CN104824337A - 一种饲用发酵豆粕的制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种饲用发酵豆粕的制备方法。该制备方法为将混合菌液接种到豆粕发酵底物中，混合均匀，在27～37℃下发酵72～96h，然后烘干，粉碎，得到饲用发酵豆粕；所述混合菌液由黑曲霉菌液、酵母菌液、枯草芽孢杆菌液和乳酸菌液组成；所述混合菌液与豆粕发酵底物的重量比为6～18:1000，所述混合菌液中黑曲霉菌液、酵母菌液、枯草芽孢杆菌液和乳酸菌液的重量比为1～4:0.5～2:0.5～2:0.5～2。该制备方法可有效降解发酵豆粕中的多聚糖，释放豆粕中的营养物质，进而浓缩发酵豆粕的粗蛋白，同时还能有效降解大豆球蛋白和β-伴球蛋白、寡糖、植酸等抗营养因子，提高养分的消化利用率，针对性地解决了发酵豆粕中聚糖含量偏高，粗蛋白难以提升、营养价值不高的关键问题。
Description
技术领域
本发明属于发酵技术领域，特别涉及一种饲用发酵豆粕的制备方法。
背景技术
豆粕因其良好的营养价值，是目前饲料行业应用最广泛的植物性蛋白原料，但是其中存在较多的抗营养因子，限制了其进一步的开发和应用。目前多采用微生物发酵的方法来提升豆粕的品质，主要是利用细菌发酵处理豆粕，处理后的豆粕去除了部分聚糖以及大豆球蛋白、β-伴球蛋白、寡糖、植酸等多种抗营养因子，使粗蛋白含量略有提升，且富含蛋白酶、淀粉酶、有机酸和活性益生菌，使得豆粕转化成营养价值较高的功能性饲料。
但是，传统发酵方法制备的发酵豆粕仍然含有较大比例的聚糖和抗营养因子。聚糖是植物细胞壁构成成分，是纤维素、木聚糖、半乳糖、甘露聚糖和果胶等非淀粉多糖的总和，具有抗营养性，不仅会降低养分的消化利用率，而且抑制畜禽的生长健康。抗营养因子是指饲料中某些阻碍营养成分消化、吸收和利用的物质，主要包括大豆球蛋白、β-伴球蛋白、寡糖、植酸、水苏糖、棉子糖等。高聚糖以及抗营养因子的高含量限制了发酵豆粕蛋白品质的进一步提升，导致传统发酵方法制备的发酵豆粕中粗蛋白极限值仅有50％左右。
因此，改进发酵豆粕的制备方法，解决发酵豆粕中聚糖和抗营养因子含量偏高，粗蛋白品质难以提升的问题非常重要。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术中所存在的上述不足，提供一种饲用发酵豆粕的制备方法。本发明所述制备方法采用黑曲霉菌、酵母菌、枯草芽孢杆菌和乳酸菌混合发酵技术，通过发酵产生木聚糖酶、葡聚糖酶、甘露聚糖酶、纤维素酶和果胶酶等，最大程度地破坏了豆粕细胞壁，有效降解了发酵豆粕中的多聚糖，释放豆粕中的营养物质，进而浓缩发酵豆粕的粗蛋白，同时还能有效降解大豆球蛋白和β-伴球蛋白、寡糖、植酸等抗营养因子，提高养分的消化利用率，最终获得低聚糖、高蛋白含量、高营养的饲用发酵豆粕。
为了实现上述发明目的，本发明提供了以下技术方案：
本发明所述饲用发酵豆粕的制备方法为：将混合菌液接种到豆粕发酵底物中，混合均匀，在27～37℃下发酵72～96h，然后烘干，粉碎，得到饲用发酵豆粕；所述混合菌液由黑曲霉菌液、酵母菌液、枯草芽孢杆菌液和乳酸菌液组成；所述混合菌液与豆粕发酵底物的重量比为6～18:1000，所述混合菌液中黑曲霉菌液、酵母菌液、枯草芽孢杆菌液和乳酸菌液的重量比为1～4:0.5～2:0.5～2:0.5～2；所述黑曲霉菌液中的黑曲霉菌活菌数为2.5×107～4.6×107CFU/g；所述酵母菌液中酵母菌活菌数为1.3×109～3.6×109CFU/g；所述枯草芽孢杆菌液中的枯草芽孢杆菌活菌数为1.5×108～2.3×108CFU/g；所述乳酸菌液中乳酸菌活菌数为2.3×108～4.0×108CFU/g。
黑曲霉菌分泌会产生淀粉酶、糖化酶、柠檬酸、葡萄糖酸、五倍子酸等。酵母菌在豆粕中产生大量二氧化碳气体，并由于发酵豆粕网络组织的形成，而被留在网状组织内，使发酵豆粕疏松多孔、体积增大；此外，在发酵过程中，经历一系列复杂的生物化学反应，产生了发酵豆粕特有的发酵香味。枯草芽孢杆菌菌体自身合成α-淀粉酶、蛋白酶、脂肪酶、纤维素酶等酶类。乳酸菌在酶的催化作用下将葡萄糖转化为乳酸，并具有生物防腐的作用。本发明利用黑曲霉菌、酵母菌、枯草芽孢杆菌和乳酸菌混合发酵技术，通过发酵产生木聚糖酶、葡聚糖酶、甘露聚糖酶、纤维素酶和果胶酶等，最大程度地破坏了豆粕细胞壁，有效降解了发酵豆粕中的多聚糖，释放豆粕中的营养物质，进而浓缩发酵豆粕的粗蛋白，同时还能有效降解大豆球蛋白和β-伴球蛋白、寡糖、植酸等抗营养因子，提高养分的消化利用率，使得豆粕转化成营养价值较高的功能性饲料，同时富含蛋白酶、淀粉酶、有机酸和活性益生菌。
申请人经多次试验发现，将活菌数为2.5×107～4.6×107CFU/g的黑曲霉菌液；活菌数为1.3×109～3.6×109CFU/g的酵母菌液；活菌数为1.5×108～2.3×108CFU/g的枯草芽孢杆菌液；活菌数为2.3×108～4.0×108CFU/g的乳酸菌液按照重量比为1～4:0.5～2:0.5～2:0.5～2加入到豆粕发酵底物中，通过发酵产生木聚糖酶、葡聚糖酶、甘露聚糖酶、纤维素酶和果胶酶等，最大程度地破坏了豆粕细胞壁，有效降解了发酵豆粕中的多聚糖，释放豆粕中的营养物质，进而浓缩发酵豆粕的粗蛋白，同时该制备方法还能有效降解大豆球蛋白和β-伴球蛋白、寡糖、植酸等抗营养因子，提高养分的消化利用率，最终获得低聚糖、高蛋白含量、高营养的饲用发酵豆粕。
优选地，所述豆粕发酵底物由以下重量份配比的原料制成：豆粕30～70份，麸皮1～4份，硫酸铵1～4份，糖蜜0.5～2份，水30～70份。豆粕发酵底物的制备方法具体为：按重量份配比称取豆粕、麸皮、硫酸铵和糖蜜，混合搅拌，然后注入自来水，继续混匀搅拌，然后等待接种菌液。该豆粕发酵底物经上述制备方法发酵以后，豆粕中的聚糖、以及大豆球蛋白和β-伴球蛋白、寡糖、植酸等抗营养因子被有效降解，粗蛋白含量高，能促进畜禽的生长健康，适宜饲喂断奶猪、仔猪、鸡等牲畜。
在上述制备方法中，将混合菌液接种到豆粕发酵底物中，混合均匀，在27～37℃下发酵72～96h。当发酵时间短于72h，发酵不够充分，聚糖和抗营养因子未得到充分降解；当发酵时间长于96h时，聚糖和抗营养因子降解过度，营养价值反而降低。最佳优选地，所述将混合菌液接种到豆粕发酵底物中，混合均匀，在27～37℃下发酵80h。
在上述制备方法中，所述混合菌液与豆粕发酵底物的重量比为6～18:1000。当重量比小于6:1000，会明显降低发酵豆粕质量；当接种量大于18:1000，会导致细菌繁殖过量，发酵豆粕转化率降低，造成不必要的浪费。进一步优选地，所述混合菌液与豆粕发酵底物的重量比为10～15:1000。最佳优选的，所述混合菌液与豆粕发酵底物的重量比为12:1000。
优选地，所述混合菌液中黑曲霉菌液、酵母菌液、枯草芽孢杆菌液和乳酸菌液的重量比为2:1:1:1。通过上述优选，可以进一步促进聚糖和抗营养因子的降解，提高发酵豆粕的品质。
优选地，所述黑曲霉菌液由以下方法制成：
(1)将黑曲霉菌接种到黑曲霉菌斜面培养基中，25～30℃下培养68～76h；从黑曲霉菌斜面培养基挑取一环黑曲霉菌，接种至黑曲霉菌液体培养基中，23～28℃下培养72～96h，得到黑曲霉菌增菌液；
(2)取步骤(1)制备的黑曲霉菌增菌液，按体积比为0.5～5:100的接种量接种至黑曲霉菌液体培养基中，调节pH至6.2～6.6，23～28℃下通气培养72～96h；此后每次接种均按照体积比为0.5～5:100的接种量接种至黑曲霉菌液体培养基中，调节pH至6.2～6.6，23～28℃下通气培养72～96h，直到扩大至5L，此时黑曲霉菌液体培养基中黑曲霉菌活菌数为2.5×107～4.6×107CFU/g；
所述黑曲霉菌斜面培养基由葡萄糖8～12g、蛋白胨4～6g、磷酸二氢钾0.5～2g、硫酸镁0.1～1g、琼脂10～30g、孟加拉红0.03～0.04g、氯霉素0.05～0.2g、蒸馏水900～1100mL为原料制成；
所述黑曲霉菌液体培养基均由蛋白胨4～6g、酵母浸出粉1～3g、硫酸镁0.1～1g、葡萄糖10～30g、磷酸氢二钾0.5～2g、蒸馏水900～1000mL为原料配制而成。
发明人经多次试验发现，采用上述方法培养的黑曲霉菌液，能有效分泌产生淀粉酶、糖化酶、柠檬酸、葡萄糖酸、五倍子酸等，进而更好的与酵母菌液、枯草芽孢杆菌液、乳酸菌液协同配伍，降解豆粕中的聚糖和抗营养因子，提升发酵豆粕的粗蛋白品质。
优选地，所述黑曲霉菌斜面培养基的制备方法如下：取葡萄糖10g、蛋白胨5g、磷酸二氢钾1g、硫酸镁0.5g、琼脂20g、孟加拉红0.033g、氯霉素0.1g、蒸馏水1000mL配制，121℃灭菌20min。
优选地，所述黑曲霉菌液体培养基的制备方法如下：取蛋白胨5g、酵母浸出粉2g、硫酸镁0.5g、葡萄糖20g、磷酸氢二钾1g、蒸馏水1000mL配制，121℃灭菌20min。
优选地，所述酵母菌液由以下方法制成：
(1)将酵母菌接种到酵母菌斜面培养基中，25～30℃下培养68～76h，从酵母菌斜面培养基中挑取一环酵母菌，接种至酵母菌液体培养基中，35～37℃下培养36～72h，得到酵母菌增菌液；
(2)取步骤(1)制备的酵母菌增菌液，按照体积比为0.5～5:100的接种量接种至酵母菌液体培养基中，调节pH至6.5～7.5，25～30℃下通气培养36～72h；此后每次接种均按照体积比为0.5～5:100的接种量接种至酵母菌液体培养基中，调节pH至6.5～7.5，25～30℃下通气培养36～72h，直到扩大至5L；此时酵母菌液体培养基中酵母菌活菌数为1.3×109～3.6×109CFU/g；
所述酵母菌斜面培养基由葡萄糖3～7g、蛋白胨1～3g、酵母膏0.5～2g、氯化钠0.1～1g，琼脂10～20g为原料配制而成；
所述酵母菌液体培养基均由葡萄糖3～7g、蛋白胨1～3g、酵母膏0.5～2g、氯化钠0.1～1g和蒸馏水900～1100ml为原料配制而成。
发明人经多次试验发现，采用上述方法培养的酵母菌液，可在豆粕中有效产生大量二氧化碳气体，并由于发酵豆粕网络组织的形成，而被留在网状组织内，使发酵豆粕疏松多孔、体积增大；此外，在发酵过程中，经历一系列复杂的生物化学反应，产生了发酵豆粕特有的发酵香味；进而更好地与黑曲霉菌液、枯草芽孢杆菌液、乳酸菌液协同配伍，更好地降解豆粕中的聚糖和抗营养因子，提升发酵豆粕的粗蛋白品质。
优选地，所述酵母菌斜面培养基的制备方法如下：取葡萄糖5g、蛋白胨2g、酵母膏1g、氯化钠0.5g、琼脂15g配制，酵母菌斜面培养基pH为6.5～7.5，121℃灭菌20min。
优选地，所述酵母菌液体培养基的制备方法如下：取葡萄糖5g、蛋白胨2g、酵母膏1g、氯化钠0.5g、蒸馏水1000ml配制，121℃灭菌20min。
优选地，所述枯草芽孢杆菌液由以下方法制成：
(1)将枯草芽孢杆菌接种到枯草芽孢杆菌斜面培养基中，35～38℃下培养40～60h，从枯草芽孢杆菌斜面培养基中挑取一环枯草芽孢杆菌，接种至枯草芽孢杆菌液体培养基中，35～38℃下培养36～72h，得到枯草芽孢杆菌增菌液；
(2)取步骤(1)制备的枯草芽孢杆菌增菌液，按照体积比为0.5～5:100的接种量接种至枯草芽孢杆菌液体培养基中；调节pH至7.0～7.2，35～38℃下培养36～72h；此后每次接种均按照体积比为0.5～5:100的接种量接种至枯草芽孢杆菌液体培养基中，调节pH至7.0～7.2，35～38℃下培养36～72h，直到扩大至5L；此时液体培养基中枯草芽孢杆菌活菌数为1.5×108～2.3×108CFU/g；
所述枯草芽孢杆菌斜面培养基由葡萄糖3～7g、蛋白胨1～4g、酵母膏0.5～2g、氯化钠0.1～1g、琼脂10～20g为原料配制而成；
所述枯草芽孢杆菌液体培养基均由胰蛋白胨5～15g、酵母浸出粉1～10g、氯化钠5～20g、蒸馏水900～1100ml为原料配制而成。
发明人经多次试验发现，采用上述方法培养的枯草芽孢杆菌液，自身可有效合成α-淀粉酶、蛋白酶、脂肪酶、纤维素酶等酶类，进而更好地与酵母菌液、黑曲霉菌液、乳酸菌液协同配伍，更好地降解豆粕中的聚糖和抗营养因子，提升发酵豆粕的粗蛋白品质。
优选地，所述枯草芽孢杆菌斜面培养基的制备方法如下：取葡萄糖5g、蛋白胨2g、酵母膏1g、氯化钠0.5g、琼脂15g配制，酵母菌斜面培养基pH 6.5～7.5，121℃灭菌20min。
优选地，所述枯草芽孢杆菌液体培养基的制备方法如下：取胰蛋白胨10g、酵母浸出粉5g、氯化钠10g、蒸馏水1000mL配制，121℃灭菌20min。
优选地，所述乳酸菌液由以下方法制成：
(1)将乳酸菌接种到乳酸菌斜面培养基中，35～38℃下培养40～60h；从乳酸菌斜面培养基中挑取一环乳酸菌，接种至乳酸菌液体培养基中，28～32℃下培养36～72h，得到乳酸菌增菌液；
(2)取步骤(1)制备的乳酸菌增菌液，按照体积比为0.5～5:100的接种量接种至乳酸菌液体培养基中，调节pH至5.5～6.0，35～38℃下培养36～72h；此后每次接种均按照体积比为0.5～5:100的接种量接种至乳酸菌液体培养基中，调节pH至5.5～6.0，35～38℃下培养36～72h，直到扩大至5L；此时乳酸菌液体培养基中乳酸菌活菌数为2.3×108～4.0×108CFU/g；
所述乳酸菌液体斜面培养基由脱脂奶粉50～200g、酵母粉0.5～2g、磷酸氢二钾1～10g、琼脂10～20g为原料配制而成；
所述乳酸菌液体培养基均由蛋白胨5～20g、牛肉粉1～10g、酵母浸出粉2～8g、牛肉蛋白胨5～14g、葡萄糖10～30g、吐温-80 0.5～2mL、磷酸氢二钾1～4g、醋酸钠1～10g、柠檬酸三铵0.5～4g、硫酸镁0.1～0.3g、硫酸锰0.01～0.1g、蒸馏水900～1000ml为原料配制而成。
发明人经多次试验发现，采用上述方法培养的乳酸菌液，可在酶的催化作用下将葡萄糖有效转化为乳酸，并具有生物防腐的作用。进而更好地与酵母菌液、枯草芽孢杆菌液、黑曲霉菌液协同配伍，更好地降解豆粕中的聚糖和抗营养因子，提升发酵豆粕的粗蛋白品质。
优选地，所述乳酸斜面培养基的制备方法如下：取脱脂奶粉100g、酵母粉1g、磷酸氢二钾5g、琼脂15g配制，121℃灭菌20min。
优选地，所述乳酸菌液体培养基的制备方法如下：取蛋白胨10g、牛肉粉5g、酵母浸出粉4g、牛肉蛋白胨10g、葡萄糖20g、吐温-801mL、磷酸氢二钾2g、醋酸钠5g、柠檬酸三铵2g、硫酸镁0.2g、硫酸锰0.05g、蒸馏水1000mL配制，121℃灭菌20min。
与现有技术相比，本发明的有益效果：
(1)本发明所述制备方法以黑曲霉菌、酵母菌、枯草芽孢杆菌和乳酸菌混合发酵的方式，通过发酵产生木聚糖酶、葡聚糖酶、甘露聚糖酶、纤维素酶和果胶酶等，最大程度地破坏了豆粕细胞壁，有效降解了发酵豆粕中的多聚糖，释放豆粕中的营养物质，进而浓缩发酵豆粕的粗蛋白，同时还有效降解了大豆球蛋白和β-伴球蛋白、寡糖、植酸等抗营养因子，提高养分的消化利用率，针对性地解决了发酵豆粕中聚糖含量偏高，粗蛋白难以提升、营养价值不高的关键问题。
(2)经本发明方法制备的发酵豆粕，木聚糖、葡聚糖、甘露聚糖降解率均在50％以上，特别是果胶降解率高达70％以上，降解后的发酵豆粕聚糖总量仅为传统发酵豆粕的三分之一。
(3)本发明方法消除了聚糖后的发酵豆粕，干物质成分相应地被浓缩，使传统发酵工艺的粗蛋白极限值由50％提升至60％，发酵豆粕品质进一步得到提升。
(4)本发明方法还很好地降解了大豆球蛋白和β-伴球蛋白、水苏糖、棉子糖等抗营养因子，抗营养因子降解率均在90％以上，提高了发酵豆粕中养分的消化利用率。
具体实施方式
下面结合试验例及具体实施方式对本发明作进一步的详细描述。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实施例，凡基于本发明内容所实现的技术均属于本发明的范围。
(1)黑曲霉菌液的制备
A、将黑曲霉菌接种到黑曲霉菌斜面培养基中，25～30℃下培养68～76h；从黑曲霉菌斜面培养基挑取一环黑曲霉菌，接种至黑曲霉菌液体培养基中，23～28℃下培养72～96h，得到黑曲霉菌增菌液；
B、取步骤A制备的黑曲霉菌增菌液，按体积比为0.5～5:100的接种量接种至黑曲霉菌液体培养基中，调节pH至6.2～6.6，23～28℃下通气(经过滤菌处理后的空气)培养72～96h；此后每次接种均按照体积比为0.5～5:100的接种量接种至黑曲霉菌液体培养基中，调节pH至6.2～6.6，23～28℃下通气(经过滤菌处理后的空气)培养72～96h，直到扩大至5L，此时黑曲霉菌液体培养基中黑曲霉菌活菌数为2.5×107～4.6×107CFU/g；
其中，黑曲霉菌斜面培养基由葡萄糖8～12g、蛋白胨4～6g、磷酸二氢钾0.5～2g、硫酸镁0.1～1g、琼脂10～30g、孟加拉红0.03～0.04g、氯霉素0.05～0.2g、蒸馏水900～1100mL为原料制成；
黑曲霉菌液体培养基均由蛋白胨4～6g、酵母浸出粉1～3g、硫酸镁0.1～1g、葡萄糖10～30g、磷酸氢二钾0.5～2g、蒸馏水900～1000mL为原料配制而成。
(2)酵母菌液的制备
A、将酵母菌接种到酵母菌斜面培养基中，25～30℃下培养68～76h，从酵母菌斜面培养基中挑取一环酵母菌，接种至酵母菌液体培养基中，35～37℃下培养36～72h，得到酵母菌增菌液；
B、取步骤A制备的酵母菌增菌液，按照体积比为0.5～5:100的接种量接种至酵母菌液体培养基中，调节pH至6.5～7.5，25～30℃下通气(经过滤菌处理后的空气)培养36～72h；此后每次接种均按照体积比为0.5～5:100的接种量接种至酵母菌液体培养基中，调节pH至6.5～7.5，25～30℃下通气(经过滤菌处理后的空气)培养36～72h，直到扩大至5L；此时酵母菌液体培养基中酵母菌活菌数为1.3×109～3.6×109CFU/g；
其中，酵母菌液体培养基I由葡萄糖3～7g、蛋白胨1～3g、酵母膏0.5～2g、氯化钠0.1～1g，琼脂10～20g为原料配制而成；
酵母菌液体培养基均由葡萄糖3～7g、蛋白胨1～3g、酵母膏0.5～2g、氯化钠0.1～1g和蒸馏水900～1100ml为原料配制而成。
(3)枯草芽孢杆菌液的制备
A、将枯草芽孢杆菌接种到枯草芽孢杆菌斜面培养基中，35～38℃下培养40～60h，从枯草芽孢杆菌斜面培养基中挑取一环枯草芽孢杆菌，接种至枯草芽孢杆菌液体培养基中，35～38℃下培养36～72h，得到枯草芽孢杆菌增菌液；
B、取步骤A制备的枯草芽孢杆菌增菌液，按照体积比为0.5～5:100的接种量接种至枯草芽孢杆菌液体培养基中；调节pH至7.0～7.2，35～38℃下培养36～72h；此后每次接种均按照体积比为0.5～5:100的接种量接种至枯草芽孢杆菌液体培养基中，调节pH至7.0～7.2，35～38℃下培养36～72h，直到扩大至5L；此时液体培养基中枯草芽孢杆菌活菌数为1.5×108～2.3×108CFU/g；其中，枯草芽孢杆菌液体培养基由葡萄糖3～7g、蛋白胨1～4g、酵母膏0.5～2g、氯化钠0.1～1g、琼脂10～20g为原料配制而成；
枯草芽孢杆菌液体培养基均由胰蛋白胨5～15g、酵母浸出粉1～10g、氯化钠5～20g、蒸馏水900～1100ml为原料配制而成。
(4)乳酸菌液的制备
A、将乳酸菌接种到乳酸菌斜面培养基中，35～38℃下培养40～60h；从乳酸菌斜面培养基中挑取一环乳酸菌，接种至乳酸菌液体培养基中，28～32℃下培养36～72h，得到乳酸菌增菌液；
B、取步骤A制备的乳酸菌增菌液，按照体积比为0.5～5:100的接种量接种至乳酸菌液体培养基中，调节pH至5.5～6.0，35～38℃下培养36～72h；此后每次接种均按照体积比为0.5～5:100的接种量接种至乳酸菌液体培养基中，调节pH至5.5～6.0，35～38℃下培养36～72h，直到扩大至5L；此时乳酸菌液体培养基中乳酸菌活菌数为2.3×108～4.0×108CFU/g；
其中，乳酸菌液体培养基由脱脂奶粉50～200g、酵母粉0.5～2g、磷酸氢二钾1～10g、琼脂10～20g为原料配制而成；
乳酸菌液体培养基均由蛋白胨5～20g、牛肉粉1～10g、酵母浸出粉2～8g、牛肉蛋白胨5～14g、葡萄糖10～30g、吐温-800.5～2mL、磷酸氢二钾1～4g、醋酸钠1～10g、柠檬酸三铵0.5～4g、硫酸镁0.1～0.3g、硫酸锰0.01～0.1g、蒸馏水900～1000ml为原料配制而成。
(5)发酵豆粕的制备
称取原料豆粕300～700kg，麸皮10～40kg、硫酸铵10～40kg、糖蜜5～20kg依次加入混合机内，混合搅拌5～20min后注入300～700kg的自来水，继续混匀搅拌5～20min，制成发酵底物；向发酵底物内注入6～18kg混合菌液，其中混合菌液由黑曲霉菌液、酵母菌液、枯草芽孢杆菌液和乳酸菌液按照重量比为1～4:0.5～2:0.5～2:0.5～2组成；搅拌混合10～20min，然后在27℃～37℃下堆积发酵72～96h；最后将发酵豆粕转移至烘干设备，在45～65℃下烘干至含水率为12％左右，粉碎，打包，即得发酵豆粕产品。
对发酵豆粕的营养指标进行分析，主要包括：木聚糖、葡聚糖、甘露聚糖、果胶、粗蛋白、酸溶蛋白、氨基酸、大豆球蛋白、β伴球蛋白、水苏糖、棉籽糖、乳酸、小肽、脲酶。其中，各指标的检测方法如下：
A、粗蛋白，GB/T 6432；
B、酸溶蛋白，QB/T 2653；
C、水苏糖、棉籽糖，NY/T 2218-2012；
D、乳酸，GB/T 23877-2009；
E、小肽，GB/T 22492-2008；
F、大豆球蛋白、β伴球蛋白，酶联免疫法试剂盒，企标；
G、木聚糖、葡聚糖、甘露聚糖、果胶，气相色谱法，企标；
本发明制备方法制得的发酵豆粕的检测结果如下：木聚糖降解率≥50％、葡聚糖降解率≥50％、甘露聚糖降解率≥50％、果胶降解率≥80％、粗蛋白含量≥60％、酸溶蛋白≥85％、大豆球蛋白抗原降解率≥90％、β伴球蛋白抗原降解率≥90％、水苏糖降解率≥99％、棉子糖≥99％、乳酸≥5.5％、小肽≥15％、尿酶活性抑制降解率≥90％。
实施例1
(1)黑曲霉菌液的制备
A、将黑曲霉菌接种到黑曲霉菌斜面培养基中，28℃下培养72h；从黑曲霉菌斜面培养基挑取一环黑曲霉菌，接种至黑曲霉菌液体培养基中，23～28℃下培养72～96h，得到黑曲霉菌增菌液；
B、取步骤A制备的黑曲霉菌增菌液，按体积比为0.5～5:100的接种量接种至黑曲霉菌液体培养基中，调节pH至6.2～6.6，23～28℃下通气培养72～96h；此后每次接种均按照体积比为0.5～5:100的接种量接种至黑曲霉菌液体培养基中，调节pH至6.2～6.6，23～28℃下通气培养72～96h，直到扩大至5L，此时黑曲霉菌液体培养基中黑曲霉菌活菌数为2.5×107～4.6×107CFU/g；
其中，黑曲霉菌斜面培养基的制备方法如下：取葡萄糖10g、蛋白胨5g、磷酸二氢钾1g、硫酸镁0.5g、琼脂20g、孟加拉红0.033g、氯霉素0.1g、蒸馏水1000mL配制，121℃灭菌20min。
黑曲霉菌液体培养基的制备方法如下：取蛋白胨5g、酵母浸出粉2g、硫酸镁0.5g、葡萄糖20g、磷酸氢二钾1g、蒸馏水1000mL配制，121℃灭菌20min。
(2)酵母菌液的制备
A、将酵母菌接种到酵母菌斜面培养基中，28℃下培养72h，从酵母菌斜面培养基中挑取一环酵母菌，接种至酵母菌液体培养基中，35～37℃下培养36～72h，得到酵母菌增菌液；
B、取步骤A制备的酵母菌增菌液，按照体积比为0.5～5:100的接种量接种至酵母菌液体培养基中，调节pH至6.5～7.5，28℃下通气培养36～72h；此后每次接种均按照体积比为0.5～5:100的接种量接种至酵母菌液体培养基中，调节pH至6.5～7.5，28℃下通气培养36～72h，直到扩大至5L；此时酵母菌液体培养基中酵母菌活菌数为1.3×109～3.6×109CFU/g；
其中，酵母菌斜面培养基的制备方法如下：取葡萄糖5g、蛋白胨2g、酵母膏1g、氯化钠0.5g、琼脂15g配制，酵母菌斜面培养基pH为6.5～7.5，121℃灭菌20min。
酵母菌液体培养基的制备方法如下：取葡萄糖5g、蛋白胨2g、酵母膏1g、氯化钠0.5g、蒸馏水1000ml配制，121℃灭菌20min。
(3)枯草芽孢杆菌液的制备
A、将枯草芽孢杆菌接种到枯草芽孢杆菌斜面培养基中，37℃下培养48h，从枯草芽孢杆菌斜面培养基中挑取一环枯草芽孢杆菌，接种至枯草芽孢杆菌液体培养基中，37℃下培养36～72h，得到枯草芽孢杆菌增菌液；
B、取步骤A制备的枯草芽孢杆菌增菌液，按照体积比为0.5～5:100的接种量接种至枯草芽孢杆菌液体培养基中；调节pH至7.0～7.2，37℃下培养36～72h；此后每次接种均按照体积比为0.5～5:100的接种量接种至枯草芽孢杆菌液体培养基中，调节pH至7.0～7.2，37℃下培养36～72h，直到扩大至5L；此时液体培养基中枯草芽孢杆菌活菌数为1.5×108～2.3×108CFU/g；
其中，枯草芽孢杆菌斜面培养基的制备方法如下：取葡萄糖5g、蛋白胨2g、酵母膏1g、氯化钠0.5g、琼脂15g配制，酵母菌斜面培养基pH 6.5～7.5，121℃灭菌20min。
枯草芽孢杆菌液体培养基的制备方法如下：取胰蛋白胨10g、酵母浸出粉5g、氯化钠10g、蒸馏水1000mL配制，121℃灭菌20min。
(4)乳酸菌液的制备
A、将乳酸菌接种到乳酸菌斜面培养基中，37℃下培养48h；从乳酸菌斜面培养基中挑取一环乳酸菌，接种至乳酸菌液体培养基中，28～32℃下培养36～72h，得到乳酸菌增菌液；
B、取步骤A制备的乳酸菌增菌液，按照体积比为0.5～5:100的接种量接种至乳酸菌液体培养基中，调节pH至5.5～6.0，37℃下培养36～72h；此后每次接种均按照体积比为0.5～5:100的接种量接种至乳酸菌液体培养基中，调节pH至5.5～6.0，37℃下培养36～72h，直到扩大至5L；此时乳酸菌液体培养基中乳酸菌活菌数为2.3×108～4.0×108CFU/g；
其中，乳酸菌斜面培养基的制备方法如下：取脱脂奶粉100g、酵母粉1g、磷酸氢二钾5g、琼脂15g配制，121℃灭菌20min。
乳酸菌液体培养基的制备方法如下：取蛋白胨10g、牛肉粉5g、酵母浸出粉4g、牛肉蛋白胨10g、葡萄糖20g、吐温-801mL、磷酸氢二钾2g、醋酸钠5g、柠檬酸三铵2g、硫酸镁0.2g、硫酸锰0.05g、蒸馏水1000mL配制，121℃灭菌20min。
(5)发酵豆粕的制备
称取原料豆粕500kg，麸皮20kg、硫酸铵20kg、糖蜜10kg依次加入混合机内，混合搅拌10min后注入450kg的自来水，继续混匀搅拌10min，制成发酵底物；向发酵底物内注入12kg混合菌液，其中混合菌液由黑曲霉菌液、酵母菌液、枯草芽孢杆菌液和乳酸菌液按照重量比为2:1:1:1组成；搅拌混合10min，然后在27℃～37℃下堆积发酵80h；最后将发酵豆粕转移至烘干设备，在45～65℃下烘干至含水率为12％左右，粉碎，打包，即得发酵豆粕产品。
对比例1
考察发酵时间对豆粕产品质量的影响。
对比例1-1：除了堆积发酵的时间为68h外，其余均同实施例1。
对比例1-2：除了堆积发酵的时间为72h外，其余均同实施例1。
对比例1-3：除了堆积发酵的时间为76h外，其余均同实施例1。
对比例1-4：除了堆积发酵的时间为88h外，其余均同实施例1。
对比例1-5：除了堆积发酵的时间为96h外，其余均同实施例1。
对比例1-6：除了堆积发酵的时间为100h外，其余均同实施例1。
分析各豆粕产品的聚糖降解率、寡糖降解率、抗原降解率、粗蛋白、小肽、乳酸，同时分析发酵豆粕的转化效率，其结果如下表1所示。
表1 各发酵豆粕的品质检测结果
由上表1可知，当发酵时间小于72h时，由于发酵时间不够，其聚糖降解率仅为48.03％，寡糖降解率仅为95.01％，抗原降解率为82.32％、粗蛋白(百分含量)为50.03％、小肽为(百分含量)9.25％、乳酸为(百分含量)4.51％、转化效率低至86.03％，严重影响了发酵豆粕的品质。当发酵时间为72h～96h，发酵时间适宜，各发酵豆粕的品质获得了明显的提高。其中发酵时间为80h时，聚糖降解率为51.30％，寡糖降解率为99.21％，抗原降解率为90.61％、粗蛋白(百分含量)为60.87％、小肽为(百分含量)15.12％、乳酸为(百分含量)5.46％、转化效率为91.37％，以较小的优势处于较佳的效果。此后，随着发酵时间的继续延长，各指标的检测结果变化平缓，表明发酵时间长于96h，会导致过度发酵，造成不必要的浪费，同时还会一定程度上导致有益营养成分也被分解。
对比例2
考察混合菌液中黑曲霉菌液、酵母菌液、枯草芽孢杆菌液和乳酸菌液的重量比对发酵豆粕品质的影响。
对比例2-1：除了混合菌液中黑曲霉菌液、酵母菌液、枯草芽孢杆菌液和乳酸菌液的重量比为1:2:0.5:0.5，其余均同实施例1。
对比例2-2：除了混合菌液中黑曲霉菌液、酵母菌液、枯草芽孢杆菌液和乳酸菌液的重量比为4:1:2:2，其余均同实施例1。
对比例2-3：除了混合菌液中黑曲霉菌液、酵母菌液、枯草芽孢杆菌液和乳酸菌液的重量比为3:0.5:1:1，其余均同实施例1。
对比例2-4：除了混合菌液中黑曲霉菌液、酵母菌液、枯草芽孢杆菌液和乳酸菌液的重量比为0.5:3:3:3，其余均同实施例1。
对比例2-5：除了混合菌液中黑曲霉菌液、酵母菌液、枯草芽孢杆菌液和乳酸菌液的重量比为5:0.1:0.5:3，其余均同实施例1。
分析各豆粕产品的聚糖降解率、寡糖降解率、抗原降解率、粗蛋白、小肽、乳酸，同时分析发酵豆粕的转化效率，其结果如下表2所示。
表2 各发酵豆粕的品质检测结果
由上述表2中实施例1和对比例2-1～2-3的各项指标检测结果可知，本发明所述发酵方法中，当混合菌液中黑曲霉菌液、酵母菌液、枯草芽孢杆菌液和乳酸菌液的重量比为1～4:0.5～2:0.5～2:0.5～2时，可显著提高发酵豆粕的品质，其聚糖降解率大于51％，寡糖降解率大于99％，抗原降解率大于90％、粗蛋白大于60％、小肽大于15％、乳酸大于5％、转化效率大于90％。其中，当混合菌液中黑曲霉菌液、酵母菌液、枯草芽孢杆菌液和乳酸菌液的重量比为2:1:1:1，其聚糖降解率为51.30％，寡糖降解率为99.21％，抗原降解率为90.61％、粗蛋白(百分含量)为60.87％、小肽为(百分含量)15.12％、乳酸为(百分含量)5.46％、转化效率为91.37％，略高于对比例2-1、2-2和2-3，以较小的优势处于较佳的效果，即混合菌液中黑曲霉菌液、酵母菌液、枯草芽孢杆菌液和乳酸菌液的重量比为2:1:1:1为本发明的最佳实施方案。
而对比例2-4和对比例2-5的发酵豆粕品质与对比例2-1～2-3相比，有显著下降，其聚糖降解率小于50％，寡糖降解率小于90％，抗原降解率小于90％、粗蛋白小于55％、小肽小于15％、乳酸小于5％、转化效率小于70％。表明当混合菌液中黑曲霉菌液、酵母菌液、枯草芽孢杆菌液和乳酸菌液的重量比不在本发明权利要求的保护范围内，会显著降低发酵豆粕的品质。
对比例3
步骤(1)～步骤(4)均同实施例1。
步骤(5)如下：
A、称取原料豆粕500kg，麸皮20kg、硫酸铵20kg、糖蜜10kg依次加入混合机内，混合搅拌10min后注入450kg的自来水，继续混匀搅拌10min，制成发酵底物；向发酵底物内注入12kg步骤(1)制备的黑曲霉菌液；搅拌混合10min，然后在27℃～37℃下堆积发酵80h；最后将发酵豆粕转移至烘干设备，在45～65℃下烘干至含水率为12％左右，粉碎，打包，即得发酵豆粕A。
B、称取原料豆粕500kg，麸皮20kg、硫酸铵20kg、糖蜜10kg依次加入混合机内，混合搅拌10min后注入450kg的自来水，继续混匀搅拌10min，制成发酵底物；向发酵底物内注入12kg步骤(2)制备的酵母菌液；搅拌混合10min，然后在27℃～37℃下堆积发酵80h；最后将发酵豆粕转移至烘干设备，在45～65℃下烘干至含水率为12％左右，粉碎，打包，即得发酵豆粕B。
C、称取原料豆粕500kg，麸皮20kg、硫酸铵20kg、糖蜜10kg依次加入混合机内，混合搅拌10min后注入450kg的自来水，继续混匀搅拌10min，制成发酵底物；向发酵底物内注入12kg步骤(3)制备的枯草芽孢杆菌液；搅拌混合10min，然后在27℃～37℃下堆积发酵80h；最后将发酵豆粕转移至烘干设备，在45～65℃下烘干至含水率为12％左右，粉碎，打包，即得发酵豆粕C。
D、称取原料豆粕500kg，麸皮20kg、硫酸铵20kg、糖蜜10kg依次加入混合机内，混合搅拌10min后注入450kg的自来水，继续混匀搅拌10min，制成发酵底物；向发酵底物内注入12kg步骤(4)制备的乳酸菌液；搅拌混合10min，然后在27℃～37℃下堆积发酵80h；最后将发酵豆粕转移至烘干设备，在45～65℃下烘干至含水率为12％左右，粉碎，打包，即得发酵豆粕D。
E、称取原料豆粕500kg，麸皮20kg、硫酸铵20kg、糖蜜10kg依次加入混合机内，混合搅拌10min后注入450kg的自来水，继续混匀搅拌10min，制成发酵底物；向发酵底物内注入12kg混合菌液，其中混合菌液由酵母菌液、枯草芽孢杆菌液和乳酸菌液按照重量比为1:1:1组成；搅拌混合10min，然后在27℃～37℃下堆积发酵80h；最后将发酵豆粕转移至烘干设备，在45～65℃下烘干至含水率为12％左右，粉碎，打包，即得发酵豆粕E。
F、称取原料豆粕500kg，麸皮20kg、硫酸铵20kg、糖蜜10kg依次加入混合机内，混合搅拌10min后注入450kg的自来水，继续混匀搅拌10min，制成发酵底物；向发酵底物内注入12kg混合菌液，其中混合菌液由黑曲霉菌液、枯草芽孢杆菌液和乳酸菌液按照重量比为2:1:1组成；搅拌混合10min，然后在27℃～37℃下堆积发酵80h；最后将发酵豆粕转移至烘干设备，在45～65℃下烘干至含水率为12％左右，粉碎，打包，即得发酵豆粕F。
G、称取原料豆粕500kg，麸皮20kg、硫酸铵20kg、糖蜜10kg依次加入混合机内，混合搅拌10min后注入450kg的自来水，继续混匀搅拌10min，制成发酵底物；向发酵底物内注入12kg混合菌液，其中混合菌液由黑曲霉菌液、枯草芽孢杆菌液按照重量比为2:1组成；搅拌混合10min，然后在27℃～37℃下堆积发酵80h；最后将发酵豆粕转移至烘干设备，在45～65℃下烘干至含水率为12％左右，粉碎，打包，即得发酵豆粕G。
随机取样检测，其结果为：
发酵豆粕A中聚糖总含量7.64％，寡糖总含量0.15％，大豆球蛋白5.49％，β-伴球蛋白4.53％，粗蛋白63.27％。相应地，聚糖降解率为51.02％，寡糖降解率为96.05％，抗原降解率为60.70％，粗蛋白提升了37.84％。
发酵豆粕B中聚糖总含量为14.93％，寡糖总含量3.35％，大豆球蛋白3.03％，β-伴球蛋白2.82％，粗蛋白49.01％；相应地，聚糖降解率为4.32％，寡糖降解率为11.84％，抗原降解率为77.06％，粗蛋白提升了14.18％。
发酵豆粕C中，聚糖总含量为11.92％，寡糖总含量0.89％，大豆球蛋白4.54％，β-伴球蛋白4.19％，粗蛋白51.26％；相应地，聚糖降解率为23.59％，寡糖降解率为76.50％，抗原降解率为65.8％，粗蛋白提升了19.21％。
发酵豆粕D中，聚糖总含量为13.31％，寡糖总含量0.38％，大豆球蛋白9.33％，β-伴球蛋白8.97％，粗蛋白50.59％；相应地，聚糖降解率为14.68％，寡糖降解率为90.0％，抗原降解率为28.23％，粗蛋白提升了17.65％。
发酵豆粕E中，聚糖总含量为11.04％，寡糖总含量0.35％，大豆球蛋白2.32％，β-伴球蛋白2.19％，粗蛋白52.31％；相应地，聚糖降解率为29.23％，寡糖降解率为90.79％，抗原降解率为82.31％，粗蛋白提升了21.65％。
发酵豆粕F中，聚糖总含量为7.96％，寡糖总含量0.22％，大豆球蛋白4.23％，β-伴球蛋白3.91％，粗蛋白60.04％；相应地，聚糖降解率为51.02％，寡糖降解率为94.21％，抗原降解率为68.08％，粗蛋白提升了39.63％。
发酵豆粕G中，聚糖总含量为7.76％，寡糖总含量0.13％，大豆球蛋白4.37％，β-伴球蛋白4.03％，粗蛋白60.12％；相应地，聚糖降解率为50.30％，寡糖降解率为96.58％，抗原降解率为67.05％，粗蛋白提升了25.47％。
将上述结果列于下表3中。
表3 菌种对发酵豆粕品质的影响
| 组别 | 聚糖降解率 | 寡糖降解率 | 抗原降解率 | 粗蛋白 |
| 实施例1 | 51.30％ | 99.21％ | 90.61％ | 60.87％ |
| 发酵豆粕A | 51.02％ | 96.05％ | 60.70％ | 59.27％ |
| 发酵豆粕B | 4.32％ | 11.84％ | 77.06％ | 49.01％ |
| 发酵豆粕C | 23.59％ | 76.50％ | 65.80％ | 51.26％ |
| 发酵豆粕D | 14.68％ | 90.00％ | 28.23％ | 50.59％ |
| 发酵豆粕E | 29.23％ | 90.79％ | 82.31％ | 52.31％ |
| 发酵豆粕F | 51.02％ | 94.21％ | 68.08％ | 60.04％ |
| 发酵豆粕G | 50.30％ | 96.58％ | 67.05％ | 60.12％ |
由发酵豆粕A和实施例1可知，当只添加黑曲霉菌液，其寡糖降解率降低了3.16％，抗原降解率降低了29.91％，粗蛋白含量和聚糖降解率与实施例1基本相当。
由发酵豆粕B和实施例1可知，当只添加酵母菌液，其聚糖降解率降低了46.98％，寡糖降解率降低了82.41％，抗原降解率降低了13.55％，粗蛋白含量降低了11.86％。
由发酵豆粕C和实施例1可知，当只添加枯草芽孢杆菌液，其聚糖降解率降低了27.71％，寡糖降解率降低了22.71％，抗原降解率降低了24.81％，粗蛋白含量降低了9.61％。
由发酵豆粕D和实施例1可知，当只添加乳酸菌液，其聚糖降解率降低了36.62％，寡糖降解率降低了9.21％，抗原降解率降低了62.38％，粗蛋白含量降低了10.28％。
由发酵豆粕E和实施例1可知，当只添加酵母菌液、枯草芽孢杆菌液和乳酸菌液，其聚糖降解率降低了22.07％，寡糖降解率降低了8.42％，抗原降解率降低了8.3％，粗蛋白含量降低了8.56％。
由发酵豆粕F和实施例1可知，当只添加黑曲霉菌液、枯草芽孢杆菌液和乳酸菌液，寡糖降解率降低了5.00％，抗原降解率降低了22.53％，粗蛋白和聚糖降解率与实施例1基本相当。
由发酵豆粕G和实施例1可知，当只添加黑曲霉菌液和枯草芽孢杆菌液，寡糖降解率降低了2.63％，抗原降解率降低了23.56％，粗蛋白和聚糖降解率与实施例1基本相当。
上述结果表明，本发明采用黑曲霉菌液、酵母菌液、枯草芽孢杆菌液和乳酸菌液为混合菌液进行豆粕发酵，黑曲霉菌、酵母菌、枯草芽孢杆菌和乳酸菌共同发酵产生了协同增效的作用，显著提高了聚糖降解率、寡糖降解率和抗原降解率以及粗蛋白的含量。缺少其中任何一种菌种均达不到本发明所述的技术效果。
对比例4
采用以下方法分别制备发酵豆粕。
(1)传统发酵豆粕1的制备：配制豆粕固体发酵基料，混入营养补充剂，制成固体发酵培养基，向固体发酵培养基中接种海洋红酵母和乳酸菌菌种，经固体发酵后获得海洋红酵母发酵饲料。发酵豆粕成品经称量、包装后放于阴凉处。
(2)传统发酵豆粕2的制备：将斜面保存或冻存的纳豆芽孢杆菌菌种用KMB培养基摇瓶培养得一级菌种；将豆粕粉、玉米淀粉、玉米浆、NaCl溶于水，调节pH值，灭菌，接入一级菌种摇瓶培养得二级菌种；接着用水浸泡豆粕，再添加NaCl，碳源葡萄糖、蔗糖或玉米淀粉，氮源明胶，于40℃下需氧发酵48小时，然后于60℃下干燥制样。发酵豆粕成品经称量、包装后放于阴凉处。
(3)传统发酵豆粕3的制备：将扩大培养好的枯草芽孢杆菌3株、啤酒酵母菌1株以及乳酸菌1株的发酵培养液按重量比为1.8∶1∶1混合均匀，以5％的接种量接种到含水量为50％的棉籽粕(过40目筛)中，同时加入5％的糖蜜，并混合均匀(初始pH值为7.0)，于40℃下需氧发酵48小时，然后于60℃下干燥制样。发酵豆粕成品经称量、包装后放于阴凉处。
(4)传统发酵豆粕4的制备：在豆粕原料中加入水并搅拌均匀得含水豆粕浆料，将含水豆粕浆料进行灭菌处理，加入尿素和铵并搅拌均匀，得豆粕培养料，然后在豆粕培养料中接入能产生赖氨酸的微生物菌种，控温发酵，得到发酵豆粕，干燥得成品。
各发酵豆粕的检测结果如下表4所示。
表4 各发酵豆粕品质的检测结果
由上述表4可知，将实施例1制备的发酵豆粕的各项指标与传统发酵豆粕1～4的各项指标相比，实施例1的聚糖降解率分别提高了37.15％、39.21％、41.48％、42.55％；寡糖降解率分别提高了12.43％、9.06％、29.38％、26.4％；抗原降解率分别提高了38.16％、36.91％、34.48％、12.02％；粗蛋白分别提高了10.42％、13.17％、11.69％、11.82％；小肽分别提高了5.8％、6.26％、3.57％、1.04％；乳酸分别提高了3.12％、1.73％、0.43％、2.04％。表明，本发明所述制备方法与传统的制备方法相比，显著提高了发酵豆粕的聚糖降解率和抗原降解率，显著提高了蛋白品质。
Claims (10)
1.一种饲用发酵豆粕的制备方法，其特征在于：将混合菌液接种到豆粕发酵底物中，混合均匀，在27～37℃下发酵72～96h，然后烘干，粉碎，得到饲用发酵豆粕；所述混合菌液由黑曲霉菌液、酵母菌液、枯草芽孢杆菌液和乳酸菌液组成；所述混合菌液与豆粕发酵底物的重量比为6～18:1000，所述混合菌液中黑曲霉菌液、酵母菌液、枯草芽孢杆菌液和乳酸菌液的重量比为1～4:0.5～2:0.5～2:0.5～2；所述黑曲霉菌液中的黑曲霉菌活菌数为2.5×107～4.6×107CFU/g；所述酵母菌液中酵母菌活菌数为1.3×109～3.6×109CFU/g；所述枯草芽孢杆菌液中的枯草芽孢杆菌活菌数为1.5×108～2.3×108CFU/g；所述乳酸菌液中乳酸菌活菌数为2.3×108～4.0×108CFU/g。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述豆粕发酵底物由以下重量份配比的原料制成：豆粕30～70份，麸皮1～4份，硫酸铵1～4份，糖蜜0.5～2份，水30～70份。
3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：所述将混合菌液接种到豆粕发酵底物中，混合均匀，在27～37℃下发酵80h。
4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：所述混合菌液与豆粕发酵底物的重量比为10～15:1000。
5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于：所述混合菌液与豆粕发酵底物的重量比为12:1000。
6.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：所述混合菌液中黑曲霉菌液、酵母菌液、枯草芽孢杆菌液和乳酸菌液的重量比为2:1:1:1。
7.根据权利要求1～6任一项所述的制备方法，其特征在于，所述黑曲霉菌液由以下方法制成：
(1)将黑曲霉菌接种到黑曲霉菌斜面培养基中，25～30℃下培养68～76h；从黑曲霉菌斜面培养基挑取一环黑曲霉菌，接种至黑曲霉菌液体培养基中，23～28℃下培养72～96h，得到黑曲霉菌增菌液；
(2)取步骤(1)制备的黑曲霉菌增菌液，按体积比为0.5～5:100的接种量接种至黑曲霉菌液体培养基中，调节pH至6.2～6.6，23～28℃下通气培养72～96h；此后每次接种均按照体积比为0.5～5:100的接种量接种至黑曲霉菌液体培养基中，调节pH至6.2～6.6，23～28℃下通气培养72～96h，直到扩大至5L，此时黑曲霉菌液体培养基中黑曲霉菌活菌数为2.5×107～4.6×107CFU/g；
所述黑曲霉菌斜面培养基由葡萄糖8～12g、蛋白胨4～6g、磷酸二氢钾0.5～2g、硫酸镁0.1～1g、琼脂10～30g、孟加拉红0.03～0.04g、氯霉素0.05～0.2g、蒸馏水900～1100mL为原料制成；
所述黑曲霉菌液体培养基均由蛋白胨4～6g、酵母浸出粉1～3g、硫酸镁0.1～1g、葡萄糖10～30g、磷酸氢二钾0.5～2g、蒸馏水900～1000mL为原料配制而成。
8.根据权利要求1～6任一项所述的制备方法，其特征在于，所述酵母菌液由以下方法制成：
(1)将酵母菌接种到酵母菌斜面培养基中，25～30℃下培养68～76h，从酵母菌斜面培养基中挑取一环酵母菌，接种至酵母菌液体培养基中，35～37℃下培养36～72h，得到酵母菌增菌液；
(2)取步骤(1)制备的酵母菌增菌液，按照体积比为0.5～5:100的接种量接种至酵母菌液体培养基中，调节pH至6.5～7.5，25～30℃下通气培养36～72h；此后每次接种均按照体积比为0.5～5:100的接种量接种至酵母菌液体培养基中，调节pH至6.5～7.5，25～30℃下通气培养36～72h，直到扩大至5L；此时酵母菌液体培养基中酵母菌活菌数为1.3×109～3.6×109CFU/g；
所述酵母菌斜面培养基由葡萄糖3～7g、蛋白胨1～3g、酵母膏0.5～2g、氯化钠0.1～1g，琼脂10～20g为原料配制而成；
所述酵母菌液体培养基均由葡萄糖3～7g、蛋白胨1～3g、酵母膏0.5～2g、氯化钠0.1～1g和蒸馏水900～1100ml为原料配制而成。
9.根据权利要求1～6任一项所述的制备方法，其特征在于，所述枯草芽孢杆菌液由以下方法制得：
(1)将枯草芽孢杆菌接种到枯草芽孢杆菌斜面培养基中，35～38℃下培养40～60h，从枯草芽孢杆菌斜面培养基中挑取一环枯草芽孢杆菌，接种至枯草芽孢杆菌液体培养基中，35～38℃下培养36～72h，得到枯草芽孢杆菌增菌液；
(2)取步骤(1)制备的枯草芽孢杆菌增菌液，按照体积比为0.5～5:100的接种量接种至枯草芽孢杆菌液体培养基中；调节pH至7.0～7.2，35～38℃下培养36～72h；此后每次接种均按照体积比为0.5～5:100的接种量接种至枯草芽孢杆菌液体培养基中，调节pH至7.0～7.2，35～38℃下培养36～72h，直到扩大至5L；此时液体培养基中枯草芽孢杆菌活菌数为1.5×108～2.3×108CFU/g；
所述枯草芽孢杆菌斜面培养基由葡萄糖3～7g、蛋白胨1～4g、酵母膏0.5～2g、氯化钠0.1～1g、琼脂10～20g为原料配制而成；
所述枯草芽孢杆菌液体培养基均由胰蛋白胨5～15g、酵母浸出粉1～10g、氯化钠5～20g、蒸馏水900～1100ml为原料配制而成。
10.根据权利要求1～6任一项所述的制备方法，其特征在于，所述乳酸菌液由以下方法制得：
(1)将乳酸菌接种到乳酸菌斜面培养基中，35～38℃下培养40～60h；从乳酸菌斜面培养基中挑取一环乳酸菌，接种至乳酸菌液体培养基中，28～32℃下培养36～72h，得到乳酸菌增菌液；
(2)取步骤(1)制备的乳酸菌增菌液，按照体积比为0.5～5:100的接种量接种至乳酸菌液体培养基中，调节pH至5.5～6.0，35～38℃下培养36～72h；此后每次接种均按照体积比为0.5～5:100的接种量接种至乳酸菌液体培养基中，调节pH至5.5～6.0，35～38℃下培养36～72h，直到扩大至5L；此时乳酸菌液体培养基中乳酸菌活菌数为2.3×108～4.0×108CFU/g；
所述乳酸菌液体斜面培养基由脱脂奶粉50～200g、酵母粉0.5～2g、磷酸氢二钾1～10g、琼脂10～20g为原料配制而成；
所述乳酸菌液体培养基均由蛋白胨5～20g、牛肉粉1～10g、酵母浸出粉2～8g、牛肉蛋白胨5～14g、葡萄糖10～30g、吐温-800.5～2mL、磷酸氢二钾1～4g、醋酸钠1～10g、柠檬酸三铵0.5～4g、硫酸镁0.1～0.3g、硫酸锰0.01～0.1g、蒸馏水900～1000ml为原料配制而成。
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