CN103852458B

CN103852458B - 一种基于宽场受激发射差分的显微方法和装置

Info

Publication number: CN103852458B
Application number: CN201410071793.6A
Authority: CN
Inventors: 匡翠方; 蔡欢庆; 葛剑虹; 刘旭
Original assignee: Zhejiang University ZJU
Current assignee: Zhejiang University ZJU
Priority date: 2014-02-28
Filing date: 2014-02-28
Publication date: 2016-02-03
Anticipated expiration: 2034-02-28
Also published as: CN103852458A

Abstract

本发明公开了一种基于宽场受激发射差分的显微方法，首先对样品进行宽场照明并成像，然后利用激光经两个渥拉斯顿棱镜形成两束垂直偏振光（s光）和两束平行偏振光（p光），这四束线偏光聚焦形成的干涉光斑对荧光样品进行照明并成像，然后同FED类似对宽场下得到的图像和干涉光斑下得到的图像进行差分处理，由于暗斑的大小小于衍射极限，所以能够得到暗斑中的超分辨图像，最后通过扫描振镜控制干涉光斑在样品上移动，以得到样品全部的显微图像。本发明还公开了本发明一种基于宽场受激发射差分的显微装置，结构简单，便于操作，能够实现基于宽场受激发射差分的快速超分辨显微成像，可用于光学显微成像领域。

Description

一种基于宽场受激发射差分的显微方法和装置

技术领域

本发明属于超分辨显微领域，尤其涉及一种基于宽场受激发射差分的显微方法和装置。

背景技术

由于光学***衍射的影响，常规远场光学显微方法可实现的分辨率存在限制。根据阿贝衍射极限理论，光束经显微物镜聚焦后所成光斑的尺寸用半高全宽表示为其中λ为显微镜的工作波长，NA为所用显微物镜的数值孔径，因此，常规远场光学显微镜的极限分辨率一般被限制在了半波长左右。近年来，为了突破光学衍射极限的限制，提高显微***的分辨率，科研工作者们提出了多种超分辨光学显微方法。

例如FED（fluorescentemissiondifference），公开号为102735617A的专利文献提供了一种超分辨显微方法，首先一束光经显微物镜聚焦，在样品上形成一个实心光斑，该实心光斑的尺寸与常规光学显微术中所用照明光束聚焦所成衍射斑的尺寸相同。实心光斑照射范围内的样品所发出的信号光被探测器所收集，得到当前扫描点处的第一信号光强I₁；再利用另一束调制后光束经显微物镜聚焦在样品上，形成的光斑为一个面包圈型的空心光斑。该空心光斑照射范围内的样品所发出的信号光被探测器所收集，得到当前扫描点处的第二信号光强I₂。利用公式I(x,y)=I₁(x,y)-γI₂(x,y)计算得到I(x,y)，显然I(x,y)所对应的各扫描点处的有效信号光发光面积将小于I₁(x,y)所对应的各扫描点处的第一信号光发光面积。

与常规光学显微方法相比，FED减小了有效信号光的发光面积，并实现超衍射极限的分辨率，但这种方法的局限性在于，每次只能对单点进行成像。

发明内容

本发明提供了一种基于宽场受激发射差分的显微方法和装置，首先对样品进行宽场照明并成像，然后利用激光经两个渥拉斯顿棱镜形成两束垂直偏振光（s光）和两束平行偏振光（p光），这四束线偏光聚焦形成的干涉光斑对荧光样品进行照明并成像，然后同FED类似对宽场下得到的图像和干涉光斑下得到的图像进行差分处理，由于暗斑的大小小于衍射极限，所以能够得到暗斑中的超分辨图像，最后通过扫描振镜控制干涉光斑在样品上移动，以得到样品全部的显微图像。本发明装置结构简单，便于操作，能够实现基于宽场受激发射差分的快速超分辨显微成像，可用于光学显微成像领域。

一种基于宽场受激发射差分的显微方法，针对荧光样品包括以下步骤：

（1）第一激光器发出激光，经第一透镜准直后，得到准直光束；所述准直光束经第一双色镜全部反射后，形成第一反射光；所述第一反射光再经第二双色镜全部透射，形成照明光；所述照明光经扫描振镜***后汇聚到物镜的后焦面，最后经物镜照射到荧光样品表面，对荧光样品进行宽场照明；

（2）所述样品发出荧光，被物镜收集，再经扫描振镜***和第二双色镜全部反射，最后经滤波片过滤杂散光，被探测器接收得到宽场照明下的样品图像；

（3）第二激光器发出光束；所述光束经第一渥拉斯顿棱镜得到两束分开的，角度、振动方向互相垂直的第一线偏光和第二线偏光；所述第一线偏光经第二渥拉斯顿棱镜得到第一平行偏振光（p光）和第一垂直偏振光（s光）；所述第二线偏光经第二渥拉斯顿棱镜得到第二平行偏振光（p光）和第二垂直偏振光（s光）；所述第一平行偏振光（p光）、第一垂直偏振光（s光）、第二平行偏振光（p光）、第二垂直偏振光（s光）经第二透镜，第一双色镜，第二双色镜全部透射后得到四束线偏光；

（4）所述四束线偏光经扫描振镜***后汇聚到物镜的后焦面，最后经物镜聚焦到荧光样品表面，形成干涉光斑，其中干涉光斑的亮斑部分对荧光样品进行照明；

（5）四束线偏光形成的干涉光斑如图2所示，其中两亮点的最小距离为D=λ/2NA，NA为物镜的数值孔径；

（6）所述样品发出荧光，被物镜收集，再经扫描振镜***和第二双色镜全部反射，最后经滤波片过滤杂散光，被探测器接收得到干涉光斑照明下的样品图像；

（7）对得到的两幅图进行差分处理，就可以得到干涉光斑中暗斑部分的显微图像；

（8）通过计算机控制扫描振镜***实现干涉光斑在样品表面的移动，以得到完整的样品图像；

本发明还提供了基于宽场受激发射差分的显微装置，针对荧光样品包括：

第一激光器，用于发出激光，实现对荧光样品的宽场照明；

第二激光器，用于发出激光，实现对荧光样品的照明；

在所述第一激光器发出照明光光路的光轴上设置的第一透镜；

在所述第二激光器发出的照明光路的光轴上依此设置第一渥拉斯顿棱镜，第二渥拉斯顿棱镜，第二透镜，第一双色镜，第二双色镜和扫描振镜***；

在所述扫描振镜***反射光光路的光轴上依此设置的物镜和荧光样品；

还包括滤波片、探测器和与所述探测器和扫描振镜***相连的计算机。

其中所述第一透镜用于对所述第一激光器发出的激光进行准直；

所述第一双色镜用于全部反射第一激光器发出的照明光和全部透射经第二透镜全部透射的激光；

所述第二双色镜用于全部透射经第一双色镜全部透射的激光和全部反射物镜收集的经扫描振镜***的样品发出的荧光；

所述第一渥拉斯顿棱镜的作用是将所述第二激光器发出的激光分成两束分开的，角度、振动方向互相垂直的线偏光，所述第二渥拉斯顿棱镜的作用是将这两束线偏光分别分成平行偏振光（p光）和垂直偏振光（s光）。这样在***入瞳处就得到四束线偏光，分别是两束平行偏振光（p光），两束垂直偏振光（s光）；

所述滤波片的作用是将非信号光波段过滤；

所述计算机的作用是用于处理探测器的信号，同时控制扫描振镜***完成对样品的二维平面扫描。

本发明原理如下：

在基于宽场受激发射差分的显微方法中，首先利用一束照明光对样品的荧光分子进行宽场照明，得到宽场下的样品图像，然后另一束激光经过两个渥拉斯顿棱镜，在***入瞳处形成四束线偏振光，如图3所示。这四束偏振光聚焦发生干涉并形成干涉光斑，干涉光斑如图2所示，其中两亮斑或两暗斑中心的最小距离为D=λ/2NA，大小恰好等于一个艾里斑的直径，其中NA为物镜的数值孔径。其中干涉光斑中的亮斑部分对荧光样品照明，得到干涉光斑下的图像，最后通过对两幅图进行差分处理，如图4所示，得到干涉光斑中暗斑的图像，而暗斑的大小远小于衍射极限，所以能够实现超分辨显微成像。

与现有技术相比，本发明具有以下有益的技术效果：

（1）可以一次性对多个位置进行成像，实现更快速度的成像；

（2）装置结构简单，数据处理方便。

附图说明

图1为针对荧光样品的一种基于宽场受激发射差分的显微装置示意图；

图2为四束线偏光经物镜透射聚焦到荧光样品表面，发生干涉形成的干涉光斑图样；

图3为第二激光器发出的光束经第一渥拉斯顿棱镜，第二渥拉斯顿棱镜和第二透镜，并经第一双色镜，第二双色镜全部透射后在入瞳处形成的四束线偏光光斑图样；

图4为对得到的两幅图进行差分处理的原理图。

具体实施方式

下面结合实施例和附图来详细说明本发明，但本发明并不限于此。

实施例1

如图1所示，一种针对荧光样品的基于宽场受激发射差分的显微装置，包括第二激光器1，第一渥拉斯顿棱镜2，第二渥拉斯顿棱镜3，第二透镜4，第一双色镜5，第二双色镜6，扫描振镜7，物镜9，样品10，样品台11，第一透镜12，第一激光器13，滤波片14，探测器15，计算机16。

采用图1所示的装置实现针对荧光样品的基于宽场受激发射差分的显微方法，其过程如下：

（1）第一激光器13发出激光，经第一透镜12准直后形成准直光，准直光经第一双色镜5全部反射，再经第二双色镜6全部透射，再经扫描振镜7反射，最后经物镜9聚焦到样品10表面，激发样品10中的荧光分子；

（2）所述样品10荧光被激发，得到的激发荧光被物镜9收集，再经扫描振镜7和第二双色镜6全部反射，最后经滤波片14过滤掉非信号光波段，被探测器15所接收，所述探测器15将光信号转化为电信号传至计算机16；

（3）第二激光器1发出激光，经第一渥拉斯顿棱镜2和第二渥拉斯顿棱镜3后形成四束偏振光，这四束偏振光经第二透镜4透射后，再经第一双色镜5，第二双色镜6全部透射，再经扫描振镜7反射，在入瞳8处形成如图3所示的光斑，最后经物镜9聚焦到样品10表面，四束偏振光发生干涉并形成干涉光斑，其中亮斑部分对样品10中的荧光分子进行激发；

（4）所述样品10荧光被干涉光斑的亮斑部分激发，得到的激发荧光被物镜9收集，再经扫描振镜7和第二双色镜6全部反射，经滤波片14过滤掉非信号光波段，最后被探测器15所接收，所述探测器15将光信号转化为电信号传至计算机16；

（5）计算机16将对得到的两幅图进行差分处理，得到暗斑部分的超分辨图像，完成第一次扫描；

（6）扫描振镜7与计算机16相连，通过计算机16来控制扫描振镜7使干涉光斑在样品表面移动一个光斑的距离，以得到完整的样品图像。

实施例2

如图1所示，一种针对荧光样品的全内角反射荧光（TIRF）下基于宽场受激发射差分的显微装置，包括第二激光器1，第一渥拉斯顿棱镜2，第二渥拉斯顿棱镜3，第二透镜4，第一双色镜5，第二双色镜6，扫描振镜7，物镜9，样品10，第一透镜12，第一激光器13，滤波片14，探测器15，计算机16。

采用图1所示的装置实现针对荧光样品的全内角反射荧光（TIRF）下基于宽场受激发射差分的显微方法，其过程如下：

（1）第一激光器13发出激光，经第一透镜12准直后形成准直光，准直光经第一双色镜5全部反射，再经第二双色镜6全部透射，再经扫描振镜7反射，最后经物镜9聚焦到样品10表面，对样品10进行激发，其中通过调节扫描振镜7，使入射光大角度（大于全反射角）进入物镜10，实现全内角反射荧光照明，以减小背景噪声，得到更好质量的图像；

（2）所述样品10荧光被激发，得到的激发荧光被物镜9收集，再经扫描振镜7和第二双色镜6全部反射，经滤波片14过滤掉非信号光波段，最后被探测器15所接收，所述探测器15将光信号转化为电信号传至计算机16；

（3）第二激光器1发出激光，经第一渥拉斯顿棱镜2和第二渥拉斯顿棱镜3后形成四束偏振光，这四束偏振光经第二透镜4透射后，再经第一双色镜5，第二双色镜6全部透射，再经扫描振镜7反射，在入瞳8处形成如图3所示的光斑，最后经物镜9聚焦到样品10表面，四束偏振光发生干涉并形成干涉光斑，其中亮斑部分对样品10中的荧光分子进行激发,其中通过调节第一渥拉斯顿棱镜2，第二渥拉斯顿棱镜3和扫描振镜7，使四束偏振光大角度进入物镜10，实现全内角反射荧光照明，以减小背景噪声，得到更好质量的图像；

Claims

1.一种基于宽场受激发射差分的显微方法，其特征在于，包括以下步骤：

1)第一激光光束准直处理后，经物镜聚焦到荧光样品表面进行宽场照明，收集荧光样品发出的荧光，得到宽场照明下的第一样品图像；

2)将第二激光光束分为四束线偏光后，经物镜聚焦到荧光样品表面并形成干涉光斑，所述干涉光斑中的亮斑部分对荧光样品进行照明并激发荧光，并采集荧光得到干涉光斑照明下的第二样品图像；

其中，所述四束线偏光包括两组的平行偏振光和垂直偏振光；

3)对步骤1)和步骤2)中的两幅样品图像进行差分处理，得到所述干涉光斑中暗斑部分的显微图像。

2.如权利要求1所述的基于宽场受激发射差分的显微方法，其特征在于，在所述的步骤3)之后，控制干涉光斑在样品表面移动，得到完整的样品图像。

3.如权利要求2所述的基于宽场受激发射差分的显微方法，其特征在于，干涉光斑在样品表面移动一个亮斑大小的距离。

4.如权利要求1所述的基于宽场受激发射差分的显微方法，其特征在于，所述的第二激光光束依次通过两块渥拉斯顿棱镜后，分为四束线偏光。

5.如权利要求1所述的基于宽场受激发射差分的显微方法，其特征在于，所述的第一激光光束和四束线偏光以大于物镜全反射角的角度进入所述的物镜。

6.一种基于宽场受激发射差分的显微装置，其特征在于，包括：

第一激光器和第二激光器；

位于第二激光器的光路上的分光组件，用于将第二激光器发出的光束分为四束线偏光，所述的四束线偏光包括两组的平行偏振光和垂直偏振光；

物镜，用于将第一激光器和第二激光器发出的光束聚焦于荧光样品表面并收集激发荧光；

探测器，用于将收集的荧光信号转化为电信号；

计算机，用于处理探测器上传的信号。

7.如权利要求6所述的基于宽场受激发射差分的显微装置，其特征在于，所述的分光组件为依次布置在第二激光器光路上的第一渥拉斯顿棱镜和第二渥拉斯顿棱镜。

8.如权利要求6所述的基于宽场受激发射差分的显微装置，其特征在于，还包括受控于计算机的扫描振镜***，用于控制干涉光斑在荧光样品表面移动。

9.如权利要求6所述的基于宽场受激发射差分的显微装置，其特征在于，还包括滤波片，用于过滤进入探测器的非信号光。