CN107907981A - 一种基于双振镜的三维结构光照明超分辨显微成像装置 - Google Patents

Abstract

本发明公开一种基于双振镜的三维结构光照明超分辨显微成像装置，包括激光器和沿所述激光器的光路依次布置的：分束组件，将所述激光光束分为三路相干的入射光；振镜扫描***，分别安装在两入射光路内，且其中一入射光路设有通过移动来改变光程差的反射镜；显微物镜，用于将三束光入射到样品上进行干涉产生结构光照明图样，并收集样品发出的荧光强度信号；还包括一计算机，通过控制反射镜移动以及振镜扫描***进行扫描，使结构光照明图样进行多次相移和方向旋转，并对相移和方向旋转后的多幅荧光强度图像进行数据处理，重构得到超分辨图像。本发明成像速度快，入射光能量利用率高，干涉图样对比度高，成像质量高，适用于对活体生物组织进行三维超分辨成像。

Description

一种基于双振镜的三维结构光照明超分辨显微成像装置

技术领域

本发明属于光学超分辨显微成像领域，特别涉及一种基于双振镜的三维结构光照明超分辨显微成像装置。

背景技术

光学显微镜，特别是荧光显微镜，由于其可以研究细胞和生物体的三维内部结构的能力以及通过荧光染料标记可以对分子进行特异性观测的优势，而被广泛应用于生命科学领域的研究中。但是传统光学显微镜的空间分辨率受入射光波长的限制，无法突破衍射极限，只能达到200nm左右。

作为一种功能强大的超分辨显微成像技术，结构光照明显微镜可以突破光学衍射极限，将传统荧光显微镜的横向分辨率提高两倍。它的基本原理是使用结构光图样照明样品，一般是正弦图样，利用频率混叠效应将样品内通常无法被观测到的高频成分移动到成像***的低频通带范围之内，从而可以获取样品更多的高频细节信息，提高了分辨率。与其他各种成像技术相比，结构光照明显微镜具有很多优点，如相比受激发射损耗显微镜点扫描和单分子定位显微镜需要获取大量图像进行重构，结构光显微镜只需获取很少数量的宽场图像即可恢复出超分辨图像，成像速度高，可用于实时观测和活体成像；相比单分子定位显微镜需要特异荧光染料，结构光显微镜无需特异染料，大大扩展了它的应用范围。

目前在生命科学研究时另外一个迫切需求的技术就是可以对样品进行活体三维成像，这有助于科研工作者们更好的理解生物体各组织的功能和相互之间的联系。由于二维结构光照明显微镜使用双光束进行干涉，其光学传递函数在轴向上会出现中心缺失现象，导致轴向分辨率过低，无法应用于三维成像。如果使用三束相干光进行干涉，其产生的结构光照明图样会包含更多的高频分量，从而消除了光学传递函数的中心缺失现象，保证它在横向和轴向上都能获得两倍于传统光学显微镜的分辨率，可用于三维超分辨成像。

发明内容

本发明提供了一种基于双振镜的三维结构光照明超分辨显微成像装置，使用两个分束镜产生三束相干光，其中两束光分别通过振镜控制进行扫描，最后通过物镜收集三束光在样品表明进行干涉产生三维结构光图样。本装置成像速度快；实验误差小；入射光能量利用率高；干涉图样对比度高，成像质量高；可以实现三维超分辨，特别适用于对荧光样品进行活体三维成像。

为实现上述发明目的，本发明所采用的具体技术方案如下：

一种基于双振镜的三维结构光照明超分辨显微成像装置，包括激发光路模块，用于将入射激光分为三路，在样品内部进行干涉产生三维结构光照明图样；和成像光路模块，用于收集待测样品发出的荧光信号，利用计算机进行数据处理和图像重构；

所述的激发光路模块包括依次布置的：

激光器，发出激光光束；

分束组件，包括依次布置两个分束镜，用于产生三路入射光；

振镜***，用于控制光束扫描方向，实现结构光图样的旋转；

显微物镜，用于将三束切向线偏振光聚焦到样品上进行干涉产生结构光照明图样，并收集样品发出的荧光强度信号；

所述的成像光路模块包括依次布置的：

二向色镜，用于透射入射光、反射样品发出的荧光；

工业相机，用于收集所述的荧光强度信号；

计算机，用于控制振镜***扫描和压电陶瓷移动以改变结构光图样的方向和相位，控制半波片旋转保证正入射光偏振方向始终保持切向，控制样品台进行轴向扫描获取三维信息，控制工业相机获取样品发出的荧光信号，并对相机采集的荧光强度信号进行数据处理和相位重构，得到二维和三维超分辨图像。

优选的，所述激光器与两个分束镜之间依次放置有：单模光纤，用于对激光光束进行滤波；起偏器，用于将激光光束变为线偏振光；和半波片，用于控制入射到分束镜上的线偏振光方向。

可选的，所述两套振镜***采用透射式或反射式振镜***均可。

优选的，所述两套振镜***的透镜焦面位置处各放置有切向光偏振片转换器，用于旋转两路线偏振光的偏振方向，保证在样品上发生干涉的入射光均为切向线偏振光，以产生对比度最大的结构光照明图样。

优选的，所述两套振镜***与显微物镜之间依次放置有：平面反射镜，用于改变振镜出来的光束的传播方向，使其斜入射到后方扫描透镜上；和扫描透镜，用于使三路入射光均聚焦到显微物镜后瞳面处。

设置在一路光路上的平面反射镜由压电陶瓷驱动进行移动，改变光程差使结构光照明图样产生相移。

优选的，从分束镜透射出的一路光正入射到扫描透镜中央位置，所述正入射光路的分束镜和扫描透镜之间依次放置有：半波片，用于旋转该路线偏振光的偏振方向，保证相对其它两路入射光均为切向线偏振光，半波片的旋转通过计算机控制。

优选的，所述二向色镜和工业相机之间依次放置有：滤波片，用于滤去待测样品发出的荧光信号中的杂散光；和汇聚透镜，用于将待测样品发出的荧光信号成像到工业相机上。

采用一种基于双振镜的三维结构光照明超分辨显微成像装置操作流程如下：

1)激光光束分成三路沿不同方向传播的线偏振光，其中一路光直接入射到样品上，另外两路光经过振镜入射到样品上，三束光在样品内部相互干涉产生三维结构光照明图样；

2)结构光图样激发样品发出荧光，通过工业相机收集样品发出的荧光信号，得到荧光强度信息；

3)依次旋转结构光照明图样方向，同时在各方向下多次改变结构光图样的相位，得到各方向的对应相位下的多幅荧光强度图像；

4)移动样品台对样品进行轴向扫描获取样品不同深度处的信息；

5)对得到的多幅荧光强度图像进行数据处理，重构得到样品不同深度处的二维超分辨图像。

6)对多幅二维超分辨图像进行重构得到物体的三维超分辨图像。

在步骤3)中，至少在三个角度下旋转结构光图样的方向，在各方向下至少五次改变结构光图样的相位。

本发明中，单幅结构光图样投射到样品上获得的荧光强度信息中包含五个频率分量，为了分离这五个频率分量，需要得到五个方程。普通的结构光照明显微技术通过移动光栅得到五个方程，本发明通过压电陶瓷控制干涉臂反射镜进行多次移动，改变投射到样品上的结构光图样的相位，得到多幅相移后的荧光图像，从而对各频率分量进行提取和移动。

进一步的，为了在每个方向上都实现超分辨成像，还需要对结构光图样进行多次旋转。普通的结构光照明显微技术通过旋转光栅实现结构光图样的旋转，本发明通过振镜控制干涉光束进行扫描，从而改变投射到样品上的结构光图样的方向，得到旋转后的荧光图像，实现了各个方向的超分辨成像。

优选的，分别在0°、60°和120°旋转结构光图样的方向，并分别控制结构光图样相移0°、72°、144°、216°、288°。此处仅限于作为最优的实例，从理论上来说，旋转方向和相移角度可以是任意的数值，满足每次旋转方向和相移角度不同即可；另外，也可以增加旋转方向和相移角度的次数，也能实现本发明所要达到的技术效果和解决所提出的技术问题。

优选的，对样品进行轴向扫描获取样品三维信息时，其轴向扫描间距和次数需要根据具体样品特性并结合奈奎斯特采样定理来确定，一般可选取轴向扫描间距100nm左右，扫描次数10次左右。

与现有技术相比，本发明具有以下有益的技术效果：

(1)使用振镜扫描和压电陶瓷移动代替光栅机械扫描和移动，实现结构光照明图样的旋转和相移，减小了实验误差，提高了结构光照明显微镜的成像速度，适用于三维活体成像；

(2)使用切向光偏振转换器代替线偏振片的机械转动保证结构光图样对比度最高，一方面进一步提高了成像速度，另一方面避免了机械转动可能造成的误差；

(3)使用分束镜代替光栅衍射获取三束相干光，提高了入射光能量利用率；

(4)实现了三维超分辨，特别适用于对荧光样品进行活体三维成像。

附图说明

图1为本发明一种基于双振镜的三维结构光照明超分辨显微成像装置示意图；

图2为本装置采用的切向光偏振转换器结构示意图；

图3为本装置在样品内部产生的三维结构光图样示意图，其中，(a)图为三维结构光图样横向示意图，(b)图为三维结构光图样轴向示意图。

图4为本发明一种基于双振镜的三维结构光照明超分辨显微成像装置操作流程示意图。

具体实施方式

下面结合实施例和附图来详细说明本发明，但本发明并不仅限于此。

如图1所示的三维结构光照明超分辨显微成像装置，包括：激光器1、单模光纤2、起偏器3、第一半波片4、第一分束镜5、第二分束镜6、第二半波片7、第一凸透镜8、第二凸透镜9、第一振镜***10、第一切向光偏振转换器11、第一平面反射镜12、第二振镜***13、第二切向光偏振转换器14、第二平面反射镜15、压电陶瓷16、扫描透镜17、显微物镜18、待测荧光样品19、二向色镜20、滤波片21、汇聚透镜22、工业相机23和计算机24。

激光器1发出激光光束，单模光纤2、起偏器3、第一半波片4、第一分束镜5、第二分束镜6、第二半波片7、第一凸透镜8和第二凸透镜9依次放置在入射光路的光轴上。单模光纤2用于对激光光束进行滤波。起偏器3用于将出射光转换成线偏振光。第一半波片4用于控制线偏振光入射到分束镜上的方向。第一分束镜5和第二分束镜6用于将入射光分成三路。第二半波片7用于保证正入射光路的光束始终为切向线偏振光。第一凸透镜8和第二凸透镜9焦面重合但焦距不同，可对像面进行转移，同时对光束进行缩束。

第一分束镜5和第二分束镜6分出的另外两路入射光分别进入由第一振镜***10和第二振镜***13。两套振镜***由两个振镜和两个凸透镜构成，四个光学元件的放置位置需要与后续光路保证物像关系，两个凸透镜焦面重合但焦距不同，可对光束进行缩束。两个振镜***通过计算机24控制其进行扫描。振镜***也可采用其它结构，如反射式四镜***或反射式三镜***等。两个振镜***的焦平面处分别放置有切向光偏振转换器11和切向光偏振转换器14，其结构如图2所示，用于将入射线偏振光转换成两束切向偏振的线偏振光，保证形成的结构光照明图样对比度最高。

从第一振镜***10和第二振镜***13出来的两束切向线偏振光经过平面反射镜12和15改变光路传播方向后和中央正入射光路的切向线偏振光再依次经过共轴放置的扫描透镜17和显微物镜18，入射到待测荧光样品19上。扫描透镜17的一侧焦平面与透镜9和振镜***的焦平面重合，另一侧焦平面与显微物镜18的入瞳面重合，用于转移物像关系，提高振镜扫描边缘光束入射到物镜入瞳面的能力。平面反射镜15通过压电陶瓷16驱动控制其位移，改变入射光的光程差，实现结构光照明图样的相移。显微物镜18用于将三束入射光聚焦到待测样品19同一位置处相互干涉产生三维结构光光照明图样，如图3所示，激发样品发出荧光。待测样品19放置在样品台上，通过计算机24控制其进行轴向移动，获取样品不同深度处的信息用于重构三维超分辨图像。

待测样品19发出的荧光信号依次通过显微物镜18、二向色镜20、滤波片21和汇聚透镜22，进入工业相机23。二向色镜20用于透射入射光、反射荧光。滤波片21用于滤去待测样品19发出的荧光信号中的杂散光。汇聚透镜22用于将荧光信号聚焦到工业相机23上。

计算机24用于控制半波片7旋转保证正入射光偏振方向始终保持切向、控制振镜***10和14扫描改变结构光照明图样的方向、控制压电陶瓷16位移改变结构光照明图样的相位、控制样品台19对样品进行轴向扫描获取三维信息和控制工业相机23采集样品发出的荧光强度信号，同时通过算法进行数据处理和相位重构，得到样品的二维和三维超分辨图像。

如图4所示，一种基于双振镜的三维结构光照明超分辨显微成像装置工作流程如下：

激光器1发出的激光光束入射到第一分束镜5和第二分束镜6上，分解成三束振动方向正交的线偏振光进入，成像到显微物镜18后瞳面，聚焦到带有荧光标记的待测样品19上相互干涉产生条纹结构光图样。结构光照明图样激发待测样品19发出荧光信号被显微物镜18收集起来，经过滤波片21滤去收集到的荧光中的杂散光，然后成像到CMOS工业相机23上，得到待测样品19内部的荧光强度分布信息。

单幅三维结构光图样投射到样品上获得的荧光强度信息中包含五个独立频率分量，所以需要得到五个图像方程以分离这五个频率分量，通过压电陶瓷16控制平面反射镜15进行移动，使得投射到待测样品19上的结构光照明图样相移0°、72°、144°、216°、288°，得到五幅相移后的荧光图像，从而对各频率分量进行提取和移动，得到样品的高频信息。

相移后得到的频率分量只分布在水平方向，为了在各个方向都实现超分辨，需要使用计算机24控制振镜***10和13进行扫描，使得投射到样品19上的结构光图样的方向旋转0°、60°、120°，得到相应角度下的荧光强度图像，此时即获取了样品19成像位置处各个方向上的信息。

为了获取样品19的三维信息，还需要控制样品台移动对样品19进行轴向扫描，其轴向扫描间距和次数需要根据具体样品特性来确定，一般可选取轴向扫描间距100nm左右、扫描次数10次左右。

最后再通过计算机24对得到的多幅荧光强度图像进行数据处理，重构得到样品19的二维和三维超分辨图像。

以上所述仅为本发明的较佳实施举例，并不用于限制本发明，凡在本发明精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种基于双振镜的三维结构光照明超分辨显微成像装置，包括发出激光光束的激光器，其特征在于：

包括沿所述激光器的光路依次布置的：

分束组件，将所述激光光束分为三路相干的入射光；

振镜扫描***，分别安装在两入射光路内，且其中一入射光路设有通过移动来改变光程差的反射镜；

显微物镜，用于将三束光入射到样品上进行干涉产生三维结构光照明图样，并收集样品发出的荧光强度信号；

还包括一计算机，用于控制所述的反射镜移动以及振镜扫描***进行扫描，使结构光照明图样进行多次相移和方向旋转，并对相移和方向旋转后的多幅荧光强度图像进行数据处理，重构得到超分辨图像。

2.如权利要求1所述的三维结构光照明超分辨显微成像装置，其特征在于，所述的激光器与分束组件间依次放置有：

单模光纤，用于对激光光束进行滤波；

起偏器，用于将激光光束变为线偏振光；

和第一半波片，用于控制入射到分束组件上的线偏振光方向。

3.如权利要求1所述的三维结构光照明超分辨显微成像装置，其特征在于，所述的分束组件包括第一分束镜和位于所述第一分束镜的透射光路上的第二分束镜。

4.如权利要求1所述的三维结构光照明超分辨显微成像装置，其特征在于，所述的振镜扫描***为透射式或反射式振镜***，内部放置有一切向光偏振片转换器，用于旋转两路线偏振光的偏振方向，使得产生的结构光照明图样对比度最大。

5.如权利要求1所述的三维结构光照明超分辨显微成像装置，其特征在于，在所述的三路入射光内，剩余的一路入射光内安装由所述计算机控制旋转的第二半波片，将该路入射光旋转为切向线偏振光。

6.如权利要求5所述的三维结构光照明超分辨显微成像装置，其特征在于，所述的第二半波片与显微物镜间依次设置有焦面重合但焦距不同的第一凸透镜和第二凸透镜，用于转移像面和缩束。

7.如权利要求1所述的三维结构光照明超分辨显微成像装置，其特征在于，所述的反射镜由压电陶瓷驱动进行移动，该压电陶瓷根据计算机发出的信号，改变入射光路的光程差使结构光照明图样产生相移。

8.如权利要求1～7任一项所述的三维结构光照明超分辨显微成像装置，其特征在于，计算机控制所述的反射镜至少移动五次，得到至少五幅相移后的荧光强度图像，对各荧光强度图像的频率分量进行提取和移动，得到样品的高频信息；

计算机控制所述振镜扫描***对样品进行扫描，使得投射到样品上的结构光图样至少具有三个不同角度的方向旋转，得到不同角度下的荧光强度图像，获取样品成像位置处各个方向上的信息。

9.如权利要求8所述的三维结构光照明超分辨显微成像装置，其特征在于，相移后的荧光强度图像为结构光照明图样相移0°、72°、144°、216°和288°后采集的图像；

不同角度下的荧光强度图像为结构光照明图样的方向旋转0°、60°和120°后采集的图像。

10.如权利要求1所述的三维结构光照明超分辨显微成像装置，其特征在于，还包括承载所述样品的样品台，所述的样品台带动样品沿光轴向移动，用于获取样品的三维信息。