CN107858352B - 一种shRNA-cluster序列及其表达载体和用途 - Google Patents

一种shRNA-cluster序列及其表达载体和用途 Download PDF

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Abstract

本发明提供一种shRNA‑cluster序列，本发明还提供了一种表达载体，所述表达载体表达上述所述的shRNA‑cluster序列和CAR分子，本发明还提供了它们的用途。本发明通过miRNA‑cluster来源的序列特异性下调PD‑1，Tim‑3，Lag‑3三个受体的表达或下调PD‑1受体表达。本发明在利用CAR分子改造后的T细胞的同时抑制其表面多个抑制性受体的表达，从而增强其拮抗实体肿瘤微环境的抑制性，进而强有力地介导对肿瘤的杀伤，能更好的用于抗实体肿瘤免疫治疗。

Description

一种shRNA-cluster序列及其表达载体和用途
技术领域
本发明涉及一种shRNA-cluster序列及其表达载体和用途。
背景技术
自CAR-T免疫技术在2011年针对CD19抗原的急性淋巴型白血病的临床试验取得成果并在2013年被Science杂志评选为当年十大科技突破之首开始，该技术获得的从科学界到金融界一致的好评。
中国每年诊断的新发肿瘤患者超过300万人，多数肿瘤术后复发的概率超过50％，中位生存期不足5年，当前的传统治疗手段在面对大多数难治、复发的肿瘤时疗效捉襟见肘，研发可特异性浸润并有效拮抗实体肿瘤微环境进而介导对其的有效杀伤的CAR-T细胞具备重要的意义。相对于CAR-T细胞在血液型肿瘤取得的***成果，CAR-T细胞在针对实体肿瘤的I期临床试验个体差异性极大，只有少量成功的案例，解决CAR-T对实体肿瘤的浸润与避免过早衰竭是攻克实体肿瘤细胞免疫疗法的关键。
基于实体肿瘤的免疫疗法的发展，科学家研发了大量可特异性识别实体肿瘤表面抗原的单抗类药物，这些蛋白类药物为针对实体肿瘤的CAR-T免疫细胞疗法的研发提供了保障，例如用于治疗Her-2阳性结肠癌、卵巢癌的单抗类药物Trastuzumab(Herceptin)自2010年即被开发为可特异性识别并杀伤Her-2阳性肿瘤的CAR-T免疫细胞，用于治疗EGFR阳性的多种肿瘤的尼妥珠单抗、西妥昔单抗、帕尼单抗均被开发为相关scFv为膜外域的CAR-T免疫细胞并开展了大量的临床试验。然而，除了少数取得了良好的预后效果，大多数针对实体肿瘤的临床试验结果并不理想，利用CAR-T免疫细胞疗法清除患者体内的实体瘤存在广泛的争议。除淋巴瘤之外，在利用对IL13Rα2抗原特异性CAR-T细胞治疗一位50岁的脑胶质瘤的患者的临床试验中，临床医生在超过220天对患者的肿瘤部位以及颅内共计开展了16次细胞回输后终于观察到肿瘤的消失。多个团队利用当前的CAR-T免疫细胞疗法在清除胰腺癌、***癌等实体肿瘤的临床试验，证实了相关CAR-T细胞的安全性以及对肿瘤细胞有限的杀伤。究其原因，肿瘤微环境的抑制性使得CAR-T细胞无法像可溶性的单抗药物一样抑制并杀伤肿瘤细胞，因此针对实体肿瘤的CAR-T技术的研发的重点应偏向于增强CAR-T细胞对实体肿瘤的浸润能力以及对肿瘤微环境中低氧条件的耐受能力。因此设计能够充分浸润肿瘤微环境，长期维持自我更新同时耐受低氧环境，进一步增强对实体肿瘤的杀伤并在体内持续存在行使免疫监视功能的下一代CAR-T免疫细胞技术是利用免疫细胞疗法攻克各种实体肿瘤的关键。
发明内容
本发明的目的在于，提供一种shRNA-cluster序列，本发明还提供了一种表达载体，所述表达载体表达上述所述的shRNA-cluster序列和CAR分子，本发明还提供了它们的用途。
为实现上述目的，本发明所采取的技术方案：一种shRNA-cluster序列，所述shRNA-cluster序列的核苷酸序列如SEQ ID NO:1或如SEQ ID NO:2所示。本发明通过miRNA-cluster来源的序列特异性下调PD-1，Tim-3，Lag-3三个受体的表达或下调PD-1受体表达。
本发明提供了一种表达载体，所述表达载体是将如SEQ ID NO:1或如SEQ ID NO:2所示的序列，以及CAR分子的编码序列连接到基础载体上而得的；所述表达载体表达上述所述的shRNA-cluster序列和CAR分子。将如SEQ ID NO:1所示的序列，以及CAR分子的编码序列连接到基础载体上而得的表达载体称为PTL-CAR分子；将如SEQ ID NO:2所示的序列，以及CAR分子的编码序列连接到基础载体上而得的表达载体称为P-CAR分子，所述如SEQ IDNO:1或如SEQ ID NO:2所示的序列和CAR分子由两个不同的启动子分别驱动，CAR分子可特异性识别靶向的抗原。P-CAR分子的结构如图1中的上图所示；PTL-CAR分子的结构如图1中的下图所示。
优选地，所述基础载体为慢病毒载体。
本发明提供了一种改造的CAR-T细胞，所述T细胞是将上述所述的表达载体转入CD8+T细胞中而得的。PTL-CAR分子改造的CD8+T细胞称为PTL-CAR-T细胞，P-CAR分子改造的CD8+T细胞称为P-CAR-T细胞。经体外长时间培养，PTL-CAR改造的CD8+T细胞介导表达Her2细胞系SK-OV3的杀伤及分泌细胞因子的效果更加明显。
本发明提供了一种上述所述的改造的CAR-T细胞的制备方法，所述方法包括以下步骤：
(1)收集外周血单个核细胞并分离富集其中的CD8+T细胞，采用anti-CD3、anti-CD28和IL-2激活所述CD8+T细胞；
(2)CD8+T细胞激活48小时后，以1ml/1×106细胞的比例加入如权利要求3所述的慢病毒表达载体进行感染，同时加入聚凝胺溶液，离心后继续培养；8～12小时后，进行第二轮感染，得到改造的CAR-T细胞。
优选地，所述anti-CD3的使用浓度为1μg/mL，所述anti-CD28的使用浓度为1μg/mL，所述IL-2的使用浓度为10ng/mL。
优选地，所述聚凝胺溶液的浓度为8μg/mL。
本发明提供了一种扩增权利要求4所述的改造的CAR-T细胞的方法，包括如下步骤：(1)将改造的CAR-T细胞以新鲜培养基重悬细胞，并加入IL-2和IL-7保持细胞状态；(2)改造后的第3天和第5天，根据细胞状态和增殖情况，对细胞添加完全RMPI1640培养基，细胞浓度维持在2×106/ml，并补充IL-2和IL-7，继续培养并及时传代，进一步扩增细胞。
优选地，其特征在于，所述IL-2的浓度为10ng/mL，IL-7的浓度为10ng/mL。
本发明提供了上述所述的shRNA-cluster序列在制备清除实体肿瘤细胞的制剂中的应用。
本发明提供了上述所述的表达载体或如权利要求4所述的改造的CAR-T细胞在制备清除实体肿瘤细胞的制剂中的应用。
本发明提供了一种改善CAR-T细胞功能的方法，所述方法是通过shRNA下调CAR-T细胞的PD-1，Tim-3和Lag-3三个受体表达，或者下调CAR-T细胞的PD-1受体表达。
本发明提供了PD-1受体、或者PD-1，Tim-3和Lag-3三个受体联合作为靶点在改善CAR-T细胞功能的应用。
本发明提供了下调CAR-T细胞的PD-1，Tim-3和Lag-3三个受体表达的shRNA或者下调CAR-T细胞的PD-1受体表达的shRNA在改善CAR-T细胞功能的应用。
本发明的有益效果在于：
本发明中全新改造的PTL-CAR-T细胞在治疗SK-OV3荷瘤的NSG小鼠中，本发明中全新改造的PTL-CAR-T细胞相比已报道的CAR-T细胞，PTL-CAR-T细胞治疗组小鼠肿瘤的大小明显小于CAR-T细胞，且PTL-CAR-T细胞治疗组小鼠生存率明显优于CAR-T细胞。PTL-CAR-T细胞可以被特异性激活并大量分泌细胞毒性相关的细胞因子IFN-γ进而强有力地介导肿瘤的坏死。
本发明在治疗CD19阳性Raji细胞荷瘤的NSG小鼠中，相比已报道的CAR-T细胞，PTL-CAR-T细胞介导表达CD19阳性的实体肿瘤的坏死效果更加明显，相关治疗组小鼠肿瘤的大小明显小于CAR-T细胞。
附图说明
图1为构建的PTL-CAR分子的结构示意图。
图2为pLKO-IRES-GFP慢病毒载体结构示意图。
图3为PTL–Her2-CAR抑制体外长期培养CD8+CAR-T细胞的抑制性受体的表达。
图4为PTL-Her2-CAR和P-Her2-CAR改造的CD8+T细胞分别与Her2阳性靶细胞系混合后分泌IFN-γ的比较。
图5为PTL-Her2-CAR和P-CAR改造的CD8+T细胞分别与Her2阳性靶细胞系混合后杀伤效果的比较。
图6为PTL-Her2-CAR-T和Her2-CAR改造的CD8+T细胞治疗后，SK-OV3荷瘤小鼠肿瘤的大小以及小鼠生存率。
图7为PTL-Her2-CAR-T和Her2-CAR改造的CD8+T细胞治疗后，SK-OV3荷瘤小鼠肿瘤中浸润的改造CD8+T细胞以及释放IFN-γ的能力。
图8为PTL-Her2-CAR-T和Her2-CAR改造的CD8+T细胞治疗后，SK-OV3荷瘤小鼠正常器官浸润免疫细胞。
图9为PTL-CD19-CAR-T和CD19-CAR改造的CD8+T细胞治疗后，Raji荷瘤小鼠肿瘤的大小的变化。
具体实施方式
下面结合说明书附图和具体实施例对本发明作出进一步地详细阐述，所述实施例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。下述实施例中所使用的试验方法如无特殊说明，均为常规方法；所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，为可从商业途径得到的试剂和材料。
实施例1
一种与CAR分子共同转录的shRNA-cluster序列，通过miRNA-cluster来源的序列特异性下调PD-1，Tim-3，Lag-3三个受体的表达或下调PD-1受体表达的技术，其核酸核苷酸序列如SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2所示。SEQ ID NO：1所示的shRNA-cluster分子的结构如图1中的下图所示；SEQ ID NO：2所示的shRNA-cluster分子的结构如图1中的上图所示。
实施例2
一、shRNA-cluster-CAR分子重组pLKO.3G慢病毒载体：按照SEQ ID NO：1或SEQ IDNO：2所示序列合成shRNA-cluster，合成的shRNA-cluster通过EcoR I和Pac I双酶切，***pLKO.3G慢病毒载体中(见图2)，酶切、连接的具体步骤参考本领域的常规方法；通过同源重组的分子克隆手段将质粒中GFP蛋白替换得到CAR分子，重组后得到共转录shRNA-cluster和CAR序列的的pLKO.3G慢病毒载体。
将一个生长状态的HEK293T细胞平均铺于用多聚赖氨酸处理的10cm培养皿中(细胞密度约为6.5×104/cm2)，要求细胞呈单个均匀分布。培养约24小时后，细胞汇合度应接近80％，此时各皿均以12ml完全培养基换液，同时加入3.75ul氯喹(100mM，4000×)。换液后按表1配制磷酸钙-DNA混合液，颠倒数次混匀后静置1分钟，然后以3ml/皿迅速加入各皿细胞培养液中，边加边摇匀，逐滴快速加入。
表1为磷酸钙-DNA混合液体系配方
Figure BDA0001462279670000051
Figure BDA0001462279670000061
转染后12小时，细胞汇合度应接近100％，此时各皿均以12ml新鲜培养基换液，同时加入90μl丁酸钠(1M，100×)。转染后约48小时，收集全部34ml HEK293T细胞上清液，以0.45μm的过滤器过滤后装入50ml离心管，按下表2比例加入PEG-NaCl-PBS混合液，颠倒混匀后于4℃放置1.5小时，期间每20～30分钟混匀一次或颠倒混匀后于4℃放置过夜。
表2
Figure BDA0001462279670000062
将混合液于4℃，7000g离心10分钟，管壁上可见白色沉淀，小心去除全部上清液，加入适量体积(300ul～3ml)的新鲜培养基，轻轻摇晃使沉淀溶解，即得到shRNA-cluster-CAR分子重组的病毒浓缩液，立即使用或分装后于-80℃保存。
二、shRNA-cluster-CAR在CD8+T细胞中的表达情况：从外周血样本中分离外周血单个核细胞，然后通过偶联生物素的CD8抗体分离富集CD8+T淋巴细胞，计数，离心。用RPMI1640完全培养基重悬，然后按2×106/ml的细胞浓度，均匀铺至细胞培养板中。利用anti-CD3(终浓度为1μg/ml)、anti-CD28(终浓度为1μg/ml)抗体和IL2(终浓度为10ng/ml)对细胞进行刺激，作用48小时后，收集细胞，用于假病毒的感染。
取适量生长状态良好的目标细胞悬液，放入离心管中300g离心5分钟。弃去上清液，以1ml/1×106细胞的比例加入假病毒浓缩液，同时加入终浓度8μg/ml的Polybrene，轻轻吹打混匀。将细胞悬液移入培养皿，37℃、350×g离心90分钟，离心结束后，放回培养箱中继续培养。约8～12小时后，进行第二轮感染，步骤同上，约12小时后，离心换液，用PBS洗去培养基中的病毒，以新鲜培养基重悬细胞，并加入终浓度均为10ng/ml的IL-2和IL-7保持细胞状态。继续培养并及时传代，进一步扩增细胞。感染后的第3天，根据细胞状态和增殖情况，对细胞添加完全RMPI1640培养基，细胞浓度维持在2×106/ml。并补充IL-2和IL-7，终浓度均为10ng/ml。感染后的第5天，按照第3天的流程继续扩增细胞。并利用流式检测荧光蛋白鼠源Fab的表达，确定shRNA-cluster-CAR的下调体外长期培养的CD8+T细胞抑制性受体表达的效率(图3)。感染后的第5天，细胞用于后续实验检测或继续培养以及冻存。此后，为了方便起见，由SEQ ID NO：1构建的shRNA-cluster-CAR质粒以下实验均称其为PTL-CAR，由SEQ ID NO：2构建的shRNA-cluster-CAR-T质粒以下实验均称其为P-CAR。
实施例3
一、由SEQ ID NO：1构建并靶向Her2的shRNA-cluster-CAR质粒以下实验均称其为PTL-Her2-CAR，由SEQ ID NO：2构建并靶向Her2的shRNA-cluster-CAR-T质粒以下实验均称其为P-Her2-CAR。
PTL-Her2-CAR和P-Her2CAR改造的CD8+T细胞体外扩增培养后，分别与靶细胞系混合后释放IFN-γ效果的比较：以同样的条件转导CD8+T淋巴细胞，然后与表达Her2蛋白的靶细胞系(SK-OV3)混合于预包被IFN-γ抗体的ELIspot板，通过检测其对靶细胞分泌IFN-γ的能力探究抑制性受体的表达与Her2-CAR-T细胞功能之间的关系。结果显示PTL-Her2-CAR-T细胞响应靶细胞的刺激分泌IFN-γ的能力强于P-CAR-T细胞，即多抑制性受体的下调对Her2-CAR-T细胞功能的提升强于单独抑制性受体下调对Her2-CAR-T细胞功能的提升(图4)。
二、杀伤效果的比较：我们将转导了空载以及PTL-Her2-CAR，P-Her2-CAR分子的CD8+T效应细胞在体外扩增培养，在体外培养第5天、10天、15天、20天、25天五个时间点分别冻存等量的细胞，于第五批细胞冻存后同时复苏后并培养24小时，而后三种效应细胞分别与靶细胞系以8：1的比例混合培养24小时，通过检测乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase,LDH)的释放的方法，检测Her2-CAR-T淋巴细胞的杀伤活性。实验结果显示：体外培养五个时间点的对照效应细胞Mock(空载转导的CD8+T淋巴细胞)对靶细胞细胞系没有杀伤效果，在体外培养5天到15天的三个时间点，PTL-Her2-CAR-T细胞对靶细胞的杀伤与P-Her2-CAR-T细胞无显著性差异，且对靶细胞的杀伤随着培养时间的增强逐渐降低。在体外培养20天、25天两个时间点，两种效应细胞对靶细胞的杀伤效力继续降低，P-Her2-CAR-T细胞对靶细胞的杀伤效力几乎消失，PTL-Her2-CAR-T细胞对靶细胞依旧具备有限的杀伤能力，两者对靶细胞的杀伤存在显著性差异(图5)。
实施例4
一、PTL-Her2-CAR-T细胞治疗的溶瘤效果与小鼠的生存率：6～8周的NSG老鼠21只皮下接种含有40％Corning公司高浓度基底膜基质胶的SK-OV3细胞1×106个/只，将荷瘤NSG小鼠随机分成三组：PTL-Her2-CAR-T细胞治疗组、Her2-CAR-T细胞治疗组、Mock-T细胞治疗对照组，每组7只。待肿瘤达到500mm3后，通过尾静脉回输的方式，每只老鼠过继免疫细胞5×105个。实验结果显示，在过继免疫细胞后，尾静脉过继了PTL-Her2-CAR-T细胞的实验组荷瘤小鼠肿瘤的大小明显小于过继Her2-CAR-T细胞的实验组小鼠以及过继了Mock-T细胞的对照组小鼠，同时PTL-Her2-CAR-T细胞治疗组小鼠的生存率也明显高于Her2-CAR-T细胞治疗组小鼠以及Mock-T细胞治疗组小鼠，实验结果证实PTL-Her2-CAR-T对Her2阳性肿瘤的具有显著而特异性的杀伤，并可有效提高小鼠的生存率(图6)。
二、PTL-Her2-CAR-T细胞对实体肿瘤的浸润与有效杀伤：制备肿瘤组织的冰冻切片并通过间接免疫荧光开展实验。我们以IFN-γ作为评估CAR-T细胞功能的标志物。冰冻切片结果显示，PTL-Her2-CAR-T细胞治疗组小鼠的肿瘤中浸润的CAR-T细胞的数量明显多于Her2-CART细胞的实验组小鼠以及对照组小鼠的肿瘤组织，且在肿瘤坏死区域的边界，PTL-Her2-CAR-T更趋向在肿瘤坏死的边界区域富集，且分泌大量IFN-γ进一步介导肿瘤组织的坏死(图7)。
三、PTL-Her2-CAR-T细胞安全性评价：免疫细胞由于一系列的“刹车”基因的表达受到抑制，相关CAR-T细胞一旦脱靶将带来严重的毒副反应。为了评估临床试验的安全性，我们收取了小鼠的主要脏器进行HE染色，实验结果显示，PTL-Her2-CAR-T细胞并未浸润和杀伤小鼠的主要脏器，其安全性得到了初步的论证(图8)。
四、为探究特异性抑制三个抑制性受体表达的CAR-T细胞对实体肿瘤浸润与杀伤能力的增强是否只局限于Her-2阳性的SK-OV3卵巢癌细胞系，我们建立可特异性靶向CD19的CAR-T细胞，进一步评估CD19-CAR-T细胞用于清除实体淋巴瘤的可行性。我们建立皮下接种Raji细胞的淋巴瘤NSG小鼠模型，在小鼠肿瘤达到200mm3的时候，尾静脉过继三种同样条件下转导的CAR-T细胞5×105个/只。实验结果显示，经尾静脉过继PTL-CD19-CAR-T细胞的治疗组的小鼠皮下肿瘤明显小于CD19-CAR-T细胞的治疗组以及VC-CAR-T细胞的对照组(图9)。
最后所应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。
序列表
<110> 广州千扬生物医药技术有限公司
<120> 一种shRNA-cluster序列及其表达载体和用途
<130> 2017
<160> 2
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 690
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial)
<400> 1
tggtaagtgc ccaaattgct ggagggccat ctgttttgac ccttaaaggg gtagctcctt 60
accgtgctct cattgccgcc tccccacctc ccgctccagc cctgccgggg cgcttcgtgc 120
taaactggta gctttgtgta ggctaccagt ttagcacgaa gcgctccagc agggcacgca 180
cagcgtccgt ggagggaaag gccttttccc cacttcttaa ccttcactga gagggtggtt 240
ggggtctgtt tcactccatg tgtcctagat cctgtgctac agaccttcct ttctgtcctc 300
ccgtcttgga cctcagtcct gggggctcac tctagattgg ccaatgagct ttgtgtaggc 360
tcattggcca atctagagtg agcccccggg acacgttctc tctgccaatt gtcttcttgg 420
ctgagctccc caagctccat ctgtcatgct ggggagccca gtggcgttca aaagggtctg 480
gtctccctca caggacagct gaactccggg actggccagt gttgagtggc gactttaccc 540
ttcgagcttt gtgtaggctc gaagggtaaa gtcgccactc agtgccggcc caacactgcg 600
gatgctgggg ggagggggga ttccactcct gttttgtgag taggcgaccc atgggctgcc 660
cagccttaaa gccagaacaa gggtgtcccc 690
<210> 2
<211> 690
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial)
<400> 2
tggtaagtgc ccaaattgct ggagggccat ctgttttgac ccttaaaggg gtagctcctt 60
accgtgctct cattgccgcc tccccacctc ccgctccagc cctgccgggg cgcttcgtgc 120
taaactggta gctttgtgta ggctaccagt ttagcacgaa gcgctccagc agggcacgca 180
cagcgtccgt ggagggaaag gccttttccc cacttcttaa ccttcactga gagggtggtt 240
ggggtctgtt tcactccatg tgtcctagat cctgtgctac agaccttcct ttctgtcctc 300
ccgtcttgga cctcagtcct gggggctcta aggctatgaa gagatacgct ttgtgtaggc 360
tagcgactaa acacatcaag agcccccggg acacgttctc tctgccaatt gtcttcttgg 420
ctgagctccc caagctccat ctgtcatgct ggggagccca gtggcgttca aaagggtctg 480
gtctccctca caggacagct gaactccggg actggccagt gttgagtaag gctatgaaga 540
gatacgcttt gtgtaggcta gcgactaaac acatcaactc agtgccggcc caacactgcg 600
gatgctgggg ggagggggga ttccactcct gttttgtgag taggcgaccc atgggctgcc 660
cagccttaaa gccagaacaa gggtgtcccc 690

Claims (7)

1.一种shRNA-cluster序列，其特征在于，所述shRNA-cluster序列的核苷酸序列如SEQID NO:1所示。
2.一种表达载体，其特征在于，所述表达载体是将如SEQ ID NO:1所示的序列，以及CAR分子的编码序列连接到基础载体上而得的；所述表达载体表达如权利要求1所述的shRNA-cluster序列和CAR分子。
3.根据权利要求1所述的表达载体，其特征在于，所述基础载体为慢病毒载体。
4.一种改造的CAR-T细胞，其特征在于，所述T细胞是将如权利要求2或3所述的表达载体转入CD8+T细胞中而得的。
5.一种如权利要求4所述的改造的CAR-T细胞的制备方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：
（1）收集外周血单个核细胞并分离富集其中的CD8+ T细胞，采用anti-CD3、anti-CD28和IL-2激活所述CD8+ T细胞；
（2）CD8+ T细胞激活48小时后，以1ml/1×106细胞的比例加入如权利要求3所述的慢病毒表达载体进行感染，同时加入聚凝胺溶液，离心后继续培养；8～12小时后，进行第二轮感染，得到改造的CAR-T细胞。
6.一种扩增权利要求4所述的改造的CAR-T细胞的方法，其特征在于，包括如下步骤：（1）将改造的CAR-T细胞以新鲜培养基重悬细胞，并加入IL-2和IL-7保持细胞状态；（2）改造后的第3天和第5天，根据细胞状态和增殖情况，对细胞添加完全RMPI1640培养基，细胞浓度维持在2×106/ml，并补充IL-2和IL-7，继续培养并及时传代，进一步扩增细胞。
7.如权利要求1所述的shRNA-cluster序列、如权利要求2或3所述的表达载体或如权利要求4所述的改造的CAR-T细胞在制备清除实体肿瘤细胞的制剂中的应用。
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