CN107937292A - 一种酿酒酵母培养物及其发酵工艺 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种酿酒酵母培养物及其发酵工艺。本发明中酿酒酵母培养物的发酵工艺，包括以下步骤：1)摇瓶种子培养；2)液态深层有氧发酵；3)液态低温无氧发酵；4)固态酶解有氧发酵；5)固态无氧发酵；6)固态高温破壁自溶，即得到酿酒酵母培养物。本发明使酵母菌在液态发酵阶段和固态发酵阶段均进行充分的发酵，产生更多的代谢产物，从而提高产品效果。通过本发明提供的方法所制得酿酒酵母培养物具有独特的芳香气味，经高温破壁后，酵母细胞壁、内容物等益生成分可发挥活菌所不具备或体现不充分的诱食、抗应激性、肠道益生等功效。
Description
技术领域
本发明涉及微生物发酵技术领域，特别涉及一种酿酒酵母培养物及其发酵工艺。
背景技术
酿酒酵母培养物是一种微生态制剂，由特定的酵母菌种按特定的工艺和特定培养基进行充分发酵而形成。该微生态制品不同于含有活性酵母细胞的产品，其主要作用成分是酿酒酵母菌在发酵过程中所产生的细胞外代谢产物，此外还含有发酵后变性的固体基质、酿酒酵母菌破壁后的细胞内容物以及酵母菌细胞壁等，富含B族维生素、矿物质、小肽、有机酸、维生素、核苷酸、甘露寡糖、β-葡聚糖以及“未知促生长因子”等，这些物质作为动物胃肠道内益生菌的营养底物，可以有效刺激益生菌的生长，调节肠道菌群，有效提高动物对饲料的利用率，进而提高动物的生产性能。它是一种集营养与保健等多重功效为一体的微生态饲料添加剂。
酵母培养物一般的生产工艺主要有液态发酵法和固态发酵法，现在的技术多只采用其中的一种发酵方法，但是简单的单一利用液态深层发酵法，更多的获得的是酵母细胞本身而非酵母菌的代谢活性产物，只采用固态发酵法，往往接种量不足，酵母菌活性低导致固体发酵不充分，有采用将两者结合的液固两相发酵，但也只是将液体阶段作为酵母菌的扩繁阶段，并没有进行液体无氧发酵代谢产物，低温无氧发酵可以促进有机酸、酯类、醇类、酮类、萜烯类等芳香物质的合成。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于提出一种酿酒酵母培养物及其发酵工艺，本发明使酵母菌在液态发酵阶段和固态发酵阶段均进行充分的发酵，产生更多的代谢产物，从而提高产品效果。
基于上述目的，本发明提供的一种酿酒酵母培养物的发酵工艺，包括以下步骤：
1)摇瓶种子培养：先将酿酒酵母菌接种至液体培养基中进行一级、二级扩大培养，获得摇瓶种子培养液；
2)液态深层有氧发酵：将获得的摇瓶种子培养液接种至底糖液体培养基中，通气进行有氧发酵，然后加补料培养基继续进行有氧发酵，获得酵母菌液态有氧发酵菌液；
3)液态低温无氧发酵：向获得的酵母菌液态有氧发酵菌液中加入糖蜜培养基，进行无氧发酵，获得低温无氧发酵菌液；
4)固态酶解有氧发酵：向获得的低温无氧发酵菌液中补加所述糖蜜培养基，然后与固态培养基混合，并添加水解酶，进行固态有氧发酵，得到固态有氧发酵产物；
5)固态无氧发酵：将得到的固态有氧发酵产物进行固态无氧发酵，得到固态无氧发酵产物；
6)固态高温破壁自溶：对得到的固态无氧发酵产物进行保温处理，使酵母细胞充分自溶，即得到酿酒酵母培养物。
作为本发明的一个实施例，在步骤6)之后还包括对所述酿酒酵母培养物进行低温烘干的步骤。
本发明中，可选的，对所述酿酒酵母培养物利用气流干燥机进行短时气流烘干，得到干燥的酵母培养物，并将其粉碎，包装成袋，避光阴凉保存。
作为本发明的一个实施例，在步骤1)中，所述液体培养基为酵母浸出粉胨葡萄糖培养基(又称为YPD液体培养基)，所述酵母浸出粉胨葡萄糖培养基的组成为：每1L水中含葡萄糖10～20g、胰蛋白胨10～30g和酵母浸粉5～15g。
作为本发明的一个实施例，在步骤2)中，将获得的摇瓶种子培养液以体积百分数为4～10％的接种量接种至所述底糖液体培养基中扩繁；
通气进行有氧发酵的条件为：温度为28～30℃，转速为150～200rpm，罐压为0.03～0.04Mpa，通气比(简称vvm：每分钟通气量与罐体实际料液体积的比值)2:1，发酵的时间为18～24小时；
加补料培养基继续进行有氧发酵的条件为：溶氧为20％～40％，发酵温度为30～34℃，转速为200～250rpm，罐压为0.03～0.04Mpa，通气量为2～2.5:1(罐体积v/无菌空气体积v)，发酵的时间为5～6小时；
所述底糖液体培养基由以下物质按照质量百分比组成：甘蔗糖蜜10～16％，硫酸铵0.8～1.5％，酵母膏0.08～0.16％，硫酸镁0.1～0.2％，无水氯化钙0.005～0.02％，磷酸二氢钾0.05～0.2％，消泡剂0.03～0.06％，余量为水；调节所述底糖液体培养基的初始pH值至6.0～6.5；
所述补料培养基由以下物质按照质量百分比组成：甘蔗糖蜜90～95％，硫酸铵2～5％，酵母膏0.1～0.3％，硫酸镁0.05～0.20％，氯化钙0.008～0.015％，磷酸二氢钾0.05～0.15％，消泡剂0.02～0.04％，余量为水；
所述酵母菌液态有氧发酵菌液中活菌数为6～10亿CFU/ml。
在本发明中，使用的消泡剂有天然油酯、高碳醇及脂肪酸、聚醚、有机硅等四类，以聚醚和有机硅类性能比较优越，应用广泛。其中聚醚类中又以四元醇聚醚(PPE)的消泡效果最佳。
作为本发明的一个实施例，在步骤3)中，向获得的酵母菌液态有氧发酵菌液中加入体积百分数为8％～15％的糖蜜培养基；
无氧发酵的条件为：发酵温度为15～20℃，转速为50～60rpm，密闭保持发酵罐压力不高于0.1Mpa，发酵时间为48～72h；
所述糖蜜培养基由以下物质按照质量百分比组成：甘蔗糖蜜8～15％，硫酸铵0.8～1.5％，酵母膏0.08～0.16％，硫酸镁0.01～0.06％，无水氯化钙0.005～0.02％，磷酸二氢钾0.01～0.05％，余量为水。
作为本发明的一个实施例，在步骤4)中，向获得的低温无氧发酵菌液中补加体积百分数为6％～12％的所述糖蜜培养基；所述糖蜜培养基由以下物质按照质量百分比组成：甘蔗糖蜜75～90％，硫酸铵0.1～0.6％，酵母膏0.1～0.3％，硫酸镁0.01～0.05％，氯化钙0.001～0.005％，磷酸二氢钾0.01～0.05％，余量为水，调节pH为5.8；
补加所述糖蜜培养基后的酵母菌液态低温无氧发酵菌液与固态培养基以质量比为1:0.5～0.8混合，经混合后堆放高度为0.2～0.6m，水分含量为35～45％，发酵环境空气湿度为70～80％，所述固态有氧发酵的温度为32～38℃，发酵时间为12～24h；
所述固态有氧发酵产物中酵母菌活菌数为4～10亿CFU/g；
所述水解酶选自低温淀粉酶、中性纤维素酶和酸性蛋白酶中的至少一种，所述低温淀粉酶的酶活≥2000U/ml，中性纤维素酶的酶活≥2000U/ml，酸性蛋白酶的酶活≥50000U/ml。
淀粉酶活力单位定义：在37℃，pH6.8的条件下，每分钟水解淀粉生成1mg还原糖所需要的酶量。淀粉酶活力测定时，在37℃，pH6.8的条件下，在一定的初始作用时间内将淀粉转化为还原糖，然后通过与DNS试剂作用，比色测定求得还原糖的生成量，从而计算出酶反应的初速度，即酶的活力。1U＝1mg还原糖/min·ml酶。
中性纤维素酶活力单位定义：1ml液体酶，在(50±0.1)℃、pH6.0，1h水解羧甲基纤维素钠底物，产生出相当于1mg葡萄糖的还原糖量，为1个酶活力单位，以U/ml表示。
酸性蛋白酶活力单位定位：在pH3.6和40℃温度条件下，每分钟水解酪蛋白产生1μg酪氨酸定义为一个蛋白酶活力单位。
作为本发明的一个实施例，在步骤4)中，所述固态培养基由以下物质按照质量百分比组成：
按照玉米粉20～30％、麸皮30～40％、玉米胚芽粕20～30％、玉米浆干粉10～20％、玉米芯粉10～20％配置成固体培养基；
或者，按照玉米粉20～40％、次粉20～30％、DDGS(干酒糟及其可溶物)20～30％、玉米芯粉20～40％配置成固体培养基；
或者，按照玉米粉10～20％、次粉25～40％、玉米皮10～20％、玉米蛋白饲料20～35％配置成固体培养基；
或者，按照玉米粉20～35％、次粉20～40％、玉米胚芽粕20～30％、玉米浆干粉10～20％、玉米芯粉10～20％配置成固体培养基。
作为本发明的一个实施例，在步骤5)中，采用密闭的发酵箱进行所述固态无氧发酵；
所述固态无氧发酵的发酵温度为32～38℃，发酵时间48h～72h；
所述固态无氧发酵产物中酵母菌活菌数为2～6亿CFU/ml，酸溶蛋白含量为35～40％。
作为本发明的一个实施例，在步骤6)中，保温处理的温度为45～60℃，时间为6～12h，将对所述固态无氧发酵产物的温度上升至上述温度条件下保温处理使酵母菌自溶完全，稀释涂布平板检测基本无活菌。
在本发明中，所使用的各种培养基均需要经过灭菌处理。
在本发明中，所述酿酒酵母菌为酿酒酵母菌Sa-10，保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏号是CGMCC No.6120。
本发明还提供了一种酿酒酵母培养物，所述酿酒酵母培养物根据所述的酿酒酵母培养物的发酵工艺制备得到。
从上面所述可以看出，本发明提供的酿酒酵母培养物的发酵工艺采用液态深层有氧发酵－液态低温无氧发酵－固态酶解有氧发酵－固态无氧发酵－高温自溶五阶段发酵方式，充分利用了液态发酵和固态发酵的优势，其中液态深层有氧发酵为高密度培养，为后续阶段提供足够的酵母菌细胞数量，接着采用液态低温无氧发酵，有利于酵母菌在液态状态下进行充分无氧发酵，使液态阶段产生更丰富的代谢产物，再通过固态酶解有氧发酵，在对原料进行酶解的同时进行酵母菌的有氧增殖，酶解作用能对固态原料中酵母菌不能利用的物质进行充分的降解，更利于酵母菌在固态发酵阶段的繁殖代谢，再进行固态无氧发酵，酵母菌更进一步充分进行无氧发酵得到丰富的代谢成分，并有效改善固态原料的气味，使其产生浓郁的酸香味，诱食性极佳，最后阶段进行高温自溶，使酵母菌细胞破碎，充分释放酵母细胞内容物，最终制备成具有营养价值高，具独特活性的功能性的酵母培养物。
附图说明
图1为本发明酿酒酵母培养生产工艺流程图。
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚明白，以下结合具体实施例，并参照附图，对本发明进一步详细说明。
在以下实施例中，所述酿酒酵母菌为酿酒酵母菌Sa-10，保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏号是CGMCC No.6120。
实施例1
作为本发明的一个实施例，所述酵母培养物的发酵工艺包括以下步骤：
(1)摇瓶种子培养(一级、二级种子液)：取超低温(例如－196℃的液氮)保存的酿酒酵母菌菌种Sa-10进行活化，再将活化后的酿酒酵母菌接种1～2环到一级摇瓶培养基中，28～30℃、180～200rpm摇床振荡培养17～24h，得到一级种子液，然后将一级种子液接种到二级摇瓶培养基，28℃～30℃、180～200rpm摇床振荡培养20～24h，获得摇瓶种子培养液。
其中，一级摇瓶培养基和二级摇瓶培养基均为YPD液体培养基，所述YPD液体培养基的组成为：葡萄糖20g、胰蛋白胨20g、酵母浸粉10g，1000ml水，自然pH；该培养基在116℃条件下高温灭菌30min。
(2)液态深层有氧发酵：再将上述得到的摇瓶种子培养液以10％(v/v)的接种量接种至底糖液体培养基中进行底糖发酵培养阶段，培养条件调整到温度30℃，转速设定150转/分，罐压为0.04Mpa，通气比2:1(vvm：每分钟通气量与罐体实际料液体积的比值)，培养时间约18小时，当溶氧开始直线上升时转入流加补料培养基，进入补料培养阶段，温度30℃，转速设定200转/分，通气比2.5:1(罐体积v/无菌空气体积v)，溶氧20％～40％之间，流加时间6小时，流速为700L/h，当溶氧再次直线上升时，残糖<1％，发酵结束，制得酵母菌液态有氧发酵菌液。
其中，所述底糖液体培养基由以下物质按照质量百分比组成：甘蔗糖蜜15％，硫酸铵1.0％，酵母膏0.16％，硫酸镁0.15％，无水氯化钙0.008％，磷酸二氢钾0.15％，消泡剂0.03％，余量为水，调节该培养基的初始pH为6.2；所述补料培养基为糖蜜液体培养基，由以下物质按照质量百分比组成：甘蔗糖蜜92％，硫酸铵4％，酵母膏0.2％，硫酸镁0.1％，氯化钙0.01％，磷酸二氢钾0.1％，消泡剂0.03％，余量为水，调节该培养基的初始pH为6.0。发酵过程中不调控pH，生物量湿重达到180g/L，酵母活菌数达到8亿CFU/ml，即得到液态深层有氧发酵菌液。
(3)液体低温无氧发酵：将酵母菌液态深层有氧发酵菌液降温至18℃，接着向其中补加8％(v/v)的灭菌处理过的糖蜜培养基，开启低速搅拌50rpm，不通无菌空气，保持发酵罐压为0.1Mpa，发酵时间为72h，获得液态低温无氧发酵菌液。
其中所述补加的糖蜜培养基由以下物质按照质量百分比组成：甘蔗糖蜜12％，硫酸铵1.0％，酵母膏0.15％，硫酸镁0.04％，无水氯化钙0.006％，磷酸二氢钾0.05％，余量为水，调节pH为5.8；
(4)固态酶解有氧发酵：向上步所述液态低温无氧发酵菌液中补加10％(V/V)的经过灭菌处理的糖蜜培养基，立即将液态低温无氧发酵菌液与固态培养基以质量比为1:0.6混合，并添加水解酶，酶的用量为每克固态培养基中添加一定量酶活，低温淀粉酶用量为6U/g，中性纤维素酶8U/g，酸性蛋白酶12U/g，物料水分控制在40％，发酵环境空气湿度在70％，固态酶解过程与有氧发酵同步进行，所述固态有氧发酵产物中初始酵母菌活菌数为2～4亿CFU/g，装入固态发酵箱中，发酵箱中物料放置厚度0.4m，在32～35℃条件下有氧发酵24小时，得到固态有氧发酵产物，所述固态有氧发酵产物中最终酵母菌活菌数为8亿CFU/g。
其中所述糖蜜培养基由以下物质按照质量百分比组成：甘蔗糖蜜90％，硫酸铵0.2％，酵母膏0.2％，硫酸镁0.03％，氯化钙0.002％，磷酸二氢钾0.04％，余量为水，调节pH为5.8；
其中，所述固态培养基由以下物质按照质量百分比组成：按照玉米粉20％，麸皮30％，玉米胚芽粕25％，玉米芯粉15％，玉米浆干粉10％，配置成固态培养基。
在该步骤中，玉米粉、麸皮主要提供碳源，玉米胚芽粕和玉米浆干粉主要提供氮源，玉米芯粉主要作为一种吸附成分，有效吸附菌液。
5)固态无氧发酵：将所述装有固态酶解有氧发酵产物的发酵箱密闭，调节发酵温度至35℃，无氧发酵72小时，酸溶蛋白含量达到38.28％，发酵结束，得到固态无氧发酵产物，固态无氧发酵产物中酵母菌活菌数为4亿CFU/ml。
6)固态高温破壁自溶：再将无氧发酵后的产物升温至60℃进行保温处理10h，让酵母细胞充分自溶破壁，酵母菌自溶完全后，稀释涂布平板检测基本无活酵母菌，即得到自溶后的酵母培养物，酵母细胞壁多糖甘露聚糖含量达到1.5％。
7)低温干燥及粉碎包装：利用气流干燥剂将自溶后的酵母培养物进行短时气流低温烘干，得到干燥的酵母培养物，并将其粉碎，包装成袋，避光阴凉保存，即得到酵母培养物成品，其具有发酵香味，呈酸性。
实施例2
作为本发明的一个实施例，所述酵母培养物的发酵工艺包括以下步骤：
(1)摇瓶种子培养(一级、二级种子液)：取超低温(例如－196℃的液氮)保存的酿酒酵母菌菌种Sa-10进行活化，再将活化后的酿酒酵母菌接种1～2环到一级摇瓶培养基中，28～30℃、180～200rpm摇床振荡培养17～24h，得到一级种子液，然后将一级种子液接种到二级摇瓶培养基，28℃～30℃、180～200rpm摇床振荡培养20～24h，获得摇瓶种子培养液。
其中，一级摇瓶培养基和二级摇瓶培养基均为YPD液体培养基，所述YPD液体培养基的组成为：葡萄糖10g、胰蛋白胨10g、酵母浸粉5g，1000ml水，自然pH；该培养基在116℃条件下高温灭菌30min。。
(2)液态深层有氧发酵：再将上述得到的摇瓶种子培养液以8％(v/v)的接种量接种至底糖液体培养基中进行底糖发酵培养阶段，培养条件温度30℃，转速设定180转/分，罐压为0.03Mpa，通气比2:1(vvm：每分钟通气量与罐体实际料液体积的比值)，培养时间18小时，当溶氧直线上升时，残糖<1％，开始流加补料培养基，温度30℃，通气比2.5:1(罐体积v/无菌空气体积v)，溶氧20％～40％之间，流加时间5小时，流速为840L/h，当溶氧再次开始直线上升，发酵结束，制得酵母菌液态有氧发酵菌液。
其中，所述底糖液体培养基由以下物质按照质量百分比组成：甘蔗糖蜜13％，硫酸铵0.8％，酵母膏0.1％，硫酸镁0.15％，无水氯化钙0.01％，磷酸二氢钾0.15％，消泡剂0.03％，余量为水，调节该培养基的初始pH为6.2；所述补料培养基由以下物质按照质量百分比组成：甘蔗糖蜜90％，硫酸铵3.5％，酵母膏0.15％，硫酸镁0.2％，氯化钙0.01％，磷酸二氢钾0.2％，消泡剂0.03％，余量为水，调节该培养基的初始pH为6.2。发酵过程中不调控pH，控制发酵过程溶氧在20％～40％，生物量湿重达到170g/L，酵母活菌数达到7亿CFU/ml，即得到液态深层有氧发酵菌液。
(3)液态低温无氧发酵：将酵母菌液态深层有氧发酵菌液降温至20℃，接着向其中补加9％(v/v)的灭菌处理过的糖蜜培养基，开启低速搅拌30rpm，不通无菌空气，保持发酵罐压为0.1Mpa，发酵时间为48h，获得液态低温无氧发酵菌液。
其中所述补加的糖蜜培养基由以下物质按照质量百分比组成：甘蔗糖蜜9％，硫酸铵0.9％，酵母膏0.12％，硫酸镁0.04％，无水氯化钙0.008％，磷酸二氢钾0.04％，余量为水，调节pH为6.0；
(4)固态酶解有氧发酵：向上步所述液态低温无氧发酵菌液中补加7％(V/V)的经过灭菌处理的糖蜜培养基，立即将酵母菌液态有氧发酵菌液与固态培养基以质量比为1:0.5混合，并添加水解酶，酶的用量为每克固态培养基中添加一定量酶活，低温淀粉酶用量为8U/g，中性纤维素酶8U/g，物料水分控制为35％，发酵环境空气湿度在70～80％，所述固态有氧发酵产物中初始酵母菌活菌数为2亿CFU/g，装入固态发酵箱中，发酵箱中物料放置厚度不超过0.6m，在32～35℃条件下有氧发酵16小时，得到固态有氧发酵产物，所述固态有氧发酵产物中最终酵母菌活菌数为6亿CFU/g。
其中所述补加糖蜜培养基由以下物质按照质量百分比组成：甘蔗糖蜜82％，硫酸铵0.5％，酵母膏0.2％，硫酸镁0.01％，氯化钙0.001％，磷酸二氢钾0.01％，余量为水，调节pH为5.8；
其中，所述固态培养基由以下物质按照质量百分比组成：按照玉米粉30％、次粉30％、DDGS(干酒糟及其可溶物)20％，玉米芯粉20％配置成固体培养基；
在该步骤中，玉米粉、次粉主要提供碳源，DDGS主要提供氮源，玉米芯粉主要作为一种吸附成分，有效吸附菌液。
5)固态无氧发酵：将所述装有固态酶解有氧发酵产物的发酵箱密闭，保持无氧状态，调节发酵温度至35℃左右，无氧发酵60小时，发酵结束，得到固态无氧发酵产物，酸溶蛋白含量达到36.46％。
6)固态高温破壁自溶：再将无氧发酵后的产物升温至55℃进行保温处理12h，让酵母细胞充分自溶破壁，酵母菌自溶完全后，稀释涂布平板检测基本无活酵母菌，即得到自溶后的酵母培养物，酵母细胞壁多糖甘露聚糖含量达到1％。
7)低温干燥及粉碎包装：将自溶后的酵母培养物进行低温烘干，得到干燥的酵母培养物，并将其粉碎，包装成袋，避光阴凉保存，即得到酵母培养物成品，其具有发酵香味，呈酸性。
实施例3
作为本发明的另一个实施例，所述酵母培养物的发酵工艺包括以下步骤：
(1)摇瓶种子培养(一级、二级种子液)：取超低温(例如－196℃的液氮)保存的酿酒酵母菌菌种Sa-10进行活化，再将活化后的酿酒酵母菌接种1～2环到一级摇瓶培养基中，28～30℃、180～200rpm摇床振荡培养17～24h，得到一级种子液，然后将一级种子液接种到二级摇瓶培养基，28℃～30℃、180～200rpm摇床振荡培养20～24h，获得摇瓶种子培养液。
其中，一级摇瓶培养基和二级摇瓶培养基均为YPD液体培养基，所述YPD液体培养基的组成为：葡萄糖15g、胰蛋白胨30g、酵母浸粉15g，1000ml水，自然pH；该培养基在116℃条件下高温灭菌30min。。
(2)液态深层有氧发酵：将上述得到的摇瓶种子培养液以10％(v/v)的接种量接种至底糖液体培养基中进行底糖发酵培养阶段，培养条件温度30℃，转速设定200转/分，通气比2:1(vvm：每分钟通气量与罐体实际料液体积的比值)，罐压为0.04Mpa，培养时间16小时，当溶氧直线上升时，残糖<1％，开始流加补料培养基，温度30℃，通气比2:1(罐体积v/无菌空气体积v)，溶氧20％～40％之间，流加时间5.5小时，流速为765L/h，当溶氧再次开始直线上升，发酵结束，制得酵母菌液态有氧发酵菌液。
其中，所述底糖液体培养基由以下物质按照质量百分比组成：甘蔗糖蜜11％，硫酸铵1.0％，酵母膏0.12％，硫酸镁0.15％，无水氯化钙0.02％，磷酸二氢钾0.15％，消泡剂0.04％，余量为水，调节该培养基的初始pH为6.3；所述补料培养基由以下物质按照质量百分比组成：甘蔗糖蜜90％，硫酸铵3.5％，酵母膏0.15％，硫酸镁0.2％，氯化钙0.012％，磷酸二氢钾0.2％，消泡剂0.03％，余量为水，调节该培养基的初始pH为6.2。发酵过程中不调控pH，生物量湿重达到180g/L，酵母活菌数达到8亿CFU/ml，即得到液态深层有氧发酵菌液。
(3)液态低温无氧发酵：将酵母菌液态深层有氧发酵菌液降温至22℃，接着向其中补加6％(v/v)的灭菌处理过的糖蜜培养基，开启低速搅拌60rpm，不通无菌空气，保持发酵罐压为0.1Mpa，发酵时间为60h，获得液态低温无氧发酵菌液。
其中所述补加的糖蜜培养基由以下物质按照质量百分比组成：甘蔗糖蜜10％，硫酸铵1.2％，酵母膏0.14％，硫酸镁0.03％，氯化钙0.008％，磷酸二氢钾0.03％，余量为水，调节pH为6.0；
(4)固态酶解有氧发酵：向上步所述液态低温无氧发酵菌液中补加8％(V/V)的经过灭菌处理的糖蜜培养基，立即将酵母菌液态有氧发酵菌液与固态培养基以质量比为1:0.5混合，并添加水解酶，酶的用量为每克固态培养基中添加一定量酶活，低温淀粉酶用量为6U/g，酸性蛋白酶10U/g，物料水分控制为35％，发酵环境空气湿度在70～80％，所述固态有氧发酵产物中初始酵母菌活菌数为2亿CFU/g，装入固态发酵箱中，发酵箱中物料放置厚度不超过0.6m，在32～35℃条件下有氧发酵16小时，得到固态有氧发酵产物，所述固态有氧发酵产物中最终酵母菌活菌数为6亿CFU/g。
其中所述补加糖蜜培养基由以下物质按照质量百分比组成：甘蔗糖蜜86％，硫酸铵0.5％，酵母膏0.2％，硫酸镁0.03％，氯化钙0.002％，磷酸二氢钾0.04％，余量为水，调节pH为5.8；
其中，所述固态培养基由以下物质按照质量百分比组成：按照玉米粉20％，次粉30％，玉米皮20％，玉米蛋白饲料30％配置成固体培养基；
在该步骤中，玉米粉、次粉主要提供碳源，玉米蛋白饲料主要提供氮源，玉米皮主要作为一种吸附成分，有效吸附菌液。
5)固态无氧发酵：将所述装有固态酶解有氧发酵产物的发酵箱密闭，调节发酵温度至32℃左右，无氧发酵48小时，发酵结束，得到固态无氧发酵产物，酸溶蛋白含量达到35.86％。
6)固态高温破壁自溶：再将无氧发酵后的产物升温至50℃进行保温处理15h，让酵母细胞充分自溶破壁，酵母菌自溶完全后，稀释涂布平板检测基本无活酵母菌，即得到自溶后的酵母培养物，酵母细胞壁多糖甘露聚糖含量达到1.2％。
7)低温干燥及粉碎包装：将自溶后的酵母培养物进行低温烘干，得到干燥的酵母培养物，并将其粉碎，包装成袋，避光阴凉保存，即得到酵母培养物成品，其具有发酵香味，呈酸性。
对比例1
省去本发明实施例1中的液态低温无氧发酵步骤，其他同实施例1一致，具体如下：
(1)摇瓶种子培养(一级、二级种子液)：取超低温(例如－196℃的液氮)保存的酿酒酵母菌菌种Sa-10进行活化，再将活化后的酿酒酵母菌接种1～2环到一级摇瓶培养基中，28～30℃、180～200rpm摇床振荡培养17～24h，得到一级种子液，然后将一级种子液接种到二级摇瓶培养基，28℃～30℃、180～200rpm摇床振荡培养20～24h，获得摇瓶种子培养液。
其中，一级摇瓶培养基和二级摇瓶培养基均为YPD液体培养基，所述YPD液体培养基的组成为：葡萄糖20g、胰蛋白胨20g、酵母浸粉10g，1000ml水，自然pH；该培养基在116℃条件下高温灭菌30min。
(2)液态深层有氧发酵：再将上述得到的摇瓶种子培养液以8％(v/v)的接种量接种至底糖液体培养基中进行底糖发酵培养阶段，培养条件调整到温度30℃，转速设定150转/分，罐压为0.04Mpa，通气比2:1(vvm：每分钟通气量与罐体实际料液体积的比值)，培养时间约18小时，当溶氧开始直线上升时转入流加补料培养基，进入补料培养阶段，温度30℃，转速设定200转/分，通气比2.5:1(罐体积v/无菌空气体积v)，溶氧20％～40％之间，流加时间6小时，流速为700L/h，当溶氧再次直线上升时，残糖<1％，发酵结束，制得酵母菌液态深层有氧发酵菌液。
其中，所述底糖液体培养基由以下物质按照质量百分比组成：甘蔗糖蜜13％，硫酸铵0.8％，酵母膏0.15％，硫酸镁0.1％，无水氯化钙0.01％，磷酸二氢钾0.1％，消泡剂0.03％，余量为水；所述补料培养基由以下物质按照质量百分比组成：甘蔗糖蜜90％，硫酸铵3.5％，酵母膏0.15％，硫酸镁0.1％，氯化钙0.01％，磷酸二氢钾0.1％，消泡剂0.03％，余量为水；调节该培养基的初始pH为6.2。发酵过程中不调控pH，控制发酵过程溶氧在20％～40％，生物量湿重达到160g/L，酵母活菌数达到6亿CFU/ml。
(3)固态无氧发酵：将固态培养基和上述得到的酵母菌液态深层有氧发酵菌液依据质量比为1:0.5的比例混合，装入发酵箱密闭处理，调节发酵温度至35℃左右，无氧发酵72小时，发酵结束，得到固态无氧发酵产物。
所述固态培养基由以下物质按照质量百分比组成：按照玉米粉30％、次粉30％、玉米胚芽粕20％、玉米浆干粉10％，玉米芯粉10％配置成固体培养基；
在该步骤中，玉米粉、次粉主要提供碳源，玉米胚芽粕和玉米浆干粉主要提供氮源，玉米芯粉主要作为一种吸附成分，有效吸附菌液。
4)低温干燥及粉碎包装：将得到固态无氧发酵产物进行低温烘干，得到干燥的酵母培养物，并将其粉碎，包装成袋，避光阴凉保存，即得到酵母培养物成品。
对比例2
省去本发明实施例1中的固态酶解有氧发酵，其他同本发明实施例1，具体如下：
(1)摇瓶种子培养(一级、二级种子液)：取超低温(例如－196℃的液氮)保存的酿酒酵母菌菌种Sa-10进行活化，再将活化后的酿酒酵母菌接种1～2环到一级摇瓶培养基中，28～30℃、180～200rpm摇床振荡培养17～24h，得到一级种子液，然后将一级种子液接种到二级摇瓶培养基，28℃～30℃、180～200rpm摇床振荡培养20～24h，获得摇瓶种子培养液。
其中，一级摇瓶培养基和二级摇瓶培养基均为YPD液体培养基，所述YPD液体培养基的组成为：葡萄糖20g、胰蛋白胨20g、酵母浸粉10g，1000ml水，自然pH；该培养基在116℃条件下高温灭菌30min。
(2)液态深层有氧发酵：再将上述酵母菌种子培养液以8％(v/v)的接种量接种至底糖液体培养基中进行底糖发酵培养阶段，培养条件温度30℃，转速设定200转/分，罐压为0.03Mpa，培养时间18小时，当溶氧直线上升时，残糖<1％，开始流加补料培养基，温度30℃，溶氧20～40％之间，流加时间6小时，流速为700L/h，当溶氧再次开始直线上升，发酵结束，制得酵母菌液态深层有氧发酵菌液。
其中，所述底糖液体培养基由以下物质按照质量百分比组成：甘蔗糖蜜13％，硫酸铵0.8％，酵母膏0.15％，硫酸镁0.1％，无水氯化钙0.01％，磷酸二氢钾0.1％，消泡剂0.03％，余量为水；所述补料培养基由以下物质按照质量百分比组成：甘蔗糖蜜90％，硫酸铵3.5％，酵母膏0.15％，硫酸镁0.1％，氯化钙0.01％，磷酸二氢钾0.1％，消泡剂0.03％，余量为水；调节该培养基的初始pH为6.2。发酵过程中不调控pH，控制发酵过程溶氧在20％～40％，生物量湿重达到160g/L，酵母活菌数达到6亿CFU/ml。
(3)液体低温无氧发酵：将酵母菌液态有氧发酵菌液降温至18℃，接着向其中补加8％(v/v)的灭菌处理过的糖蜜培养基，开启低速搅拌50rpm，不通无菌空气，保持发酵罐压为0.1Mpa，发酵时间为72h，获得液态低温无氧发酵菌液。
其中所述补加的糖蜜培养基由以下物质按照质量百分比组成：甘蔗糖蜜7％，硫酸铵0.5％，酵母膏0.15％，硫酸镁0.02％，氯化钙0.002％，磷酸二氢钾0.02％，余量为水，调节pH为5.8；
(4)固态无氧发酵：将固态培养基和上述得到的液态低温无氧发酵菌液依据质量比为1:0.6的比例混合，装入发酵箱密闭处理，调节发酵温度至35℃左右，无氧发酵48小时，发酵结束，得到固态无氧发酵产物，酸溶蛋白含量为28.42％。
所述固态培养基由以下物质按照质量百分比组成：按照玉米粉30％、次粉30％、玉米胚芽粕20％、玉米浆干粉10％，玉米芯粉10％配置成固体培养基；
在该步骤中，玉米粉、次粉主要提供碳源，玉米胚芽粕和玉米浆干粉主要提供氮源，玉米芯粉主要作为一种吸附成分，有效吸附菌液。
5)低温干燥及粉碎包装：将得到固态无氧发酵产物进行低温烘干，得到干燥的酵母培养物，并将其粉碎，包装成袋，避光阴凉保存，即得到酵母培养物成品。
测试本发明实施例1-3中经过步骤(3)液态低温无氧发酵得到的液态发酵液以及对比例1-2中经过步骤(2)液态深层有氧发酵后得到的发酵液的有机酸含量，结果见下表。
有机酸测定方法：仪器为岛津LC-2030，色谱柱：C18柱，4.6mm×250mm，5μm，或同等性能的色谱柱，分析条件：用0.1％磷酸溶液-甲醇＝97.5+2.5(体积比)比例的流动相等度洗脱20min，柱温：40℃，进样量：10μL，检测波长:210nm，测定液体低温无氧发酵产物中有机酸含量。结果见表1。
表1 有机酸检测结果
注：有机酸能有效降低消化物的pH，能抑制有害菌的繁殖，并能提高饲料的适口性。
测试实施例1-3得到的酵母培养物、对比例1得到的酵母培养物的核苷酸含量。
核苷酸测定方法：岛津LC－2030及紫外检测器，分析条件：流动相：磷酸盐缓冲液：甲醇(0.01mol/L)＝1000:40，流速1.0ml/min，柱温箱25℃，检测波长：254nm，进样量：10ul，测定各实施例与对比例得到的酵母培养物中核苷酸含量。结果见表2。
表2 酵母培养物成品中核苷酸检测结果
注：核苷酸作为细胞合成的必需物质，具有保护肠道黏膜、增强机体免疫力等生理功能。
测试实施例1-3得到的酵母培养物、对比例2得到的酵母培养物中的多肽含量。结果见表3。
表3 多肽检测结果
| 测试项目 | 实施例1 | 实施例2 | 实施例3 | 对比例2 |
| 多肽含量(％) | 38.28 | 36.46 | 35.86 | 28.42 |
注：多肽含量为多肽占总蛋白的百分比，多肽为活性物质，更有利于动物的消化吸收。
因此，相对于现有技术，本发明提供的酵母培养物的发酵工艺具有以下优点：
(1)本发明采用已知筛选的性能优越的酿酒酵母为菌种，菌种安全可靠，以甘蔗糖蜜、玉米粉、麸皮、次粉、玉米胚芽粕、玉米皮、DDGS、玉米芯粉等为原料，这些原料都为大宗原料，且多为农产品加工副产物，价格低廉。
(2)本发明采用酵母菌液态发酵+固态发酵两相发酵及有氧发酵+无氧发酵两种发酵方式相结合的新方法，通过液态深层有氧发酵－液态低温无氧发酵－固态酶解有氧发酵－固态无氧发酵－高温自溶五阶段发酵方式，发酵获得的产品有机酸含量，核苷酸含量及多肽含量都明显高于对比例。
(3)本发明采用酶解处理固态培养基及酵母菌有氧发酵繁殖同步进行，利用高活性的酶类物质分解固态培养基中酵母难以利用的物质，同时进行酵母菌的有氧发酵，用此种处理方法获得的酿酒酵母培养物，相比对比例2，实施例1-3组酿酒酵母培养物中核苷酸含量明显高于对比例，有效提高了酿酒酵母培养物的品质。
(4)本发明经过液态无氧发酵，有机酸含量丰富，相比对比例1，有机酸含量明显提高，在接种酵母菌固体发酵时使初始阶段pH为4.6～5.0，发酵环境成酸性，可以有效抑制有害菌的生长，从而有效保证产品质量。
(5)本发明所有的发酵菌液均混入固态培养基中，继续发酵制成酿酒酵母培养物成品，发酵产物无需分离纯化便可直接使用，无废液废渣排放，符合环保要求。
通过本发明提供的方法所制得酿酒酵母培养物具有独特的芳香气味，经高温破壁后，酵母细胞壁、内容物等益生成分可发挥活菌所不具备或体现不充分的诱食、抗应激性、肠道益生等功效。
所属领域的普通技术人员应当理解：以上所述仅为本发明的具体实施例而已，并不用于限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (10)
1.一种酿酒酵母培养物的发酵工艺，其特征在于，包括以下步骤：
1)摇瓶种子培养：先将酿酒酵母菌接种至液体培养基中进行一级、二级扩大培养，获得摇瓶种子培养液；
2)液态深层有氧发酵：将获得的摇瓶种子培养液接种至底糖液体培养基中，通气进行有氧发酵，然后加补料培养基继续进行有氧发酵，获得酵母菌液态有氧发酵菌液；
3)液态低温无氧发酵：向获得的酵母菌液态有氧发酵菌液中加入糖蜜培养基，进行无氧发酵，获得低温无氧发酵菌液；
4)固态酶解有氧发酵：向获得的低温无氧发酵菌液中补加所述糖蜜培养基，然后与固态培养基混合，并添加水解酶，进行固态有氧发酵，得到固态有氧发酵产物；
5)固态无氧发酵：将得到的固态有氧发酵产物进行固态无氧发酵，得到固态无氧发酵产物；
6)固态高温破壁自溶：对得到的固态无氧发酵产物进行保温处理，使酵母细胞充分自溶，即得到酿酒酵母培养物。
2.根据权利要求1所述的酿酒酵母培养物的发酵工艺，其特征在于，在步骤6)之后还包括对所述酿酒酵母培养物进行低温烘干的步骤。
3.根据权利要求1所述的酿酒酵母培养物的发酵工艺，其特征在于，在步骤1)中，所述液体培养基为酵母浸出粉胨葡萄糖培养基，所述酵母浸出粉胨葡萄糖培养基的组成为：每1L水中含葡萄糖10～20g、胰蛋白胨10～30g和酵母浸粉5～15g。
4.根据权利要求1所述的酿酒酵母培养物的发酵工艺，其特征在于，在步骤2)中，将获得的摇瓶种子培养液以体积百分数为4～10％的接种量接种至所述底糖液体培养基中扩繁；
通气进行有氧发酵的条件为：温度为28～30℃，转速为150～200rpm，罐压为0.03～0.04Mpa，通气比2:1，发酵的时间为18～24小时；
加补料培养基继续进行有氧发酵的条件为：溶氧为20～40％，发酵温度为30～34℃，转速为200～250rpm，罐压为0.03～0.04Mpa，通气量为2～2.5:1，发酵的时间为5～6小时；
所述底糖液体培养基由以下物质按照质量百分比组成：甘蔗糖蜜10～16％，硫酸铵0.8～1.5％，酵母膏0.08～0.16％，硫酸镁0.1～0.2％，无水氯化钙0.005～0.02％，磷酸二氢钾0.05～0.2％，消泡剂0.03～0.06％，余量为水；调节所述底糖液体培养基的初始pH值至6.0～6.5；
所述补料培养基由以下物质按照质量百分比组成：甘蔗糖蜜90～95％，硫酸铵2～5％，酵母膏0.1～0.3％，硫酸镁0.05～0.20％，氯化钙0.008～0.015％，磷酸二氢钾0.05～0.15％，消泡剂0.02～0.04％，余量为水；
所述酵母菌液态有氧发酵菌液中活菌数为6～10亿CFU/ml。
5.根据权利要求1所述的酿酒酵母培养物的发酵工艺，其特征在于，在步骤3)中，向获得的酵母菌液态有氧发酵菌液中加入体积百分数为8％～15％的糖蜜培养基；
无氧发酵的条件为：发酵温度为15～20℃，转速为50～60rpm，密闭保持发酵罐压力不高于0.1Mpa，发酵时间为48～72h；
所述糖蜜培养基由以下物质按照质量百分比组成：甘蔗糖蜜8～15％，硫酸铵0.8～1.5％，酵母膏0.08～0.16％，硫酸镁0.01～0.06％，无水氯化钙0.005～0.02％，磷酸二氢钾0.01～0.05％，余量为水。
6.根据权利要求1所述的酿酒酵母培养物的发酵工艺，其特征在于，在步骤4)中，向获得的低温无氧发酵菌液中补加体积百分数为6％～12％的所述糖蜜培养基；
补加所述糖蜜培养基后的酵母菌液态低温无氧发酵菌液与固态培养基以质量比为1:0.5～0.8混合，经混合后堆放高度为0.2～0.6m，水分含量为35～45％，发酵环境空气湿度为70～80％，所述固态有氧发酵的温度为32～38℃，发酵时间为12～24h；
所述固态有氧发酵产物中酵母菌活菌数为4～10亿CFU/g；
所述水解酶选自低温淀粉酶、中性纤维素酶和酸性蛋白酶中的至少一种，所述低温淀粉酶的酶活≥2000U/ml，中性纤维素酶的酶活≥2000U/ml，酸性蛋白酶的酶活≥50000U/ml。
7.根据权利要求1所述的酿酒酵母培养物的发酵工艺，其特征在于，在步骤4)中，所述固态培养基由以下物质按照质量百分比组成：
按照玉米粉20～30％、麸皮30～40％、玉米胚芽粕20～30％、玉米浆干粉10～20％、玉米芯粉10～20％配置成固体培养基；
或者，按照玉米粉20～40％、次粉20～30％、DDGS20～30％、玉米芯粉20～40％配置成固体培养基；
或者，按照玉米粉10～20％、次粉25～40％、玉米皮10～20％、玉米蛋白饲料20～35％配置成固体培养基；
或者，按照玉米粉20～35％、次粉20～40％、玉米胚芽粕20～30％、玉米浆干粉10～20％、玉米芯粉10～20％配置成固体培养基。
8.根据权利要求1所述的酿酒酵母培养物的发酵工艺，其特征在于，在步骤5)中，采用密闭的发酵箱进行所述固态无氧发酵；
所述固态无氧发酵的发酵温度为32～38℃，发酵时间48h～72h；
所述固态无氧发酵产物中酵母菌活菌数为2～6亿CFU/ml，酸溶蛋白含量为35～40％。
9.根据权利要求1所述的酿酒酵母培养物的发酵工艺，其特征在于，在步骤6)中，保温处理的温度为45～60℃，时间为6～12h。
10.一种酿酒酵母培养物，其特征在于，所述酿酒酵母培养物根据权利要求1-9中任一项所述的酿酒酵母培养物的发酵工艺制备得到。
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Denomination of invention: A Brewing Yeast Culture and Its Fermentation Process Granted publication date: 20210928 Pledgee: Beijing technology intellectual property financing Company limited by guarantee Pledgor: BEIJING ENHALOR INTERNATIONAL TECH CO.,LTD. Registration number: Y2024990000167 |