CN107937321B - 一种枯草芽孢杆菌及其在多环芳烃污染物菲降解中的应用 - Google Patents

一种枯草芽孢杆菌及其在多环芳烃污染物菲降解中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种枯草芽孢杆菌及其在多环芳烃污染物菲降解中的应用，本发明的枯草芽孢杆菌分类命名为枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）ZL09‑26，其保藏编号为GDMCC No：60293，本发明还提供了利用枯草芽孢杆菌ZL09‑26在菲降解中的应用，并提供了利用小分子有机酸提高菲降解效率的方法。本发明的枯草芽孢杆菌ZL09‑26可实现多环芳烃污染物（菲）的降解，并可利用小分子有机酸（柠檬酸、草酸、戊二酸）提高枯草芽孢杆菌ZL09‑26对多环芳烃污染物（菲）降解效率。

Description

一种枯草芽孢杆菌及其在多环芳烃污染物菲降解中的应用
技术领域
本发明属于微生物和环境工程技术领域，具体涉及一种枯草芽孢杆菌及其在多环芳烃污染物菲降解中的应用。
背景技术
多环芳烃（PAHs）广泛存在于工业领域的柴油废气、大气颗粒物和土壤中，并具有致癌，致畸和致突变等有害作用，长期以来清除多环芳烃污染物是世界性的研究热点和难题。随着全球对石油的开发和需求日益增加，越来越多的多环芳烃被释放到自然环境中。美国环保署（EPA）将PAHs中的16种列为环境中优先控制的污染物，菲作为这16种PAHs中的一种持久性有机污染物，常用作PAHs生物降解研究的模型化合物。
多环芳烃污染的治理方法主要包括三大类：物理法、化学法和生物法。物理法和化学法见效相对较快，但成本偏高，易产生二次污染。而生物法具有成本低、高效率、对环境破坏小、无二次污染等优势而备受青睐，具有良好的应用前景。目前，虽然对于多环芳烃的生物降解研究比较多，但是均存在降解效率低，速度慢等特点，因此寻求快速提高生物降解PAHs的方法尤为迫切。
小分子有机酸是土壤环境中一类重要的活性物质，主要来源于植物根系的分泌、动植物残体的分解、微生物的分泌与合成、土壤中有机物的转化等。土壤中的小分子有机酸具有重要的环境效应，除对土壤中重金属的迁移、毒性和生物有效性有影响外，同时还对有机污染物的迁移、转化和降解也有一定的影响，且作用机制不同。这些有机酸有些具有特殊功能，如影响土壤中矿物溶解，调节植物营养；与土壤中污染物作用，减小污染物的胁迫作用；为微生物生长提供能源和碳源，进而维持根际微生物的活性，为根的生长创造良好的外部环境等。同时，土壤中微生物的生长代谢过程中也会分泌小分子有机酸，这些小分子有机酸在不同程度上也会影响植物根际生长。不同土壤有机质含量和有机质类型对小分子有机物的生成、降解及转化有很大的影响。
为了提高多环芳烃-菲污染土壤生物修复的效率，在应用基础研究上需要从以下2个方面入手：（1）提高多环芳烃（菲）的生物利用度；（2）寻找可行的微生物能源。在提高多环芳烃-菲的生物利用度方面，研究者们做了很多工作，主要采用添加表面活性剂的方式，但却少有研究者将小分子有机酸作为提高多环芳烃（菲）降解效率的有效手段进行研究。鉴于上述原因，寻找一种能够自然环境中存在的可降解多环芳烃，同时在添加小分子酸后降解效率可以极大提高的菌株是十分必要的。
发明内容
本发明目的在于提供一种多环芳烃污染物（菲）的枯草芽孢杆菌。
本发明的芽孢杆菌来源于胜利油田石油污染区，其分类命名为枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）ZL09-26，其保藏编号为GDMCC No：60293，已保藏于广东省微生物菌种保藏中心（简称GDMCC，地址：广州市先烈中路100号大院59号楼5楼），保藏日期为：2017年12月1日。
本发明所提供的芽孢杆菌ZL09-26具有以下特征：
1）菌落特征：菌落呈圆形，呈白色或微黄色。
2）细胞形态特征：细胞呈椭圆到柱状，稍弯曲，细胞约为（0.7～0.8）×（2～3）μm；革兰氏染色呈阳性。无荚膜，周生鞭毛，能运动。
本发明的另一个目的在于提供上述枯草芽孢杆菌ZL09-26在多环芳烃污染物降解中的应用。
本发明还提供了一种优选的技术方案，利用小分子有机酸（柠檬酸、草酸、戊二酸）提高枯草芽孢杆菌ZL09-26对多环芳烃污染物（菲）降解效率。
本发明的枯草芽孢杆菌ZL09-26可实现多环芳烃污染物（菲）的降解，并可通过添加小分子有机酸的培养方法调节枯草芽孢杆菌ZL09-26的细胞代谢，提高枯草芽孢杆菌ZL09-26对多环芳烃污染物（菲）的降解效率。
附图说明
图1是枯草芽孢杆菌ZL09-26降解多环芳烃污染物-菲的最适pH；
图2是枯草芽孢杆菌ZL09-26降解多环芳烃污染物-菲的最适温度；
图3是枯草芽孢杆菌ZL09-26降解多环芳烃污染物-菲的最适底物浓度；
图4是添加和未添加小分子有机酸对多环芳烃污染物-菲降解情况；
本发明所述的生物材料，其分类命名为其分类命名为枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）ZL09-26，其保藏编号为GDMCC No：60293，保藏于广东省微生物菌种保藏中心（GDMCC），保藏日期为2017年12月1日，保藏地址为：广州市先烈中路100号大院59号楼5楼广东省微生物研究所。
具体实施方式
实施例所用LB培养基成分为：胰蛋白胨10 g，酵母提取物5 g，氯化钠10 g，蒸馏水定容至1000 mL。
无机盐培养基成分为：硝酸铵 1.0 g，磷酸二氢钾0.5 g, 磷酸氢二钾 1.5 g，七水合硫酸镁0.2 g，无水氯化钙 0.02 g，三氯化铁 0.5 g，蒸馏水定容至1000 mL。
实施例1
本实施例具体说明枯草芽孢杆菌ZL09-26的分离筛选和培养方法，包括以下步骤：
（1）将来自胜利油田石油污染区的土壤5 g装入250 mL含有Luria-Bertani（LB）培养基的锥形瓶中，于37℃、180rpm条件下培养10-12h。然后取5mL的上述培养液转接入装有200 mg/L 菲的无机盐培养基中，37℃、180rpm驯化培养四个周期，每个周期为5d，富集培养结束后取培养液做10-2、10-3、10-4梯度稀释，各取0.1 mL分别涂布于含菲的无机盐培养基平板上，每个梯度3个重复，置25℃恒温培养箱中培养48h。待长出菌落后挑取形状、大小、颜色等不同的菌落分别划线接种于相应的平板，直至无杂菌落。随后将获得的纯化菌株接种于牛肉膏蛋白胨斜面，放入4℃冰箱中保存备用。
（2）观察菌落及细胞的形态特征，并进行系列生理生化实验。
观察结果及实验结果如下：
1）菌落特征：菌落呈圆形，呈白色或微黄色。
2）细胞形态特征：细胞呈椭圆到柱状，稍弯曲，细胞约为（0.7～0.8）×（2～3）μm；革兰氏染色呈阳性。无荚膜，周生鞭毛，能运动。
3）生理生化特征：好氧生长；能液化明胶，能利用甘油，接触酶反应阳性，能将硝酸盐还原成亚硝酸盐，能液化明胶，可利用甘露糖发酵，不利用***糖、苦杏仁苷和甘露醇发酵，能水解淀粉。
（3）经培养筛选后确定的芽孢杆菌菌株于LB培养基中37℃富集培养12h，随后参照TAKARA提基因组试剂盒提取DNA。将16S rRNA基因的进行PCR扩增，PCR产物的测序送至金唯智公司完成。通过PCR获得芽孢杆菌菌株的16S rDNA序列，经序列测定及BLAST同源性对比与进化分析，鉴定获取的芽孢杆菌为枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis。将该芽孢杆菌菌株命名为枯草芽孢杆菌ZL09-26。
实施例2
本实施例对枯草芽孢杆菌ZL09-26进行了最适生长条件测定，操作步骤为：
（1）将菌株ZL09-26接入LB培养基中富集培养10-12h后转接入含有200mg/L菲的无机盐培养基中，于37℃，180rmp，不同pH（6.0、6.5、7.0、7.5、8.0）条件下振荡培养50h。
（2）将菌株ZL09-26接入LB培养基中富集培养10-12h后转接入含有200mg/L菲的无机盐培养基中，于pH 8.0，180rmp，不同温度（20℃、33℃、37℃、40℃、45℃）条件下振荡培养50h。
（3）将菌株ZL09-26接入LB培养基中富集培养10-12h后转接入含有以菲为唯一碳源的无机盐培养基中，于37℃，180rmp，不同浓度的菲（50mg/L、100mg/L、200mg/L、450mg/L、800mg/L）条件下振荡培养50h。
本发明菌株在以菲为唯一碳源的生长情况下最适pH，温度，菲浓度分别为8.0，37℃，200mg/L。
实施例3
本实施例说明本发明枯草芽孢杆菌ZL09-26在多环芳烃污染物-菲降解中的应用。
将菌株ZL09-26接入LB培养基中富集培养10-12h，以2%的接种量转接入含有200mg/L的菲为唯一碳源的无机盐培养基，于37℃，180rmp，pH 8.0的生长条件下培养15d，每隔5d测定其剩余菲含量。结果如图4所示，15天后菲的含量降低至不到5%。
实施例4
本实施例说明小分子有机酸可提高枯草芽孢杆菌ZL09-26降解多环芳烃污染物-菲效率。
将菌株ZL09-26接入LB培养基中富集培养10-12h，以2%的接种量转接入含有200mg/L菲与100mg/L小分子有机酸（柠檬酸、草酸、戊二酸）的无机盐培养基中，于37℃，180rmp，pH 8.0的生长条件下培养15d，每隔5d测定其剩余菲含量。
结果如图4所示，相比于未接种添加小分子有机酸的培养基中的降解情况，添加小分子有机酸的明显提高了多环芳烃污染物-菲的降解效率，其中柠檬酸对芽孢杆菌提高多环芳烃污染物-菲的降解效率尤为显著。

Claims (9)

1.一种枯草芽孢杆菌，其特征在于，其分类命名为枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）ZL09-26，其保藏编号为GDMCC No：60293。
2.权利要求1所述枯草芽孢杆菌的培养方法，其特征在于，将枯草芽孢杆菌ZL09-26接种于含200mg/L菲的无机盐培养基，37℃，pH 8.0条件下有氧培养。
3.根据权利要求2所述的培养方法，其特征在于，所述无机盐培养基成分为：硝酸铵1.0 g，磷酸二氢钾0.5 g, 磷酸氢二钾 1.5 g，七水合硫酸镁 0.2 g，无水氯化钙 0.02 g，三氯化铁 0.5 g，蒸馏水定容至1000 mL。
4.权利要求1所述枯草芽孢杆菌在多环芳烃污染物菲降解中的应用。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，在无机盐培养基中加入小分子有机酸，所述小分子有机酸选自柠檬酸、草酸、戊二酸中的一种。
6.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，在无机盐培养基中加入柠檬酸。
7. 根据权利要求4所述的应用，其特征在于，将枯草芽孢杆菌ZL09-26接入LB培养基中富集培养10-12h，以2%的接种量转接入含有200mg/L菲与100mg/L小分子有机酸的无机盐培养基中，于37℃，180rmp，pH 8.0的生长条件下培养；所述小分子有机酸选自柠檬酸、草酸、戊二酸中的一种。
8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述LB培养基成分为：胰蛋白胨10 g，酵母提取物 5g，氯化钠 10g，蒸馏水定容至1000 mL。
9.根据权利要求5-7任一项所述的应用，其特征在于，所述无机盐培养基成分为：硝酸铵 1.0 g，磷酸二氢钾0.5 g, 磷酸氢二钾 1.5 g，七水合硫酸镁 0.2 g，无水氯化钙 0.02g，三氯化铁 0.5 g，蒸馏水定容至1000 mL。
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