CN113624731A - 一种超分辨荧光高光谱显微成像*** - Google Patents

一种超分辨荧光高光谱显微成像*** Download PDF

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Abstract

本发明适用于显微成像技术领域，提供了一种超分辨荧光高光谱显微成像***，包括：样本显微组件，包括样品台以及物镜组；激发光源；结构光调制模组，对激发光进行调制，形成不同相位平移的明暗相间的结构线；结构线扫描模组，对结构线进行调制，形成用于对待测样本进行扫描的扫描结构线，扫描结构线经物镜组聚焦于待测样本上；图像探测模组，接收待测样本被扫描结构线扫描激发后发射的荧光信号，并对荧光信号进行高光谱显微成像。本发明通过形成不同相位平移的明暗相间的结构线来对样本进行扫描，并使样本发生不同方向的旋转，利用样本结构与结构线不同相位结构发生多方向的多次叠加实现样本平面各向同性的频域扩展和分辨率提高。

Description

一种超分辨荧光高光谱显微成像***
技术领域
本发明属于显微成像技术领域，尤其涉及一种超分辨荧光高光谱显微成像***。
背景技术
高光谱成像作为光谱成像技术的分支，自20世纪80年代诞生以来，广泛应用于农业学、矿物学、大气学以及生命科学等领域新兴技术。它与传统的成像技术相比，在获得目标图像信息的同时，又可以获得特定波段的光谱信息，且高光谱成像的光谱分辨率能够达到10nm以下，它能够瞬时记录视场角内每个像素几十个甚至数百个连续窄波段的光谱信息。近年来，随着显微技术渗透到生物医学检测各方面，出现了许多高光谱技术与显微成像结合的报导，如：染色体识别、癌症诊断、皮肤病检查、食品、农产品等无损检测、细胞功能研究等。
现有的细胞检测技术难以同时获得样本的空间信息和组成成分信息，而显微高光谱技术能够很好地呈现细胞的外观信息和内部的化学成分信息，因而研究显微高光谱成像***对于细胞乃至于整个生命科学领域来说都有重大的意义。在生物医学研究领域，生物组织的自体荧光检测已经被广泛地应用于疑难病症的预防和诊断研究，而高光谱显微成像技术结合显微镜技术和光谱成像技术，能够被用来进行病理学的定量分析，相对于传统的医学成像方法，它能提供更丰富的光谱成分信息和客观的诊断标准，在生物医学领域有着广阔的应用前景。
目前现有能突破光学衍射极限实现超分辨的高光谱显微成像***采用结构线照明的拉曼显微成像技术：即在扫描拉曼显微镜中使用结构线照明，以一条精细的线形焦点照明样品，沿着平行于线的方向应用结构光图案，提高了该方向的空间分辨率；
但是，由于拉曼显微成像的固有特征，只能对自发荧光进行观察，对样本和相机的要求较高；并且结构线只有平移调制，无法实现样本平面各向同性的空间分辨率提高，只能提高某一方向的分辨率，对样本观察不利。
发明内容
本发明实施例提供一种超分辨荧光高光谱显微成像***，旨在解决现有高光谱显微成像无法实现样本平面各向同性的空间分辨率提高的技术问题。
本发明实施例是这样实现的一种超分辨荧光高光谱显微成像***，所述***包括：
样本显微组件，包括放置待测样本的样品台以及对所述待测样本进行显微的物镜组；
激发光源，用于提供照射待测样本的激发光；
结构光调制模组，接收所述激发光并对所述激发光进行调制，形成不同相位平移的明暗相间的结构线；
结构线扫描模组，接收所述结构线并对所述结构线进行调制，形成用于对所述待测样本进行扫描的扫描结构线，所述扫描结构线经所述物镜组聚焦于所述待测样本上；以及
图像探测模组，接收所述待测样本被所述扫描结构线扫描激发后发射的荧光信号，并对所述荧光信号进行高光谱显微成像；
其中，所述***还包括：
第二二向色镜，设置于所述结构线扫描模组和所述结构光调制模组之间，所述结构线透过所述第二二向色镜射入所述结构线扫描模组；
所述荧光信号经所述第二二向色镜反射后射入所述图像探测模组。
优选地，所述结构线扫描模组包括：
一维扫描振镜，接收所述结构线并对所述结构线进行调制，形成用于对所述待测样本进行扫描的扫描结构线；
扫描透镜和套筒透镜，所述扫描结构线先经所述扫描透镜聚焦在同一焦平面上后、再经所述套筒透镜校直后射入所述物镜组。优选地，所述结构光调制模组包括：
空间光调制器，接收所述激发光并对所述激发光进行平移调制，形成不同相位平移的明暗相间的结构光；
柱状透镜组件，接收所述结构光并将所述结构光压缩为所述结构线。
优选地，所述柱状透镜组件包括：
第一柱状透镜，用于对所述结构光进行一次一维聚焦；
空间滤波器，用于对一次一维聚焦后的结构光进行滤波，选取±1级衍射光；
第二柱状透镜，用于对滤波后的结构光进行散焦，校直并调整结构光束宽度；
第三柱状透镜，用于对所述结构光进行二次一维聚焦，形成所需结构线射入所述结构线扫描模组。
优选地，所述激发光源的数量为两个，分别为第一激发光源和第二激发光源；
所述第一激发光源和所述第二激发光源发射的激发光波长不相同。
优选地，所述***还包括第一二向色镜，所述第一激发光源发射的激发光经所述第一二向色镜反射后射入所述结构光调制模组；所述第二激发光源发射的激发光经所述第一二向色镜透射后射入所述结构光调制模组。
优选地，扫描至样本不同位置所产生的荧光信号经所述结构线扫描模组反扫描之后再经过第二二向色镜反射后射入所述图像探测模组，其中所述图像探测模组包括：
第一探测相机，用于获取所述荧光信号的荧光强度信息；
第二探测相机，用于获取所述荧光信号的光谱图像。
优选地，所述图像探测模组还包括：
翻转镜，设置于所述荧光信号的传递路径上，用于改变所述荧光信号的传递路径，以使所述荧光信号选择性射向所述第一探测相机或所述第二探测相机。
优选地，所述图像探测模组还包括：
分光镜，设置于所述荧光信号的传递路径上，所述分光镜透过的部分荧光信号进入所述第二探测相机，所述分光镜反射的部分荧光信号进入所述第一探测相机。
优选地，所述样品台布置于一由步进电机控制的旋转台上，所述旋转台带动所述样品台旋转。
本发明所达到的有益效果：通过设置结构光调制模组来对结构线进行平移调制，并采用结构线扫描模组来对结构线进行扫描，且通过高精度旋转台对样本进行旋转控制有效实现了样本平面各向同性的频域扩展和分辨率提高。同时通过设置激发光源并搭配结构线扫描模组，实现对待测样本的扫描激发，即可以对待测样本自发的荧光信号进行探测，也可以对扫描激发的荧光信号进行探测。
附图说明
图1是本发明实施例一当中的超分辨荧光高光谱显微成像***的结构示意图。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
现有能突破衍射极限，实现超分辨的高光谱成像***采用结构线照明的拉曼显微成像技术，但是由于拉曼显微成像的固有特征，只能对自发荧光进行观察，对样本和相机的要求较高；并且结构线只有平移调制，无法实现样本平面各向同性的空间分辨率提高，只能提高某一方向的分辨率，对样本观察不利；
为此，本发明的目的在于，提供一种超分辨荧光高光谱显微成像***，通过形成不同相位平移的明暗相间的结构线，同时使样本平面发生不同方向的旋转，产生样本结构与照明结构线的多方向多次叠加来实现样本平面各向同性的频域扩展和分辨率提高；同时通过设置激发光源并搭配结构线扫描模组，实现对待测样本的扫描激发，即可以对待测样本自发的荧光信号进行探测，也可以对扫描激发的荧光信号进行探测。
实施例一
请参阅图1，所示为本发明实施例一当中的超分辨荧光高光谱显微成像***，所述***包括：
样本显微组件10，包括放置待测样本的样品台11以及对待测样本进行显微的物镜组12；
激发光源20，用于提供照射待测样本的激发光；
结构光调制模组30，接收激发光并对激发光进行调制，形成不同相位平移的明暗相间的结构线；
结构线扫描模组40，接收结构线并对结构线进行调制，形成用于对待测样本进行扫描的扫描结构线，扫描结构线经物镜组12聚焦于待测样本上；以及
图像探测模组50，接收待测样本被扫描结构线扫描激发后发射的荧光信号，并对荧光信号进行高光谱显微成像。
在本实施例当中，物镜组12倒置于样品台11的下方，这种采用倒置型的显微结构有利于对半透明乃至透明的样本进行成像，更有助于实现对细胞等的透射和荧光成像。
此外，在本实施例当中，激发光源20的数量为两个，分别为第一激发光源20a和第二激发光源20b。超分辨荧光高光谱显微成像***还包括第一二向色镜21，第一激发光源20a发射的激发光经第一二向色镜21反射后射入结构光调制模组30，而第二激发光源20b发射的激发光经第一二向色镜21透射后射入结构光调制模组30。此外，超分辨荧光高光谱显微成像***还包括声光可调谐滤波器22(Acousto-opticTunableFilter，简称AOTF)，激发光源20射出的激发光经过声光可调谐滤波器22之后得以切换再射入结构光调制模组30。
其中，第一激发光源20a和第二激发光源20b发射的激发光波长不相同，示例而非限定，第一激发光源20a发射的激发光波长可以为488nm，第二激发光源20b发射的激发光波长可以为561nm。
具体地，结构光调制模组30包括空间光调制器(Spatial Light Modulator，简称SLM)31和柱状透镜组件33，其中，空间光调制器31接收激发光并对激发光进行平移调制，形成不同相位平移的明暗相间的结构光，即空间光调制器31通过光栅图案来产生衍射光、并通过旋转和平移的手段调制空间光，使后续照射在样本表面的结构线产生不同位置的平移，实现样本平面各向同性的频域扩展和分辨率提高。柱状透镜组件33则用于接收该结构光并将结构光压缩为结构线。
具体地，在本实施例当中，柱状透镜组件33包括第一柱状透镜331、空间滤波器332、第二柱状透镜333及第三柱状透镜334，第一柱状透镜331用于对所述结构光进行一次一维聚焦，空间滤波器332用于对一次一维聚焦后的结构光进行滤波，选取±1级衍射光，第二柱状透镜333用于对滤波后的结构光进行散焦，校直并调整结构光束宽度，第三柱状透镜334用于对所述结构光进行二次一维聚焦，形成所需结构线射入所述结构线扫描模组40。
其中，结构线扫描模组40包括一维扫描振镜41、扫描透镜42和套筒透镜43，一维扫描振镜41用于接收结构光调制模组30输出的结构线、并对结构线进行调制，形成用于对待测样本进行扫描的扫描结构线。随后，扫描结构线先经扫描透镜42聚焦在同一焦平面上后、再经套筒透镜43校直后射入物镜组12。
此外，样品台11布置于一由步进电机控制的旋转台(图未示出)上，旋转台带动样品台旋转，从而调节样本的角度。也就是说，在本实施例当中，结构线先经空间光调制器31进行第一方向维度的平移调制，再由一维扫描振镜进行第二方向维度上的扫描，最终射向样本台，与此同时，样本台上的样本又被旋转台带动进行第三方向维度的旋转，以此实现不同方向的结构线来对样本进行扫描，实现样本平面各向同性的频域扩展和分辨率提高。
除此之外，超分辨荧光高光谱显微成像***还包括第二二向色镜60，其设置于结构线扫描模组40和结构光调制模组30之间，扫描至样本不同位置所产生的荧光信号经结构线扫描模组40反扫描之后再经过第二二向色镜60反射后射入图像探测模组。具体地，结构光调制模组30输出的结构线将透过第二二向色镜60射入结构线扫描模组40，以经结构线扫描模组40扫描后射向待测样本；由于光具有可逆性，样本被结构线激发产生的荧光信号将原路返回，即经结构线扫描模组40发生反扫描，随后到达第二二向色镜60，此时荧光信号会经第二二向色镜60反射后射入图像探测模组50。
在本实施例当中，图像探测模组50包括第一探测相机sCMOS1、第二探测相机sCMOS2和翻转镜51，翻转镜51设置于荧光信号的传递路径上，用于改变荧光信号的传递路径，以使荧光信号选择性射向第一探测相机或第二探测相机，具体地，翻转镜51由电机控制，以通过电机来带动翻转镜51旋转，从而调整翻转镜51的角度，当翻转镜51转至与荧光信号的传递路径呈夹角设置时，荧光信号经翻转镜51反射进入第一探测相机sCMOS1；当翻转镜51转至与荧光信号的传递路径平行时，荧光信号透过翻转镜51反射并经下方的固定反射镜反射进入第二探测相机sCMOS2。第一探测相机用于获取荧光信号的荧光强度信息；第二探测相机连接光谱仪器用于获取荧光信号的光谱图像。
在另一些可选实施例当中，所述图像探测模组还可以包括分光镜，分光镜设置于所述荧光信号的传递路径上，所述分光镜透过的部分荧光信号进入所述第二探测相机，所述分光镜反射的部分荧光信号进入所述第一探测相机。即可以由分光镜来代替翻转镜51，由于分光镜的半透射半反射作用，能够使透过的部分荧光信号成功通过下方的固定反射镜反射进入第二探测相机，而被分光镜反射的另一部分荧光信号将成功被反射进入第一探测相机。
因此，在本发明实施例当中，在第一探测相机前利用分光镜或翻转镜分离荧光光束，分别使用两台sCMOS探测相机同时获取荧光强度信息和光谱信息的原始图像；一方面使用线阵或面阵相机探测荧光强度图像，另一方面使用面阵相机配合光谱仪采集结构线激发样本的光谱信息，两台相机利用扫描振镜外部触发配合扫描速度和分光速度进行不同结构线扫描所得数据的采集。
除此之外，超分辨荧光高光谱显微成像***还包括处理器(如计算机、上位机等)，处理器用于控制***进行协同工作，并对图像探测模组50探测的信息进行处理。具体地，处理器具体包括时序控制模块和图像重构模块。其中：
时序控制模块是基于LABVIEW软件开发，编程实现软件控制硬件设备的时序同步，使其相互配合以最快的速度成高质量原始图像。软件通过编写LABVIEW状态机实现人机交互、通过顺序结构和触发事件等操作实现对硬件命令的流程化处理，进而结合串口通讯、调用驱动、子VI等方式实现对硬件或下位机的集成控制。时序控制模块设计为计算机给数据采集卡信号，通过数据采集卡控制声光可调谐滤波器、空间光调制器31、扫描振镜、高精度旋转台和相机探测器，使得扫描振镜的扫描与相机的曝光同步，每完成一次样本平面的扫描切换空间光调制器31调制结构光的相移或控制样本平面的旋转台使样本发生一次方向旋转，同时控制快速光束翻转反射镜51使荧光结构线依次进入图像探测模块的两个相机探测器，经过3个方向各3次相移的9次结构光调制后控制声光可调谐滤波器切换激光。
图像重构模块包括四个重要部分：重构参数确定、原始图像质量判断、反卷积算法的实现以及荧光图像与高光谱超分辨图像互校。
重构参数的确定部分包括模式波矢量、起始相位、调制深度等参数的确定，其中非常重要的是原始图像的模式波矢量的精确确定，因为对于低信噪比的原始图像，上述重构参数的细微偏差，尤其是模式矢量的偏差会带来较大的伪影，破坏重构图像的真实性。通过合并相同波矢量和相位的图像以减少噪声，用低信噪比原始图像的多帧平均使振幅归一化，仅使用相位信息来执行互相关，并采用这种归一化互相关算法分离不同频域并精确计算模式波矢量等重构参数。
使用ImageJ软件的SIMcheck插件对原始图像进行质量判断，主要判断原始图像的调制信噪比。基于SIMcheck的前期判断决定了后期图像处理算法的选择，调制信噪比数值较高的原始图像使用维纳反卷积的重构算法进行超分辨图像重构，而调制信噪比数值较低的原始图像则需要海森反卷积重构算法进行处理。
基于MATLAB的图像重构部分包括了根据原始图像质量对重构算法的选择，获取照明空间频率和方向，计算光学传递函数，利用不同的反卷积算法进行反卷积和频分重组得到超分辨图像。
针对原始高光谱tiff图像堆栈，首先需要进行图像堆栈的坐标轴转换，输出各个波段的荧光强度图像，而后进行基于SIMcheck的前期判断和基于MATLAB的图像处理。最后对荧光强度的超分辨图像与光谱信息超分辨图像进行相互对比与校正。
综上，本实施例当中的超分辨荧光高光谱显微成像***，相较于结构线照明拉曼显微镜，至少具有以下技术效果：
1)通过设置结构光调制模组来对结构线进行平移调制、并配合一维扫描振镜来对结构线进行扫描、且设置旋转台来对样本进行旋转，相当于了提供了不同旋转方向和相移的结构线对样本进行扫描激发，以利用样本结构与结构线不同相位结构发生多方向的多次叠加，实现了样本平面各向同性的频域扩展和分辨率提高；
2)同时通过设置激发光源并搭配结构线扫描模组，实现对待测样本的扫描激发，即可以对待测样本自发的荧光信号进行探测，也可以对扫描激发的荧光信号进行探测；
3)使用荧光倒置显微镜对样本进行成像，包括激发与荧光的收集，搭配使用高光谱仪与sCMOS，与绝大部分生物样本适配，在光谱上区分物质的内部成分；
4)采用空间光调制器，能够对结构线进行更灵活精确的控制，快速且稳定地完成结构线平移的控制；
5)在探测光路上新加入了一个分光镜/翻转镜和探测相机，使其能够获取荧光强度的超分辨图像，与超分辨高光谱图像互相校正；
6)新加入了多个激光器和声光可调谐滤波器组成激发光控制模块，实现荧光强度的超分辨多色成像，满足对生物样本的直观观察；
7)本申请当中的超分辨荧光高光谱显微成像***可用于各种微观生物样本的观察，最大的优越性可体现在对小型细胞器及其快速动态过程与动态过程中物体内部成分变化的观察，高空间分辨的强度信息与光谱信息可用于病理研究与药物开发。例如对脂滴与线粒体相互作用过程的观察等。
在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不一定指的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任何的一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (9)

1.一种超分辨荧光高光谱显微成像***，其特征在于，所述***包括：
样本显微组件，包括放置待测样本的样品台以及对所述待测样本进行显微的物镜组；
激发光源，用于提供照射待测样本的激发光；
结构光调制模组，接收所述激发光并对所述激发光进行调制，形成不同相位平移的明暗相间的结构线；
结构线扫描模组，接收所述结构线并对所述结构线进行调制，形成用于对所述待测样本进行扫描的扫描结构线，所述扫描结构线经所述物镜组聚焦于所述待测样本上；以及
图像探测模组，接收所述待测样本被所述扫描结构线扫描激发后发射的荧光信号，并对所述荧光信号进行高光谱显微成像；
所述***还包括：
第二二向色镜，设置于所述结构线扫描模组和所述结构光调制模组之间，所述结构线透过所述第二二向色镜射入所述结构线扫描模组；
所述荧光信号经所述第二二向色镜反射后射入所述图像探测模组。
2.根据权利要求1所述的超分辨荧光高光谱显微成像***，其特征在于，所述结构光调制模组包括：
空间光调制器，接收所述激发光并对所述激发光进行平移调制，形成不同相位平移的明暗相间的结构光；
柱状透镜组件，接收所述结构光并将所述结构光压缩为所述结构线。
3.根据权利要求2所述的超分辨荧光高光谱显微成像***，其特征在于，所述柱状透镜组件包括：
第一柱状透镜，用于对所述结构光进行一次一维聚焦；
空间滤波器，用于对一次一维聚焦后的结构光进行滤波，选取±1级衍射光；
第二柱状透镜，用于对滤波后的结构光进行散焦，校直并调整结构光束宽度；
第三柱状透镜，用于对所述结构光进行二次一维聚焦，形成所需结构线射入所述结构线扫描模组。
4.根据权利要求1所述的超分辨荧光高光谱显微成像***，其特征在于，所述激发光源的数量为两个，分别为第一激发光源和第二激发光源；
所述第一激发光源和所述第二激发光源发射的激发光波长不相同。
5.根据权利要求4所述的超分辨荧光高光谱显微成像***，其特征在于，所述***还包括第一二向色镜，所述第一激发光源发射的激发光经所述第一二向色镜反射后射入所述结构光调制模组；所述第二激发光源发射的激发光经所述第一二向色镜透射后射入所述结构光调制模组。
6.根据权利要求1所述的超分辨荧光高光谱显微成像***，其特征在于，扫描至样本不同位置所产生的荧光信号经所述结构线扫描模组反扫描之后再经过第二二向色镜反射后射入所述图像探测模组，其中所述图像探测模组包括：
第一探测相机，用于获取所述荧光信号的荧光强度信息；
第二探测相机，用于获取所述荧光信号的光谱图像。
7.根据权利要求6所述的超分辨荧光高光谱显微成像***，其特征在于，所述图像探测模组还包括：
翻转镜，设置于所述荧光信号的传递路径上，用于改变所述荧光信号的传递路径，以使所述荧光信号选择性射向所述第一探测相机或所述第二探测相机。
8.根据权利要求6所述的超分辨荧光高光谱显微成像***，其特征在于，所述图像探测模组还包括：
分光镜，设置于所述荧光信号的传递路径上，所述分光镜透过的部分荧光信号进入所述第二探测相机，所述分光镜反射的部分荧光信号进入所述第一探测相机。
9.根据权利要求1-8任一项所述的超分辨荧光高光谱显微成像***，其特征在于，所述样品台布置于一由步进电机控制的旋转台上，所述旋转台带动所述样品台旋转。
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CN117608066A (zh) * 2024-01-19 2024-02-27 清华大学 正倒置一体化扫描光场显微成像装置及方法

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