CN107478628A - 一种基于光子重组的双光子荧光显微方法及装置 - Google Patents

Abstract

本发明公开一种基于光子重组的双光子荧光显微装置，包括：飞秒激光器，用于发出超短脉冲激光对样品进行双光子激发；光参量振荡器；第一半波片，用于调节光参量振荡器出射光的s光和p光比例；偏振分数器，用于调节光强；第二半波片，用于调节线偏光的偏振方向；第一四分之一波片，用于将线偏振光转换为圆偏振光；物镜，将圆偏振光聚焦为实心圆斑照明样品并激发荧光；由多个探测器单元组成的阵列探测器，用于收集荧光信号；和计算机，将每个探测器单元所获得的荧光信号进行处理得到一个物点所对应的图像。本发明还公开一种基于光子重组的双光子荧光显微方法。本发明采用探测器阵列取代原有的单个针孔探测器，使获得的图像具有更高的信噪比。

Description

一种基于光子重组的双光子荧光显微方法及装置

技术领域

本发明属于共聚焦显微领域，特别涉及一种基于光子重构的双光子荧光显微方法及装置。

背景技术

双光子荧光显微镜使得在活生物样品中的三维成像成为可能。和传统的共聚焦显微镜相比，双光子可以实现更好的光学切片功能，更深的穿透深度以及更小的光毒性。单光子激发过程为基态电子吸收一个短波长光子到达激发态。这个过程一般需要紫外波段或者蓝/绿波段光，这些短波长光可能会对生物样品造成严重的光毒性。对于双光子激发来讲，在光照强度足够的情况下，基态电子的激发可以由同时吸收两个能量较低的光子来实现(波长通常在红外波段)。虽然根据阿贝衍射理论计算，波长越长，衍射极限越大，在相同波长情况下，双光子激发由于需要更高的激发光强，其激发体积相对于单光子更小。由于双光子具有光学切片以及深穿透深度的优势，所以其在生物研究中被广泛的应用。

近年来，随着生物医学研究的不断发展，对双光子显微技术的空间分辨率提出了要求。现在发展出了很多提升空间分辨率的方法，例如结构光照明显微镜，受激发射损耗显微镜等。这些方法都已经成功的打破了衍射极限，有效的提升了光学显微镜的分辨率。但是结构光显微镜一般应用于宽场显微镜中，受激发射损耗显微镜虽然可以应用于双光子显微镜，但是需要很高的对准精度。在荧光显微镜中应用光子重组技术能够有效提升***的分辨率，使其在生物领域中有更为广泛的应用。

发明内容

本发明在传统共焦显微术(如图1所示)的基础上，提出一种基于光子重组的双光子荧光显微方法及装置。实现了对样品的高分辨成像。这种方法被称为基于光子重组的双光子荧光显微技术。光子重组技术采用探测器阵列取代了双光子显微镜中放置于像面的点探测器，利用光子重构的方法，得到分辨率和信噪比都有所提升的图像。仿真结果显示，其分辨率相对于传统双光子显微技术可以提高至少28.5％。

本发明通过多个探测器组成的探测器阵列取代传统共焦显微镜中的单个探测器获取图像，再利用图像处理得到高清的样品图像。相对于其他超分辨成像显微镜，该装置是基于共聚焦显微镜，其结构简单，成像深度大，为生命科学和纳米技术提供了良好的研究手段。

本发明的具体技术方案如下：

一种基于光子重构的双光子荧光显微方法，针对荧光样品包括以下步骤：

(1)飞秒激光器发出照明光束，经过光参量振荡器出射，经过半波片和偏振分束镜得到具有较高偏振度的线偏振光；

(2)线偏振光经过两个反射镜之后通过一个半波片，实现对于光线偏振方向的控制，线偏光经过第一四分之一波片后成为圆偏振光，然后经过第二四分之一波片，补偿了后面的二色镜和反射镜，二维扫描振镜等光学元器件造成的位相差，使其在物镜入瞳处的光为准确的圆偏光；

(3)圆偏振光经过物镜后聚焦到位于物镜焦面处样品平面上形成如图5所示的实心光斑照明荧光样品，荧光样品被实心光斑照明后激发出荧光；荧光被物镜收集，经二色镜反射后，经滤光片后的荧光被场镜收集，会聚到ICCD的像素阵列上参与成像；

(4)探测器阵列将光信号转换为电信号并传送给计算机；计算机将每个探测器探测到的实心光斑做相应的平移后叠加，得到实心光斑的图像，完成了对样品一个点的信息读入和处理；

(5)荧光样品放置于载物平台上；通过计算机的控制软件实现振镜在二维方向上的扫描完成对荧光样品的二维扫描；或者所述的载物平台为由计算机控制纳米平移台，通过纳米平移台的移动完成对样品的二维扫描。

本发明还提供了一种基于光子重组的非线性荧光显微装置，针对荧光样品包括：

飞秒激光器，用于发出超短脉冲激光，实现对荧光样品的双光子激发；

第一半波片，用于调节光参量振荡器出射光的s光、p光比例；

偏振分数器，用于和第一半波片配合，实现对光路中光强的调节；

第二半波片，用于调节光路中线偏光的偏振方向；

第一四分之一波片，用于将光路中的线偏振光转换为圆偏振光；

第二四分之一波片，用于补偿后续反射镜，二色镜以及振镜所造成的偏振变化，使激发光束为理想的圆偏振光；

振镜扫描模块，包括：振镜，两片扫描振镜，分别用于x方向，y方向上的扫描；扫描镜，用于配合振镜，对样品进行x方向和y方向上的扫描；场镜，用于和扫描镜，振镜配合，实现对于样品x方向和y方向上的扫描；

二色镜，用于激发光和荧光的第一步分离，透过长波长的激发光，将荧光反射至滤光片；

物镜，用于对光束进行聚焦，对样品进行照明；

载物台，用于稳固的放置样品，保障成像质量；

滤光片，用于去除荧光信号中的杂散光，去除信号的背景噪声；

场镜，用于收集荧光信号，将荧光信号聚焦在阵列探测器上；

ICCD，阵列探测器，用作信号探测，将探测到的光信号转换成为电信号并传至计算机，选用5*5个像素作为探测阵列(如图3所示)；

计算机，用于处理探测器传送过来的信号，同时控制振镜对样品进行x方向，y方向上的扫描。

在另一个技术方案中，将样品放置在纳米平移台上，替换所述的振镜扫描模块，通过计算机控制纳米平移台的移动完成对样品的二维扫描。

本发明原理如下：

本发明在传统共聚焦显微镜装置的基础上，首先经光参量振荡器之后出射的激光入射到第一半波片后，p光、s光比例发生变化，经过偏振分束器之后得到光强经过调节的光束，经过第二半波片后，偏振方向改变，然后通过两个反射镜，进入第一四分之一波片，由线偏振光变为圆偏振光，然后经过第二四分之一波片，第二四分之一波片用于补偿后续反射镜等光学器件造成的偏振变化，使光束为理想的圆偏振光。光束经过反射镜，扫描振镜，扫描镜，场镜之后通过二色镜，进入物镜入瞳，由物镜聚焦后，形成实心光斑，实心光斑扫描照明样品使样品发出荧光，物镜将收集到的荧光经过二色镜反射，通过滤光片以及场镜，最终成像在ICCD探测器阵列上，则探测器阵列上所记录的光强为：

其中，代表样品上被扫描的位置矢量，代表物空间上的物的位置矢量，代表探测器所在的位置矢量，有效点扩散函数为

其中，代表激发点扩散函数，代表探测点扩散函数。

当探测器单元不处在共轭焦点上时，该探测器单元所探测到的探测点扩散函数将发生平移，从而使有效点扩散函数的峰值产生平移，如图6(a)中的点虚线和线虚线所示。故假如直接将每个探测器单元所获得的有效点扩散函数加起来，则所获得的有效点扩散函数将产生较大的轮廓，从而与未采用针孔探测器的共焦显微一样降低了分辨率。所以，在已知探测器阵列中每个探测单元的实际位置时，将每个探测器单元所获得的图像作一定的平移，如图6(b)所示，然后再相加，这一过程被称为光子重组，用公式表示即：

其中q称为平移因子，采用卷积的形式写出该光强即为：

其中，

为光子重组后的图像光强。相对于直接平移相加，可以得到更为锐利的点扩散函数，如图7所示，也就是更高的图像分辨率。

与现有技术相比，本发明具有以下有益的技术效果：

(1)相对于原有的共聚焦显微镜，通过采用探测器阵列取代原有的单个针孔探测器，使获得的图像具有更高的信噪比；

(2)相对于原有的共聚焦显微镜，采用光子重组的方法使获得的具有更高的横向分辨率，也使图像具有更高的保真度。

附图说明

图1为传统的共聚焦显微镜装置示意图；

图2为一种振镜扫描的基于光子重组的双光子显微装置示意图；

图3为探测器阵列的横截面示意图；

图4为一种纳米平移台实现样品扫描的光子重组双光子显微装置示意图；

图5为探测器阵列中位于坐标(0,0)处中心探测单元探测到的点扩散函数中心处切线的曲线示意图；

图6(a)实线为探测器阵列中位于坐标(0,0)处中心探测单元探测到的点扩散函数示意图；图6(a)点虚线为探测器阵列中位于坐标(0.25λ,0)处中心探测单元探测到的点扩散函数示意图；图6(a)线虚线为探测器阵列中位于坐标(-0.25λ,0)处中心探测单元探测到的点扩散函数示意图；图6(b)实线为探测器阵列中位于坐标(0,0)处中心探测单元探测到的点扩散函数示意图；点虚线和线虚线分别为将图6(a)位于(0.25λ,0)和(-0.25λ,0)的探测器单元得到的点扩散函数作平移后所得到的点扩散函数示意图；

图7为将探测器阵列上每个探测单元探测到的光斑作光子重组后得到的点扩散函数意图。

具体实施方式

下面结合实施例和附图来详细说明本发明，但本发明并不仅限于此。

实施例1

如图2所示，一种振镜扫描实现样品扫描的基于光子重组的虚拟荧光差分显微装置，包括飞秒激光器1，光参量振荡器2，半波片3，偏振分束器4，反射镜5、反射镜6，半波片7，反射镜8、反射镜9，四分之一波片10，四分之一波片11，反射镜12、反射镜13，扫描振镜14、扫描振镜15，扫描镜16，场镜17，反射镜18，二色镜19，显微物镜20，滤光片21和场镜22。

采用图2所示的装置所实现的虚拟荧光差分显微方法，其过程如下：

(1)飞秒激光器1发出照明光，经过光参量振荡器2出射，通过半波片3成为s光、p光比例经过调制的偏振光，通过半波片3和偏振分束器4实现对于光路中光强的调节；

(2)从偏振分数器4中出射的线偏振光，经过反射镜5和反射镜6反射进入半波片7，经过反射镜8和反射镜9后进入四分之一波片10，半波片7和四分之一波片10得组合使用将线偏振光变为圆偏振光，圆偏振光再经过四分之一波片11后被反射镜12和反射镜13反射至扫描振镜14，四分之一11波片用于补偿后续扫描振镜14、扫描振镜15、扫描镜16、场镜17和二色镜19等光学元器件造成的偏振改变，使得入射到物镜20后焦面的光为理想的圆偏振光，经物镜20聚焦后得到一个理想实心圆斑聚焦在荧光样品24上。

(3)理想实心圆斑的激光照明荧光样品24后激发样品产生荧光，再经过物镜20收集后入射到二色镜19上，二色镜19反射荧光，使其入射到滤波片21上；荧光经滤光后，滤除了样品反射的激光和其他杂散光，经过场镜22聚焦到阵列探测器23上，如图3所示，矩形排列的阵列探测器23将光信号转变成电信号，并将电信号传送至计算机25；

(4)计算机25将探测器阵列23中的每个探测器单元所获得的信号作相应的图像处理后得到一个物点所对应的图像；

(5)扫描振镜14和扫描振镜15组成振镜模块由计算机25控制，通过计算机25对振镜模块控制来完成二维扫描，得到样品对应的二维图像。

实施例2

如图4所示，一种由纳米平移台实现样品扫描的基于光子重组的双光子显微装置，包括飞秒激光器1，光参量振荡器2，半波片3，偏振分束器4，反射镜5，反射镜6，反射镜8，反射镜9，反射镜12，反射镜13，反射镜14，半波片7，四分之一波片10，四分之一波片11，二色镜15，滤光片17，场镜18，阵列探测器19，纳米平移台21，计算机22。

采用图4所示的装置所实现的基于光子充足的双光子显微方法，其过程如下：

(1)飞秒激光器1发出超短脉冲光，经过光参量振荡器2，经过半波片3和偏振分束器4，得到强度可调制的线偏振光束；

(2)线偏振光经过反射镜5，反射镜6后入射到半波片7上，得到偏振方向可调制的线偏振光束；

(3)线偏振光束经过反射镜8和反射镜9入射到四分之一波片10，将线偏振光转为圆偏振光；

(4)圆偏振光入射到四分之一波片11，得到偏振经过补偿的理想圆偏振光，四分之一波片用于补偿后续反射镜、二色镜15等产生的偏振变化，使得入射到物镜入瞳的光束为理想圆偏振光。

(5)理想圆偏振光经过物镜16聚焦到样品上，激发荧光样品20产生荧光，荧光信号经过物镜收集，被二色镜15反射，经过滤光片17滤去被反射的激发光和其他杂散光，由场镜18聚焦到阵列探测器19上；

(6)计算机22将探测器阵列19中的每个探测器单元所获得的信号作相应的图像处理后得到一个物点所对应的图像

(7)由计算机22控制纳米平移台21的移动完成对样品的二维扫描，最终得到样品对应的二维图像。

以上所述仅为本发明的较佳实施举例，并不用于限制本发明，凡在本发明精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种基于光子重组的双光子荧光显微装置，其特征在于，包括沿光路依次布置的：

飞秒激光器，用于发出超短脉冲激光对荧光样品进行双光子激发；

光参量振荡器，

第一半波片，用于调节光参量振荡器出射光的s光和p光比例；

偏振分数器，与第一半波片配合，用于调节光强；

第二半波片，用于调节光路中线偏光的偏振方向；

第一四分之一波片，用于将光路中的线偏振光转换为圆偏振光；

物镜，将圆偏振光聚焦为实心圆斑照明样品并激发样品产生荧光；

由多个探测器单元组成的阵列探测器，用于收集荧光信号；

和计算机，将探测器阵列中的每个探测器单元所获得的荧光信号进行图像处理后得到一个物点所对应的图像。

2.如权利要求1所述的双光子荧光显微装置，其特征在于，在所述的第一四分之一波片和物镜间设置由计算机控制的振镜扫描模块，用于样品的二维扫描。

3.如权利要求2所述的双光子荧光显微装置，其特征在于，所述的振镜扫描模块具有依次布置的第一扫描振镜、第二扫描振镜、扫描镜和场镜。

4.如权利要求1所述的双光子荧光显微装置，其特征在于，所述的样品放置在由计算机控制纳米平移台上，通过纳米平移台的移动完成对样品的二维扫描。

5.如权利要求2或4所述的双光子荧光显微装置，其特征在于，所述的第一四分之一波片和物镜间设有第二四分之一波片，用于补偿圆偏振光的偏振变化。

6.如权利要求1所述的双光子荧光显微装置，其特征在于，所述的阵列探测器由5*5个探测器单元组成。

7.一种基于光子重组的双光子荧光显微方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)飞秒激光器发出照明光束，经过光参量振荡器出射，和经过第一半波片和偏振分束镜后得到的线偏振光；

(2)所述的线偏振光经过第二半波片控制光线偏振方向，并由第一四分之一波片转换为圆偏振光和第二四分之一波片补偿偏振变化；

(3)圆偏振光经过物镜后聚焦到位于物镜焦面处样品平面上形成实心光斑照明荧光样品，荧光样品被实心光斑照明后激发出荧光；

(4)利用由多个探测器单元组成的阵列探测器采集荧光信号，计算机将每个探测器单元探测到的实心光斑做相应的平移后叠加，得到实心光斑的图像，完成样品当前物点的图像处理。

8.如权利要求7所述的双光子荧光显微方法，其特征在于，所述的样品放置在由计算机控制纳米平移台上，通过纳米平移台的移动对样品进行二维扫描。

9.如权利要求7所述的双光子荧光显微方法，其特征在于，利用由计算机控制的振镜扫描模块对样品进行二维扫描，所述的振镜扫描模包括依次布置的第一扫描振镜、第二扫描振镜、扫描镜和场镜。

10.如权利要求8或9所述的双光子荧光显微方法，其特征在于，所述的阵列探测器由5*5个探测器单元组成。