CN111956795A

CN111956795A - 以cd99为靶点的嵌合抗原受体联合抗肿瘤药物的应用

Info

Publication number: CN111956795A
Application number: CN202010876364.1A
Authority: CN
Inventors: 张同存; 顾潮江; 祝海川; 周经姣; 周勇; 史江舟
Original assignee: Wuhan Bio Raid Biotechnology Co ltd
Current assignee: Wuhan Bio Raid Biotechnology Co ltd
Priority date: 2020-08-27
Filing date: 2020-08-27
Publication date: 2020-11-20
Anticipated expiration: 2040-08-27
Also published as: CN111956795B

Abstract

本发明提供了一种***的联合用药方法及其应用，该联合用药的方法将嵌合抗原受体免疫细胞疗法与化学疗法结合起来，具有比单一化学疗法或单一免疫细胞疗法更强的抗肿瘤效果。同时能降低化疗药物的使用剂量，降低化疗药物产生的毒副作用。克服CAR‑T细胞***过程中面临着肿瘤的高度异质性导致的脱靶以及靶点的单一性导致治疗效果不理想等问题。

Description

以CD99为靶点的嵌合抗原受体联合抗肿瘤药物的应用

技术领域

本发明涉及医药生物领域，具体是指一种以CD99为靶点治疗广谱性肿瘤的嵌合抗原受体(CAR)联合抗肿瘤药物的应用。

背景技术

2019年初，美国癌症学会公布的数据表明，全球2018年新发1810万例癌症，死亡960万，中国人群癌症发病率，死亡率均居全球首位，并呈迅猛增长态势。全球的科学家们也在致力于各种抗癌疗法的研究，免疫治疗作为继化疗和靶向治疗后抗癌治疗的第三次革命成为新一代的肿瘤治疗手段。2013年美国《科学》杂志把肿瘤免疫治疗选为当年最大的科学突破，2015年又将肿瘤免疫联合治疗列为最值得关注的四项科学进展之一。

肿瘤免疫治疗是指应用免疫学的原理和方法，提高肿瘤的免疫原性，利用自身的免疫***攻击肿瘤细胞，从而抑制或杀伤肿瘤细胞。按其治疗策略分为两大类：免疫检查点抑制剂(如CTLA-4、PD-1、PD-L1等)和细胞免疫治疗(如CAR-T等)。其中CAR-T细胞全称为嵌合抗原受体T细胞(Chimeric Antigen Receptor T-Cell)，原理为通过基因工程的方法，将能识别某种肿瘤抗原的抗体单链可变区(Scfv)与CD3-ζ链的胞内区在体外偶联为一个嵌合蛋白，通过基因转导的方法转染体外培养的患者T细胞，使其表达嵌合抗体受体(CAR)。患者的T细胞被“重编程”后，生成大量具有杀伤性的CAR-T细胞，能够特异性的靶向肿瘤细胞。CAR-T与传统的免疫疗法相比，具有治疗更精确、靶向更精准、杀瘤更广泛、效果更持久等显著优势。作为新型前沿治疗手段，CAR-T治疗主要由中美引领发展，中国的表现尤为突出，截至2019年5月，全球CAR-T治疗临床试验登记项目507项，主要分布在中国和美国，分别占试验总数的44.2％和36.7％。CAR-T疗法已在临床上获得巨大成功，尤其是在血液肿瘤治疗中取得了巨大的成就。2017年美国FDA相继批准两款CAR-T免疫治疗产品Kymriah(tisagenlecleucel，CTL-019)和Yescarta(axicabtagene ciloleucel，KTE-C10)上市，分别应用于治疗用于治疗复发或难治性(r/r)儿童和年轻成人B细胞急性淋巴细胞白血病和难治、复发型成人大B细胞淋巴瘤患者。

CD99蛋白是由基因MIC2(MIC2X，MIC2Y)或编码的定位于细胞膜上的糖基化蛋白，其分子量为32kD。主要在胸腺表皮细胞，胰岛细胞，卵巢颗粒细胞以及睾丸支持细胞等正常组织细胞中高表达。过去的研究表明，血管瘤样纤维组织细胞瘤等20种肿瘤中95％以上的样本均为CD99阳性，T淋巴母细胞白血病/淋巴瘤等19种肿瘤中大于75％的病人为CD99阳性，胶质母细胞瘤等14种肿瘤中大于55％的病人显示为CD99阳性。尤其是在尤文氏肉瘤中研究发现几乎100％的此类肿瘤为CD99阳性，临床上将其作为尤文肉瘤的诊断标志物。CD99不仅在初症时期的肿瘤中高表达，对于T细胞急性淋巴白血病(T-ALL)而言，CD99的表达用于化疗后免疫微小残留细胞的检测与诊断T-ALL复发的依据。

化学抗癌药物在肿瘤的治疗的研究较早，应用也比较广泛。顺铂(Cisplatin，DDP)是1978年FDA批准的首个用于癌症治疗的铂类化合物，常用于治疗多种类型的癌症，包括卵巢癌、睾丸癌、头颈癌、结肠直肠癌、膀胱癌和肺癌等，具有抗癌谱广、作用机制独特、利于临床联合用药等特点。顺铂的抗肿瘤作用与DNA损伤和DNA合成的抑制相关。顺铂与DNA相互作用形成DNA加合物，导致DNA链内或链间交联，激活多种信号通路，诱导氧化应激，激活细胞凋亡，最终导致肿瘤细胞死亡。紫杉醇(Paclitaxel，PTX)最早于1992年被FDA批准用于晚期乳腺癌的治疗。2018年，在美国被批准用于治疗乳腺癌，胰腺癌，卵巢癌，卡波西氏肉瘤和非小细胞肺癌。紫杉醇是从红豆杉中提取出的天然生物碱，对微管蛋白的聚合进程具有明显的刺激作用，同时能够对微管蛋白的解聚反应起到明显的抑制作用，从而提升微管蛋白的稳定性，阻断肿瘤细胞的有丝***进程，提高化疗的敏感性。

尽管CD99为靶点能够成为有效***的方法，但是CAR-T细胞***过程中仍然面临着肿瘤的高度异质性导致的脱靶以及靶点的单一性导致治疗效果不佳等问题。其中肿瘤细胞的高度异质性直接导致了CAR-T疗法在治疗过程中的局限性，而靶点的单一性限制了治疗上的效果和肿瘤的清除。CAR-T联合抗肿瘤药物治疗既可以利用CAR T细胞的靶向性又具有抗肿瘤药物的广泛性，提高单一疗法治愈率。因此CAR-T联合抗肿瘤药物治疗可能是作为肿瘤治疗和愈后很关键性的治疗手段。

申请人在前期研究中制备获得了一种以CD99为靶点的嵌合抗原受体(CAR),(专利公开号CN110590960A)，其携带靶向CD99的ScFv序列，携带该序列的CAR-T细胞可以有效的杀伤任何表面表达CD99的肿瘤细胞，拓展了杀伤肿瘤的广谱性。在此基础上，申请人在对该嵌合抗原受体的临床应用进行更进一步的研究过程中，惊喜地发现，利用携带该序列的CAR-T细胞联合化学抗癌药联合使用，具有协同抗肿瘤的技术效果。

发明内容

针对现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种***的联合用药方法及其应用，该联合用药的方法将嵌合抗原受体免疫细胞疗法与化学疗法结合起来，具有比单一化学疗法或单一免疫细胞疗法更强的抗肿瘤效果。同时能降低化疗药物的使用剂量，降低化疗药物产生的毒副作用。克服CAR-T细胞***过程中面临着肿瘤的高度异质性导致的脱靶以及靶点的单一性导致治疗效果不理想等问题。

为达到此发明目的，本发明采用以下技术方案：

一方面，本发明提供一种以CD99为靶点的嵌合抗原受体(CAR)和抗肿瘤药物治疗广谱性肿瘤的联合用药组合物。

所述以CD99为靶点的嵌合抗原受体，从N端到C端顺次拼接信号肽、单链抗体ScFv、strepII、CD8 hinge、CD28跨膜区、CD28胞内结构域、胞内共刺激域4-1BB和CD3ζ链；优选地，所述单链抗体ScFv能够识别肿瘤细胞表面的CD99抗原。所述信号肽的氨基酸序列如SEQ IDNO.5所示，strepII的氨基酸序列如SEQ ID NO.7所示，CD8 hinge的氨基酸序列如SEQ IDNO.9所示，CD28跨膜区(CD28TM)的氨基酸序列如SEQ ID NO.11、CD28胞内结构域(CD28ICD)的氨基酸序列分别如SEQ ID NO.17所示，胞内共刺激域4-1BB的核苷酸序列如SEQ IDNO.13所示，CD3ζ的核苷酸序列如SEQ ID NO.15所示。

在本发明的一些实施例中，单链抗体ScFv的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，优选地，所述单链抗体ScFv的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

在本发明的一些实施例中，单链抗体ScFv的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示，对应地，所述单链抗体ScFv的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。

所述抗肿瘤药物包括顺铂和紫杉醇。优选地，上述技术方案中，所述顺铂浓度为32μg/mL，所述紫杉醇的浓度为20nmol/L。

另一方面，本发明提供一种如上所述的联合用药物组合物在制备抗肿瘤药物中的应用。优选地，所述肿瘤肿瘤优选为尤文肉瘤、急性淋巴瘤/白血病、急性髓系白血病、恶性神经胶质瘤、乳腺癌。

再一方面，本发明提供一种新型的抗肿瘤联合疗法，所述抗肿瘤联合疗法为化学疗法与嵌合抗原受体T细胞免疫疗法的联合疗法。

本发明的有益效果在于：

1、本发明提供的CD99为靶点的嵌合抗原受体包括特定的单链抗体ScFv，其用于修饰免疫细胞，修饰后的免疫细胞能用于表面CD99阳性的肿瘤的治疗，尤其对尤文肉瘤、急性淋巴瘤/白血病、急性髓系白血病、恶性神经胶质瘤、乳腺癌杀瘤效果显著。

2、本发明提供的CAR T细胞与抗肿瘤药物联合使用，CAR-T和抗肿瘤药物能够产生协同作用，杀瘤效率得到显著提高。联合方案可更好地控制肿瘤进展，减少癌症复发，从而提高患者的存活率。

3、本发明还提供表达嵌合型抗原受体的免疫细胞的制备方法，是将分离得到的免疫细胞激活激活2-15天后再感染表达嵌合抗原受体的慢病毒，这样，原有免疫细胞不会影响转染后的表达嵌合型抗原受体的免疫细胞的杀瘤效果，进一步地，表达嵌合型抗原受体的免疫细胞进行体外功能检测时，所选择的细胞系为细胞膜外高表达或中表达CD99靶点的细胞系，这样对表达嵌合型抗原受体的免疫细胞的杀瘤效果评价更为科学。

附图说明

附图用来提供对本发明的进一步理解，并且构成说明书的一部分，与本发明的实施例一起用于解释本发明，并不构成对本发明的限制。在附图中：

图1为实施例中C1-CAR、C2-CAR的DNA片段的示意图；

图2为实施例中PTK881-EF1α-C1、PTK881-EF1α-C2质粒图；

图3为实施例中C1-CAR-T细胞、C2-CAR-T细胞转导效率检测结果；

图4对阴性靶细胞Raji的杀伤效率；

图5对阳性靶细胞TC71、6647的杀伤效率；

图6对阳性靶细胞jurkat、molt4的杀伤效率；

图7对阳性靶细胞U373-MG、U251-MG的杀伤效率；

图8对阳性靶细胞H1299、MCF-7的杀伤效率。

具体实施方式

下面将结合实施例对本发明的方案进行解释。本领域技术人员将会理解，下面的实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体技术或条件的，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。

实施例1：PTK881-EF1α-C1、PTK881-EF1α-C2的构建

1、分别人工合成SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.4所示的片段构成SP-C1、SP-C2。

2、以人的cDNA文库为模板，设计引物PCR分别扩增片段CD8 hinge、CD28跨膜区、CD28胞内结构域、4-1BB、CD3ζ，以引物互补方式得到StrepⅡ片段。采用Overlap PCR技术分别将SP-C1、SP-C2与片段Strep tagⅡ、CD8 hinge、CD28跨膜区、CD28胞内结构域、4-1BB、CD3ζ顺次扩增连接成带有酶切位点EcoR I和BamH I的C1-CAR和C2-CAR，C1-CAR、C2-CAR结构示意图如图1所示；

其中，SP-C1、SP-C2为能够识别肿瘤细胞表面的CD99的单链抗体ScFv。单链抗体ScFv：SP-C1、SP-C2的氨基酸序列分别如SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.3所示，SP-C1、SP-C2的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.4所示。信号肽SP的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示，strepII的核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示，CD8 hinge的核苷酸序列如SEQ ID NO.10所示，CD28TM的核苷酸序列如SEQ ID NO.12所示，CD28ICD的核苷酸序列如SEQ ID NO.18所示，4-1BB的核苷酸序列如SEQ ID NO.14所示，CD3ζ的核苷酸序列如SEQ ID NO.16所示，信号肽SP的的氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示，strepII的氨基酸序列如SEQ ID NO.7所示，CD8 hinge的氨基酸序列如SEQ ID NO.9所示，CD28TM的氨基酸序列如SEQ ID NO.11所示，CD28ICD的氨基酸序列如SEQ ID NO.17所示，4-1BB的氨基酸序列如SEQ ID NO.13所示，CD3ζ的氨基酸序列如SEQ ID NO.15所示。

3、将质粒PTK881-Kan使用EcoR I和BamH I限制性内切酶进行双酶切，产物经过0.8％的琼脂糖凝胶电泳，并割胶回收置于1.5mL离心管内，用Axygen公司的琼脂糖凝胶回收试剂盒回收相应的酶切片段，并测定产物的纯度和浓度。

4、将片段以1:2摩尔比加入1.5mL离心管加入ExnaseⅡ连接酶与同源重组酶5×CEⅡbuffer，37℃反应0.5h；将连接液取出10μL加入100μL DH5α感受态细胞冰浴30min后42℃热激90s，完成后加入500μL soc培养基37℃、220rpm培养2h；2h后将1.5mL离心管4000g离心1min移除400μL多余液体。将剩余液体涂布在LB平板37℃培养12h；在平板上挑取单菌落，接种到5mL LB液体培养基中37℃、220rpm培养12h。

5、用Axygen小提试剂盒提取质粒，获得质粒PTK881-EF1α-C1、PTK881-EF1α-C2送生工生物工程(上海)股份有限公司科技公司一代测序验证无误后，进行含质粒PTK881-EF1α-C1、PTK881-EF1α-C2的DH5α菌株保种。PTK881-EF1α-C1、PTK881-EF1α-C2的完整图谱示意图如图2所示。

实施例2、质粒的制备与测序

1、质粒的制备

将含质粒PTK881-EF1α-C1、PTK881-EF1α-C2的DH5α菌种接种至250mL含100μg/mL氨苄霉素的LB培养液中，37℃、220rpm培养过夜。培养液在4℃于6000g离心20min，弃上清。

取出Endo Free plasmid mega kit(Qiagen)中的Buffers P1，向离心得到的大肠杆菌沉淀中加120mL提前预冷的Buffers P1，盖上离心瓶盖，剧烈振荡离心瓶使大肠杆菌沉淀在Buffers P1中完全分散。

向离心瓶中加120mL Buffers P2，盖上瓶盖放置在滚轴混匀仪上，慢慢提速至50rpm，彻底混匀后室温放置5min。

向离心瓶中加120mL Buffers P3，盖上瓶盖放置在滚轴混匀仪上，慢慢提速至滚轴混匀仪最大转速70rpm，彻底混匀直至呈白色不粘稠蓬松的混合液。在4℃于9000g离心15min。

向QIAfilter Cartridge倒入50mL Buffer FW，将离心所得上清液倒入QIAfilterCartridge中，轻轻地搅拌混匀。将混合液抽滤入已标记好对应的玻璃瓶中。

向每个玻璃瓶中加入20mL Buffer ER，上下颠倒混匀6次，在-20℃孵育30min。

将标记好的mega柱放入对应的架子上，向每个mega柱内加入35mL Buffers QBT平衡，重力作用使之流尽。

将玻璃瓶中的液体分批全部倒入对应标记的mega柱中，待柱中液体流尽后，向每个mega柱分批加入200mL Buffer QC进行清洗。待柱中液体流尽后，将废液收集盘中的废液倒入50mL洁净离心管内。

再向每个mega柱内加入40mL Buffer QN，使用50mL洁净离心管收集流出液，上下颠倒6次混匀，分装20mL至另一洁净已标记的50mL离心管内。

向每个50mL离心管加入14mL异丙醇(常温)，上下颠倒6次混匀。在4℃于15000g离心50min。

超净工作台内吸尽上清，每管加入3.5mL Endotoxin-free water漂洗，不要将底部沉淀冲散。在4℃于15000g离心30min。将EndoFree plasmid megakit中的Buffer TE放入烘箱内预热。

在超净工作台内吸尽离心后的上清，于超净工作台内吹干(挥发残留的无水乙醇，时间在10min左右)。

在烘箱内拿出Buffer TE，在超净工作台内向每管加入1mL Buffer TE，用枪吹打10次后放入65℃烘箱，期间不间断地敲击管壁促使沉淀完全溶解。在4℃于4000g离心1min将管壁上的液体甩到管底后吹打混匀。

在超净工作台内将液体全部转移至无内毒素无热源无核酸酶对应标记的EP管中。吸出2μL用微量分光光度计测质粒浓度，并标记在对应的EP管上，获得质粒PTK881-EF1α-C1、PTK881-EF1α-C2。

2、目的基因测序

分别取20μL(约500ng)质粒DNA，外送测序，根据原始种子序列，检查质粒生产所得产品的目的基因有无发生改变，稳定的工艺下，工作种子在进行发酵培养放大过程中，目的基因不会发生改变，可用于下一环节的生产和正确表达蛋白。

实施例3、Lenti3-C1-CAR、Lenti3-C2-CAR慢病毒载体的制备与活滴检测

1、慢病毒载体的制备

在多层细胞培养瓶(Hyperflask)接入130.0～140.0×10⁶数目的293T细胞(Takara)，共560mL DMEM完全培养基(50mL胎牛血清、5mL Antibiotic-Antimycotic(100×))，在37℃含5％CO₂培养箱中培养24h。将穿梭质粒PTK881-EF1α-C1/PTK881-EF1α-C2与包装质粒按如下比例混合，PTK881-EF1α-C1/PTK881-EF1α-C2：BZ1质粒：BZ2质粒：BZ3质粒＝12：10：5：6，得到320μg混合质粒，加入15mL的DMEM完全培养基。同时在15mL的DMEM完全培养基中加入960μg PEI，将混有PEI的DMEM完全培养基缓慢加入到混有质粒的DMEM完全培养基，室温平衡10min。分别将上述30mL混合液与530mL DMEM完全培养基混匀，换入上述多层细胞培养瓶中。将多层细胞培养瓶置于37℃含5％CO₂培养箱培养3天后，收集细胞培养上清液。

分别将上清液4000rpm(或3000g)离心30min后，向离心后上清中加入cryonase酶(Takara)置于4℃。6h后，使用0.22μm的滤膜对慢病毒上清液进行抽滤，4℃于30000g离心2.5h。去除上清，加入1mL的T细胞培养基重悬沉淀。重悬后，留20μL做病毒活性滴度检测，剩余慢病毒浓缩液分装，标记为Lenti3-C1-CAR、Lenti3-C2-CAR并置于-80℃保存备用。

2、慢病毒载体活性滴度检测

原理：anti-strepII抗体上标记有荧光素，而anti-strepII抗体能与CAR中strepII特异性结合，通过流式细胞仪检测到的荧光信号间接反应了CAR在293T细胞中的表达情况。

方法：在6孔板中接入5.0×10⁵个/孔293T细胞，慢病毒浓缩液每孔分别加入0.1μL、0.5μL、1μL，并设1个阴性对照。置于37℃含5％CO₂培养箱内培养。三日后，用Versene溶液(Gibco)收集293T细胞送流式细胞学检测CAR阳性293T细胞比例，并换算得到Lenti3-C1-CAR、Lenti3-C2-CAR慢病毒浓缩液活性滴度。

Lenti3-C1-CAR、Lenti3-C2-CAR慢病毒浓缩液活性滴度流式检测结果如表1所示；目前的慢病毒浓缩液活性滴度在1×10⁸～10×10⁹(TU/mL)范围内。

表1 Lenti3-C1-CAR、Lenti3-C2-CAR慢病毒活性滴度检测分析结果

样品编号	活性滴度(TU/mL)
		Lenti3-C1-CAR	2.1×10<sup>8</sup>
Lenti3-C2-CAR	2.8×10<sup>8</sup>

实施例4、C1-CAR-T、C2-CAR-T细胞的制备

1、CAR-T细胞制剂制备：

采集健康供者外周血100mL，采用Ficoll淋巴细胞分离液分离单个核细胞。计数后，使用适量CD3MicroBeads,human(美天旎)分选CD3阳性细胞，并以1.0～2.0×10⁶个/mL密度在T细胞完全培养液(OpTmizer^TM CTS^TM T-Cell Expansion Basal Medium，OpTmizer^TMCTS T-Cell Expansion Supplement(Invitrogen)，500IU/mL的IL-2(双鹭药业))中培养，同时按每10⁶个细胞加入25μL Dynabeads Human T-ActivatorCD3/CD28(Invitrogen)活化T细胞。

48h(Day2)后，按MOI为3加入Lenti3-C1-CAR、Lenti3-C2-CAR慢病毒载体进行转导，混匀后置于CO₂培养箱孵育，4h后补加适量的T细胞完全培养基进行培养。

慢病毒转导24h后将转导后C1-CAR-T、C2-CAR-T细胞换入新鲜T细胞完全培养液，并调整活细胞密度为1.0-2.0×10⁶个/mL，继续培养扩增10～20天，每天进行观察和计数，并根据计得的细胞数量进行补液扩大培养，始终保持细胞培养密度为1.0-2.0×10⁶/mL。

根据预计细胞用量收集C1-CAR-T、C2-CAR-T细胞，重悬于含2％人血白蛋白的100mL生理盐水中，转入细胞回输袋中，热封后制成C1-CAR-T、C2-CAR-T细胞制剂成品。

2、C1-CAR-T、C2-CAR-T细胞转导效率检测

取1.0×10⁶个转导后T细胞，与1μg/mL FITC-strepII室温孵育30min，生理盐水清洗两次后，通过流式细胞仪检测FITC荧光信号，测量FITC阳性细胞比率，反映了CAR-T细胞在总细胞中的比率。C1-CAR-T、C2-CAR-T细胞转导效率检测结果分别如图3和表2所示。图3和表2表明成功制备了C1-CAR-T、C2-CAR-T细胞。

表2 C1-CAR-T、C2-CAR-T细胞转导效率检测结果

编号	转导类型	转导效率
			1	C1-CAR-T细胞	97.1％
2	C2-CAR-T细胞	80.1％

实施例5、C1-CAR-T、C2-CAR-T细胞联合抗肿瘤药物的体外功能检测

采用钙黄绿素检测法分别对T、C1-CAR-T、C2-CAR-T细胞进行体外杀瘤功能检测。

靶细胞在尤文肉瘤(EWS)，急性淋巴母细胞性淋巴瘤/白血病(T-ALL)，恶性胶质瘤(Malignant Gliomas)和乳腺癌(Breast Cancer)，肺癌(Lung Cancer)这六种肿瘤的细胞系中进行筛选，筛选的标准是能够膜外高表达或中表达CD99靶点，选用细胞系如表3所示，实验组阴性靶细胞为Raj i(CD99阴性细胞系)。

表3 anti-CD99 CAR-T细胞的靶细胞系的选择

肿瘤种类	细胞系
		尤文肉瘤(EWS)	TC71、6647
急性淋巴母细胞性淋巴瘤(T-ALL)	JURKAT、MOLT-4
		恶性神经胶质瘤(Malignant Gliomas)	U251-MG、U373-MG
乳腺癌(Breast Cancer)	MCF-7
		肺癌(Lung Cancer)	H1299

杀瘤实验具体操作如下：取取5×10⁵个靶细胞，重悬在0.5mL的杀瘤buffer(含5％FBS的PBS)中，加入5μL的钙黄绿素-乙酰羟甲基酯(Calcein-AM)(终浓度为25μM)，轻柔吹打混匀。将细胞悬液放入培养箱中孵育30min。常温离心5min，弃上清。重复操作两次。加入10mL的杀瘤buffer，调整细胞密度至0.5×10⁵个/mL。在96孔板中每孔分别加入0.5×10⁵个阳性靶细胞(如上表所示)和阴性靶细胞Raji。计算T、C1-CAR-T、C2-CAR-T细胞密度，对照组按5:1的效靶比分别加入T、C1-CAR-T、C2-CAR-T细胞。实验组按5:1的效靶比分别加入个T、C1-CAR-T、C2-CAR-T细胞后再分别加入顺铂终浓度为32μg/mL，紫杉醇的终浓度为20nmol/L。对照组合实验组同时37℃孵育2～3h。孵育完成后取上清，测量其中钙黄绿素的荧光强度，并根据自发释放对照和最大释放对照，计算靶细胞裂解百分数。

T细胞、DDP、PTX、C1-CAR-T细胞、C2-CAR-T细胞、C1-CAR-T细胞加DDP、C1-CAR-T细胞加PTX、C2-CAR-T细胞加DDP、C2-CAR-T细胞加PTX对阴性细胞Raji的裂解百分数结果如图4所示。

T细胞、DDP、PTX、C1-CAR-T细胞、C2-CAR-T细胞、C1-CAR-T细胞加DDP、C1-CAR-T细胞加PTX、C2-CAR-T细胞加DDP、C2-CAR-T细胞加PTX对尤文肉瘤细胞系TC71、6647靶细胞裂解百分数结果如图5所示。

T细胞、C1-CAR-T细胞、C2-CAR-T细胞、C1-CAR-T细胞加DDP、C1-CAR-T细胞加PTX、C2-CAR-T细胞加DDP、C2-CAR-T细胞加PTX对急性淋巴母细胞性淋巴瘤阳性细胞JURKAT、MOLT-4裂解百分数结果如图6所示。

T细胞、C1-CAR-T细胞、C2-CAR-T细胞、C1-CAR-T细胞加DDP、C1-CAR-T细胞加PTX、C2-CAR-T细胞加DDP、C2-CAR-T细胞加PTX对恶性神经胶质瘤阳性细胞U251-MG、U373-MG裂解百分数结果如图7所示。

T细胞、C1-CAR-T细胞、C2-CAR-T细胞、C1-CAR-T细胞加DDP、C1-CAR-T细胞加PTX、C2-CAR-T细胞加DDP、C2-CAR-T细胞加PTX对乳腺癌阳性细胞MCF-7、对肺癌阳性细胞H1299裂解百分数结果如图8所示。

由图4～图8结果可知，C1-CAR-T细胞和C2-CAR-T细胞联合DDP和PTX，对尤文肉瘤细胞、急性淋巴母细胞性淋巴瘤阳性细胞、恶性神经胶质瘤阳性细胞、乳腺癌阳性细胞、对肺癌阳性细胞均具有协同治疗的效果。例如图5所示的结果，T细胞对TC71、6647的杀伤效率约为10％、DDP和PTX对TC71、6647的杀伤效率约为25％、C1-CAR-T细胞、C2-CAR-T细胞对TC71、6647的杀伤效率均小于45％，而C1-CAR-T细胞加PTX和DDP对靶细胞的杀伤效率达到100％，C2-CAR-T细胞加PTX和DDP对靶细胞的杀伤效率也达到80％以上，由此可以看出，C1-CAR-T细胞和C2-CAR-T细胞与PTX和DDP联合用药对靶细胞TC71、6647的裂解作用具有明显的协同作用，明显提高了CAR-T细胞和抗肿瘤药物单独使用时的杀瘤效果，达到了1+1≥2的效果。

尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例性的，不能理解为对本发明的限制，本领域的普通技术人员在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型。

序列表

<110> 武汉波睿达生物科技有限公司

<120> 以CD99为靶点的嵌合抗原受体联合抗肿瘤药物的应用

<130> CP20421

<141> 2020-08-27

<160> 18

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 241

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Leu Ser Cys Thr Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp Thr

20 25 30

Tyr Ile His Trp Val Lys Arg Arg Pro Glu Gln Gly Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Gly Arg Ile Asp Pro Ala Asn Gly Asn Thr Lys Tyr Asp Pro Lys Phe

50 55 60

Gln Gly Lys Ala Thr Ile Thr Ala Asp Thr Ser Ser Asn Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Arg Gly Gly Val Asp Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val

100 105 110

Ser Ala Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly

115 120 125

Ser Asp Val Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Thr Leu Ser Val Thr Ile

130 135 140

Gly Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asp

145 150 155 160

Gly Asp Gly Lys Thr Tyr Leu Asn Trp Leu Leu Gln Arg Pro Gly Gln

165 170 175

Ser Pro Lys Arg Leu Ile Tyr Leu Val Ser Lys Leu Asp Ser Gly Val

180 185 190

Pro Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys

195 200 205

Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Val Tyr Tyr Cys Trp Gln

210 215 220

Gly Thr His Phe Pro Arg Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile

225 230 235 240

Lys

<210> 2

<211> 723

<212> DNA/RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

gaggtgcagc tgcagcagag cggcgccgag ctggtgaagc ccggcgccag cgtgaagctg 60

agctgcaccg ccagcggctt caacatcaag gacacctaca tccactgggt gaagcgccgc 120

cccgagcagg gcctggagtg gatcggccgc atcgaccccg ccaacggcaa caccaagtac 180

gaccccaagt tccagggcaa ggccaccatc accgccgaca ccagcagcaa caccgcctac 240

ctgcagctga gcagcctgac cagcgaggac accgccgtgt actactgcgc ccgccgcggc 300

ggcgtggact ggggccaggg caccctggtg accgtgagcg ccggtggagg cggttcaggc 360

ggaggtggct ctggcggtgg cggatcggac gtggtgatga cccagacccc cctgaccctg 420

agcgtgacca tcggccagcc cgccagcatc agctgcaaga gcagccagag cctgctggac 480

ggcgacggca agacctacct gaactggctg ctgcagcgcc ccggccagag ccccaagcgc 540

ctgatctacc tggtgagcaa gctggacagc ggcgtgcccg accgcttcac cggcagcggc 600

agcggcaccg acttcaccct gaagatcagc cgcgtggagg ccgaggacct gggcgtgtac 660

tactgctggc agggcaccca cttcccccgc accttcggcg gcggcaccaa gctggagatc 720

aag 723

<210> 3

<211> 241

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp Thr

20 25 30

Tyr Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met

35 40 45

Gly Arg Ile Asp Pro Ala Asn Gly Asn Thr Lys Tyr Asp Pro Lys Phe

50 55 60

Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Ile Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Arg Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Arg Gly Gly Val Asp Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val

100 105 110

Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly

115 120 125

Ser Asp Ile Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Ser Val Thr Pro

130 135 140

Gly Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asp

145 150 155 160

Gly Asp Gly Lys Thr Tyr Leu Asn Trp Leu Leu Gln Lys Pro Gly Gln

165 170 175

Ser Pro Gln Arg Leu Ile Tyr Leu Val Ser Lys Leu Asp Ser Gly Val

180 185 190

Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys

195 200 205

Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Trp Gln

210 215 220

Gly Thr His Phe Pro Arg Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile

225 230 235 240

Lys

<210> 4

<211> 723

<212> DNA/RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

caggtgcagc tggtgcagag cggcgccgag gtgaagaagc ccggcgccag cgtgaaggtg 60

agctgcaagg ccagcggctt caacatcaag gacacctaca tccactgggt gcgccaggcc 120

cccggccagg gcctggagtg gatgggccgc atcgaccccg ccaacggcaa caccaagtac 180

gaccccaagt tccagggccg cgtgaccatg acccgcgaca ccagcatcag caccgcctac 240

atggagctga gccgcctgcg cagcgacgac accgccgtgt actactgcgc ccgccgcggc 300

ggcgtggact ggggccaggg caccctggtg accgtgagca gcggtggagg cggttcaggc 360

ggaggtggct ctggcggtgg cggatcggac atcgtgatga cccagacccc cctgagcctg 420

agcgtgaccc ccggccagcc cgccagcatc agctgcaaga gcagccagag cctgctggac 480

ggcgacggca agacctacct gaactggctg ctgcagaagc ccggccagag cccccagcgc 540

ctgatctacc tggtgagcaa gctggacagc ggcgtgcccg accgcttcag cggcagcggc 600

agcggcaccg acttcaccct gaagatcagc cgcgtggagg ccgaggacgt gggcgtgtac 660

tactgctggc agggcaccca cttcccccgc accttcggcc agggcaccaa gctggagatc 720

aag 723

<210> 5

<211> 21

<212> DNA/RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

<210> 6

<211> 63

<212> DNA/RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

atggccctgc ctgtgacagc tctgctcctc cctctggccc tgctgctcca tgccgccaga 60

ccc 63

<210> 7

<211> 14

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

Asn Trp Ser His Pro Gln Phe Glu Lys Gly Gly Gly Gly Ser

1 5 10

<210> 8

<211> 42

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

aactggagcc acccccagtt cgagaagggc ggtggcggaa gc 42

<210> 9

<211> 45

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala

1 5 10 15

Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly

20 25 30

Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp

35 40 45

<210> 10

<211> 135

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

accacgacgc cagcgccgcg accaccaaca ccggcgccca ccatcgcgtc gcagcccctg 60

tccctgcgcc cagaggcgtg ccggccagcg gcggggggcg cagtgcacac gagggggctg 120

gacttcgcct gtgat 135

<210> 11

<211> 27

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

Phe Trp Val Leu Val Val Val Gly Gly Val Leu Ala Cys Tyr Ser Leu

1 5 10 15

Leu Val Thr Val Ala Phe Ile Ile Phe Trp Val

20 25

<210> 12

<211> 81

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 12

ttttgggtgc tggtggtggt tggtggagtc ctggcttgct atagcttgct agtaacagtg 60

gcctttatta ttttctgggt g 81

<210> 13

<211> 42

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 13

Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met

1 5 10 15

Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe

20 25 30

Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu

35 40

<210> 14

<211> 126

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 14

aaacggggca gaaagaaact cctgtatata ttcaaacaac catttatgag accagtacaa 60

actactcaag aggaagatgg ctgtagctgc cgatttccag aagaagaaga aggaggatgt 120

gaactg 126

<210> 15

<211> 112

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 15

Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly

1 5 10 15

Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr

20 25 30

Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys

35 40 45

Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys

50 55 60

Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg

65 70 75 80

Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala

85 90 95

Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg

100 105 110

<210> 16

<211> 336

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 16

agagtgaagt tcagcaggag cgcagacgcc cccgcgtacc agcagggcca gaaccagctc 60

tataacgagc tcaatctagg acgaagagag gagtacgatg ttttggacaa gagacgtggc 120

cgggaccctg agatgggggg aaagccgaga aggaagaacc ctcaggaagg cctgtacaat 180

gaactgcaga aagataagat ggcggaggcc tacagtgaga ttgggatgaa aggcgagcgc 240

cggaggggca aggggcacga tggcctttac cagggtctca gtacagccac caaggacacc 300

tacgacgccc ttcacatgca ggccctgccc cctcgc 336

<210> 17

<211> 41

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 17

Arg Ser Lys Arg Ser Arg Leu Leu His Ser Asp Tyr Met Asn Met Thr

1 5 10 15

Pro Arg Arg Pro Gly Pro Thr Arg Lys His Tyr Gln Pro Tyr Ala Pro

20 25 30

Pro Arg Asp Phe Ala Ala Tyr Arg Ser

35 40

<210> 18

<211> 123

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 18

aggagtaaga ggagcaggct cctgcacagt gactacatga acatgactcc ccgccgcccc 60

gggcccaccc gcaagcatta ccagccctat gccccaccac gcgacttcgc agcctatcgc 120

tcc 123

Claims

1.一种广谱抗肿瘤药物组合物，其特征在于，所述抗肿瘤药物的活性成分包括；

(1)一种表达嵌合型抗原受体的免疫细胞，所述免疫细胞携带有特异性识别肿瘤细胞表面的CD99抗原的单链抗体，所述单链抗体的ScFv的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；

(2)化学抗肿瘤药物。

2.如权利要求1所述的广谱抗肿瘤药物组合物，其特征在于，所述化学抗肿瘤药物选自顺铂或紫杉醇。

3.权利要求1或2所述的抗肿瘤药物组合物在制备治疗抗肿瘤药物制剂中的应用。

4.如权利要求3所述的应用，其特征在于，所述肿瘤包括尤文肉瘤(EWS)，急性淋巴母细胞性淋巴瘤/白血病(T-ALL)，恶性胶质瘤(Malignant Gliomas)和乳腺癌(BreastCancer)，肺癌(Lung Cancer)。

5.一种抗肿瘤药物制剂，其特征在于，包括权利要求1或2所述的抗肿瘤药物组合物以及药学上可接受的药用辅料。

6.如权利要求5所述的抗肿瘤药物制剂，其特征在于，所述肿瘤包括尤文肉瘤(EWS)，急性淋巴母细胞性淋巴瘤/白血病(T-ALL)，恶性胶质瘤(Malignant Gliomas)和乳腺癌(Breast Cancer)，肺癌(Lung Cancer)。