CN110684120A

CN110684120A - 一种靶向gpc3的嵌合抗原受体及其应用

Info

Publication number: CN110684120A
Application number: CN201910967265.1A
Authority: CN
Inventors: 张坤
Original assignee: Huaxia Yuan (shanghai) Cell Genetic Engineering Ltd By Share Ltd
Current assignee: Huaxia Yuan (shanghai) Cell Genetic Engineering Ltd By Share Ltd
Priority date: 2019-10-12
Filing date: 2019-10-12
Publication date: 2020-01-14
Anticipated expiration: 2039-10-12
Also published as: CN110684120B

Abstract

本发明公开了一种靶向GPC3的嵌合抗原受体及其应用，属于肿瘤免疫治疗领域。所述嵌合抗原受体包括：依次连接的信号肽、靶向GPC3的单链抗体、Myc标签、CD8α铰链区、CD28跨膜区、共刺激因子、胞内信号域、P2A连接肽和CCL19分泌区。该嵌合抗原受体能够识别GPC3抗原，采用该新型嵌合抗原受体构建的CAR‑T细胞对GPC3靶蛋白具有良好的杀伤能力，同时该靶向GPC3的嵌合抗原受体还能分泌趋化因子CCL19，在不改变抗肿瘤活性的同时，产生的趋化因子有望促进免疫细胞向肿瘤微环境浸润，抑制肿瘤的生长速度，缩小肿瘤的体积，使得该靶向GPC3的嵌合抗原受体具有更强的抗实体瘤肿瘤活性，从而展现出良好的应用前景。

Description

一种靶向GPC3的嵌合抗原受体及其应用

技术领域

本发明涉及肿瘤免疫治疗领域，特别涉及一种靶向GPC3的嵌合抗原受体及其应用。

背景技术

嵌合抗原受体T细胞(Chimeric Antigen Receptor T-Cell，CAR-T)是将融合有CAR基因以核酸的形式导入到宿主T淋巴细胞基因组中构建而成。CAR-T在血液瘤中的应用中表现出令人可喜的治疗效果，特别对复发、难治的B淋巴细胞白血病病人，缓解率达到90％以上。但在实体瘤的应用方面，由于缺乏肿瘤特异性抗原等原因，使得CAR-T在治疗实体瘤方面在临床上尚未取得较好的疗效。

发明内容

为了解决现有技术的问题，本发明实施例提供了一种靶向GPC3的嵌合抗原受体及其应用。所述技术方案如下：

一方面，本发明实施例提供了一种靶向GPC3的嵌合抗原受体，所述嵌合抗原受体包括：依次连接的信号肽、靶向GPC3的单链抗体、Myc标签、CD8α铰链区、CD28跨膜区、共刺激因子、胞内信号域、P2A连接肽和CCL19分泌区，所述信号肽的核苷酸序列如序列表中SEQ IDNO：1所示，所述靶向GPC3的单链抗体的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO：2所示，所述Myc标签的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO：3所示，所述CD8α铰链区的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO：4所示，所述CD28跨膜区的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO：5所示，所述胞内信号域的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO：6所示，所述P2A连接肽的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO：7所示，所述CCL19分泌区的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO：8所示。

进一步地，所述靶向GPC3的嵌合抗原受体还包括共刺激因子，所述共刺激因子的一端与所述CD28跨膜区的另一端连接，所述共刺激因子为CD27、CD28、4-1BB、OX40、CD30、CD40、ICOS、NKG2D和B7-H3中的至少一种。

进一步地，所述共刺激因子为CD28，所述共刺激因子的核苷酸序列如序列表中SEQID NO：9所示。

另一方面，本发明实施例提供了一种上述靶向GPC3的嵌合抗原受体的应用，所述应用包括：将所述靶向GPC3的嵌合抗原受体作为抗肿瘤药物。

进一步地，所述肿瘤包括：肝癌、肺癌、胃癌、乳腺癌、黑色素瘤、卵巢癌、卵黄囊瘤和神经母细胞瘤。

优选地，所述肿瘤为肝癌。

本发明实施例提供的技术方案带来的有益效果是：本发明实施例提供了一种靶向GPC3的嵌合抗原受体，GPC3抗原在原发性肝癌HCC中呈特异性高表达，且在肿瘤初期即可检出，尤其在小肝癌及甲胎蛋白AFP阴性的HCC患者中阳性率很高，在肝癌组织中GPC3水平明显升高，因此本发明实施例提供的嵌合抗原受体的以GPC3抗原作为靶点，并能够识别该GPC3抗原，这使得采用该新型嵌合抗原受体构建的CAR-T细胞对GPC3靶蛋白具有良好的杀伤能力，可发挥更强的抗肿瘤效果，同时该靶向GPC3的嵌合抗原受体还能分泌细胞趋化因子CCL19，在不改变抗肿瘤活性的同时，产生的趋化因子有望促进免疫细胞向肿瘤微环境浸润，抑制肿瘤的生长速度，缩小肿瘤的体积，使得该靶向GPC3的嵌合抗原受体具有更强的抗实体瘤肿瘤活性，从而展现出良好的应用前景。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例中的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1是本发明实施例提供的嵌合抗原受体结构示意图；

图2是本发明实施例提供的琼脂糖凝胶电泳图；

图3是本发明实施例提供的CAR19慢病毒转染效率图；

图4是本发明实施例提供的IL-2分泌量的对比图；

图5是本发明实施例提供的IFNγ分泌量的对比图；

图6是本发明实施例提供的细胞杀伤效率对比图，图中A为CAR-T细胞对HepG2细胞的杀伤能力，A为对照组细胞对HepG2细胞的杀伤能力，横坐标为效应细胞与靶细胞的个数比，纵坐标为细胞杀伤效率，单位为％。

具体实施方式

为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合附图对本发明实施方式作进一步地详细描述。

实施例

本发明实施例提供了一种靶向GPC3的嵌合抗原受体，该嵌合抗原受体包括：依次连接的信号肽、靶向GPC3(Glypican-3)的单链抗体、Myc标签、CD8α铰链区、CD28跨膜区、共刺激因子、胞内信号域、P2A连接肽和CCL19分泌区，所述信号肽的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO：1所示，所述靶向GPC3的单链抗体的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO：2所示，所述Myc标签的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO：3所示，所述CD8α铰链区的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO：4所示，所述CD28跨膜区的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO：5所示，所述胞内信号域的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO：6所示，所述P2A连接肽的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO：7所示，所述CCL19分泌区的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO：8所示。在实现时，靶向GPC3的单链抗体包括轻链V_L可变区、Inter-Linker和GPC3单链抗体重链V_H可变区三部分。

进一步地，共刺激因子的一端与CD28跨膜区的另一端连接，共刺激因子为CD27、CD28、4-1BB、OX40、CD30、CD40、ICOS、NKG2D和B7-H3中的至少一种。在实现时，共刺激因子可以为上述两种或多种的组合，此时，两种或多种共刺激因子依次首尾连接后其两端再分别与CD8α跨膜区和胞内信号域连接。

进一步地，共刺激因子为CD28，共刺激因子的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO：6所示。

本发明实施例提供的靶向GPC3的嵌合抗原受体的应用，该应用包括：将靶向GPC3的嵌合抗原受体作为抗肿瘤药物。肿瘤包括肝癌、肺癌、胃癌、乳腺癌、黑色素瘤、卵巢癌、卵黄囊瘤和神经母细胞瘤，优选地，肿瘤为肝癌。

在实现时，在NCBI网站数据库中分别搜索：人的CD8α信号区、人的CD28铰链区、CD28胞内区、人的CD3ζ胞内信号域、人的CCL19基因序列信息、抗GPC3单克隆抗体的重链和抗GPC3单克隆抗体的轻链可变区的序列信息，上述这些序列在网站http://sg.idtdna.com/site上进行密码子优化，保证在其编码的氨基酸序列不变的情况下更适合人类细胞表达。基因全合成嵌合抗原受体基因序列，其结构为：信号肽-靶向GPC3的单链抗体-Myc标签-CD8α铰链区-CD28跨膜区-共刺激因子CD28-胞内信号域CD3ζ-连接肽P2A-CCL19分泌区，具体为：CD8α leader-GPC3 scFv-Myc tag-CD8α hinge-CD28-CD3ζ-P2A-CCL19，标记为CAR19，该嵌合抗原受体的结构如图1所示，该嵌合抗原受体的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO：10所示，相应地，该嵌合抗原受体的氨基酸序列如序列表中SEQ IDNO：11所示。

该嵌合抗原受体各部分在连接时，可以直接连接在一起，也可以通过接头序列进行连接。接头序列可以是本领域公知的适用于抗体轻链可变区和重链可变区的柔性序列，例如含G和S的(G₄S)₃接头序列。

制备该嵌合抗原受体的基因质粒载体，具体方法如下：

通过PCR(Polymerase Chain Reaction，聚合酶链式反应)扩增并获得CAR19基因序列，在CAR19基因的两端分别添加酶切位点Xba I和酶切位点BamH I，得到待酶切产物，将其与慢病毒载体质粒pCDH-EF1-MCS-T2A-copGFP分别进行Xba I和BamH I双酶切反应，得到含有CAR19的酶切片段和含有pCDH-EF1-MCS-T2A-copGFP的酶切片段。酶切反应条件为：酶切温度37℃，酶切时间30min。总体积为50μL的酶切体系包括：5μL的10×buffer；5μg的待酶切物的DNA；2μL的XbaI酶；2μL的BamH I酶；用去离子水将酶切体系的体积补至50μL。

将含有CAR19的酶切片段和含有pCDH-EF1-MCS-T2A-copGFP的酶切片段分别利用浓度为1％琼脂糖凝胶进行电泳，电泳结束后分别将含有CAR19的酶切片段和含有pCDH-EF1-MCS-T2A-copGFP的酶切片段的核酸条带切下，并分别放在两个洁净的EP管中，然后将琼脂糖凝胶中的DNA纯化回收，得到CAR19酶切产物和pCDH-EF1-MCS-T2A-copGFP酶切产物。

将得到CAR19酶切产物和pCDH-EF1-MCS-T2A-copGFP酶切产物的DNA片段在16℃过夜连接，形成pCDH-EF1-CAR19-T2A-copGFP。其中，总体积为10μL的连接体系包括：1μL的pCDH-EF1-MCS-T2A-copGFP酶切产物、7μL的CAR19酶切产物、1μL的T4 DNA连接酶和1μL的10×T4 DNA连接酶Buffe r。

将连接产物转入Stbl3感受态细胞(购置于TRANSGEN BIOTECH)中，具体方法如下：

取出保存在-80℃冰箱中的Stbl3感受态细胞，并置于冰上解冻。将连接产物加入Stbl3感受态细胞中，冰浴30min后，于42℃下热击45s，然后再冰浴2min，得到转化产物。

将转化产物加入900μL未添加抗生素的液体LB培养基中，于37℃下摇床的转速为200rpm，发酵培养45min，得到发酵液。未添加抗生素的液体LB培养基的制备方法包括：取5g进口酵母提取物、10g进口蛋白胨、10g无水氯化钠和1L无菌水混匀后，经121℃灭菌20min后使用。

将发酵液经过4000rpm离心5min，弃去上清液，保留沉淀物，将沉淀物采用100μL的液体LB培养基进行重悬，得到重悬液。

将重悬液涂抹至Amp抗性的固体LB平板培养基上(购自上海科玛嘉微生物技术有限公司)，将固体LB平板培养基置于37℃的细菌培养箱中，过夜培养。

在固体LB平板培养基上挑取阳性克隆。

鉴定得到的阳性克隆，具体方法如下：

将得到的阳性克隆经Xba I和BamH I双酶切反应，具体操作参见上述待酶切物的双酶切反应，将由阳性克隆获得的酶切产物经琼脂糖凝胶电泳鉴定目标片段，获得了大小约为2000bp的目标片段，结果如图2所示。经测序鉴定可知该目标序列为CAR19基因。

提取质粒：将测序正确的阳性克隆制备成原始菌液接种至100mL的Amp抗性的液体LB培养基中，于37℃下，摇床转速为200rpm，进行过夜培养，得到原始菌发酵液。

将原始菌发酵液经过4000rpm离心10min，弃去上清液，保留沉淀物(菌体)。

采用无内毒素质粒大提试剂盒(购自天根公司)提取菌体的质粒，具体方法按照该试剂盒的说明书进行。

CAR19慢病毒载体包装：在转染前6h，以每皿约8.5×10⁶个细胞将293T细胞接种至直径为10cm的培养皿中。确保转染时细胞的汇合度在80％左右，且均匀分布于培养皿中。

制备溶液A和溶液B，其中，溶液A包括：4mL的2×HEPES buffer缓冲液(8个培养皿一起包装的量)，溶液B包括：72ug质粒(target plasmid)、37.04ug包装质粒PLP1、34.8ug包装质粒PLP2、24.08ug包装质粒PLP-VSVG和400μL2.5M钙离子溶液，溶液B的总体积为4mL。充分混匀溶液B，轻轻涡旋溶液A的同时，向溶液A中逐滴加入溶液B，静置3～5min，得到混合液。轻轻涡旋混合液，将混合液逐滴加入含293T细胞的培养皿上，每个培养皿中加入1mL该混合液，轻轻前后晃动培养皿使混合液均匀分布在培养皿的表面(注意晃动时不要旋转培养皿)，将培养皿放置于37℃培养箱中培养。培养12h后，更换新鲜的培养基，继续培养。培养48h后收集合CAR19慢病毒的上清液。经过1500rpm/min离心5min后保留上清液，将上清液用规格为0.45μm的滤膜过滤，得到含CAR19慢病毒的滤液。

将含CAR19慢病毒的滤液转移至超速离心管中，在超速离心管的底部小心地铺上一层浓度为20％的蔗糖(每8mL含慢病毒的滤液加1mL蔗糖)。以PBS(phosphate buffersaline，磷酸缓冲盐溶液)平衡超速离心管，在4℃下于27600rpm/min离心2h，小心取出超速离心管，倒掉上清液，倒置该超速离心管去掉残余上清液，保留沉淀物。向超速离心管中加入150μLPBS，使用微量移液枪在超速离心管的底部轻轻吹打几次，使沉淀物溶解在PBS中，得到浓缩的CAR19慢病毒(嵌合抗原受体的基因质粒载体)，在实现时可将浓缩的CAR19慢病毒分装于离心管，置于-80℃保存。

CAR19慢病毒滴度检测：取浓缩的CAR19慢病毒0.5μL、5μL和50μL分别感染293T细胞(1×10⁵个/孔)24h，24h后换液，72h后提取细胞基因组DNA，并将基因组DNA浓度稀释至5～100ng/μL。采用TransLv^TM Lentivirus qPCR Titration Kit(购自TransGen)，具体方法按照其说明书进行。经检测可知该CAR19慢病毒滴度为5×10⁸TU/mL。

制备嵌合抗原受体的T细胞，具体方法如下：

PBMC(Peripheral Blood Mononuclear Cell，外周血单个核细胞)的制备：采集志愿者20mL外周血，将外周血加入至含有肝素的50mL离心管中，经过2000rpm离心10min，将上层血浆转移至新的离心管内冻存。向离心管中加入与沉淀等体积的经37℃预热的生理盐水，充分混匀，进行血细胞沉淀重悬，得到重悬细胞液。另取一只50mL离心管，加入20mL预温的淋巴细胞分离液。将20mL重悬细胞液缓慢的加至淋巴细胞分离液的上层。于800rpm离心20min。匀速吸去上层血浆，当血浆距白膜层2～3cm时停止吸去血浆，然后快速吸去白膜层细胞，并转移至另一新的50mL离心管中，用生理盐水将其体积补充至45mL，于1200rpm离心5min，重复2次，用于清洗细胞。使用RPMI1640+浓度为10％的FBS培养基重悬细胞沉淀，并计算T细胞数量。在本实施例中，T细胞数量为1.5×10⁷个。

CAR19慢病毒转染人的T细胞：在本实施例中，将T细胞密度调整到1×10⁶/mL，将T细胞按照1mL/孔接种到抗人50ng/mL CD3抗体和50ng/mL CD28抗体中，再加入200IU/mL的白细胞介素2，刺激培养48h。T细胞活化培养两天后，将CAR19慢病毒以MOI＝5的感染系数进行转染，并添加8μg/mL的polybrene，于37℃培养培养箱中培养。转染24h后，更换培养基，并持续观察细胞生长状况，培养时间为8～13天。得到转染的CAR-T细胞。

CAR19慢病毒转染效率检测：转染完成后，定时使用倒置荧光显微镜下观察转染细胞。吸取转染的CAR-T细胞，于1000rpm离心5min收集沉淀物，将沉淀物用PBS溶液洗涤。使用流式细胞仪FITC通道检测转染的CAR-T细胞的表达GFP荧光的细胞比例。其转染效率如图3所示。

CAR-T细胞的趋化因子分泌检测，具体如下：

为了检测经过CAR19慢病毒转染后的CAR-T细胞是否被有效激活，本实施例检测CAR-T细胞与靶细胞共培养，分别通过ELISA试剂盒检测IFNγ和IL-2的分泌量。具体地，分别将每孔1×10⁶个CAR-T细胞和每孔1×10⁵个靶细胞接种至6孔板中，于37℃、浓度为5％的CO₂中培养24h。吸取培养的上清液，于1000rpm离心5min去除细胞沉淀，收获培养上清液。按照ELISA剂盒说明书检测培养上清液中的IFNγ和IL-2。如图4和图5所示，图4为IL-2分泌量的对比图，图5为IFNγ分泌量的对比图。由于检测到了IFNγ和IL-2分泌，因此可以证明，该经过CAR19慢病毒转染后的CAR-T细胞已经被有效激活。

体外抗肿瘤效果：①组：在96孔板中取其中40个孔并分成八个小组，每个小组设置五个复孔，第一组中均只加入200μL培养基(记作Ab)，第二组中均加入100μL培养基和100μL1×10⁴个靶细胞(记作Ack)，靶细胞为靶细胞含GPC3靶蛋白的HepG2细胞，第三组中均加入100μL培养基和100μL 1×10⁴个效应细胞(记作Acn)，其中效应细胞为转染CAR结构的CAR-T细胞，第四组中均加入100μL 1×10⁴个靶细胞和100μL 1×10⁴个效应细胞(记作As，效应细胞个数∶靶细胞个数＝1∶1)，第五组中均加入100μL培养基和100μL 5×10⁴个效应细胞(记作Acn)，第六组中均加入100μL 1×10⁴个靶细胞和100μL 5×10⁴个效应细胞(记作As，效应细胞个数∶靶细胞个数＝5∶1)，第七组中均加入100μL培养基和100μL 1×10⁵个效应细胞(记作Acn)，第八组中均加入100μL 1×10⁴个靶细胞和100μL 1×10⁵个效应细胞(记作As，效应细胞个数∶靶细胞个数＝10∶1)。

②组(对照组)：将96孔板另外的40个孔分成八个小组，每个小组设置五个复孔，分组方法与①组相同，但是，与①组的区别在于效应细胞为转染CAR结构的CAR-T细胞或未感染过的T细胞。

将96孔板孵育4h后每孔加入20uL的CCK-8溶液，将96孔板在培养箱内孵育4h。用酶标仪在450nm处测定吸光度。根据吸光度分别计算①组和②组的细胞杀伤效率＝[1-(As-Acn)/(Ack-Ab)]×100％，式中，As为试验孔(含有靶细胞的培养基、效应细胞和CCK-8溶液)，Ack为靶细胞对照孔(含有靶细胞的培养基和CCK-8溶液)，Can为效应细胞对照孔(含有效应细胞的培养基、CCK-8溶液)，Ab为空白对照(不含细胞的培养基和CCK-8溶液)。图6为本发明实施例提供的细胞杀伤效率图，如图6所示，采用本发明实施例提供的靶向GPC3的嵌合抗原受体获得的CAR-T细胞对HepG2细胞杀伤效率明显高于对照组，可见本发明实施例提供的靶向GPC3的嵌合抗原受体针对GPC3靶蛋具有良好的抗肿瘤效果。

本发明实施例提供了一种靶向GPC3的嵌合抗原受体，GPC3抗原在原发性肝癌HCC中呈特异性高表达，且在肿瘤初期即可检出，尤其在小肝癌及甲胎蛋白AFP阴性的HCC患者中阳性率很高。在肝癌组织中GPC3水平明显升高，因此本发明实施例提供的嵌合抗原受体的以GPC3抗原作为靶点，并能够识别该GPC3抗原，这使得采用该新型嵌合抗原受体构建的CAR-T细胞对GPC3靶蛋白具有良好的杀伤能力，可发挥更强的抗肿瘤效果，同时该靶向GPC3的嵌合抗原受体还能分泌细胞趋化因子CCL19，在不改变抗肿瘤活性的同时，产生的趋化因子有望促进免疫细胞向肿瘤微环境浸润，抑制肿瘤的生长速度，缩小肿瘤的体积，使得该靶向GPC3的嵌合抗原受体具有更强的抗实体瘤肿瘤活性，从而展现出良好的应用前景。

以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

序列表

<110> 华夏源(上海)细胞基因工程股份有限公司

<120> 一种靶向GPC3的嵌合抗原受体及其应用

<160> 11

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 63

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

atggccttac cagtgaccgc cttgctcctg ccgctggcct tgctgctcca cgccgccagg 60

ccg 63

<210> 2

<211> 675

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

gacgtcgtca tgacgcagtc accgctttca cttcctgtca cacctgggga gcccgcaagc 60

attagctgcc gctcaagtca gtcactggtt cactctaatg caaacacata cctgcactgg 120

taccttcaaa agcccggtca aagcccacaa cttctgatat ataaggtaag caatagattc 180

tccggtgtac ctgataggtt ttcaggaagt gggtccggta cagactttac attgaaaata 240

agtagagtgg aggcagagga tgtaggagtg tactactgtt ctcaaaacac ccacgtacca 300

ccgacatttg ggcaggggac aaagttggaa attaagagag gcggcggggg ttctggtggc 360

ggcggcagcg gcggtggagg atcacaggta caactcgtgc agtcaggtgc tgaggtaaaa 420

aagccgggtg ccagcgtgaa agtgagctgt aaggcatctg gttacacctt cacggattac 480

gagatgcact gggttcgaca agcgcccggt caaggactcg aatggatggg agcgcttgac 540

ccgaagactg gagatacagc gtactcccag aaattcaagg gaagggtgac tcttactgcc 600

gacgagtcaa caagcacggc ttatatggaa ctttccagct tgcggagcga agacaccgcc 660

gtgtattatt gtacc 675

<210> 3

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

gaacaaaagt tgatttctga agaagatttg 30

<210> 4

<211> 186

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

gccctgagca actccatcat gtacttcagc cacttcgtgc cggtcttcct gccagcgaag 60

cccaccacga cgccagcgcc gcgaccacca acaccggcgc ccaccatcgc gtcgcagccc 120

ctgtccctgc gcccagaggc gagccggcca gcggcggggg gcgcagtgca cacgaggggg 180

ctggac 186

<210> 5

<211> 87

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

aagccctttt gggtgctggt ggtggttggt ggagtcctgg cttgctatag cttgctagta 60

acagtggcct ttattatttt ctgggtg 87

<210> 6

<211> 336

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

agagtgaagt tcagcaggag cgcagacgcc cccgcgtacc agcagggcca gaaccagctc 60

tataacgagc tcaatctagg acgaagagag gagtacgatg ttttggacaa gagacgtggc 120

cgggaccctg agatgggggg aaagccgaga aggaagaacc ctcaggaagg cctgtacaat 180

gaactgcaga aagataagat ggcggaggcc tacagtgaga ttgggatgaa aggcgagcgc 240

cggaggggca aggggcacga tggcctttac cagggtctca gtacagccac caaggacacc 300

tacgacgccc ttcacatgca ggccctgccc cctcgc 336

<210> 7

<211> 66

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

ggaagcggag ctactaactt cagcctgctg aagcaggctg gagacgtgga ggagaaccct 60

ggacct 66

<210> 8

<211> 297

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

atggccctgc tactggccct cagcctgctg gttctctgga cttccccagc cccaactctg 60

agtggcacca atgatgctga agactgctgc ctgtctgtga cccagaaacc catccctggg 120

tacatcgtga ggaacttcca ctaccttctc atcaaggatg gctgcagggt gcctgctgta 180

gtgttcacca cactgagggg ccgccagctc tgtgcacccc cagaccagcc ctgggtagaa 240

cgcatcatcc agagactgca gaggacctca gccaagatga agcgccgcag cagttaa 297

<210> 9

<211> 123

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

aggagtaaga ggagcaggct cctgcacagt gactacatga acatgactcc ccgccgcccc 60

gggcccaccc gcaagcatta ccagccctat gccccaccac gcgacttcgc agcctatcgc 120

tcc 123

<210> 10

<211> 1893

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

atggccttac cagtgaccgc cttgctcctg ccgctggcct tgctgctcca cgccgccagg 60

ccggctagcg acgtcgtcat gacgcagtca ccgctttcac ttcctgtcac acctggggag 120

cccgcaagca ttagctgccg ctcaagtcag tcactggttc actctaatgc aaacacatac 180

ctgcactggt accttcaaaa gcccggtcaa agcccacaac ttctgatata taaggtaagc 240

aatagattct ccggtgtacc tgataggttt tcaggaagtg ggtccggtac agactttaca 300

ttgaaaataa gtagagtgga ggcagaggat gtaggagtgt actactgttc tcaaaacacc 360

cacgtaccac cgacatttgg gcaggggaca aagttggaaa ttaagagagg cggcgggggt 420

tctggtggcg gcggcagcgg cggtggagga tcacaggtac aactcgtgca gtcaggtgct 480

gaggtaaaaa agccgggtgc cagcgtgaaa gtgagctgta aggcatctgg ttacaccttc 540

acggattacg agatgcactg ggttcgacaa gcgcccggtc aaggactcga atggatggga 600

gcgcttgacc cgaagactgg agatacagcg tactcccaga aattcaaggg aagggtgact 660

cttactgccg acgagtcaac aagcacggct tatatggaac tttccagctt gcggagcgaa 720

gacaccgccg tgtattattg taccgaattc ggtggcgaac aaaagttgat ttctgaagaa 780

gatttgagat ctgccctgag caactccatc atgtacttca gccacttcgt gccggtcttc 840

ctgccagcga agcccaccac gacgccagcg ccgcgaccac caacaccggc gcccaccatc 900

gcgtcgcagc ccctgtccct gcgcccagag gcgagccggc cagcggcggg gggcgcagtg 960

cacacgaggg ggctggacgt caagcccttt tgggtgctgg tggtggttgg tggagtcctg 1020

gcttgctata gcttgctagt aacagtggcc tttattattt tctgggtgag gagtaagagg 1080

agcaggctcc tgcacagtga ctacatgaac atgactcccc gccgcccagg gcctacccgc 1140

aagcattacc agccctatgc cccaccacgc gacttcgcag cctatcgctc cggaagagtg 1200

aagttcagca ggagcgcaga cgcccccgcg taccagcagg gccagaacca gctctataac 1260

gagctcaatc taggacgaag agaggagtac gatgttttgg acaagagacg tggccgggac 1320

cctgagatgg ggggaaagcc gagaaggaag aaccctcagg aaggcctgta caatgaactg 1380

cagaaagata agatggcgga ggcctacagt gagattggga tgaaaggcga gcgccggagg 1440

ggcaaggggc acgatggcct ttaccagggt ctcagtacag ccaccaagga cacctacgac 1500

gcccttcaca tgcaggccct gccccctcgc ggaagcggag ctactaactt cagcctgctg 1560

aagcaggctg gagacgtgga ggagaaccct ggacctatgg ccctgctact ggccctcagc 1620

ctgctggttc tctggacttc cccagcccca actctgagtg gcaccaatga tgctgaagac 1680

tgctgcctgt ctgtgaccca gaaacccatc cctgggtaca tcgtgaggaa cttccactac 1740

cttctcatca aggatggctg cagggtgcct gctgtagtgt tcaccacact gaggggccgc 1800

cagctctgtg cacccccaga ccagccctgg gtagaacgca tcatccagag actgcagagg 1860

acctcagcca agatgaagcg ccgcagcagt taa 1893

<210> 11

<211> 650

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu

1 5 10 15

His Ala Ala Ala Pro Ala Val Val Met Thr Gly Ser Pro Leu Ser Leu

20 25 30

Pro Val Thr Pro Gly Gly Pro Ala Ser Ile Ser Cys Ala Ser Ser Gly

35 40 45

Ser Leu Val His Ser Ala Ala Ala Thr Thr Leu His Thr Thr Leu Gly

50 55 60

Leu Pro Gly Gly Ser Pro Gly Leu Leu Ile Thr Leu Val Ser Ala Ala

65 70 75 80

Pro Ser Gly Val Pro Ala Ala Pro Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Ala

85 90 95

Pro Thr Leu Leu Ile Ser Ala Val Gly Ala Gly Ala Val Gly Val Thr

100 105 110

Thr Cys Ser Gly Ala Thr His Val Pro Pro Thr Pro Gly Gly Gly Thr

115 120 125

Leu Leu Gly Ile Leu Ala Gly Gly Cys Gly Gly Cys Gly Gly Gly Gly

130 135 140

Gly Thr Thr Cys Thr Gly Gly Thr Gly Gly Cys Gly Gly Cys Gly Gly

145 150 155 160

Cys Ala Gly Cys Gly Gly Cys Gly Gly Thr Gly Gly Ala Gly Gly Ala

165 170 175

Thr Cys Ala Gly Val Gly Leu Val Gly Ser Gly Ala Gly Val Leu Leu

180 185 190

Pro Gly Ala Ser Val Leu Val Ser Cys Leu Ala Ser Gly Thr Thr Pro

195 200 205

Thr Ala Thr Gly Met His Thr Val Ala Gly Ala Pro Gly Gly Gly Leu

210 215 220

Gly Thr Met Gly Ala Leu Ala Pro Leu Thr Gly Ala Thr Ala Thr Ser

225 230 235 240

Gly Leu Pro Leu Gly Ala Val Thr Leu Thr Ala Ala Gly Ser Thr Ser

245 250 255

Thr Ala Thr Met Gly Leu Ser Ser Leu Ala Ser Gly Ala Thr Ala Val

260 265 270

Thr Thr Cys Thr Gly Gly Leu Leu Ile Ser Gly Gly Ala Leu Ala Leu

275 280 285

Ser Ala Ser Ile Met Thr Pro Ser His Pro Val Pro Val Pro Leu Pro

290 295 300

Ala Leu Pro Thr Thr Thr Pro Ala Pro Ala Pro Pro Thr Pro Ala Pro

305 310 315 320

Thr Ile Ala Ser Gly Pro Leu Ser Leu Ala Pro Gly Ala Ser Ala Pro

325 330 335

Ala Ala Gly Gly Ala Val His Thr Ala Gly Leu Ala Leu Pro Pro Thr

340 345 350

Val Leu Val Val Val Gly Gly Val Leu Ala Cys Thr Ser Leu Leu Val

355 360 365

Thr Val Ala Pro Ile Ile Pro Thr Val Ala Ser Leu Ala Ser Ala Leu

370 375 380

Leu His Ser Ala Thr Met Ala Met Thr Pro Ala Ala Pro Gly Pro Thr

385 390 395 400

Ala Leu His Thr Gly Pro Thr Ala Pro Pro Ala Ala Pro Ala Ala Thr

405 410 415

Ala Ser Ala Val Leu Pro Ser Ala Ser Ala Ala Ala Pro Ala Thr Gly

420 425 430

Gly Gly Gly Ala Gly Leu Thr Ala Gly Leu Ala Leu Gly Ala Ala Gly

435 440 445

Gly Thr Ala Val Leu Ala Leu Ala Ala Gly Ala Ala Pro Gly Met Gly

450 455 460

Gly Leu Pro Ala Ala Leu Ala Pro Gly Gly Gly Leu Thr Ala Gly Leu

465 470 475 480

Gly Leu Ala Leu Met Ala Gly Ala Thr Ser Gly Ile Gly Met Leu Gly

485 490 495

Gly Ala Ala Ala Gly Leu Gly His Ala Gly Leu Thr Gly Gly Leu Ser

500 505 510

Thr Ala Thr Leu Ala Thr Thr Ala Ala Leu His Met Gly Ala Leu Pro

515 520 525

Pro Ala Gly Ser Gly Ala Thr Ala Pro Ser Leu Leu Leu Gly Ala Gly

530 535 540

Ala Val Gly Gly Ala Pro Gly Pro Met Ala Leu Leu Leu Ala Leu Ser

545 550 555 560

Leu Leu Val Leu Thr Thr Ser Pro Ala Pro Thr Leu Ser Gly Thr Ala

565 570 575

Ala Ala Gly Ala Cys Cys Leu Ser Val Thr Gly Leu Pro Ile Pro Gly

580 585 590

Thr Ile Val Ala Ala Pro His Thr Leu Leu Ile Leu Ala Gly Cys Ala

595 600 605

Val Pro Ala Val Val Pro Thr Thr Leu Ala Gly Ala Gly Leu Cys Ala

610 615 620

Pro Pro Ala Gly Pro Thr Val Gly Ala Ile Ile Gly Ala Leu Gly Ala

625 630 635 640

Thr Ser Ala Leu Met Leu Ala Ala Ser Ser

645 650

Claims

1.一种靶向GPC3的嵌合抗原受体，其特征在于，所述嵌合抗原受体包括：依次连接的信号肽、靶向GPC3的单链抗体、Myc标签、CD8α铰链区、CD28跨膜区、共刺激因子、胞内信号域、P2A连接肽和CCL19分泌区，所述信号肽的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO：1所示，所述靶向GPC3的单链抗体的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO：2所示，所述Myc标签的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO：3所示，所述CD8α铰链区的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO：4所示，所述CD28跨膜区的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO：5所示，所述胞内信号域的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO：6所示，所述P2A连接肽的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO：7所示，所述CCL19分泌区的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO：8所示。

2.根据权利要求1所述的靶向GPC3的嵌合抗原受体，其特征在于，所述共刺激因子的一端与所述CD28跨膜区的另一端连接，所述共刺激因子为CD27、CD28、4-1BB、OX40、CD30、CD40、ICOS、NKG2D和B7-H3中的至少一种。

3.根据权利要求2所述的靶向GPC3的嵌合抗原受体，其特征在于，所述共刺激因子为CD28，所述共刺激因子的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO：9所示。

4.一种如权利要求1～3任一项所述的靶向GPC3的嵌合抗原受体的应用，其特征在于，所述应用包括：将所述靶向GPC3的嵌合抗原受体作为抗肿瘤药物。

5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述肿瘤包括：肝癌、肺癌、胃癌、乳腺癌、黑色素瘤、卵巢癌、卵黄囊瘤和神经母细胞瘤。

6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述肿瘤为肝癌。