CN105043988A - 基于扫描振镜的单点去卷积显微***与成像方法 - Google Patents

Abstract

本发明基于扫描振镜的单点去卷积显微***与成像方法属于光学显微测量领域；该显微***包括螺旋相位板等元件；第一平行光和第二平行光最终在荧光样品上分别形成环形光斑和圆形光斑；荧光样品表面激发出的荧光被光电探测器接收并成像；在上述***上实现的成像方法，首先得到坐标为(i,j)的物点的灰度值，再通过调整两个扫描振镜，遍历i和j的所有取值，利用所有物点的灰度值信息，构造完整的二维图像；本发明与传统STED技术的不同在于在不同时刻照射两束波长相同的激光束，并利用两幅图像求差来缩小感兴趣区域的范围，同时引入去卷积运算，去除非焦平面上的模糊，减少探测器的卷积效应带来的测量误差，最终提高成像***的分辨率。

Description

基于扫描振镜的单点去卷积显微***与成像方法

技术领域

本发明基于扫描振镜的单点去卷积显微***与成像方法属于光学显微测量领域。

背景技术

在纳米技术和生物技术的研究当中，高分辨显微成像技术起到了至关重要的作用。特别是在生命科学领域，为了更好地理解人体生命的作用过程和疾病的产生机理，需要观察细胞(细胞内器官)、病毒等在三维细胞内的三维空间位置和分布，需要在细胞内精确定位特定的蛋白质以研究其位置与功能的关系。而反映这些体系性质的特征尺度都在纳米量级。光学显微技术可以通过非接触的方式实现快速成像、长时间监控成像，同时不会影响生物体系的活性。近年来，随着新的荧光探针和成像理论的出现，光学显微镜的分辨率得以突破光学衍射极限，达到可以与电子显微镜相媲美的精度，并可以在活细胞上看到纳米尺度的蛋白质。这些分辨率突破光学衍射极限的显微技术被称为超分辨显微术。其中，最著名的当属获得2014年诺贝尔奖的受激辐射损耗(StimulatedEmissionDepletion，STED)显微技术。

STED技术由StefanW.Hell提出(Hell,S.W.andWichmann,J.(1994),‘Breakingthediffractionresolutionlimitbystimulatedemission:Stimulated-emission-depletionfluorescencemicroscopy’，OpticsLetters，19(11):780–782)，其基本思想是同时照射两束具有不同波长的皮秒脉冲激光光束，其中一束皮秒脉冲激光光束在样品表面会聚成面包圈状的第一聚焦光斑，另外一束皮秒脉冲激光光束在样品表面会聚成第二聚焦光斑，将两个光斑中心重合，其中位于光斑中心区域的荧光物质激发出荧光，位于光斑内但不在光斑中心区域中的荧光物质发生退激发，不发出荧光，从而实现超分辨成像。

发明内容

本发明在传统STED技术的基础上，在不同时刻照射两束具有相同波长的激光束，同时采用了去卷积算法，进一步提高显微***的分辨率。

本发明的目的是这样实现的：

基于扫描振镜的单点去卷积显微***，包括螺旋相位板、分光棱镜、偏振分束器、X轴扫描振镜、Y轴扫描振镜、扫描透镜、管镜、聚焦物镜、长波通滤光片、收集物镜和光电探测器；

第一平行光经过螺旋相位板调制后，依次经过分光棱镜和偏振分束器透射，X轴扫描振镜和Y轴扫描振镜反射，扫描透镜和管镜透射，由聚焦物镜汇聚在荧光样品上，形成环形光斑；

所述的螺旋相位板使第一平行光附加螺旋相位因子exp(ilθ)；其中，i为虚数单位，l为螺旋相位板的拓扑荷数，θ为旋转方位角；所述X轴扫描振镜由X轴电机带动、受X轴伺服***控制，Y轴扫描振镜由Y轴电机带动、受Y轴伺服***控制，X轴扫描振镜与Y轴扫描振镜相互配合，实现对样品进行XY面的逐点扫描；

第二平行光经过分光棱镜反射后，依次经过偏振分束器透射，X轴扫描振镜和Y轴扫描振镜反射，扫描透镜和管镜透射，由聚焦物镜汇聚在荧光样品上，形成圆形光斑；

所述第一平行光与第二平行光波长相同，在经过分光棱镜后同轴传递，将荧光样品表面激发出荧光，所述荧光依次经过聚焦物镜、管镜和扫描透镜透射，Y轴扫描振镜、X轴扫描振镜和偏振分束器反射，长波通滤光片透射，由收集物镜汇聚到光电探测器上进行成像。

上述基于扫描振镜的单点去卷积显微***，所述的偏振分束器替换为二向色镜。

上述基于扫描振镜的单点去卷积显微***，所述的长波通滤光片替换为带通滤光片。

上述基于扫描振镜的单点去卷积显微***，所述长波通滤光片的截止波长λ选取应满足：λ₁＜λ＜λ₂，其中，λ₁为激发光波长，λ₂为荧光样品表面激发出的荧光波长。

一种在上述基于扫描振镜的单点去卷积显微***上实现的成像方法，首先得到坐标为(i,j)的物点的灰度值sum_i,j，再通过调整X轴扫描振镜和Y轴扫描振镜的角度，遍历i和j的所有取值，利用所有物点的灰度值信息，构造完整的二维图像。

上述成像方法，所述的坐标为(i,j)的物点的灰度值信息，通过以下步骤得到：

步骤a、在只照射第一平行光，不照射第二平行光的条件下，光电探测器以坐标(i,j)为中心对荧光样品进行成像，得到分辨率为m×n的第一图像Image1_m,n；

步骤b、在只照射第二平行光，不照射第一平行光的条件下，光电探测器以坐标(i,j)为中心对荧光样品进行成像，得到分辨率为m×n的第二图像Image2_m,n；

步骤c、按照以下公式对第一图像Image1_m,n和第二图像Image2_m,n进行运算：

Temp1_m,n＝deconv(Image1_m,n)

Temp2_m,n＝deconv(Image2_m,n)

式中，deconv表示去卷积运算；

步骤d、按照以下公式计算得到中心感兴趣区域信息Temp_m,n：

${\mathrm{Temp}}_{m,n}=\left\{\begin{array}{cc}Temp{2}_{m,n}-n\×Temp{1}_{m,n},& Temp{2}_{m,n}>Temp{1}_{m,n}\\ 0,& Temp{2}_{m,n}\≤Temp{1}_{m,n}\end{array}\right.$

式中，n大于0；

步骤e、按照以下公式对中心感兴趣区域信息Temp_m,n进行求和运算：

${\mathrm{sum}}_{i,j}=\underset{m}{\Σ}\underset{n}{\Σ}{\mathrm{Temp}}_{m,n}$

式中，sum_i,j表示坐标为(i,j)的物点的灰度值。

上述成像方法，构造完整的二维图像通过以下步骤得到：

步骤a、构造一个空白矩阵；

步骤b、将sum_i,j依次填到对应元素位置。

有益效果：

第一、传统STED技术要求两个激光束波长不相同，并且同时照射，而本发明要求两个激光束波长相同，并且不同时照射，并利用两幅图像求差来缩小感兴趣区域的范围，这些区别技术特征可以提高成像***的分辨率。

第二、本发明采用了去卷积运算，进而可以去除非焦平面上的模糊，减少探测器的卷积效应带来的测量误差，该技术特征可以进一步提高成像***的分辨率。

第三、本发明设置有管径，形成远心光路，用于配合X轴扫描振镜和Y轴扫描振镜，实现轴上像质与轴外像质一致，提高扫描面上光束照明的均匀性，降低因激光照射分布不均导致的测量误差。

附图说明

图1是本发明基于扫描振镜的单点去卷积显微***的结构示意图。

图2是将sum_i,j依次填到对应元素位置后的示意图。

图中：1螺旋相位板、2分光棱镜、3偏振分束器、4X轴扫描振镜、5Y轴扫描振镜、6扫描透镜、7管镜、8聚焦物镜、9长波通滤光片、10收集物镜、11光电探测器。

具体实施方式

下面结合附图对本发明具体实施方式作进一步详细描述。

具体实施例一

本实施例为基于扫描振镜的单点去卷积显微***实施例。

本实施例的基于扫描振镜的单点去卷积显微***，结构示意图如图1所示。该基于扫描振镜的单点去卷积显微***包括螺旋相位板1、分光棱镜2、偏振分束器3、X轴扫描振镜4、Y轴扫描振镜5、扫描透镜6、管镜7、聚焦物镜8、长波通滤光片9、收集物镜10和光电探测器11；

第一平行光经过螺旋相位板1调制后，依次经过分光棱镜2和偏振分束器3透射，X轴扫描振镜4和Y轴扫描振镜5反射，扫描透镜6和管镜7透射，由聚焦物镜8汇聚在荧光样品上，形成环形光斑；

所述的螺旋相位板1使第一平行光附加螺旋相位因子exp(ilθ)；其中，i为虚数单位，l为螺旋相位板1的拓扑荷数，θ为旋转方位角；所述X轴扫描振镜4由X轴电机带动、受X轴伺服***控制，Y轴扫描振镜5由Y轴电机带动、受Y轴伺服***控制，X轴扫描振镜4与Y轴扫描振镜5相互配合，实现对样品进行XY面的逐点扫描；

第二平行光经过分光棱镜2反射后，依次经过偏振分束器3透射，X轴扫描振镜4和Y轴扫描振镜5反射，扫描透镜6和管镜7透射，由聚焦物镜8汇聚在荧光样品上，形成圆形光斑；

所述第一平行光与第二平行光波长相同，在经过分光棱镜2后同轴传递，将荧光样品表面激发出荧光，所述荧光依次经过聚焦物镜8、管镜7和扫描透镜6透射，Y轴扫描振镜5、X轴扫描振镜4和偏振分束器3反射，长波通滤光片9透射，由收集物镜10汇聚到光电探测器11上进行成像。

具体实施例二

本实施例为基于扫描振镜的单点去卷积显微***实施例。

本实施例的基于扫描振镜的单点去卷积显微***，与具体实施例一的不同在于，所述的偏振分束器3替换为二向色镜。

具体实施例三

本实施例为基于扫描振镜的单点去卷积显微***实施例。

本实施例的基于扫描振镜的单点去卷积显微***，与具体实施例一的不同在于，所述的长波通滤光片9替换为带通滤光片。

以上实施例的单点去卷积显微***，所述长波通滤光片9的截止波长λ选取应满足：λ₁＜λ＜λ₂，其中，λ₁为激发光波长，λ₂为荧光样品表面激发出的荧光波长；长波通滤光片9的截止波长λ限定在激发光波长λ₁与荧光样品表面激发出的荧光波长λ₂之间，这种参数限定可以滤除激光器的光，保留荧光含有样品面型信息，对提高显微***分辨率起到积极作用。

具体实施例四

本实施例为在以上基于扫描振镜的单点去卷积显微***上实现的成像方法实施例。

本实施例的成像方法，首先得到坐标为(i,j)的物点的灰度值sum_i,j，再通过调整X轴扫描振镜4和Y轴扫描振镜5的角度，遍历i和j的所有取值，利用所有物点的灰度值信息，构造完整的二维图像。

具体实施例五

本实施例为在以上基于扫描振镜的单点去卷积显微***上实现的成像方法实施例。

本实施例的成像方法，在具体实施例四的基础上，进一步限定坐标为(i,j)的物点的灰度值信息，通过以下步骤得到：

步骤a、在只照射第一平行光，不照射第二平行光的条件下，光电探测器12以坐标(i,j)为中心对荧光样品进行成像，得到分辨率为m×n的第一图像Image1_m,n；

步骤b、在只照射第二平行光，不照射第一平行光的条件下，光电探测器12以坐标(i,j)为中心对荧光样品进行成像，得到分辨率为m×n的第二图像Image2_m,n；

步骤c、按照以下公式对第一图像Image1_m,n和第二图像Image2_m,n进行运算：

Temp1_m,n＝deconv(Image1_m,n)

Temp2_m,n＝deconv(Image2_m,n)

式中，deconv表示去卷积运算；

步骤d、按照以下公式计算得到中心感兴趣区域信息Temp_m,n：

${\mathrm{Temp}}_{m,n}=\left\{\begin{array}{cc}Temp{2}_{m,n}-n\×Temp{1}_{m,n},& Temp{2}_{m,n}>Temp{1}_{m,n}\\ 0,& Temp{2}_{m,n}\≤Temp{1}_{m,n}\end{array}\right.$

式中，n大于0；

步骤e、按照以下公式对中心感兴趣区域信息Temp_m,n进行求和运算：

${\mathrm{sum}}_{i,j}=\underset{m}{\Σ}\underset{n}{\Σ}{\mathrm{Temp}}_{m,n}$

式中，sum_i,j表示坐标为(i,j)的物点的灰度值。

具体实施例六

本实施例为在以上基于扫描振镜的单点去卷积显微***上实现的成像方法实施例。

本实施例的成像方法，在具体实施例四的基础上，进一步限定构造完整的二维图像通过以下步骤得到：

步骤a、构造一个空白矩阵；

步骤b、将sum_i,j依次填到对应元素位置，如图2所示。

需要说明的是，具体实施例五和具体实施例六的技术方案能够合并。

Claims (7)

1.基于扫描振镜的单点去卷积显微***，其特征在于，包括螺旋相位板(1)、分光棱镜(2)、偏振分束器(3)、X轴扫描振镜(4)、Y轴扫描振镜(5)、扫描透镜(6)、管镜(7)、聚焦物镜(8)、长波通滤光片(9)、收集物镜(10)和光电探测器(11)；

第一平行光经过螺旋相位板(1)调制后，依次经过分光棱镜(2)和偏振分束器(3)透射，X轴扫描振镜(4)和Y轴扫描振镜(5)反射，扫描透镜(6)和管镜(7)透射，由聚焦物镜(8)汇聚在荧光样品上，形成环形光斑；

所述的螺旋相位板(1)使第一平行光附加螺旋相位因子exp(ilθ)；其中，i为虚数单位，l为螺旋相位板(1)的拓扑荷数，θ为旋转方位角；所述X轴扫描振镜(4)由X轴电机带动、受X轴伺服***控制，Y轴扫描振镜(5)由Y轴电机带动、受Y轴伺服***控制，X轴扫描振镜(4)与Y轴扫描振镜(5)相互配合，实现对样品进行XY面的逐点扫描；

第二平行光经过分光棱镜(2)反射后，依次经过偏振分束器(3)透射，X轴扫描振镜(4)和Y轴扫描振镜(5)反射，扫描透镜(6)和管镜(7)透射，由聚焦物镜(8)汇聚在荧光样品上，形成圆形光斑；

所述第一平行光与第二平行光波长相同，在经过分光棱镜(2)后同轴传递，将荧光样品表面激发出荧光，所述荧光依次经过聚焦物镜(8)、管镜(7)和扫描透镜(6)透射，Y轴扫描振镜(5)、X轴扫描振镜(4)和偏振分束器(3)反射，长波通滤光片(9)透射，由收集物镜(10)汇聚到光电探测器(11)上进行成像。

2.根据权利要求1所述的基于扫描振镜的单点去卷积显微***，其特征在于，所述的偏振分束器(3)替换为二向色镜。

3.根据权利要求1所述的基于扫描振镜的单点去卷积显微***，其特征在于，所述的长波通滤光片(9)替换为带通滤光片。

4.根据权利要求1、2或3所述的基于扫描振镜的单点去卷积显微***，其特征在于，所述长波通滤光片(9)的截止波长λ选取应满足：λ₁＜λ＜λ₂，其中，λ₁为激发光波长，λ₂为荧光样品表面激发出的荧光波长。

5.一种在权利要求1所述基于扫描振镜的单点去卷积显微***上实现的成像方法，其特征在于，首先得到坐标为(i,j)的物点的灰度值sum_i,j，再通过调整X轴扫描振镜(4)和Y轴扫描振镜(5)的角度，遍历i和j的所有取值，利用所有物点的灰度值信息，构造完整的二维图像。

6.根据权利要求5所述的成像方法，其特征在于，所述的坐标为(i,j)的物点的灰度值信息，通过以下步骤得到：

步骤a、在只照射第一平行光，不照射第二平行光的条件下，光电探测器(11)以坐标(i,j)为中心对荧光样品进行成像，得到分辨率为m×n的第一图像Image1_m,n；

步骤b、在只照射第二平行光，不照射第一平行光的条件下，光电探测器(11)以坐标(i,j)为中心对荧光样品进行成像，得到分辨率为m×n的第二图像Image2_m,n；

步骤c、按照以下公式对第一图像Image1_m,n和第二图像Image2_m,n进行运算：

Temp1_m,n＝deconv(Image1_m,n)

Temp2_m,n＝deconv(Image2_m,n)

式中，deconv表示去卷积运算；

步骤d、按照以下公式计算得到中心感兴趣区域信息Temp_m,n：

${\mathrm{Temp}}_{m,n}=\left\{\begin{array}{cc}Temp{2}_{m,n}-n\×Temp{1}_{m,n},& Temp{2}_{m,n}>Temp{1}_{m,n}\\ 0,& Temp{2}_{m,n}\≤Temp{1}_{m,n}\end{array}\right.$

式中，n大于0；

步骤e、按照以下公式对中心感兴趣区域信息Temp_m,n进行求和运算：

${\mathrm{sum}}_{i,j}=\underset{m}{\Σ}\underset{n}{\Σ}{\mathrm{Temp}}_{m,n}$

式中，sum_i,j表示坐标为(i,j)的物点的灰度值。

7.根据权利要求5所述的成像方法，其特征在于，构造完整的二维图像通过以下步骤得到：

步骤a、构造一个空白矩阵；

步骤b、将sum_i,j依次填到对应元素位置。