEQ ID NO:1）的位置350处，并且为在该位置从C向T的变化。这一突变导致了氨基酸117的密码子从TCT向TTT的变化，引起了在编码的蛋白质中氨基酸117从丝氨酸向苯丙氨酸的变化。

将zmo1330编码的蛋白质用于对转运蛋白分类数据库（transporterclassification data base）（Saier Lab Bioinformatics Group；Saier等人（2009），Nucl.Acids Res.，37:D274-8）的BLAST分析，其将所述蛋白质鉴定为属于aaeB家族。这一家族的蛋白质特征在于具有预测为5至6次跨膜的疏水性N末端、相当长且疏水性较低的中段以及随后在C末端类似的5至6次跨膜。这一结果提示zmo1330编码的蛋白质是膜转运蛋白。

在公开的运动发酵单胞菌基因组序列（Seo等人，ibid；NCBI参考号：NC_006526.2）中，zmo1330对应于标注为编码“镰刀菌酸抗性蛋白”的zmo1432。在洋葱假单胞菌中对镰刀菌酸的抗性所需的蛋白组合由Utsumi等人鉴定（Agric.Biol.Chem.55:1919-1918（1991））。表现为产生镰刀菌酸抗性的操纵子的开放阅读框（ORF）组中有由Utsumi等人（ibid）命名的fusB。fusB编码的蛋白质的序列与来自新洋葱伯克霍尔德菌的Bcenm03_1426（SEQ ID NO:7）相同，其与zmo1432编码的蛋白质进行了比对。如图3中示出，所述两种蛋白质序列比对具有三个小间隙并且具有22%同一性，但具有63%的相似性（Clustal W比对）。Bcenm03_1426的序列与AaeB（SEQ ID NO:8）具有大致相同的同一性和相似性，AaeB是在大肠杆菌操纵子中编码的两个蛋白质中的较大一个，所述两个蛋白质据显示为对氨基苯甲酸（pABA）耐受性所需（VanDyk等人，J.Bact.186:7196-7204（2004））。Zmo1432与大肠杆菌aaeB具有17%的同一性和55%的相似性。zmo1432编码的蛋白质的比对以及与aaeB的比对在图4中示出。

Claims

1.重组的、利用木糖的、产生乙醇的发酵单胞菌（Zymomonas）属微生物，所述微生物在zmo1432开放阅读框中具有至少一种基因修饰。

2.根据权利要求1所述的重组发酵单胞菌，其中所述具有至少一种基因修饰的zmo1432开放阅读框编码多肽，所述多肽具有的氨基酸序列与如SEQ ID NO:2中所示的氨基酸序列具有至少约95%的同一性，其中与缺乏所述基因修饰的发酵单胞菌在相同条件下生产的产量相比，所述突变蛋白的存在提高发酵期间所述发酵单胞菌在生物质水解产物培养基中生产的乙醇产量。

3.根据权利要求2所述的重组发酵单胞菌，其中所述基因修饰是在所述zmo1432编码区中的突变，所述突变引起选自下列的氨基酸取代：1）在SEQ ID NO:2中，在位置366处的精氨酸对苏氨酸的取代；和2）在SEQ ID NO:2中，在位置117处的苯丙氨酸对丝氨酸的取代。

4.根据权利要求1所述的重组发酵单胞菌，与缺乏所述zmo1432开放阅读框中的至少一种基因修饰的发酵单胞菌相比，所述重组发酵单胞菌对生物质水解产物具有更高的耐受性。

5.多核苷酸，所述多核苷酸编码具有选自SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4的氨基酸序列的蛋白。

6.多肽，所述多肽具有选自SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4中的氨基酸序列。

7.制备重组发酵单胞菌产乙醇生物的方法，包括：

a)提供利用木糖的、产生乙醇的发酵单胞菌属微生物，所述微生物包含zmo1432开放阅读框，所述zmo1432开放阅读框编码具有如SEQID NO:2中所示的氨基酸序列的多肽；以及

8.生产乙醇的方法，包括：

a)提供权利要求1的重组发酵单胞菌；

b)提供包含木糖的生物质水解产物培养基；以及