CN107941770B - 变焦双光子光镊显微成像装置和方法 - Google Patents

变焦双光子光镊显微成像装置和方法 Download PDF

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Abstract

变焦双光子光镊显微成像装置和方法，属于光学显微成像与光学操控技术领域。本发明专利的技术特点是：装置包括：双光子照明模块、双光子扫描模块、双光子探测模块、双光子轴向调焦模块和光镊聚焦模块。本发明在常规双光子显微***中增加由偏振分光镜、四分之一波片、低孔径物镜、管镜和平面反射镜组成的轴向调焦装置，实现共光路光镊双光子显微镜中双光子焦面的轴向移动，从而抓取悬浮样品实现轴向移动，完成双光子三维层析扫描成像。该发明具有装调简单，变焦与轴向层析速度快，低观测成本低的优点。

Description

变焦双光子光镊显微成像装置和方法
技术领域
本发明涉及一种显微成像装置及方法，具体涉及一种变焦双光子光镊显微成像装置和方法，可实现共光路双光子显微***分离调焦，完成三维双光子扫描成像，属于光学显微成像与光学操控技术领域。
背景技术
在常规物镜式光镊显微镜中，光镊装置与成像装置通常位于样品两侧，方便进行单独调焦，然而在某些需要引入其他环境变量的显微观测应用中(如在样品一侧加入辐射装置用于研究活细胞对辐射的响应机制)，要求光镊与成像装置位于样品同侧，此时，由于光镊与三维显微成像装置共用同一颗物镜，其焦面难以分离，无法实现三维扫描成像。在双光子显微***中加入变焦镜头或DMD可以改变双光子显微***的聚焦位置，解决上述问题，然而调制速度较慢或成本昂贵。
发明内容
在下文中给出了关于本发明的简要概述，以便提供关于本发明的某些方面的基本理解。应当理解，这个概述并不是关于本发明的穷举性概述。它并不是意图确定本发明的关键或重要部分，也不是意图限定本发明的范围。其目的仅仅是以简化的形式给出某些概念，以此作为稍后论述的更详细描述的前序。
鉴于此，为了克服上述技术问题，本发明提供了一种变焦双光子光镊显微成像装置和方法，不仅可以提高变焦与轴向层析速度，而且还可以降低观测成本。
方案一：本发明提供了一种变焦双光子光镊显微成像装置，包括双光子照明模块、双光子轴向调焦模块、双光子扫描模块、双光子探测模块和光镊聚焦模块：
所述双光子照明模块按照光线传播方向依次为：激光器一、扩束镜、偏振分光镜；
所述双光子轴向调焦模块按照光线传播方向依次为：偏振分光镜、四分之一波片、物镜一和平面反射镜；
所述双光子扫描模块按照光线传播方向依次为：扫描振镜、扫描透镜、管镜一、二向色镜一、二向色镜二和物镜二；
所述双光子探测模块按照光线传播方向依次为：物镜二、二向色镜二、滤光片和PMT；
所述光镊聚焦模块按照光线传播方向依次为：激光器二、传导光纤、准直镜、管镜三、管镜二、二向色镜一、二向色镜二和物镜二；
所述双光子照明模块、双光子轴向调焦模块共用偏振分光镜；
所述双光子扫描模块、光镊聚焦模块共用二向色镜一与物镜二；
所述双光子扫描模块、光镊聚焦模块、双光子探测模块还共用二向色镜二；
物镜二的下方设置被测样品。
进一步地：所述被测样品为悬浮于培养皿中最大直径为微米级或纳米级单细胞、细胞群或微粒等近似球形的待测样品。
进一步地：所述光镊聚焦模块，其发射单色激光波长介于750nm-900nm之间，双光子照明模块，其发射单色飞秒激光波长介于950nm-1100nm之间，脉冲宽度小于150fs，经过二向色镜一合成光路，共用物镜二夹持和观测被测样品。
进一步地：所述偏振分光镜反射光偏振方向同激光器一出射光偏振方向相同。
进一步地：所述平面反射镜轴向最大移动范围等于物镜一的焦深。
方案二：本发明提出的一种变焦双光子光镊显微成像方法，该方法是基于方案一所述的变焦双光子光镊显微成像装置实现的，具体步骤：
步骤a、激光器一发出激发光，经过扩束镜和偏振分光镜之后形成平行光，平行光经过四分之一波片和物镜一透射到平面反射镜产生反射激光，再经过扫描振镜、扫描透镜、管镜一、二向色镜一、二向色镜二和物镜二透射后在被测样品上形成聚焦光斑，所述聚焦光斑激发被测样品发出荧光；
步骤b、激光器二发出激光经过传导光纤和准直镜产生平行光，再经过管镜三、管镜二、二向色镜一、二向色镜二和物镜二形成聚焦光斑，夹住被测样品；
步骤c、设置平面反射镜初始位置位于物镜一的准焦面②，则双光子聚焦位置位于物镜二的准焦面②’，设置平面反射镜轴向扫描范围D1+D2，则对应双光子聚焦光斑轴向扫描范围为D1’+D2’，平面反射镜位置与双光子聚焦位置对应关系为D1/D1’＝D2/D2’＝(M1M2)2；所述D1为平面反射镜远焦位移，D1’为双光子聚焦位置近焦位移，D2为平面反射镜近焦位移，D2’为双光子聚焦位置远焦位移，M1为物镜一与扫描透镜的焦距比值，M2为管镜一与物镜二的焦距比值；
步骤d、设置扫描层数为N，则平面反射镜扫描步进为(D1+D2)/N，双光子聚焦光斑扫描步进为(D1’+D2’)/N，从而实现快速三维层析扫描。
有益效果：
传统共光路光镊显微成像***中通常使用变焦镜或DMD调制波前的途径进行光镊***与显微成像***的焦面分离，用于三维成像，然而具有装调复杂、调制速度受限与成本昂贵的弊端。本发明利用由偏振分光镜、四分之一波片、低孔径物镜、管径和平面反射镜组成的双光子调焦模块，可实现在载物台和物镜不动的情况下，仅通过轴向移动平面反射镜使双光子焦面进行轴向移动，完成对光镊抓取样品的快速三维扫描成像；本发明装调简单，可以提高变焦与轴向层析速度，而且还可以降低观测成本。
附图说明
图1为本发明的变焦双光子光镊显微成像装置的结构示意图。
图2为本发明的变焦双光子光镊显微成像方法流程图。
图中：1激光器一、2扩束镜、3偏振分光镜、4四分之一波片、5物镜一、6平面反射镜、7扫描振镜、8扫描透镜、9管镜一、10二向色镜一、11二向色镜二、12物镜二、13被测样品、14滤光片、15收集透镜、16PMT、17管镜二、18管镜三、19准直镜、20传导光纤、21激光器二。
具体实施方式
在下文中将结合附图对本发明的示范性实施例进行描述。为了清楚和简明起见，在说明书中并未描述实际实施方式的所有特征。然而，应该了解，在开发任何这种实际实施例的过程中必须做出很多特定于实施方式的决定，以便实现开发人员的具体目标，例如，符合与***及业务相关的那些限制条件，并且这些限制条件可能会随着实施方式的不同而有所改变。此外，还应该了解，虽然开发工作有可能是非常复杂和费时的，但对得益于本发明公开内容的本领域技术人员来说，这种开发工作仅仅是例行的任务。
在此，还需要说明的一点是，为了避免因不必要的细节而模糊了本发明，在附图中仅仅示出了与根据本发明的方案密切相关的装置结构和/或处理步骤，而省略了与本发明关系不大的其他细节。
实施例1：如附图1所示本实施例提供了一种变焦双光子光镊显微成像装置，用于快速切换轴向位置实现三维层析扫描。
一种变焦双光子光镊显微成像装置，包括双光子照明模块、双光子轴向调焦模块、双光子扫描模块、双光子探测模块和光镊聚焦模块：
所述双光子照明模块按照光线传播方向依次为：激光器一1、扩束镜2、偏振分光镜3；
所述双光子轴向调焦模块按照光线传播方向依次为：偏振分光镜3、四分之波片4、物镜一5和平面反射镜6；
所述双光子扫描模块按照光线传播方向依次为：扫描振镜7、扫描透镜8、管镜一9、二向色镜一10、二向色镜二11和物镜二12；
所述双光子探测模块按照光线传播方向依次为：物镜二12、二向色镜二11、滤光片14、收集透镜15和PMT16；
所述光镊聚焦模块按照光线传播方向依次为：激光器二21、传导光纤20、准直镜19、管镜三18、管镜二17、二向色镜一10、二向色镜二11和物镜二12；
所述双光子照明模块、双光子轴向调焦模块共用偏振分光镜3；
所述双光子扫描模块、光镊聚焦模块共用二向色镜一10与物镜二12；
所述双光子扫描模块、光镊聚焦模块、双光子探测模块还共用二向色镜二11；
物镜二12的下方设置被测样品13。
更为具体地：所述物镜一5为低孔径物镜，孔径小于0.4。
更为具体地：所述被测样品13为置于培养皿中的微米级或纳米级悬浮细胞或颗粒状待测样品。
更为具体地：所述光镊聚焦模块，其发射单色激光波长介于750nm-900nm之间，双光子照明模块，其发射单色飞秒激光波长介于950nm-1100nm之间，脉冲宽度小于150fs，经过二向色镜一10合成光路，共用物镜二12夹持和观测被测样品13。
更为具体地：所述偏振分光镜3反射光偏振方向同激光器一1出射光偏振方向相同。
更为具体地：所述平面反射镜6轴向最大移动范围等于物镜一5的焦深。
实施例2：如附图1和图2所示本实施例提供了一种变焦双光子光镊显微成像方法，用于快速切换轴向位置实现三维层析扫描。
一种变焦双光子光镊显微成像方法，该方法是基于实施例1所述的变焦双光子光镊显微成像装置实现的，具体步骤：
步骤a、激光器一1发出激发光，经过扩束镜2和偏振分光镜3之后形成平行光，平行光经过四分之一波片4和物镜一5透射到平面反射镜6产生反射激光，再经过扫描振镜7、扫描透镜8、管镜一9、二向色镜一10、二向色镜二11和物镜二12透射后在被测样品13上形成聚焦光斑，所述聚焦光斑激发被测样品13发出荧光；
步骤b、激光器二21发出激光经过传导光纤20和准直镜19产生平行光，再经过管镜三18、管镜二17、二向色镜一10、二向色镜二11和物镜二12形成聚焦光斑，夹住被测样品13；
步骤c、设置平面反射镜6初始位置位于物镜一5的准焦面②，则双光子聚焦位置位于物镜二13的准焦面②’，设置平面反射镜6轴向扫描范围D1+D2，则对应双光子聚焦光斑轴向扫描范围为D1’+D2’，平面反射镜6位置与双光子聚焦位置对应关系为D1/D1’＝D2/D2’＝(M1M2)2；所述D1为平面反射镜6远焦位移，D1’为双光子聚焦位置近焦位移，D2为平面反射镜6近焦位移，D2’为双光子聚焦位置远焦位移，M1为物镜一5与扫描透镜8的焦距比值，M2为管镜一9与物镜二12的焦距比值；
步骤d、设置扫描层数为N，则平面反射镜6扫描步进为(D1+D2)/N，双光子聚焦光斑扫描步进为(D1’+D2’)/N，从而实现快速三维层析扫描。
更为具体地：双光子照明模块发出激光经过双光子扫描模块与光镊聚焦模块合成光路，反射光进入双光子探测模块，双光子轴向调焦模块中，平面反射镜在位置①时，对应光镊聚焦位置为①’，平面反射镜在位置②时，对应光镊聚焦位置为②’，平面反射镜在位置③时，对应光镊聚焦位置为③’。
平面反射镜初始位置为②，光镊双光子焦面初始位置为②’，轴向移动平面反射镜至图中①②③处位置，对应经物镜二12聚焦光斑位置发生对应位置变化至图中①’②’③’处位置，平面反射镜与焦面移动距离对应关系为D1/D1’＝D2/D2’＝(M1M2)2。
更为具体地：物镜二12的投射光线，经二向色镜二11、滤光片14和收集透镜15后进入PMT16，所述PMT为光电倍增管。
虽然本发明所揭示的实施方式如上，但其内容只是为了便于理解本发明的技术方案而采用的实施方式，并非用于限定本发明。任何本发明所属技术领域内的技术人员，在不脱离本发明所揭示的核心技术方案的前提下，可以在实施的形式和细节上做任何修改与变化，但本发明所限定的保护范围，仍须以所附的权利要求书限定的范围为准。

Claims (6)

1.变焦双光子光镊显微成像装置，其特征在于：包括双光子照明模块、双光子轴向调焦模块、双光子扫描模块、双光子探测模块和光镊聚焦模块：
所述双光子照明模块按照光线传播方向依次为：激光器一(1)、扩束镜(2)、偏振分光镜(3)；
所述双光子轴向调焦模块按照光线传播方向依次为：偏振分光镜(3)、四分之一波片(4)、物镜一(5)和平面反射镜(6)；
所述双光子扫描模块按照光线传播方向依次为：扫描振镜(7)、扫描透镜(8)、管镜一(9)、二向色镜一(10)、二向色镜二(11)和物镜二(12)；
所述双光子探测模块按照光线传播方向依次为：物镜二(12)、二向色镜二(11)、滤光片(14)、收集透镜(15)和PMT(16)；
所述光镊聚焦模块按照光线传播方向依次为：激光器二(21)、传导光纤(20)、准直镜(19)、管镜三(18)、管镜二(17)、二向色镜一(10)、二向色镜二(11)和物镜二(12)；
所述双光子照明模块、双光子轴向调焦模块共用偏振分光镜(3)；
所述双光子扫描模块、光镊聚焦模块共用二向色镜一(10)与物镜二(12)；
所述双光子扫描模块、光镊聚焦模块、双光子探测模块还共用二向色镜二(11)；
物镜二(12)的下方设置被测样品(13)。
2.根据权利要求1所述的变焦双光子光镊显微成像装置，其特征在于：所述被测样品(13)为悬浮于培养皿中为微米级或纳米级单细胞、细胞群或微粒的待测样品。
3.根据权利要求1所述的变焦双光子光镊显微成像装置，其特征在于：所述光镊聚焦模块，其发射单色激光波长介于750nm-900nm之间，双光子照明模块，其发射单色飞秒激光波长介于950nm-1100nm之间，经过二向色镜一(10)合成光路，共用物镜二(12)夹持和观测被测样品(13)。
4.根据权利要求3所述的变焦双光子光镊显微成像装置，其特征在于：所述偏振分光镜(3)反射光偏振方向同激光器一(1)出射光偏振方向相同。
5.根据权利要求4所述的变焦双光子光镊显微成像装置，其特征在于：所述平面反射镜(6)轴向最大移动范围等于物镜一(5)的焦深。
6.变焦双光子光镊显微成像方法，该方法是基于权利要求1～5中任一所述变焦双光子光镊显微成像装置实现的，其特征在于：具体步骤：
步骤a、激光器一(1)发出激发光，经过扩束镜(2)和偏振分光镜(3)之后形成平行光，平行光经过四分之一波片(4)和物镜一(5)透射到平面反射镜(6)产生反射激光，再经过扫描振镜(7)、扫描透镜(8)、管镜一(9)、二向色镜一(10)、二向色镜二(11)和物镜二(12)透射后在被测样品(13)上形成聚焦光斑，所述聚焦光斑激发被测样品(13)发出荧光；
步骤b、激光器二(21)发出激光经过传导光纤(20)和准直镜(19)产生平行光，再经过管镜三(18)、管镜二(17)、二向色镜一(10)、二向色镜二(11)和物镜二(12)形成聚焦光斑，夹住被测样品(13)；
步骤c、设置平面反射镜(6)初始位置位于物镜一(5)的准焦面②，则双光子聚焦位置位于物镜二(12)的准焦面②’，设置平面反射镜(6)轴向扫描范围D1+D2，则对应双光子聚焦光斑轴向扫描范围为D1’+D2’，平面反射镜(6)位置与双光子聚焦位置对应关系为D1/D1’＝D2/D2’＝(M1M2)2；所述D1为平面反射镜(6)远焦位移，D1’为双光子聚焦位置近焦位移，D2为平面反射镜(6)近焦位移，D2’为双光子聚焦位置远焦位移，M1为物镜一(5)与平面反射镜(6)的焦距比值，M2为管镜一(9)与物镜二(12)的焦距比值；
步骤d、设置扫描层数为N，则平面反射镜(6)扫描步进为(D1+D2)/N，双光子聚焦光斑扫描步进为(D1’+D2’)/N，从而实现快速三维层析扫描。
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