CN112300288B

CN112300288B - 一种cik细胞的嵌合抗原受体car及其应用

Info

Publication number: CN112300288B
Application number: CN201910689172.7A
Authority: CN
Inventors: 罗昀; 宋珂慧; 郭栋; 刑晓
Original assignee: Jinan Saier Biological Technology Co ltd
Current assignee: Jinan Saier Biological Technology Co ltd
Priority date: 2019-07-29
Filing date: 2019-07-29
Publication date: 2022-08-02
Anticipated expiration: 2039-07-29
Also published as: CN112300288A

Abstract

本申请公开了一种CIK细胞的嵌合抗原受体CAR及其应用。所述CAR包括：结合到特异性靶抗原的细胞外抗原结合结构域、铰合与跨膜结构域以及细胞内信号传导结构域；所述细胞内信号传导结构域包括共刺激信号传导结构域，所述共刺激信号传导结构域含有如下蛋白的胞内段：DAP12和CD226。实验证明，将DAP12或DAP10作为CAR的铰合与跨膜结构域和部分共刺激信号传导结构域，与DNAM‑1(CD226)或2B4等共同构成共刺激信号传导结构域，利用这些共刺激信号分子和CD3ζ来激活免疫细胞尤其是CD3⁺CD56⁺CIK内相关的信号传导通路，对恶性肿瘤细胞进行抑制杀伤，可显著降低细胞因子风暴，提高治疗产品的安全性。

Description

一种CIK细胞的嵌合抗原受体CAR及其应用

技术领域

本发明涉及生物医药领域，具体涉及恶性肿瘤的免疫细胞治疗技术领域，尤指一种嵌合抗原受体CAR及其应用，该CAR尤其适合于CIK细胞。

背景技术

嵌合抗原受体(CAR，Chimeric Antigen Receptors)一般由胞外段、跨膜区和胞内段组成，能够特异性识别靶细胞表面肿瘤相关抗原，并通过受体-活化信号的机制促进其所在的效应细胞，如T细胞、NK细胞、NKT细胞等活化、增殖并杀伤该靶细胞。

CAR分子的结构设计已经经过了多代的修改完善。第一代CAR包含识别肿瘤细胞表面抗原的单链可变片段(scFv)、铰合和跨膜结构和激活T细胞的CD3ζ或FcRγ的胞内结构域，但由于其在体内的存活时间短，严重影响了其临床疗效。第二代CAR在胞内结构域中，增加了一个共刺激分子，如CD28、4-1BB(CD137)、OX-40(CD134)等，该代CAR在血液***恶性肿瘤中获得了巨大成功。包含CD28的CAR能够产生更多的IL-2；包含4-1BB的CAR则可增强细胞的生存能力。为了使体内的CAR-T细胞获得更好的增殖能力、细胞因子分泌能力及肿瘤溶解活性，研究者们在三代CAR胞内区又增加了一个共刺激分子。四代CAR是通过增加“***基因”或者“细胞因子基因”，来控制细胞因子风暴或者增强CAR-T细胞的功能。目前已经上市的两个Anti-CD19 CAR-T均为二代CAR。对于肿瘤细胞的杀伤能力，二代CAR-T已经完全满足，但有引起细胞因子风暴和神经***毒性的风险。

CIK(cytokine-induced killer)细胞即多种细胞因子诱导的杀伤细胞，是将人体外周血单个核细胞在体外用多种细胞因子共同培养一段时间后获得的一群异质细胞，又被称为NK细胞样T淋巴细胞，兼具有T淋巴细胞强大的抗肿瘤活性和NK细胞非MHC限制性杀瘤优点。CD3、CD56双阳性细胞为其主要的效应细胞，还具有CCR7^-、CD45RA⁺、CD62L^low、CD11a⁺、CD27⁺、CD28^-、NKG2D⁺、NKp30^low、NKp44^-、NKp46^-、NKG2A^-、CD94^-等特性。临床应用的CIK细胞为细胞亚群，包括CD3⁺、CD56⁺的CIK、CD3⁺和CD8⁺的CTL(细胞毒性T淋巴细胞)、CD3⁺和CD4⁺的Th细胞(辅助性T细胞)等。CD3⁺CD56⁺的CIK主要通过NKG2D来识别恶性肿瘤上的相应配体，经细胞-细胞接触后，发挥非MHC限制性的杀伤功能。CIK细胞已经被广泛用于血液***恶性肿瘤、实体瘤的治疗中，并取得了一定的临床疗效。CIK细胞基本不会引起移植物抗宿主反应(GVHD)的特性，也让其成为了良好的CAR载体细胞。

目前，CAR-CIK的构建主要是以CD28作为共刺激分子为基础。然而以CD28-CD3ζ为胞内段的CAR-T细胞，会产生更多的不良反应。2017年Juno公司就放弃了其CD28ζCAR，而转向了4-1BBζCAR。即使是已经批准上市的Kite公司的Yescarta(同样以CD28作为共刺激分子)，在临床试验中也出现了严重临床神经毒性而引起广泛关注。如何充分发挥CIK细胞亚群中CD3⁺、CD56⁺的肿瘤抑制杀伤效应，如何控制CIK细胞亚群中CD3⁺CD8⁺的CTL可能引起的细胞因子风暴与神经***毒性，需要我们进一步的研究。

DAP12即DNAX相关蛋白12，为一跨膜分子，以同源二聚体的形式与NKG2D-S分子相连，其胞内区含有免疫受体酪氨酸激活基序(ITAM)，该基序中的酪氨酸在蛋白酪氨酸激酶(PTK)的作用下发生磷酸化后，可被带有SH2结构域的其他PTK(如Syk或ZAPT0)和细胞分子所识别，启动激活相应的信号传导通路。

DNAM-1即CD226，也称为PTA1或TliSA1，约65KDa的跨膜蛋白，分布于NK细胞、血小板、单核细胞如树突状细胞和巨噬细胞、T细胞表面，是一种重要的NK细胞活化受体，能够通过PI-3K与SLP-76等途径刺激NK细胞的细胞因子分泌，也能够促进CD4⁺和CD8⁺T细胞的共刺激作用，并能通过非经典抗原递呈细胞途径促进激活CD8⁺细胞。

目前，CAR-CIK的CAR多以传统的scFv-CD8α(TM)-CD28-CD3ζ或scFv-CD8α(TM)-4-1BB-CD3ζ为基础，增加OX-40、CD27等共刺激分子演变而来。这些CAR在T细胞中已经取得了一定的效果，但是否适合CIK仍未可知。Andreas等发现scFv-Fc-CD28-CD3ζ-OX40的CAR修饰的CD3⁺CD56⁺细胞，虽然能够分泌更多干扰素，但导致了更多的CD56⁺细胞激活诱导性细胞死亡(AICD)，从而减弱了其在体内的抗肿瘤功能。

发明内容

针对现有技术中存在的缺陷，本发明的目的在于提供一种CIK细胞的嵌合抗原受体CAR及其应用。该嵌合抗原受体CAR具有显著降低细胞因子风暴的效果，安全性更高。

一方面，本发明提供一种CIK细胞的嵌合抗原受体CAR，其包括：结合到特异性靶抗原的细胞外抗原结合结构域(也被称为抗原结合结构域或抗原特异性结合结构域，包含scFv)、铰合与跨膜结构域以及细胞内信号传导结构域；

所述细胞内信号传导结构域包括共刺激信号传导结构域(或共刺激结构域)，所述共刺激信号传导结构域含有如下蛋白的胞内段：DAP12和CD226；所述胞内段具体可为1-3个串联；

优选的，所述DAP12的胞内段序列包括SEQ ID No.1的第314-365位氨基酸序列；更优选的，所述DAP12的胞内段序列由SEQ ID No.6的第940-1095位核苷酸序列编码；所述DAP12的胞内段可为2-3个且串联；

优选的，所述CD226的胞内段序列包括SEQ ID No.No.1的第366-431位氨基酸序列；更优选的，所述CD226的胞内段序列由SEQ ID No.6的第1096-1293位核苷酸序列编码；所述CD226的胞内段可为2-3个且串联。

在上述嵌合抗原受体CAR中，所述DAP12的胞内段替换为DAP10的胞内段；优选的，所述DAP10的胞内段序列包括SEQ ID No.3的第312-335位氨基酸序列；更优选的，所述DAP10的胞内段序列由SEQ ID No.8的第934-1005位核苷酸序列编码；所述DAP10的胞内段可为2-3个且串联；

和/或，所述CD226的胞内段可以替换为2B4的胞内段，优选的，所述2B4的胞内段序列包括所述2B4的胞内段敲除包括第三个ITSM(免疫受体酪氨酸转换基序)以后的序列，更优选的，所述2B4的胞内段序列包括SEQ ID No.4的第356-475位氨基酸序列或SEQ ID No.4的第356-419位氨基酸序列，更优选的，所述2B4的胞内段序列由SEQ ID No.9的第1066-1425位核苷酸序列或SEQ ID No.9的第1066-1257位核苷酸序列编码；所述2B4的胞内段可为2-3个且串联。

在上述CAR中，可选的，所述共刺激信号传导结构域还可含有CD28、4-1BB、TLR1、TLR2、TLR3、TLR4、CD27、CD28、OX40、CD30、CD40、PD-1、ICOS、LFA-1、CD2、CD7、LIGHT、NKG2C、B7-H3、CDS、ICAM-1、GITR、BAFFR、HVEM、SLAMF7、NKp80、CD160、CD19、CD4、CD8α、CD8β、IL2Rβ、IL2Rγ、IL7Rα、ITGA4、VLA1、CD49a、ITGA4、IA4、CD49D、ITGA6、VLA-6、CD49f、ITGAD、CD11d、ITGAE、CD103、ITGAL、CD11a、LFA-1、ITGAM、CD11b、ITGAX、CD11c、ITGB1、CD29、ITGB2、CD18、LFA-1、ITGB7、TNFR2、TRANCE/RANKL、DNAM1、SLAMF4、CD84、CD96、CEACAM1、CRTAM、Ly9、CD160、PSGL1、CD100、CD69、SLAMF6、SLAM、BLAME、SELPLG、LTBR、LAT、GADS、SLP-76、PAG/Cbp、NKp44、NKp30、NKp46、NKG2D和CD83中的任一种或至少两种的组合。

在一个实施方式中，CAR包括特异性结合到在肿瘤细胞上表达的靶多肽，例如靶抗原的细胞外抗原结合结构域，结合结构域可以包括拥有特异性识别和结合到生物分子(例如，细胞表面受体或肿瘤蛋白、脂质、多糖或其它细胞表面靶分子或其组分)的能力的任何蛋白质、多肽、寡肽或肽，结合结构域包含兴趣生物分子的任何天然存在的、合成的、半合成的或重组产生的结合配偶体；

进一步的，细胞外结合结构域包括抗体或其抗原结合片段；

抗体是指作为包括至少轻链或重链免疫球蛋白可变区的多肽的结合剂，所述轻链或重链免疫球蛋白可变区特异性识别和结合靶抗原的表位，如肽、脂质、多糖或含有抗原决定簇的核酸，如由免疫细胞识别的核酸。抗体包含抗原结合片段，例如，骆驼Ig(骆驼科抗体或其VHH片段)、Ig NAR、Fab片段、Fab′片段、F(ab)′2片段、F(ab)′3片段、Fv、单链Fv抗体(“scFv”)、bis-scFv、(scFv)2、微抗体、双抗体、三抗体、四抗体、二硫键稳定的Fv蛋白(“dsFv”)以及单结构域抗体(sdAb、纳米抗体)或其其它抗体片段。在优选的实施方式中，结合结构域是scFv。

所述细胞内信号传导结构域将有效CAR结合靶抗原的信息转导到免疫效应细细胞内部以引发效应细胞功能，例如，活化、细胞因子产生、增殖和细胞毒活性，包含向CAR结合的靶细胞释放细胞毒性因子或使用与细胞外CAR结构域进行的抗原结合引发的其它细胞应答。

在一个实施方式中，CAR的所述细胞外抗原结合结构域之后是一个或多个“间隔结构域”，所述间隔结构域是指使抗原结合结构域移动远离效应细胞表面以实现适当的细胞/细胞接触、抗原结合和活化的区。间隔结构域可以源自天然、合成、半合成或重组来源。在某些实施例中，间隔结构域是免疫球蛋白的一部分，包含但不限于一个或多个重链恒定区，例如CH2和CH3。间隔结构域可以包含天然存在的免疫球蛋白铰链区或改变的免疫球蛋白铰链区的氨基酸序列。在一个实施方式中，间隔结构域包括IgG1、IgG4或IgD的CH2和CH3。

在一些实施方式中，CAR在各个结构域之间包括接头残基。“可变区连接序列”是将重链可变区连接到轻链可变区，并且提供与所述两个子结合结构域的相互作用相容的间隔功能的氨基酸序列，使得所得多肽保留与包括相同轻链可变区和重链可变区的抗体相同的靶分子的特异性结合亲和力。在具体实施例中，接头分离一个或多个重链可变结构域或轻链可变结构域、铰链结构域、跨膜结构域、共刺激结构域和/或初级信号传导结构域。在具体实施例中，CAR包括一个、两个，三个、四个或五个或更多个接头。在具体实施例中，接头的长度为约1个氨基酸到约25个氨基酸、约5个氨基酸到约20个氨基酸、或约10个氨基酸到约20个氨基酸或任何中间长度的氨基酸。在一些实施例中，接头的长度为1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个、20个、21个、22个、23个、24个、25或更多个氨基酸。

在上述CAR中，所述细胞内信号传导结构域还包括初级信号传导结构域，所述初级信号传导结构域包括FcRγ、FcRβ、CD3γ、CD3δ、CD3ε、CD3ζ、CD22、CD79a、CD79b和CD66d中的任一种或至少两种的组合，优选，CD3ζ，更优选，SEQ ID No.1的第432-543位氨基酸序列，更优选，由SEQ ID No.6的第1294-1629位核苷酸序列编码。

在上述CAR中，所述铰合与跨膜结构域包含CD8α、CD28、4-1BB、DAP12、DAP10的拓扑结构域和跨膜结构域中的任一种或至少两种，优选，DAP12、或DAP10的拓扑结构域和跨膜结构域；

更优选的，所述DAP12的拓扑结构域和跨膜结构域序列包括SEQ ID No.1的第280-313位氨基酸序列，更优选的，由SEQ ID No.6的第838-939位核苷酸序列编码，

更优选的，所述DAP10的拓扑结构域和跨膜结构域序列包括SEQ ID No.3的第262-311位氨基酸序列，更优选的，由SEQ ID No.8的第784-933位核苷酸序列编码。

所述铰合和跨膜结构域还可以包括其它源自天然、合成、半合成或重组来源的结构域，在一个实施方式中，铰合和跨膜结构域还可以包括或衍生自以下组的一个或多个跨膜区：T细胞受体的α或β链、CD3δ、CD3ε、CD3γ、CD3ζ、CD4、CD5、CD8α、CD9、CD16、CD22、CD27、CD28、CD33、CD37、CD45、CD64、CD80、CD86、CD134、CD137、CD152、CD154以及PD-1。

在上述CAR中，所述细胞外抗原结合结构域针对的特异性靶抗原包括：CD19、CD20、CD22、CD30、CD33、CD123、CD138、CD171、BCMA、ROR1、WT-1、Pr3、erB-B2、MUC1、LeY、PSCA、EGP-40、HER-2、TAG-72、CD44v7/8、MAGE-A1、GD3、CAIX、NY-ESO-1、GD2、EGFRVIII、FAP、α叶酸受体(α-Folate Receptor)、IL-13R-a2、EGP-2、间皮素(Mesothelin)、KDR、VEGF-R2、PSMA、CEA、磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3(GPC3)、IL-13中的任一种或至少两种；优选，CD19，更优选，所述细胞外抗原结合结构域的序列包括SEQ ID No.1的第28-269位氨基酸序列，更优选，由SEQ IDNo.6的第82-807位核苷酸序列编码。

在上述CAR中，在所述细胞外抗原结合结构域的N末端，还包括信号肽，优选的，所述信号肽为DAP12、DAP10、CD8α、或CD28的信号肽，更优选的，所述DAP12的信号肽包括SEQID No.1的第1-27位氨基酸序列，更优选，由SEQ ID No.6的第1-81位核苷酸序列编码，更优选的，所述DAP10的信号肽包括SEQ ID No.3的第1-19位氨基酸序列，更优选，由SEQ IDNo.8的第1-57位核苷酸序列编码，更优选的，所述CD8α的信号肽包括SEQ ID No.2的第1-21位氨基酸序列，更优选，由SEQ ID No.7的第1-63位核苷酸序列编码；

和/或，所述CAR中还包括蛋白标签序列，所述蛋白标签包括MyC、His、GST、HA、Flag、MBP、Avi Tag、SUMO、c-Myc tag中的任一种或至少两种；优选，c-Myc tag；所述蛋白标签序列包括SEQ ID No.1的第270-279位氨基酸序列，更优选的，所述蛋白标签序列由SEQID No.6的第808-837位序列编码，蛋白标签序列可用于检测CAR转染效率；优选的，所述蛋白标签序列位于所述细胞外抗原结合结构域和铰合与跨膜结构域之间；

和/或，在所述细胞内信号传导结构域的氨基酸序列后，还包括如下蛋白的氨基酸序列：自剪切蛋白(P2A、T2A、F2A、和/或IRES)、和细胞因子或***基因；在一个实施方式中，在细胞因子或“***基因”的肽段后，还可连接所述自剪切蛋白，再连接CAR结构；

优选的，所述CAR的氨基酸序列包括：SEQ ID No.1去除第270-279位后的序列、SEQID NO.1、SEQ ID NO.3、SEQ ID No.4去除第420-475位后的序列、SEQ ID NO.4、SEQ IDNo.5去除第400-455位后的序列、或SEQ ID NO.5。

另一方面，本发明还提供了一种核酸分子，编码以上任一所述的CAR，所述核酸分子为DNA或RNA，

优选的，所述核酸分子的序列包括：SEQ ID No.6去除第808-837位后的序列、SEQID No.6、SEQ ID No.8、SEQ ID No.9去除第1258-1425位后的序列、SEQ ID No.9、SEQ IDNo.10去除第1198-1365位后的序列、SEQ ID No.10。

在一些实施方式中，也能利用与所述核酸分子具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％同一性的核酸分子构建以上任一所述CAR；

在一些实施方式中，也可利用密码简并性编码同一氨基酸的不同核酸序列构建以上任一所述CAR。

另一方面，本发明还提供了一种重组载体，其含有所述的核酸分子，所述重组载体为慢病毒载体、逆转录病毒载体、腺病毒载体、腺相关病毒载体、猿猴病毒载体、痘苗病毒载体、仙台病毒载体、EB病毒载体、单纯疱疹病毒载体、睡美人转座子***质粒，优选为慢病毒载体，

具体实施时，所述慢病毒载体为在慢病毒表达载体pELPS-19-BB-z中EF-1α启动子下游的CD19BBζ片段替换为以上任一所述的核酸分子；

所述CD19BBζ片段的核苷酸序列如SEQ ID No.7所示，其编码的CRA的氨基酸序列如SEQ ID No.2所示。

另一方面，本发明还提供了一种重组细胞或重组菌，所述重组细胞或所述重组菌中含有以上任一所述的CAR，或含有以上任一所述的核酸分子，或含有所述的重组载体；

优选的，所述重组细胞为免疫细胞，优选，T细胞，更优选，CIK细胞，更优选，CD3⁺、CD56⁺的CIK细胞；

另一方面，本发明还提供了以上任一所述的CAR、所述的核酸分子、所述的重组载体在制备细胞因子风暴降低的免疫细胞中的应用；优选的，所述细胞因子为IL-6；优选的，所述免疫细胞为T细胞，更优选，CIK细胞，更优选，CD3⁺CD56⁺的CIK细胞。

另一方面，本发明还提供了以上任一所述的CAR、所述的核酸分子、所述的重组载体、或所述的重组细胞或重组菌在制备肿瘤治疗产品中的应用。

本发明的有益效果如下：

实验证明，将DAP12或DAP10作为CAR的铰合与跨膜结构域和部分共刺激信号传导结构域，与DNAM-1(CD226)或2B4等共同构成共刺激信号传导结构域，利用这些共刺激信号分子和CD3ζ来激活免疫细胞尤其是CD3⁺CD56⁺CIK内相关的信号传导通路，对恶性肿瘤细胞进行抑制杀伤，可显著降低细胞因子风暴，提高治疗产品的安全性。

附图说明

图1为表达一种新型CAR的慢病毒载体，其中scFv的靶抗原为CD19。

图2为表达一种传统CAR的慢病毒载体，其中scFv的靶抗原为CD19。

图3为两种CAR-CIK细胞对靶细胞抑制杀伤。

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例1、慢病毒的包装、纯化

将图2所示含有传统CAR结构(命名为CAR-CK，结构为SP-scFv-tag-CD8α-4-1BB-CD3ζ，即位于EF1α启动子下游的CD19BBζ)的慢病毒载体pELPS-19-BB-z(其序列详见专利2017108531905)中的CAR分别替换为表1所示7种不同的新型CAR结构(CAR-1至CAR-7)，获得7种不同的重组慢病毒载体，其中，图1所示为含有CAR-7(结构为SP-scFv-tag-DAP12-DNAM-1(CD226)-CD3ζ，即位于EF1α启动子下游的CD19-12D-ζ)的重组慢病毒载体。

将上述八种不同的重组慢病毒载体分别按照如下方法进行慢病毒包装、纯化，获得八种不同的慢病毒：

1、以10cm培养皿为例，接种HEK293T细胞于含10％胎牛血清DMEM培养基中；待其生长至融合度70-80％，开始包装病毒；

2、吸弃原有培养基，加入50％体积的新鲜培养基，继续孵育；

3、按pELPS(表达新型CAR或传统CAR)：psPAX2：PMD2.0G为8：6：2(4:3:1)，采用钙转法，转染步骤2的细胞；

4、12h后，换液；

5、36h后，收集细胞悬液，经0.44um滤膜滤过后，50000g离心2个小时；

6、收集沉淀，获得表达CAR结构的慢病毒。

表1、不同CAR的组成

表2、表1中各段的序列

表1和表2中，SP代表信号肽序列，TM代表跨膜结构域，tag代表标签序列，-表示不含有，+表示含有，G1代表共刺激信号传导结构域1，G2代表共刺激信号传导结构域2，X代表初级信号传导结构域，No.代表SEQ ID No.。

实施例2、CAR-CIK细胞的获得

一、CIK细胞的获得

1、外周血、脐带血、骨髓，以密度梯度离心法收集单个核细胞；

2、按2×10⁶/ml，将细胞种植于含1000U/ml IFN-γ的X-VIVO 15培养基中；

3、24h后，添加OKT-3、IL-2，使其浓度分别达50-100ng/ml、300-1000U/ml；

4、以后每2-3天，半换液，加入含300-500U/ml IL-2的X-VIVO 15培养基；

5、第3-7天，待CIK细胞亚群至倍数增长期后，开始细胞转染。

二、负载CAR基因的慢病毒分别转染CIK细胞亚群

1、更换培养基，调整细胞密度为0.1-1×10⁶/ml；

2、按MOI＝5-10，分别加入实施例1中获得的八种不同的慢病毒，重悬上清；

3、1000g，室温，离心60min；

4、继续培养24h，换液。

三、CAR-CIK培养与检测

以后每2-3天，半换液；到第21天时，收集细胞悬液，获得7种不同的新型CAR-CIK细胞：CAR-1-CIK、CAR-2-CIK、CAR-3-CIK、CAR-4-CIK、CAR-5-CIK、CAR-6-CIK、和CAR-7-CIK，和1种传统CAR-CIK细胞；FITC-CD3、PE-CD56、PerCP-Cy5.5-c-Myc抗体孵育CAR-7-CIK和CAR-CK-CIK，流式检测CAR结构在不同的CIK细胞亚群中的表达。

结果：表达新型CAR结构与传统CAR结构的慢病毒，转染效率未见明显差异，p>0.05，CAR-7-CIK所代表的新型CAR-CIK的结果见表3。

表3、不同CAR-CIK细胞中各亚群细胞中CAR表达结果

细胞亚群细胞类型	CAR-7-CIK(新型)	CAR-CK-CIK(传统)
			CD3<sup>+</sup>CD56<sup>+</sup>	25.6％±16.3％	27.5％±17.6％
CD3<sup>-</sup>CD56<sup>+</sup>	0	0
			CD3<sup>+</sup>CD56<sup>-</sup>	42.1％±13.9％	46.6％±15.7％

实施例3、不同CAR-CIK细胞对Raji细胞株的杀伤

将实施例2得到的八种CAR-CIK细胞分别按1:1、1:5、1:25(效靶比E:T)分别与靶细胞-Raji细胞(人淋巴瘤细胞)混合培养24h，并设置未经过慢病毒转染的CIK细胞作为对照组，采用荧光素酶定量杀伤效率评估方法，检测CAR-CIK对靶细胞的抑制杀伤能力；其中，CAR-7-CIK的结果见图3；当E:T为1:1、1:5时，CAR-7-CIK所代表的新型CAR-CIK与传统CAR-CIK对于靶细胞的杀伤未见明显差异，CAR-1-CIK、CAR-2-CIK、CAR-3-CIK、CAR-4-CIK、CAR-5-CIK、CAR-6-CIK的结果与CAR-7-CIK的结果无明显差异。

收集E:T为1:1组的细胞上清，利用ELISA法检测IFN-γ、IL-6等细胞因子的释放水平；CAR-7-CIK所代表的新型CAR-CIK结果见表4；新型CAR-CIK的IFN-γ与传统CAR-CIK的IFN-γ无统计学差异，且新型CAR-CIK的细胞因子风暴关键因子IL-6的分泌低于传统CAR-CIK，其安全性更高。

CAR-1-CIK、CAR-2-CIK、CAR-3-CIK、CAR-4-CIK、CAR-5-CIK、CAR-6-CIK的结果与CAR-7-CIK无明显差异。

表4、两种CAR-CIK细胞的细胞因子分泌表

	IL-6<sup>*</sup>	γ-IFN
			CAR-7-CIK(新型)	243.1±74.6pg/ml	4046.9±594.2pg/ml
CAR-CK-CIK(传统)	367.5±68.7pg/ml	3973.5±630.7pg/ml

表4中的*代表差异显著性p<0.05。

本说明书中未作详细描述的内容属于本领域专业技术人员公知的现有技术。以上所述仅为本申请的实施例而已，并不用于限制本申请。对于本领域技术人员来说，本申请可以有各种更改和变化。凡在本申请的精神和原理之内所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本申请的权利要求范围之内。

SEQUENCE LISTING

<110> 济南赛尔生物科技有限公司

<120> 一种CIK细胞的嵌合抗原受体CAR及其应用

<130> JH-CNP190627

<160> 10

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 543

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 1

Met Gly Gly Leu Glu Pro Cys Ser Arg Leu Leu Leu Leu Pro Leu Leu

1 5 10 15

Leu Ala Val Ser Gly Leu Arg Pro Val Gln Ala Asp Ile Gln Met Thr

20 25 30

Gln Thr Thr Ser Ser Leu Ser Ala Ser Leu Gly Asp Arg Val Thr Ile

35 40 45

Ser Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ser Lys Tyr Leu Asn Trp Tyr Gln

50 55 60

Gln Lys Pro Asp Gly Thr Val Lys Leu Leu Ile Tyr His Thr Ser Arg

65 70 75 80

Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr

85 90 95

Asp Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Asn Leu Glu Gln Glu Asp Ile Ala Thr

100 105 110

Tyr Phe Cys Gln Gln Gly Asn Thr Leu Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly

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Thr Lys Leu Glu Ile Thr Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser

130 135 140

Gly Gly Gly Gly Ser Glu Val Lys Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu

145 150 155 160

Val Ala Pro Ser Gln Ser Leu Ser Val Thr Cys Thr Val Ser Gly Val

165 170 175

Ser Leu Pro Asp Tyr Gly Val Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Arg Lys

180 185 190

Gly Leu Glu Trp Leu Gly Val Ile Trp Gly Ser Glu Thr Thr Tyr Tyr

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Asn Ser Ala Leu Lys Ser Arg Leu Thr Ile Ile Lys Asp Asn Ser Lys

210 215 220

Ser Gln Val Phe Leu Lys Met Asn Ser Leu Gln Thr Asp Asp Thr Ala

225 230 235 240

Ile Tyr Tyr Cys Ala Lys His Tyr Tyr Tyr Gly Gly Ser Tyr Ala Met

245 250 255

Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser Glu Gln Lys

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Leu Ile Ser Glu Glu Asp Leu Gln Ala Gln Ser Asp Cys Ser Cys Ser

275 280 285

Thr Val Ser Pro Gly Val Leu Ala Gly Ile Val Met Gly Asp Leu Val

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Leu Thr Val Leu Ile Ala Leu Ala Val Tyr Phe Leu Gly Arg Leu Val

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Pro Arg Gly Arg Gly Ala Ala Glu Ala Ala Thr Arg Lys Gln Arg Ile

325 330 335

Thr Glu Thr Glu Ser Pro Tyr Gln Glu Leu Gln Gly Gln Arg Ser Asp

340 345 350

Val Tyr Ser Asp Leu Asn Thr Gln Arg Pro Tyr Tyr Lys Ile Val Ile

355 360 365

Phe Leu Asn Arg Arg Arg Arg Arg Glu Arg Arg Asp Leu Phe Thr Glu

370 375 380

Ser Trp Asp Thr Gln Lys Ala Pro Asn Asn Tyr Arg Ser Pro Ile Ser

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Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Lys Gln Gly Gln

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Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp

450 455 460

Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro

465 470 475 480

Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp

485 490 495

Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg

500 505 510

Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr

515 520 525

Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg

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<210> 2

<211> 496

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 2

Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu

1 5 10 15

His Ala Ala Arg Pro Asp Ile Gln Met Thr Gln Thr Thr Ser Ser Leu

20 25 30

Ser Ala Ser Leu Gly Asp Arg Val Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Gln

35 40 45

Asp Ile Ser Lys Tyr Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asp Gly Thr

50 55 60

Val Lys Leu Leu Ile Tyr His Thr Ser Arg Leu His Ser Gly Val Pro

65 70 75 80

Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Ser Leu Thr Ile

85 90 95

Ser Asn Leu Glu Gln Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Phe Cys Gln Gln Gly

100 105 110

Asn Thr Leu Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Thr

115 120 125

Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu

130 135 140

Val Lys Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Ala Pro Ser Gln Ser

145 150 155 160

Leu Ser Val Thr Cys Thr Val Ser Gly Val Ser Leu Pro Asp Tyr Gly

165 170 175

Val Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Arg Lys Gly Leu Glu Trp Leu Gly

180 185 190

Val Ile Trp Gly Ser Glu Thr Thr Tyr Tyr Asn Ser Ala Leu Lys Ser

195 200 205

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210 215 220

Met Asn Ser Leu Gln Thr Asp Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys Ala Lys

225 230 235 240

His Tyr Tyr Tyr Gly Gly Ser Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly

245 250 255

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275 280 285

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290 295 300

Gly Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp Ile Tyr

305 310 315 320

Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys Gly Val Leu Leu Leu Ser Leu

325 330 335

Val Ile Thr Leu Tyr Cys Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile

340 345 350

Phe Lys Gln Pro Phe Met Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp

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Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Lys Gln Gly

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435 440 445

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450 455 460

Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala

465 470 475 480

Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg

485 490 495

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<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 3

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Ser Lys Tyr Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asp Gly Thr Val Lys

50 55 60

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65 70 75 80

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325 330 335

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Arg

<210> 4

<211> 587

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 4

Met Gly Gly Leu Glu Pro Cys Ser Arg Leu Leu Leu Leu Pro Leu Leu

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Leu Ala Val Ser Gly Leu Arg Pro Val Gln Ala Asp Ile Gln Met Thr

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35 40 45

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50 55 60

Gln Lys Pro Asp Gly Thr Val Lys Leu Leu Ile Tyr His Thr Ser Arg

65 70 75 80

Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr

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Val Ala Pro Ser Gln Ser Leu Ser Val Thr Cys Thr Val Ser Gly Val

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180 185 190

Gly Leu Glu Trp Leu Gly Val Ile Trp Gly Ser Glu Thr Thr Tyr Tyr

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245 250 255

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260 265 270

Ser Asp Cys Ser Cys Ser Thr Val Ser Pro Gly Val Leu Ala Gly Ile

275 280 285

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290 295 300

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580 585

<210> 5

<211> 567

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 5

Met Ile His Leu Gly His Ile Leu Phe Leu Leu Leu Leu Pro Val Ala

1 5 10 15

Ala Ala Gln Asp Ile Gln Met Thr Gln Thr Thr Ser Ser Leu Ser Ala

20 25 30

Ser Leu Gly Asp Arg Val Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile

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Ser Lys Tyr Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asp Gly Thr Val Lys

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Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Ala Pro Ser Gln Ser Leu Ser

145 150 155 160

Val Thr Cys Thr Val Ser Gly Val Ser Leu Pro Asp Tyr Gly Val Ser

165 170 175

Trp Ile Arg Gln Pro Pro Arg Lys Gly Leu Glu Trp Leu Gly Val Ile

180 185 190

Trp Gly Ser Glu Thr Thr Tyr Tyr Asn Ser Ala Leu Lys Ser Arg Leu

195 200 205

Thr Ile Ile Lys Asp Asn Ser Lys Ser Gln Val Phe Leu Lys Met Asn

210 215 220

Ser Leu Gln Thr Asp Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys Ala Lys His Tyr

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Tyr Tyr Gly Gly Ser Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Ser

245 250 255

Val Thr Val Ser Ser Thr Thr Pro Gly Glu Arg Ser Ser Leu Pro Ala

260 265 270

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275 280 285

Leu Pro Leu Leu Ala Gly Leu Val Ala Ala Asp Ala Val Ala Ser Leu

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Leu Ile Val Gly Ala Val Phe Leu Cys Ala Arg Pro Arg Arg Ser Pro

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Glu Gln Glu Gln Thr Phe Pro Gly Gly Gly Ser Thr Ile Tyr Ser Met

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Ile Gln Ser Gln Ser Ser Ala Pro Thr Ser Gln Glu Pro Ala Tyr Thr

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Leu Tyr Ser Leu Ile Gln Pro Ser Arg Lys Ser Gly Ser Arg Lys Arg

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Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg

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Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu

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Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu

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Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His

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Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg

565

<210> 6

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<212> DNA

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tctctgggag acagagtcac catcagttgc agggcaagtc aggacattag taaatattta 180

aattggtatc agcagaaacc agatggaact gttaaactcc tgatctacca tacatcaaga 240

ttacactcag gagtcccatc aaggttcagt ggcagtgggt ctggaacaga ttattctctc 300

accattagca acctggagca agaagatatt gccacttact tttgccaaca gggtaatacg 360

cttccgtaca cgttcggagg ggggaccaag ctggagatca caggtggcgg tggctcgggc 420

ggtggtgggt cgggtggcgg cggatctgag gtgaaactgc aggagtcagg acctggcctg 480

gtggcgccct cacagagcct gtccgtcaca tgcactgtct caggggtctc attacccgac 540

tatggtgtaa gctggattcg ccagcctcca cgaaagggtc tggagtggct gggagtaata 600

tggggtagtg aaaccacata ctataattca gctctcaaat ccagactgac catcatcaag 660

gacaactcca agagccaagt tttcttaaaa atgaacagtc tgcaaactga tgacacagcc 720

atttactact gtgccaaaca ttattactac ggtggtagct atgctatgga ctactggggc 780

caaggaacct cagtcaccgt ctcctcagaa caaaaactca tctcagaaga ggatctgcag 840

gcccagagcg attgcagttg ctctacggtg agcccgggcg tgctggcagg gatcgtgatg 900

ggagacctgg tgctgacagt gctcattgcc ctggccgtgt acttcctggg ccggctggtc 960

cctcgggggc gaggggctgc ggaggcagcg acccggaaac agcgtatcac tgagaccgag 1020

tcgccttatc aggagctcca gggtcagagg tcggatgtct acagcgacct caacacacag 1080

aggccgtatt acaaaattgt cattttcctt aacagaagga gaaggagaga gagaagagat 1140

ctatttacag agtcctggga tacacagaag gcacccaata actatagaag tcccatctct 1200

accagtcaac ctaccaatca atccatggat gatacaagag aggatattta tgtcaactat 1260

ccaaccttct ctcgcagacc aaagactaga gttagagtga agttcagcag gagcgcagac 1320

gcccccgcgt acaagcaggg ccagaaccag ctctataacg agctcaatct aggacgaaga 1380

gaggagtacg atgttttgga caagagacgt ggccgggacc ctgagatggg gggaaagccg 1440

agaaggaaga accctcagga aggcctgtac aatgaactgc agaaagataa gatggcggag 1500

gcctacagtg agattgggat gaaaggcgag cgccggaggg gcaaggggca cgatggcctt 1560

taccagggtc tcagtacagc caccaaggac acctacgacg cccttcacat gcaggccctg 1620

ccccctcgc 1629

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<212> DNA

<213> 人工序列

<400>7

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ccggacatcc agatgacaca gactacatcc tccctgtctg cctctctggg agacagagtc 120

accatcagtt gcagggcaag tcaggacatt agtaaatatt taaattggta tcagcagaaa 180

ccagatggaa ctgttaaact cctgatctac catacatcaa gattacactc aggagtccca 240

tcaaggttca gtggcagtgg gtctggaaca gattattctc tcaccattag caacctggag 300

caagaagata ttgccactta cttttgccaa cagggtaata cgcttccgta cacgttcgga 360

ggggggacca agctggagat cacaggtggc ggtggctcgg gcggtggtgg gtcgggtggc 420

ggcggatctg aggtgaaact gcaggagtca ggacctggcc tggtggcgcc ctcacagagc 480

ctgtccgtca catgcactgt ctcaggggtc tcattacccg actatggtgt aagctggatt 540

cgccagcctc cacgaaaggg tctggagtgg ctgggagtaa tatggggtag tgaaaccaca 600

tactataatt cagctctcaa atccagactg accatcatca aggacaactc caagagccaa 660

gttttcttaa aaatgaacag tctgcaaact gatgacacag ccatttacta ctgtgccaaa 720

cattattact acggtggtag ctatgctatg gactactggg gccaaggaac ctcagtcacc 780

gtctcctcag aacaaaaact catctcagaa gaggatctga ccacgacgcc agcgccgcga 840

ccaccaacac cggcgcccac catcgcgtcg cagcccctgt ccctgcgccc agaggcgtgc 900

cggccagcgg cggggggcgc agtgcacacg agggggctgg acttcgcctg tgatatctac 960

atctgggcgc ccttggccgg gacttgtggg gtccttctcc tgtcactggt tatcaccctt 1020

tactgcaaac ggggcagaaa gaaactcctg tatatattca aacaaccatt tatgagacca 1080

gtacaaacta ctcaagagga agatggctgt agctgccgat ttccagaaga agaagaagga 1140

ggatgtgaac tgagagtgaa gttcagcagg agcgcagacg cccccgcgta caagcagggc 1200

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ggcctgtaca atgaactgca gaaagataag atggcggagg cctacagtga gattgggatg 1380

aaaggcgagc gccggagggg caaggggcac gatggccttt accagggtct cagtacagcc 1440

accaaggaca cctacgacgc ccttcacatg caggccctgc cccctcgc 1488

<210> 8

<211> 1539

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 8

atgatccatc tgggtcacat cctcttcctg cttttgctcc cagtggctgc agctcaggac 60

atccagatga cacagactac atcctccctg tctgcctctc tgggagacag agtcaccatc 120

agttgcaggg caagtcagga cattagtaaa tatttaaatt ggtatcagca gaaaccagat 180

ggaactgtta aactcctgat ctaccataca tcaagattac actcaggagt cccatcaagg 240

ttcagtggca gtgggtctgg aacagattat tctctcacca ttagcaacct ggagcaagaa 300

gatattgcca cttacttttg ccaacagggt aatacgcttc cgtacacgtt cggagggggg 360

accaagctgg agatcacagg tggcggtggc tcgggcggtg gtgggtcggg tggcggcgga 420

tctgaggtga aactgcagga gtcaggacct ggcctggtgg cgccctcaca gagcctgtcc 480

gtcacatgca ctgtctcagg ggtctcatta cccgactatg gtgtaagctg gattcgccag 540

cctccacgaa agggtctgga gtggctggga gtaatatggg gtagtgaaac cacatactat 600

aattcagctc tcaaatccag actgaccatc atcaaggaca actccaagag ccaagttttc 660

ttaaaaatga acagtctgca aactgatgac acagccattt actactgtgc caaacattat 720

tactacggtg gtagctatgc tatggactac tggggccaag gaacctcagt caccgtctcc 780

tcaacgactc caggagagag atcatcactc cctgcctttt accctggcac ttcaggctct 840

tgttccggat gtgggtccct ctctctgccg ctcctggcag gcctcgtggc tgctgatgcg 900

gtggcatcgc tgctcatcgt gggggcggtg ttcctgtgcg cacgcccacg ccgcagcccc 960

gcccaagaag atggcaaagt ctacatcaac atgccaggca ggggcattgt cattttcctt 1020

aacagaagga gaaggagaga gagaagagat ctatttacag agtcctggga tacacagaag 1080

gcacccaata actatagaag tcccatctct accagtcaac ctaccaatca atccatggat 1140

gatacaagag aggatattta tgtcaactat ccaaccttct ctcgcagacc aaagactaga 1200

gttagagtga agttcagcag gagcgcagac gcccccgcgt acaagcaggg ccagaaccag 1260

ctctataacg agctcaatct aggacgaaga gaggagtacg atgttttgga caagagacgt 1320

ggccgggacc ctgagatggg gggaaagccg agaaggaaga accctcagga aggcctgtac 1380

aatgaactgc agaaagataa gatggcggag gcctacagtg agattgggat gaaaggcgag 1440

cgccggaggg gcaaggggca cgatggcctt taccagggtc tcagtacagc caccaaggac 1500

acctacgacg cccttcacat gcaggccctg ccccctcgc 1539

<210> 9

<211> 1761

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 9

atggggggac ttgaaccctg cagcaggctc ctgctcctgc ctctcctgct ggctgtaagt 60

ggtctccgtc ctgtccaggc cgacatccag atgacacaga ctacatcctc cctgtctgcc 120

tctctgggag acagagtcac catcagttgc agggcaagtc aggacattag taaatattta 180

aattggtatc agcagaaacc agatggaact gttaaactcc tgatctacca tacatcaaga 240

ttacactcag gagtcccatc aaggttcagt ggcagtgggt ctggaacaga ttattctctc 300

accattagca acctggagca agaagatatt gccacttact tttgccaaca gggtaatacg 360

cttccgtaca cgttcggagg ggggaccaag ctggagatca caggtggcgg tggctcgggc 420

ggtggtgggt cgggtggcgg cggatctgag gtgaaactgc aggagtcagg acctggcctg 480

gtggcgccct cacagagcct gtccgtcaca tgcactgtct caggggtctc attacccgac 540

tatggtgtaa gctggattcg ccagcctcca cgaaagggtc tggagtggct gggagtaata 600

tggggtagtg aaaccacata ctataattca gctctcaaat ccagactgac catcatcaag 660

gacaactcca agagccaagt tttcttaaaa atgaacagtc tgcaaactga tgacacagcc 720

atttactact gtgccaaaca ttattactac ggtggtagct atgctatgga ctactggggc 780

caaggaacct cagtcaccgt ctcctcacag gcccagagcg attgcagttg ctctacggtg 840

agcccgggcg tgctggcagg gatcgtgatg ggagacctgg tgctgacagt gctcattgcc 900

ctggccgtgt acttcctggg ccggctggtc cctcgggggc gaggggctgc ggaggcagcg 960

acccggaaac agcgtatcac tgagaccgag tcgccttatc aggagctcca gggtcagagg 1020

tcggatgtct acagcgacct caacacacag aggccgtatt acaaatggag gagaaagagg 1080

aaggagaagc agtcagagac cagtcccaag gaatttttga caatttacga agatgtcaag 1140

gatctgaaaa ccaggagaaa tcacgagcag gagcagactt ttcctggagg ggggagcacc 1200

atctactcta tgatccagtc ccagtcttct gctcccacgt cacaagaacc tgcatataca 1260

ttatattcat taattcagcc ttccaggaag tctggatcca ggaagaggaa ccacagccct 1320

tccttcaata gcactatcta tgaagtgatt ggaaagagtc aacctaaagc ccagaaccct 1380

gctcgattga gccgcaaaga gctggagaac tttgatgttt attccagagt gaagttcagc 1440

aggagcgcag acgcccccgc gtacaagcag ggccagaacc agctctataa cgagctcaat 1500

ctaggacgaa gagaggagta cgatgttttg gacaagagac gtggccggga ccctgagatg 1560

gggggaaagc cgagaaggaa gaaccctcag gaaggcctgt acaatgaact gcagaaagat 1620

aagatggcgg aggcctacag tgagattggg atgaaaggcg agcgccggag gggcaagggg 1680

cacgatggcc tttaccaggg tctcagtaca gccaccaagg acacctacga cgcccttcac 1740

atgcaggccc tgccccctcg c 1761

<210> 10

<211> 1701

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 10

atgatccatc tgggtcacat cctcttcctg cttttgctcc cagtggctgc agctcaggac 60

atccagatga cacagactac atcctccctg tctgcctctc tgggagacag agtcaccatc 120

agttgcaggg caagtcagga cattagtaaa tatttaaatt ggtatcagca gaaaccagat 180

ggaactgtta aactcctgat ctaccataca tcaagattac actcaggagt cccatcaagg 240

ttcagtggca gtgggtctgg aacagattat tctctcacca ttagcaacct ggagcaagaa 300

gatattgcca cttacttttg ccaacagggt aatacgcttc cgtacacgtt cggagggggg 360

accaagctgg agatcacagg tggcggtggc tcgggcggtg gtgggtcggg tggcggcgga 420

tctgaggtga aactgcagga gtcaggacct ggcctggtgg cgccctcaca gagcctgtcc 480

gtcacatgca ctgtctcagg ggtctcatta cccgactatg gtgtaagctg gattcgccag 540

cctccacgaa agggtctgga gtggctggga gtaatatggg gtagtgaaac cacatactat 600

aattcagctc tcaaatccag actgaccatc atcaaggaca actccaagag ccaagttttc 660

ttaaaaatga acagtctgca aactgatgac acagccattt actactgtgc caaacattat 720

tactacggtg gtagctatgc tatggactac tggggccaag gaacctcagt caccgtctcc 780

tcaacgactc caggagagag atcatcactc cctgcctttt accctggcac ttcaggctct 840

tgttccggat gtgggtccct ctctctgccg ctcctggcag gcctcgtggc tgctgatgcg 900

gtggcatcgc tgctcatcgt gggggcggtg ttcctgtgcg cacgcccacg ccgcagcccc 960

gcccaagaag atggcaaagt ctacatcaac atgccaggca ggggctggag gagaaagagg 1020

aaggagaagc agtcagagac cagtcccaag gaatttttga caatttacga agatgtcaag 1080

gatctgaaaa ccaggagaaa tcacgagcag gagcagactt ttcctggagg ggggagcacc 1140

atctactcta tgatccagtc ccagtcttct gctcccacgt cacaagaacc tgcatataca 1200

ttatattcat taattcagcc ttccaggaag tctggatcca ggaagaggaa ccacagccct 1260

tccttcaata gcactatcta tgaagtgatt ggaaagagtc aacctaaagc ccagaaccct 1320

gctcgattga gccgcaaaga gctggagaac tttgatgttt attccagagt gaagttcagc 1380

aggagcgcag acgcccccgc gtacaagcag ggccagaacc agctctataa cgagctcaat 1440

ctaggacgaa gagaggagta cgatgttttg gacaagagac gtggccggga ccctgagatg 1500

gggggaaagc cgagaaggaa gaaccctcag gaaggcctgt acaatgaact gcagaaagat 1560

aagatggcgg aggcctacag tgagattggg atgaaaggcg agcgccggag gggcaagggg 1620

cacgatggcc tttaccaggg tctcagtaca gccaccaagg acacctacga cgcccttcac 1680

atgcaggccc tgccccctcg c 1701

Claims

1.一种CIK细胞的嵌合抗原受体CAR，其特征在于，其包括：结合到特异性靶抗原的细胞外抗原结合结构域、铰合与跨膜结构域以及细胞内信号传导结构域；

所述细胞内信号传导结构域包括共刺激信号传导结构域，所述共刺激信号传导结构域含有如下蛋白的胞内段：DAP12和CD226；

所述DAP12的胞内段序列为SEQ ID No.1的第314-365位氨基酸序列；

所述CD226的胞内段序列为SEQ ID No. No.1的第366-431位氨基酸序列；

所述细胞内信号传导结构域还包括初级信号传导结构域；

所述初级信号传导结构域为CD3ζ；

所述铰合与跨膜结构域为DAP12的拓扑结构域和跨膜结构域；

所述DAP12的拓扑结构域和跨膜结构域序列为SEQ ID No.1的第280-313位氨基酸序列；

所述细胞外抗原结合结构域所针对的特异性靶抗原为CD19；

在所述细胞外抗原结合结构域的N末端，还包括信号肽；

所述信号肽为DAP12的信号肽；所述DAP12的信号肽为SEQ ID No.1的第1-27位氨基酸序列。

2.一种CIK细胞的嵌合抗原受体CAR，其特征在于，其包括：结合到特异性靶抗原的细胞外抗原结合结构域、铰合与跨膜结构域以及细胞内信号传导结构域；

所述细胞内信号传导结构域包括共刺激信号传导结构域，所述共刺激信号传导结构域含有如下蛋白的胞内段：DAP10和2B4；

所述DAP10的胞内段序列为SEQ ID No.3的第312-335位氨基酸序列；

所述2B4的胞内段序列为SEQ IDNo.4的第356-475位氨基酸序列或SEQ ID No.4的第356-419位氨基酸序列；

所述细胞内信号传导结构域还包括初级信号传导结构域；

所述初级信号传导结构域为CD3ζ；

所述铰合与跨膜结构域为DAP10的拓扑结构域和跨膜结构域；

所述DAP10的拓扑结构域和跨膜结构域序列为SEQ ID No.3的第262-311位氨基酸序列；

所述细胞外抗原结合结构域所针对的特异性靶抗原为CD19；

在所述细胞外抗原结合结构域的N末端，还包括信号肽；

所述信号肽为DAP10的信号肽；所述DAP10的信号肽为SEQ ID No.3的第1-19位氨基酸序列。

3.根据权利要求1或2所述的CAR，其特征在于，所述CD3ζ为SEQ ID No.1的第432-543位氨基酸序列。

4.根据权利要求1或2所述的CAR，其特征在于，所述细胞外抗原结合结构域的序列为SEQ ID No.1的第28-269位氨基酸序列。

5.根据权利要求1或2所述的CAR，其特征在于，所述CAR中还包括蛋白标签序列，所述蛋白标签包括MyC、His、GST、HA、Flag、MBP、Avi Tag、SUMO、c-Myc tag中的任一种或至少两种。

6.根据权利要求5所述的CAR，其特征在于，所述蛋白标签为c-Myc tag。

7.根据权利要求5所述的CAR，其特征在于，所述蛋白标签序列位于所述细胞外抗原结合结构域和所述铰合与跨膜结构域之间。

8.根据权利要求1或2所述的CAR，其特征在于，在所述细胞内信号传导结构域的编码序列后，还包括如下蛋白的编码序列：自剪切蛋白、和细胞因子或***基因。

9.根据权利要求1或2所述的CAR，其特征在于，所述CAR的氨基酸序列为：SEQ ID No.1去除第270-279位后的序列，SEQ ID NO.1，SEQ ID NO.3，SEQ ID No.4去除第420-475位后的序列，SEQ ID NO.4，SEQ ID No.5去除第400-455位后的序列，或SEQ ID NO.5。

10.一种核酸分子，编码权利要求1-9中任一所述的CAR。

11.根据权利要求10所述的核酸分子，其特征在于，所述CAR的DAP12的胞内段序列由SEQ ID No. 6的第940-1095位核苷酸序列编码。

12.根据权利要求10所述的核酸分子，其特征在于，所述CAR的CD226的胞内段序列由SEQ ID No. 6的第1096-1293位核苷酸序列编码。

13.根据权利要求10所述的核酸分子，其特征在于，所述CAR的CD3ζ序列由SEQ ID No.6的第1294-1629位核苷酸序列编码。

14.根据权利要求10所述的核酸分子，其特征在于，所述CAR的细胞外抗原结合结构域序列由SEQ ID No.6的第82-807位核苷酸序列编码。

15.根据权利要求10所述的核酸分子，其特征在于，所述CAR的DAP12的信号肽由SEQ IDNo.6的第1-81位核苷酸序列编码。

16.根据权利要求10所述的核酸分子，其特征在于，所述CAR的DAP10的胞内段序列由SEQ ID No.8的第934-1005位核苷酸序列编码。

17.根据权利要求10所述的核酸分子，其特征在于，所述CAR的2B4的胞内段序列由SEQID No.9的第1066-1425位核苷酸序列或SEQ ID No.9的第1066-1257位核苷酸序列编码。

18.根据权利要求10所述的核酸分子，其特征在于，所述CAR的DAP10的拓扑结构域和跨膜结构域序列由SEQ ID No.8的第784-933位核苷酸序列编码。

19.根据权利要求10所述的核酸分子，其特征在于，所述CAR的DAP10的信号肽由SEQ IDNo.8的第1-57位核苷酸序列编码。

20.根据权利要求10所述的核酸分子，其特征在于，所述核酸分子的序列为：SEQ IDNo.6去除第808-837位后的序列，SEQ ID No.6，SEQ ID No.8，SEQ ID No.9去除第1258-1425位后的序列，SEQ ID No.9，SEQ ID No.10去除第1198-1365位后的序列，或SEQ IDNo.10。

21.一种重组载体，其特征在于，其含有权利要求10-20中任一所述的核酸分子，所述重组载体为逆转录病毒载体、腺病毒载体、腺相关病毒载体、猿猴病毒载体、痘苗病毒载体、仙台病毒载体、EB病毒载体、单纯疱疹病毒载体、睡美人转座子***、质粒。

22.根据权利要求21所述的重组载体，其特征在于，所述重组载体为慢病毒载体。

23.一种重组细胞或重组菌，其特征在于：所述重组细胞或所述重组菌中含有权利要求1-9中任一所述的CAR，或含有权利要求10-20中任一所述的核酸分子，或含有权利要求21或22所述的重组载体。

24.根据权利要求23所述的重组细胞或重组菌，其特征在于，所述重组细胞为免疫细胞。

25.根据权利要求24所述的重组细胞或重组菌，其特征在于，所述重组细胞为T细胞。

26.根据权利要求25所述的重组细胞或重组菌，其特征在于，所述重组细胞为CIK细胞。

27.根据权利要求26所述的重组细胞或重组菌，其特征在于，所述重组细胞为CD3⁺CD56⁺的CIK细胞。

28.权利要求1-9中任一所述的CAR、权利要求10-20中任一所述的核酸分子、权利要求21或22所述的重组载体、或权利要求23-27中任一所述的重组细胞或重组菌在制备肿瘤治疗产品中的应用。