CN108956562A - 一种基于重定位的光切片荧光显微成像方法和装置 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种基于重定位的光切片荧光显微成像方法和装置，属于光学成像技术领域，包括沿光路依次布置的激光器、柱面镜和承载有荧光样品的样品台，以及收集荧光样品发出荧光的检测***；检测***包括第一检测器、分束器、第二检测器和第三检测器，还包括与检测***和样品台连接的处理器，控制样品台以固定的步长沿Z轴移动，并对荧光图像I1和荧光图像I2进行比较，得到图中各个部分荧光在Z轴的位置信息，根据位置信息，对荧光图像I0中的荧光信息进行重新定位和三维重构，得到荧光样品的三维成像结果。可实现在不减小成像视场范围，不增加对样品的光漂白，不降低成像速度的情况下提高成像的轴向分辨率。

Description

一种基于重定位的光切片荧光显微成像方法和装置
技术领域
本发明涉及光学成像技术领域，具体地说，涉及一种基于重定位的光切片荧光显微成像方法和装置。
背景技术
随着科学技术的发展，人们对于分辨微小结构以及生物功能显微成像方面提出了越来越高的要求。除了高分辨率的要求之外，在检测时间以及检测范围上也同样需要更快更广。
荧光显微成像作为对微观世界里发生的特异性事件的一种观察手段，长久以来对于现代生命科学研究具有重大意义。特别是在发育生物学、再生医学、组织工程等需要对多细胞样品进行观察、分析的领域里，进行三维度、全方位的成像对于分析样品的结构及生物学特性非常重要。然而，无论是倒置显微镜还是共聚焦显微镜，均无法在低倍率，大视场下提供轴向分辨率足够好的三维图像。近年来新发展出来的切片光显微成像***提供了一种新型的三维显微图像的获取手段，有别于传统的光路显微手段，切片光显微成像***增加了额外的照明光路来提供厚度极薄的线聚焦切片光照明，当染色样品放置于激光光片焦点处附近时，将被该激光光片穿透照明，有如被一把虚拟激光刀片切过，同时每次仅有被照明的薄切面会发射荧光，形成图像。传统的光切片荧光显微成像装置如图1所示。
光切片荧光显微技术具有良好的4D成像能力，而相较于传统的4D成像技术(宽场显微技术、共聚焦显微技术、多光子激发显微技术等)，光切片荧光显微技术具有许多优势，如：它将照明限制在焦平面附近，可以最小化光漂白和光损伤；能够最小化样品中的荧光饱和，在较高的帧率下也可以保证高信噪比。光切片荧光显微技术的这些优势，使它在发育生物学等领域得到了广泛的应用。但是，传统的光切片荧光显微技术的轴向分辨率大约是横向分辨率的2～3倍，这极大地限制了成像的各向同性。
提到光切片荧光显微技术的轴向分辨率，一直是研究者们十分关注的一个问题。到目前为止，在这个方面，已经进行了相当多的探索。比如，制作一个足够薄的激发光片，使轴向分辨率不再依赖于加测物镜的数值孔径(NA)，但是这种较薄的光片，在远离光束束腰的位置会发生较快的扩散，限制了成像的视场范围；还可以将激发光束调制为贝塞尔光束，来避免视场的减小，但是这又会在焦平面外部引入照射，增加对样品的光漂白；也可以通过旋转样品，在不同的检测角度对样品进行多次成像，然后使用计算机对多个视图进行融合，但这种方法既降低了成像速度，又减少了横向分辨率。
因此，上述的几种对光切片荧光显微技术轴向分辨率的提高方法都存在各自的问题。
发明内容
本发明的目的为提供一种基于重定位的光切片荧光显微成像方法，利用该方法可以有效提高传统光切片荧光显微技术的轴向分辨率，而且不会减小成像的视场范围，不会增加对样品的光漂白，也不会降低成像速度。
本发明的另一目的为提供一种基于重定位的光切片荧光显微成像装置，该装置可实现上述成像方法，在保证不减小成像视场范围，不增加对样品的光漂白，不降低成像速度的情况下提高成像的轴向分辨率。
为了实现上述目的，本发明提供的基于重定位方法的光切片荧光显微成像方法包括：
激光光束聚焦为光切片后投射到荧光样品上激发荧光，收集荧光得到对应的荧光图像；
收集荧光样品沿着Z轴向下发出的第一荧光，得到荧光图像I0；对荧光样品沿着Z轴向上发出的第二荧光进行分束并进行收集，得到荧光图像I1和荧光图像I2；
以固定的步长沿Z轴移动所述荧光样品，采集荧光并获得荧光样品在每个Z轴位置处的荧光图像I0、荧光图像I1和荧光图像I2，对荧光图像I1和荧光图像I2进行比较，得到图中各个部分荧光在Z轴的位置信息，根据所述的位置信息，对各Z轴位置处的荧光图像I0中荧光信息进行重新定位，确定荧光信息在Z轴上的位置；
对重定位后的所有荧光图像I0进行三维重构，得到荧光样品的三维成像结果。
上述技术方案中，通过获得荧光样品在Z轴位置处的图像I0、I1、I2，并通过图像I1和I2进行比较，对图I0进行重定位，处理后可以从图I0的二维图像中获得第三维的深度信息，从而提高成像的轴向分辨率。通过该方法可以有效提高传统光切片荧光显微技术的轴向分辨率，而且不会减小成像的视场范围，不会增加对样品的光漂白，也不会降低成像速度。
具体的方案为Z轴向垂直于入射到荧光样品的激光光束。
另一个具体的方案为图I0为位于焦平面上的图像，图I1为具有一个负的离焦-Δz的图像，图I2为具有一个正的离焦+Δz的图像。
更具体的方案为对荧光图像I1和荧光图像I2进行比较，得到图中各个部分荧光在Z轴的位置信息包括：
利用下式对图I1和图I2进行比较：
其中，I1(x,y)表示图I1在垂直于Z轴的二维平面内的坐标，I2(x,y)表示图I2在垂直于Z轴的二维平面内的坐标；
假设光切片的中心位置为z0，若f(x,y)＜0，表示I1(x,y)＜I2(x,y)，即在该点处，具有负离焦量图像的荧光强度低于具有正离焦量图像的荧光强度，说明该处收集到的荧光具有一个向上的离焦量，则该处荧光在Z轴的位置为z0+Δz；若f(x,y)＝0，说明具有正负离焦量的荧光强度相同，则该处荧光在Z轴的位置为z0；若f(x,y)＞0，表示具有负离焦量图像的荧光强度低于具有正离焦量图像的荧光强度，说明该荧光具有一个向下的离焦量，则该处荧光在Z轴的位置为z0-Δz。
通过这种方式，将在Z轴位置得到二维图像分成三幅图片，轴向位置分别为z0+Δz、z0和z0-Δz。
为了实现上述另一目的，本发明提供的基于重定位的光切片荧光显微成像装置包括沿光路依次布置的激光器、柱面镜和承载有荧光样品的样品台，以及收集荧光样品发出荧光的检测***；检测***包括：
第一检测器，收集荧光样品沿着Z轴向下发出的第一荧光，得到荧光图像I0；
分束器，对荧光样品沿着Z轴向上发出的第二荧光进行分束；
第二检测器和第三检测器，分别获取由分束器出射的荧光，得到荧光图像I1和荧光图像I2；
还包括与检测***和样品台连接的处理器，控制样品台以固定的步长沿Z轴移动，并对荧光图像I1和荧光图像I2进行比较，得到图中各个部分荧光在Z轴的位置信息，根据位置信息，对荧光图像I0中的荧光信息进行重新定位和三维重构，得到荧光样品的三维成像结果。
上述装置对传统光切片荧光显微镜的检测光路进行了改进，能够同时得到三幅图像I0、I1、I2；通过图像I1和I2进行比较，对图I0进行重定位，然后将图I0中的图像进行处理，可以从图I0的二维图像中获得第三维的深度信息，从而提高成像的轴向分辨率，并保证不减小成像视场范围，不增加对样品的光漂白，不降低成像速度。
具体的方案为第一检测器包括沿Z轴向下依次设置的第一检测物镜、第一滤光片、第一管透镜和第一CCD相机，沿Z轴向下的荧光被第一检测物镜收集，经过第一滤光片滤除杂散光后，经过第一管透镜聚焦到第一CCD相机上，得到图像I0。
更具体的方案为第二检测器包括沿第二荧光的其中一分束光路依次布置的第二管透镜和第二CCD相机，透过半透半反镜的光束经过第二管透镜后聚焦到第二CCD相机上，得到图像I1；第三检测器包括沿第二荧光的另一分束光路依次布置的第三管透镜和第三CCD相机，被半透半反镜反射的光束经过第三管透镜后聚焦到第三CCD相机上，得到图像I2。
进一步更具体的方案为第一CCD相机的成像面位置与光切片的中心共轭；第二CCD相机的成像面的位置与光切片中心面的共轭面相比，具有向前的离焦量-φ，因此收集得到的荧光图像也有一个向前的离焦；第三CCD相机的成像面的位置与光切片中心面的共轭面相比，具有向后的离焦量+φ，因此收集得到的荧光图像也有一个向后的离焦。
得到的图I0与传统光切片荧光显微镜检测得到的图像相同；得到的图I1是一幅具有一定负离焦(-Δz)的图像；得到的图I2是离焦量与图I1相同，但方向相反(+Δz)。通过离焦量相同，离焦方向相反的图像I1和I2，可以确定对样品中各个点进行定位。
该方案的原理为：荧光样品被光切片激发，向四周发射荧光。沿着Z轴向下的荧光，与传统的光切片荧光显微技术相同，经过第一检测物镜收集、第一滤光片滤光、第一管透镜聚焦到第一CCD相机上，得到样品在Z轴向位置的荧光强度分布I0。沿着Z轴向上的荧光，被分束镜分成两束，分别被收集，得到荧光图像I1、I2，这两幅荧光图像，相较于光切片的中心位置都有一定的离焦，并且离焦的距离相同、方向相反。通过比较这两个荧光图像，得到图像上各个点的在轴向的位置，对I0中各个部分的荧光重新定位，将一幅Z轴的图像分为三幅，以提高最后重构结果的Z向分辨率。
另一个更具体的方案为第二检测器包括布置在第二荧光的其中一分束光路上的振镜，以及沿被振镜反射后的光束的光路依次布置的针孔Ⅰ和光电管Ⅰ，处理器控制振镜旋转，使光电管Ⅰ收集到针孔Ⅰ共轭平面的图像I1；第三检测器包括布置在第二荧光的另一分束光路上的针孔Ⅱ和光电管Ⅱ，处理器控制半透半反镜旋转，使光电管Ⅱ收集到针孔Ⅱ共轭平面的图像I2。
进一步更具体的方案为针孔Ⅰ共轭的位置比光切片的中心位置偏下，针孔Ⅱ的共轭的位置比光切片中心位置偏上。
优选的，分束镜为半透半反镜。
与现有技术相比，本发明的有益效果为：
荧光样品被激发发出的荧光是朝着各个方向的，而传统的光切片荧光显微技术只收集了某一个方向的荧光，本发明中收集了荧光样品发出的上下两个方向的荧光，既提高了收集效率，又可以成功实现在不减小视场、不降低成像速度的情况下，提高对样品的轴向分辨率。
附图说明
图1为传统的光切片荧光显微成像装置的结构示意图；
图2为本发明实施例1的基于重定位的光切片荧光显微成像装置的结构示意图；
图3为本发明实施例1中荧光样品在YZ平面的成像示意图：其中(a)为成像中心位于焦平面时的成像范围；(b)为具有负离焦的成像范围，和具有正离焦的成像范围；(c)为重定位后，三个图像的等效成像范围；
图4为本发明实施例2的基于重定位的光切片荧光显微成像装置的结构示意图；
图5为本发明实施例2的小孔共轭的位置示意图。
图中各标号为：
1、激光器；2、单模光纤；3、准直透镜；4、凸透镜；5、凸透镜；6、柱面镜；7、第一中继透镜；8、反射镜；9、第二中继透镜；10、第三中继透镜；11、照明物镜；12、荧光样品；13、第一检测物镜；14、第一滤光片；15、第一管透镜；16、第一CCD相机；17、第二检测物镜；18、第二滤光片；19、半透半反镜；20、第二管透镜；21、第二CCD相机；22、第三管透镜；23、第三CCD相机；24、计算机；25、半透半反镜；26、振镜；27、针孔Ⅰ；28、光电管Ⅰ；29、针孔Ⅱ；30、光电管Ⅱ。
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，以下结合实施例及其附图对本发明作进一步说明。
实施例1
参见图2，本实施例的基于重定位的光切片荧光显微成像装置包括激光器1、单模光纤2、准直透镜3、由凸透镜4和凸透镜5组成的望远镜、柱面镜6、第一中继透镜7、反射镜8、第二中继透镜9、第三中继透镜10、照明物镜11、荧光样品12、第一检测物镜13、第一滤光片14、第一管透镜15、第一CCD相机16、第二检测物镜17、第二滤光片18、半透半反镜19、第二管透镜20、第二CCD相机21、第三管透镜22、第三CCD相机23、计算机24。
采用图2所示的成像装置，实现基于重定位的光切片荧光显微成像方法的具体步骤如下：
(1)激光器1发出的激光经过单模光纤2滤波、再经过准直透镜2对激光进行扩束准直，然后经过望远镜对激光光束大小的调整，被柱面镜6聚集为所需要的光切片，然后经过中继透镜组(第一中继透镜7、第二中继透镜9、第三中继透镜10)的扩束、聚焦，激发光切片最终被照明物镜11聚焦到荧光样品12上。
(2)荧光样品12被光切片激发发出荧光，向下的荧光被第一检测物镜13收集，经过第一滤光片14滤除杂散光后，经过第一管透镜15聚焦到第一CCD相机16上，得到图像I0。
(3)向上的荧光被第二检测物镜17收集，然后经过第二滤光片18滤除杂散光，然后被经过半透半反镜19分为透射光束和反射光束。
(4)透过半透半反镜19的透射光束经过第二管透镜20聚焦，被具有向前负离焦的第二CCD相机21收集，得到具有一个负离焦的荧光强度分布图像I1。
(5)被半透半反镜19反射的反射光束经过第三管透镜22的聚焦，被具有向后正离焦的第三CCD相机23收集，得到具有一个正离焦的荧光强度分布图像I2。
(6)使用计算机24，对图I1和图I2进行比较，比较公式如下：
其中，(x,y)表示垂直于检测透镜光轴方向上二维平面内的某一点的坐标，I1(x,y)表示图I1在垂直于Z轴的二维平面内的坐标，I2(x,y)表示图I2在垂直于Z轴的二维平面内的坐标；
如果求得的f(x,y)＜0，表示I1(x,y)＜I2(x,y)，也就是在该点处，具有负离焦量图像的荧光强度低于具有正离焦量图像的荧光强度，说明该出收集到的荧光具有一个向上的离焦量，如图3(b)所示的三个部分，该荧光的位置处于最下层的部分；如果f(x,y)＝0，说明具有正负离焦量的荧光强度相同，如图3(b)所示的三个部分，该荧光的位置处于中间部分；如果f(x,y)＞0，表示具有负离焦量图像的荧光强度低于具有正离焦量图像的荧光强度，如图3(b)所示的三个部分，该荧光的位置处于最上层。
(7)根据步骤(6)中，对各个部分荧光位置的计算，对I0中各个部分的荧光信号重新定位，如图3所示，图3(a)是原本的成像结果，图3(c)是处理后的成像结果。
(8)沿着Z轴移动样品台，对荧光样品的不同的轴向位置进行成像，然后通过计算机24，对荧光样品12进行重构，得到荧光样品12的三维图像。
本实施例的原理如下：
荧光样品被光切片激发，向四周发射荧光。沿着Z轴向下的荧光，与传统的光切片荧光显微技术相同，经过第一检测物镜收集、第一滤光片滤光、第一管透镜聚焦到第一CCD相机上，得到样品在Z轴向位置的荧光强度分布I0。沿着Z轴向上的荧光，被半透半反镜分成两束，分别被收集，得到荧光图像I1、I2，这两幅荧光图像，相较于光切片的中心位置都有一定的离焦，并且离焦的距离相同、方向相反。通过比较这两个荧光图像，得到图像上各个点的在轴向的位置，对I0中各个部分的荧光重新定位，将一幅Z轴的图像分为三幅，以提高最后重构结果的Z向分辨率。
实施例2
参见图4，本实施例的基于重定位的光切片荧光显微成像装置包括激光器1、单模光纤2、准直透镜3、由凸透镜4和凸透镜5组成的望远镜、柱面镜6、第一中继透镜7、反射镜8、第二中继透镜9、第三中继透镜10、照明物镜11、荧光样品12、第一检测物镜13、第一滤光片14、第一管透镜15、第一CCD相机16、第二检测物镜17、半透半反镜25、振镜26、针孔Ⅰ27、光电管Ⅰ28、针孔Ⅱ29、光电管Ⅱ30、计算机24。
采用图4所示的成像装置，实现基于重定位的光切片荧光显微成像方法的具体过程如下：
(1)激光器1发出的激光经过单模光纤2滤波、再经过准直透镜2对激光进行扩束准直，然后经过望远镜对激光光束大小的调整，被柱面镜6聚集为所需要的光切片，然后经过中继透镜组(第一中继透镜7、第二中继透镜9、第三中继透镜10)的扩束、聚焦，激发光切片最终被照明物镜11聚焦到荧光样品12上。
(2)荧光样品12被光切片激发发出荧光，向下的荧光被第一检测物镜13收集，经过第一滤光片14滤除杂散光后，经过第一管透镜15聚焦到第一CCD相机16上，得到图像I0。
(3)向上的荧光被第二检测物镜17收集，然后被半透半反镜25分为透射光束和反射光束。
(4)透过半透半反镜25的透射光束，被振镜26反射，然后经过针孔Ⅰ27滤光，如图5所示，通过针孔Ⅰ27的光子被具有向前负离焦的光电管Ⅰ28收集，计算机24控制振镜26转动，从而对该轴向的每一个点进行成像，得到二维荧光分布图像I1。
(5)被半透半反镜25反射的反射光束，经过针孔Ⅱ29滤光，如图5所示，通过针孔Ⅱ29的光子被具有向后正离焦的光电管Ⅱ30收集，计算机24控制半透半反镜25转动，从而对该轴向的每一个点进行成像，得到二维荧光分布图像I2。
(6)使用计算机24，对图I1和图I2进行比较，较公式如下：
其中，(x,y)表示垂直于检测透镜光轴方向上二维平面内的某一点的坐标，I1(x,y)表示图I1在垂直于Z轴的二维平面内的坐标，I2(x,y)表示图I2在垂直于Z轴的二维平面内的坐标；
如果求得的f(x,y)＜0，表示I1(x,y)＜I2(x,y)，也就是在该点处，具有负离焦量图像的荧光强度低于具有正离焦量图像的荧光强度，说明该出收集到的荧光具有一个向上的离焦量，如图3(b)所示的三个部分，该荧光的位置处于最下层的部分；如果f(x,y)＝0，说明具有正负离焦量的荧光强度相同，如图3(b)所示的三个部分，该荧光的位置处于中间部分；如果f(x,y)＞0，表示具有负离焦量图像的荧光强度低于具有正离焦量图像的荧光强度，如图3(b)所示的三个部分，该荧光的位置处于最上层。
(7)根据步骤(6)中对各个部分荧光位置的计算，对图像I0中各个部分的荧光信号重新定位，如图3所示，图3(a)是原本的成像结果，图3(c)是处理后的成像结果。
(8)沿着Z轴移动样品，对样品的不同的轴向位置进行成像，然后通过计算机24对样品12进行重构，得到样品12的三维图像。
实施例3
本实施例提供的基于重定位的光切片荧光显微成像方法已经包含在实施例1或实施例2中，此处不再赘述。

Claims (10)

1.一种基于重定位的光切片荧光显微成像方法，激光光束聚焦为光切片后投射到荧光样品上激发荧光，收集荧光得到对应的荧光图像；其特征在于：
收集荧光样品沿着Z轴向下发出的第一荧光，得到荧光图像I0；对荧光样品沿着Z轴向上发出的第二荧光进行分束并进行收集，得到荧光图像I1和荧光图像I2；
以固定的步长沿Z轴移动所述荧光样品，采集荧光并获得荧光样品在各Z轴位置处的荧光图像I0、荧光图像I1和荧光图像I2，将荧光图像I1和荧光图像I2进行比较，得到图中各个部分荧光在Z轴的位置信息，根据所述的位置信息，对各Z轴位置处的荧光图像I0中荧光信息进行重新定位，确定荧光信息在Z轴上的位置；
对重定位后的所有荧光图像I0进行三维重构，得到荧光样品的三维成像结果。
2.根据权利要求1所述的基于重定位的光切片荧光显微成像方法，其特征在于：
所述的Z轴向垂直于入射到荧光样品的激光光束。
3.根据权利要求1所述的光切片荧光显微成像方法，其特征在于：
图I0为位于焦平面上的图像，图I1为具有一个负的离焦-Δz的图像，图I2为具有一个正的离焦+Δz的图像。
4.根据权利要求3所述的光切片荧光显微成像方法，其特征在于，所述的对荧光图像I1和荧光图像I2进行比较，得到图中各个部分荧光在Z轴的位置信息包括：
利用下式对图I1和图I2进行比较：
其中，I1(x,y)表示图I1在垂直于Z轴的二维平面内的坐标，I2(x,y)表示图I2在垂直于Z轴的二维平面内的坐标；
假设光切片的中心位置为z0，若f(x,y)＜0，则该处荧光在Z轴的位置为z0+Δz；若f(x,y)＝0，则该处荧光在Z轴的位置为z0；若f(x,y)＞0，则该处荧光在Z轴的位置为z0-Δz。
5.一种基于重定位的光切片荧光显微成像装置，包括沿光路依次布置的激光器、柱面镜和承载有荧光样品的样品台，以及收集荧光样品发出荧光的检测***；其特征在于：
所述检测***包括：
第一检测器，收集荧光样品沿着Z轴向下发出的第一荧光，得到荧光图像I0；
分束器，对荧光样品沿着Z轴向上发出的第二荧光进行分束；
第二检测器和第三检测器，分别获取由所述分束器出射的荧光，得到荧光图像I1和荧光图像I2；
还包括与所述检测***和样品台连接的处理器，控制样品台以固定的步长沿Z轴移动，并对荧光图像I1和荧光图像I2进行比较，得到图中各个部分荧光在Z轴的位置信息，根据所述的位置信息，对荧光图像I0中的荧光信息进行重新定位和三维重构，得到荧光样品的三维成像结果。
6.根据权利要求5所述的光切片荧光显微成像装置，其特征在于：
所述的第一检测器包括沿Z轴向下依次设置的第一检测物镜、第一滤光片、第一管透镜和第一CCD相机，沿Z轴向下的荧光被第一检测物镜收集，经过第一滤光片滤除杂散光后，经过第一管透镜聚焦到第一CCD相机上，得到图像I0。
7.根据权利要求5或6所述的光切片荧光显微成像装置，其特征在于：
所述的第二检测器包括沿第二荧光的其中一分束光路依次布置的第二管透镜和第二CCD相机，光束经过第二管透镜后聚焦到第二CCD相机上，得到图像I1；
所述的第三检测器包括沿第二荧光的另一分束光路依次布置的第三管透镜和第三CCD相机，光束经过第三管透镜后聚焦到第三CCD相机上，得到图像I2。
8.根据权利要求7所述的光切片荧光显微成像装置，其特征在于：
所述的第一CCD相机的成像面位置与光切片的中心共轭；所述的第二CCD相机的成像面的位置与光切片中心面的共轭面相比，具有向前的离焦量-φ；所述的第三CCD相机的成像面的位置与光切片中心面的共轭面相比，具有向后的离焦量+φ。
9.根据权利要求5或6所述的光切片荧光显微成像装置，其特征在于：
所述的第二检测器包括布置在第二荧光的其中一分束光路上的振镜，以及沿被所述振镜反射后的光束的光路依次布置的针孔Ⅰ和光电管Ⅰ，所述处理器控制所述振镜旋转，使光电管Ⅰ收集到针孔Ⅰ共轭平面的图像I1；
所述的第三检测器包括布置在第二荧光的另一分束光路上的针孔Ⅱ和光电管Ⅱ，所述处理器控制所述半透半反镜旋转，使光电管Ⅱ收集到针孔Ⅱ共轭平面的图像I2。
10.根据权利要求9所述的光切片荧光显微成像装置，其特征在于：
所述的针孔Ⅰ共轭的位置比光切片的中心位置偏下，所述的针孔Ⅱ的共轭的位置比光切片中心位置偏上。
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Cited By (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN109765684A (zh) * 2019-03-03 2019-05-17 北京工业大学 多光路多方位实时显微成像***
CN110220875A (zh) * 2019-06-10 2019-09-10 浙江大学 一种基于荧光差分法的晶格光切片荧光显微成像装备及方法
CN113331788A (zh) * 2021-05-31 2021-09-03 华中科技大学 一种mfmt-xct双模式***
CN115575364A (zh) * 2022-09-30 2023-01-06 中国科学院生物物理研究所 基于光学显微成像的离子束加工方法

Citations (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN103743714A (zh) * 2014-01-14 2014-04-23 苏州大猫单分子仪器研发有限公司 一种倾斜宽场光切片扫描成像显微***及其成像方法
CN104204898A (zh) * 2012-04-03 2014-12-10 圣安德鲁斯大学董事会 扩展容积的高分辨率成像
WO2015054450A1 (en) * 2013-10-09 2015-04-16 Howard Hughes Medical Institute Multiview light-sheet microscopy
US20170146781A1 (en) * 2014-01-14 2017-05-25 Applied Scientific Instrumentation, Inc. Light sheet generator
CN106980175A (zh) * 2017-05-10 2017-07-25 暨南大学 基于环形离轴照明焦面共轭的非荧光成像光切片方法和装置
CN107228846A (zh) * 2017-05-10 2017-10-03 暨南大学 基于离轴光束焦面共轭的荧光成像光切片方法和装置
WO2017223426A1 (en) * 2016-06-24 2017-12-28 Howard Hughes Medical Institute Automated adjustment of light sheet geometry in a microscope
EP3264153A1 (en) * 2016-06-28 2018-01-03 Olympus Corporation Light sheet microscope and control method for light sheet microscope

Patent Citations (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN104204898A (zh) * 2012-04-03 2014-12-10 圣安德鲁斯大学董事会 扩展容积的高分辨率成像
WO2015054450A1 (en) * 2013-10-09 2015-04-16 Howard Hughes Medical Institute Multiview light-sheet microscopy
CN103743714A (zh) * 2014-01-14 2014-04-23 苏州大猫单分子仪器研发有限公司 一种倾斜宽场光切片扫描成像显微***及其成像方法
US20170146781A1 (en) * 2014-01-14 2017-05-25 Applied Scientific Instrumentation, Inc. Light sheet generator
WO2017223426A1 (en) * 2016-06-24 2017-12-28 Howard Hughes Medical Institute Automated adjustment of light sheet geometry in a microscope
EP3264153A1 (en) * 2016-06-28 2018-01-03 Olympus Corporation Light sheet microscope and control method for light sheet microscope
CN106980175A (zh) * 2017-05-10 2017-07-25 暨南大学 基于环形离轴照明焦面共轭的非荧光成像光切片方法和装置
CN107228846A (zh) * 2017-05-10 2017-10-03 暨南大学 基于离轴光束焦面共轭的荧光成像光切片方法和装置

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
FRANCESCO PAMPALONI 等: "Light sheet-based fluorescence microscopy (LSFM)for the quantitative imaging of cells and tissues", 《CELL TISSUE RES》 *
JOHN LIM 等: "Light sheet fluorescence microscopy (LSFM): past,present and future", 《ANALYST》 *
杨豫龙: "光片荧光显微成像", 《光学学报》 *

Cited By (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN109765684A (zh) * 2019-03-03 2019-05-17 北京工业大学 多光路多方位实时显微成像***
CN110220875A (zh) * 2019-06-10 2019-09-10 浙江大学 一种基于荧光差分法的晶格光切片荧光显微成像装备及方法
CN113331788A (zh) * 2021-05-31 2021-09-03 华中科技大学 一种mfmt-xct双模式***
CN115575364A (zh) * 2022-09-30 2023-01-06 中国科学院生物物理研究所 基于光学显微成像的离子束加工方法

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