CN114315977A - 共培养cik细胞和tabp-eic-wtn细胞联合在治疗***癌中的用途 - Google Patents

共培养cik细胞和tabp-eic-wtn细胞联合在治疗***癌中的用途 Download PDF

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Abstract

本发明公开了共培养CIK细胞和TABP‑EIC‑WTN细胞联合在治疗***癌中的用途，所述TABP‑EIC‑WTN细胞为由一个或多个本发明经筛选得到的WTN多肽通过linker串联作为抗原识别区得到的肿瘤抗原结合肽‑工程化免疫细胞，经实验验证发现，所述共培养CIK细胞和TABP‑EIC‑WTN细胞两者联合对***癌具有较好的治疗效果，本发现为***癌的治疗提供了一种新的有效治疗方法。

Description

共培养CIK细胞和TABP-EIC-WTN细胞联合在治疗***癌中 的用途
技术领域
本发明属于生物医学技术领域，具体地，本发明涉及共培养CIK细胞和TABP-EIC-WTN 细胞联合在治疗***癌中的用途。
背景技术
目前，肿瘤已成为世界上继心血管疾病的第二大死因，患者人数也在逐年增加。当前肿 瘤治疗的方法主要包括手术、放疗、化疗和靶向药物治疗等，但是，这些传统的肿瘤治疗方 法均存在一定的局限性。区别于传统的肿瘤治疗方法，肿瘤免疫治疗并非直接作用于病灶， 而是通过调节人体的免疫防御机制对抗肿瘤。近年来，肿瘤免疫治疗新靶点和新技术的涌现 也反映出了肿瘤免疫疗法的无限潜能，肿瘤免疫治疗是指通过增强机体的免疫***，来控制 和杀灭肿瘤的一种治疗方法。随着肿瘤免疫治疗手段的不断发展运用和临床治疗，它已逐渐 成为继手术治疗，放射治疗和化疗之后的“第四大”肿瘤治疗方法。相较于传统治疗方法， 肿瘤免疫治疗具有副作用小、特异性强、杀瘤谱广、低复发率等优点。
肿瘤免疫治疗主要分为主动免疫治疗、被动免疫治疗和过继性免疫疗法三大类，其中， 主动免疫治疗是指给机体输入具有抗原性的疫苗，刺激机体免疫***产生抗肿瘤免疫以治疗 肿瘤的方法；被动免疫治疗是指通过对机体注入外源性的免疫物质，由这些外源物质引起免 疫反应、抑制信号通路和输送药物至病灶来发挥抗肿瘤作用的肿瘤免疫治疗手段；过继性免 疫疗法是一种将供体的淋巴细胞移植到受体体内，以增强受体免疫功能的治疗方法。过继性 免疫疗法分为特异性和非特异性两类。目前正在开发且最有应用前景的肿瘤免疫治疗方法之 一为嵌合抗原受体(Chimeric antigen receptor，CAR)免疫细胞疗法，CAR是一种经基因工 程改造的能够靶向特异性抗原的受体。这种靶向特异性可导致对肿瘤细胞产生细胞毒性，杀 死肿瘤细胞，目前研究进展最为迅速的肿瘤免疫疗法为CAR-NK和CAR-T疗法。
细胞因子诱导的杀伤细胞(Cytokine-induced killer cells，CIK)，又称细胞因子激活杀伤 细胞，是一组T细胞-自然杀伤细胞(NK)样表型的适应免疫细胞混合体。临床上医生可通 过向外周血单核细胞或脐带血单核细胞中注入干扰素-γ、抗CD3单克隆抗体、重组人体白 细胞介素1族和2族等细胞因子诱导形成杀伤细胞。通常情况下，免疫细胞通过识别呈递在 受感染细胞表面的主要组织相容性复合体(MHC)而释放细胞因子，引发细胞裂解或细胞 凋亡。然而，CIK细胞具备不受MHC分子限制的杀伤作用，能够识别未能呈递抗原或MHC 的受感染细胞甚至恶性肿瘤细胞，并产生迅速及准确的免疫反应。而这些未能呈递MHC的 异常细胞不能被T细胞识别及清除，该特征使得CIK细胞成为治疗癌症及病毒感染的潜在 治疗方法之一。
目前，本领域主要面临的技术问题包括：肿瘤免疫疗法虽取得了一定的进展，但是仍存 在有效率低等问题；嵌合抗原受体免疫细胞疗法依赖于特异性的肿瘤相关抗原明确的肿瘤类 型，若所述肿瘤的肿瘤相关抗原不明确或未经鉴定，则无法基于肿瘤相关抗原制备相关特异 性识别的单链抗体序列，进而也就无法构建能够有效地识别肿瘤细胞的特异性CAR，以及 特异性识别并杀伤肿瘤细胞的CAR-T或CAR-NK细胞；抗体的制备周期长、特异性结合效 率普遍偏低。鉴于此，本发明的目的在于将共培养CIK细胞和TABP-EIC-WTN细胞联合用 于***癌的治疗中，经验证表明共培养CIK细胞和TABP-EIC-WTN细胞两者联合可增强 对***癌细胞的杀伤效果。
发明内容
为了解决目前本领域存在的上述技术问题，本发明的目的在于提供共培养CIK细胞和 TABP-EIC-WTN细胞联合在治疗***癌中的用途，本发明首次提出将共培养CIK细胞和 TABP-EIC-WTN细胞两者联合用于***癌的治疗中，且通过实验证明了上述联合可增强 对***癌细胞的杀伤效果。
本发明的上述目的通过以下技术方案得以实现：
第一方面，本发明提供了一种用于治疗癌症的药物组合物；
优选地，所述癌症包括***、***瘤、睾丸淋巴瘤、***癌、卵巢癌、肺癌、直肠癌、乳腺癌、皮肤鳞状细胞癌、结肠癌、肝癌、胰腺癌、胃癌、食管癌、甲状腺癌、膀 胱移行上皮癌、白血病、脑瘤、胃癌、腹膜癌、头颈癌、子宫内膜癌、肾癌、雌性生殖道癌、 原位癌、神经纤维瘤、骨癌、皮肤癌、胃肠道间质瘤、肥大细胞肿瘤、多发性骨髓瘤、黑色 素瘤、胶质瘤；更优选地，所述癌症为***癌。
进一步，所述药物组合物包含共培养CIK细胞和肿瘤抗原结合肽-工程化免疫细胞。
进一步，所述肿瘤抗原结合肽-工程化免疫细胞中肿瘤抗原结合肽的构成为WTN多肽 区-铰链区-跨膜结构域-共刺激结构域-初级信号传导结构域；
优选地，所述WTN多肽区包括多个WTN多肽的重复和多个WTN多肽的重复之间的linker；更优选地，所述WTN多肽为一种与PSMA特异性结合的多肽；最优选地，所述WTN 多肽选自以下组中的任意一种：
(1)如SEQ ID NO:1所示的多肽；
(2)与如SEQ ID NO:1所示的多肽相比，具有一个或几个氨基酸的置换、缺失或添加的 物质；
(3)与如SEQ ID NO:1所示的多肽的氨基酸序列具有至少80％、至少85％、至少90％、 至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、 至少99％的相同性的多肽；
最优选地，所述WTN多肽为如SEQ ID NO:1所示的多肽；最优选地，所述WTN多肽 的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示。
进一步，所述肿瘤抗原结合肽的铰链区为CD8α铰链区；优选地，所述CD8α铰链区的氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示；更优选地，所述CD8α铰链区的核苷酸序列如SEQ ID NO:4所示；优选地，所述跨膜结构域为2B4跨膜结构域；更优选地，所述2B4跨膜结构域的氨 基酸序列如SEQ ID NO:5所示；最优选地，所述2B4跨膜结构域的核苷酸序列如SEQ ID NO:6所示；优选地，所述共刺激结构域为2B4共刺激结构域；更优选地，所述2B4共刺激 结构域的氨基酸序列如SEQ ID NO:7所示；最优选地，所述2B4共刺激结构域的核苷酸序 列如SEQ IDNO:8所示；优选地，所述初级信号传导结构域为NKG2D初级信号传导结构域； 更优选地，所述NKG2D初级信号传导结构域的氨基酸序列如SEQ ID NO:9所示；最优选地， 所述NKG2D初级信号传导结构域的核苷酸序列如SEQ ID NO:10所示；最优选地，所述肿 瘤抗原结合肽的组成为WTN多肽区-CD8α铰链区-2B4跨膜结构域-2B4共刺激结构域 -NKG2D初级信号传导结构域；
最优选地，所述肿瘤抗原结合肽的氨基酸序列如SEQ ID NO:11所示；最优选地，所述 肿瘤抗原结合肽的核苷酸序列如SEQ ID NO:12所示。
进一步，所述肿瘤抗原结合肽-工程化免疫细胞包括肿瘤抗原结合肽-工程化NK细胞、 肿瘤抗原结合肽-工程化T细胞、肿瘤抗原结合肽-工程化B细胞、肿瘤抗原结合肽-工程化 巨噬细胞；优选地，所述肿瘤抗原结合肽-工程化免疫细胞为肿瘤抗原结合肽-工程化NK细 胞。
在本发明的具体实施例中，所述肿瘤抗原结合肽-工程化免疫细胞为TABP-EIC-WTN细 胞，其中，TABP-EIC(Tumor Antigen Binding Peptide-Engineering Immune Cell)是指肿瘤抗 原结合肽-工程化免疫细胞，本发明所述的肿瘤抗原结合肽-工程化免疫细胞为一个或多个本 发明经筛选得到的WTN多肽通过linker串联作为抗原识别区得到的工程化免疫细胞，其中， 所述的WTN多肽为本发明经噬菌体-多肽文库筛选得到的能够特异性地结合肿瘤细胞(前 列腺癌细胞)且结合效率高的一种新型多肽。
进一步，共培养CIK细胞为与***癌细胞共培养的DC-CIK细胞；优选地，所述共培养CIK细胞中包含CD8+T细胞。
在本发明的具体实施例中，所述DC细胞为树突状细胞(Dendritic cells，DC)，所述 CIK细胞为细胞因子诱导的杀伤细胞(Cytokine-induced killer cells，CIK)，又称细胞因子激 活杀伤细胞，是一组T细胞-自然杀伤细胞(NK)样表型的适应免疫细胞混合体。
在本发明的具体实施方案中，所述DC-CIK细胞是指树突状细胞-细胞因子诱导的杀伤 细胞(Dendritic cells-Cytokine-induced killer cells，DC-CIK)，其中，DC细胞是目前发现的 人体功能最强的专职抗原递呈细胞，能有效识别、摄取、加工抗原，激活获得性免疫***， 促使机体MHC分子、共刺激分子、黏附分子实现高表达，在抗肿瘤、抗感染、移植免疫上 发挥重要作用；CIK细胞是一类异质细胞群，能通过自身细胞毒性与分泌性细胞因子发挥高 效肿瘤杀伤细胞功能。
在本发明的具体实施方案中，本发明通过实验证明了本发明所述共培养CIK细胞中主 要发挥作用的为CD8+T细胞，因此，CD8+T细胞和肿瘤抗原结合肽-工程化免疫细胞联合 在制备用于治疗***癌的药物组合物中的应用、包含CD8+T细胞和肿瘤抗原结合肽-工程 化免疫细胞的药物组合物也包含在本发明的保护范围内，故本发明所述的共培养CIK细胞、 肿瘤抗原结合肽-工程化免疫细胞联合包括以下组合：
(1)共培养CIK细胞、肿瘤抗原结合肽-工程化免疫细胞；
(2)CD8+T细胞、肿瘤抗原结合肽-工程化免疫细胞。
第二方面，本发明提供了共培养CIK细胞和肿瘤抗原结合肽-工程化免疫细胞联合在制 备用于治疗癌症的药物中的应用；优选地，所述癌症为***癌。
进一步，所述肿瘤抗原结合肽-工程化免疫细胞为本发明第一方面中所述的肿瘤抗原结 合肽-工程化免疫细胞，所述共培养CIK细胞为本发明第一方面中所述的共培养CIK细胞。
第三方面，本发明提供了一种共培养CIK细胞的制备方法。
进一步，所述方法包括如下步骤：
(1)DC细胞的培养；
(2)CIK细胞的培养；
(3)将步骤(1)培养得到的DC细胞和步骤(2)培养得到的CIK细胞在培养基中混合，加 入***癌细胞共培养，收集悬浮的DC-CIK混合物即为共培养CIK细胞。
进一步，所述步骤(1)包括如下步骤：
(a)第0天，在DC细胞生长培养基中培养PBMC细胞；
(b)第3天，更换DC细胞生长培养基；
(c)第6天，在DC细胞生长培养基中添加DC细胞成熟因子；
(d)第8天，收集细胞，得到DC细胞；
优选地，步骤(a)中所述DC细胞生长培养基中添加的物质包括FBS、DC细胞培养因子；
更优选地，步骤(a)中所述DC细胞生长培养基中添加的物质包括5％FBS、2U/mL DC细胞培养因子；
优选地，步骤(c)中所述DC细胞成熟因子最终浓度为2U/mL。
进一步，所述步骤(2)包括如下步骤：
(a)第0天，在CIK细胞活化培养基中培养PBL细胞；
(b)第3、4、6天，用CIK细胞增殖培养基补充细胞培养物；
(c)第8天，收集细胞，得到CIK细胞；
优选地，步骤(a)中所述CIK细胞活化培养基中添加的物质包括KBM551、FBS、抗CD3抗体、IFN-γ、IL-1α、IL-2；
更优选地，步骤(a)中所述CIK细胞活化培养基中添加的物质包括KBM551、3％FBS、50ng/mL抗CD3抗体、1000U/mL IFN-γ、100U/mL IL-1α、500U/mL IL-2；
优选地，步骤(a)中所述PBL细胞的细胞密度为1.5×106/mL；
优选地，步骤(b)中所述CIK细胞增殖培养基中添加的物质包括KBM551、FBS、IL-2；
更优选地，步骤(b)中所述CIK细胞增殖培养基中添加的物质包括KBM551、3％FBS和500U/mL IL-2。
进一步，所述步骤(3)中培养基为CIK细胞增殖培养基；
优选地，所述DC细胞的细胞密度为4×107/mL；
优选地，所述CIK细胞的细胞密度为1×108/mL；
优选地，所述***癌细胞的细胞密度为1×107/mL；
优选地，所述共培养的条件为5％CO2、37℃、24h；
优选地，所述***癌细胞包括C4-2、LNCaP、PC-3、DU145；
更优选地，所述***癌细胞为C4-2。
第四方面，本发明提供了根据本发明第三方面所述的方法制备得到的共培养CIK细胞 在制备用于治疗癌症的药物中的应用；
优选地，所述癌症为***癌。
在本发明的具体实施方案中，所述PBMC细胞为外周血单个核细胞(Peripheralblood mononuclear cell，PBMC)，是外周血中具有单个核的细胞，包括淋巴细胞和单核细胞；所 述PBL细胞为外周血淋巴细胞(Peripheral blood lymphocyte，PBL)，由T细胞和B细胞组 成。
此外，本发明还提供了一种治疗***癌患者的方法，所述方法包括：给有需要的受 试者施用有效量的共培养CIK细胞和TABP-EIC-WTN细胞、和/或本发明第一方面所述的药 物组合物。
本发明的优点和有益效果：
本发明首次将共培养CIK细胞和TABP-EIC-WTN细胞两者联合用于***癌的治疗中， 且通过实验证明了上述联合对***癌具有较好的治疗效果，此外，本发明克服了目前本领 域存在的技术缺陷，在临床治疗***癌中具有较好的应用前景。
附图说明
以下，结合附图来详细说明本发明的实施方案，其中：
图1为多肽WTN与PSMA表达量较高的Lncap细胞系的免疫荧光结果图；
图2为多肽WTN与PSMA表达量低的PC3细胞系的免疫荧光结果图；
图3为C4-2 GFP细胞与TABP-EIC-WTN细胞共培养2、6、12、24小时的流式检测结果图；
图4为ELISA测量IFN-γ分泌水平的结果图；
图5为不同浓度IFN-γ下C4-2细胞上PD-L1的表达量检测结果图；
图6为与TABP-EIC-WTN细胞共培养24小时的C4-2细胞上PD-L1的表达量检测结果图；
图7为与C4-2细胞共培养的TABP-EIC-WTN细胞的PD-L1的表达量检测结果图；
图8为与C4-2细胞共培养的TABP-EIC-WTN细胞的PD-1的表达量检测结果图；
图9为不同浓度IFN-γ刺激下TABP-EIC-WTN细胞的PD-L1的表达量检测结果图；
图10为流式细胞术图和汇总数据的结果图，其中，图中显示PD-L1在TABP-EIC-WTN细 胞上的表达量，TABP-EIC-WTN细胞使用普通培养基培养，及从TABP-EIC-WTN+C4-2细 胞共同培养12小时后获得的上清，在两种培养基培养的TABP-EIC-WTN细胞中，PD-L1 表达百分比没有显著差异；
图11为细胞共孵育装置的示意图，其中，C4-2细胞被接种在底部，TABP-EIC-WTN细胞接 种在上部区域，内部和外部空间由过滤膜分离，它允许细胞因子通过，但阻止 TABP-EIC-WTN细胞与C4-2细胞直接接触；
图12为流式细胞术图和汇总数据的结果图；
图13为共培养/单独培养的TABP-EIC-WTN/C4-2细胞的转录差异分析结果图，A图：共培 养的TABP-EIC-WTN和单独培养的TABP-EIC-WTN细胞之间失调基因的火山图，B图：共培养的C4-2和单独培养的C4-2细胞之间失调基因的火山图；
图14为KEGG通路富集分析结果图，A图：共培养的TABP-EIC-WTN中的上调基因，B图：共培养的TABP-EIC-WTN中的下调基因，C图：共培养的C4-2细胞中的上调基因；
图15为流式检测结果图，A图：TABP-EIC-WTN细胞上NKG2D的表达量，B图：C4-2细胞上MICA/B的表达量；
图16为参与PD-L1表达的信号通路上的蛋白的Western blot结果图，A图：不加NKG2D 阻断剂时的检测结果图，B图：加NKG2D阻断剂时的检测结果图；
图17为参与PD-L1表达的信号通路上的蛋白的表达量统计结果图，A图：PD-L1，B图： p-PI3K，C图：p-AKT，D图：p-mTOR，E图：p-JAK1，F图：p-JAK2，G图：p-STAT1；
图18为与TABP-EIC-WTN共培养的C4-2 GFP细胞的生物发光强度(BLI)检测结果图，A 图：检测结果图，B图：统计结果图；
图19为增加atezolizumab或nivolumab时TABP-EIC-WTN对肿瘤细胞的抑制率结果图，A 图：E：T＝1：1，B图：E：T＝5：1；
图20为加入Atezolizumab或nivolumab时TABP-EIC-WTN细胞的IFN-γ分泌的检测结果图；
图21为流式细胞术图和汇总数据结果图，A图：流式细胞术图，B图：统计结果图，其中， 图中显示由C4-2细胞诱导产生的CD107a在TABP-EIC-WTN细胞上的表达情况(在加入atezolizumab或nivolumab时)，TABP-EIC-WTN细胞与C4-2细胞以1：1比例在37℃培养 条件下共孵育20小时，然后用atezolizumab(20μg/mL)或nivolumab(20μg/mL)收集和 处理TABP-EIC-WTN细胞，然后进行检测；
图22为第7、14、21天各组小鼠肿瘤大小的检测结果图；
图23为加或不加共培养的CIK时的肿瘤抑制情况结果图，A图：不加共培养的CIK时的肿 瘤抑制情况，B图：加共培养的CIK时的肿瘤抑制情况；
图24为肿瘤细胞免疫组化染色图，A图：染色结果图，B图：统计结果图；
图25为对有无共培养的CIK处理的小鼠的肿瘤大小分别进行统计的统计结果图，A图：有 共培养的CIK，B图：无共培养的CIK；
图26为切除的肿瘤的实物图及肿瘤重量的统计结果图，A图：实物图，B图：统计结果；
图27为共培养CIK中的CD3、CD8和CD56的表达量检测，A图：对照，B图：CD3，C 图：CD8，D图：CD56，E图：CD3 CD56，F图：统计结果图；
图28为对照组、CIK治疗组和共培养CIK治疗组小鼠的肿瘤生长情况结果图，A图：小鼠 肿瘤生长情况，B图：BLI测量值的统计分析；
图29为第5、10、20天的对照组、CIK治疗组和共培养CIK治疗组小鼠肿瘤体积的统计结 果图；
图30为一位***癌患者接受ADT后的血清睾酮和PSA水平变化曲线图，A图：血清睾 酮，B图：PSA；
图31为***癌患者肿瘤组织HE染色图(100倍与200倍)，A图：100倍，B图：200倍；
图32为流式细胞术图和汇总数据柱状图，A图：流式细胞术图，B图：统计结果图，C图： 统计结果图，其中，图中显示与TABP-EIC-WTN细胞孵育24小时的原发性***癌细胞上PD-L1的表达情况，(右)CCK-8检测结果，显示atezolizumab(20μg/mL)而不是nivolumab(20μg/mL)显著增强了对TABP-EIC-WTN的抑制效果，E：T＝1：1。
具体实施方式
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明，仅用于解释本发明，而不能理解为对本发明 的限制。本领域的普通技术人员可以理解为：在不脱离本发明的原理和宗旨的情况下可以对 这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由权利要求及其等同物限定。 下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件或按照厂商所建议的条件实施 检测。
实施例1肽库筛选
1、实验目的
本发明采用Ph.D.-12噬菌体展示肽库试剂盒筛选出与PSMA特异性结合的多肽WTN。
2、Ph.D.-12噬菌体展示肽库试剂盒组成
随机十二肽噬菌体展示文库：100μL，1.5×1013pfu/mL，贮存于含50％甘油的TBS溶液中，复杂度～2.7×109个转化子；-28gIII测序引物：5’-HOGTATGGGATTTTGCTAAACAA C-3’，100pmol，1pmol/μL；-96gIII测序引物：5’-HOCCCTCATAGTTAGCGTAACG-3’，1 00pmol/μL，1pmol/μL；E.coli ER2738宿主菌F’lacIqΔ(lacZ)M15 proA+B+zzf::Tn10(TetR) /fhuA2supE thiΔ(lac-proAB)Δ(hsdMS-mcrB)5(rk–mk–McrBC–)：该菌株以含50％甘油的菌 体培养物形式提供，非感受态细胞，贮存于-70℃；链霉亲和素Streptavidin，冻干粉1.5mg；生物素：10mM 100μL。
3、实验方法
第一天
根据需要同时在其上进行文库淘选的靶分子的数量和种类不同，淘选试验在单个灭菌聚 苯乙烯培养皿、12或24孔板、96孔微量板中进行，每种靶分子至少包被一个板(或一个孔)， 下述方法中给出的量是60×15mm培养皿的用量，括号中为微孔板的用量，其他中等尺寸的 孔相应地调整此用量，但每种情况下，加入的噬菌体数量都是相同的：1.5×1011个病毒子；
(1)准备100μg/mL的靶分子溶液(溶于0.1M pH 8.6的NaHCO3)，若需要稳定靶分子， 也可使用其他相似离子强度的缓冲液(含金属离子等)；
(2)每板(孔)加入1.5mL(微孔板每孔150μL)上述溶液，反复旋转直到表面完全湿润；
(3)在增湿容器(如：排列有湿纸巾的可封口塑料盒)中4℃轻微震荡，孵育过夜，平板在此容器中4℃贮存备用；
第二天
(4)挑ER2738单克隆(噬菌体滴度测定时铺的板)于10mL LB液体培养基中，如果同一 天扩增洗脱的噬菌体，也可将ER2738接种于20mL LB液体培养基，用250mL三角瓶，37℃剧烈震荡培养；
(5)倒掉每板中的包被液，板倒置在干净的纸巾上用力拍甩以除去残余溶液，每板(或 孔)加满封阻液，4℃作用至少1h；
(6)速洗板6次，每次均旋转以使板或孔的底部及边缘均被洗到，倾去缓冲液，倒置在 干净纸巾上拍甩以除去残余溶液(或使用自动洗板机)；
(7)用1mL(微孔板则用100μL)的TBST缓冲液稀释4×1010的噬菌体(即10μL的原始文库)，然后加到已包被好的板上，室温温和摇动10-60min；
(8)倾倒除去未结合噬菌体，倒置板在干净的纸巾上拍甩除去残余溶液；
(9)按6中所述方法用TBST缓冲液洗板10次，每次换一干净纸巾以避免交叉污染；
(10)根据所研究的分子间相互作用，用1mL(微孔板则用100μL)适当的洗脱缓冲液洗脱结合的噬菌体，将靶分子的已知配体以0.1-1mM的浓度溶于TBS溶液中或者用游离靶分子溶液(～100μg/mL溶于TBS中)从固定靶分子上将结合的噬菌体竞争性洗脱下来，室温温和摇动10-60min，将洗脱液吸入另一干净微量离心管中；也可用非特异性缓冲液如0.2MGlycine-HCl(pH 2.2)，1mg/mL BSA来分离已结合的分子：温和摇动>10min，洗脱液吸入另一干净微量离心管中，然后再用150μL(微量孔则用15μL)1M Tris-HCl(pH 9.1)中和上述洗脱液；
(11)按上述常规M13方法中的程序测定少量(～1μL)洗脱物的滴度，如需要，可对第 一或第二轮洗脱物滴度测定所得的噬菌斑进行测序，方法见下述：必要时可将剩余洗脱物4℃ 贮存过夜，第二天扩增，这时，可将ER2738在LB-Tet培养基中过夜培养，第二天将培养物 1:100稀释于20mL LB中(用250mL三角瓶盛装)，加入未扩增洗脱物，37℃剧烈摇动培养4.5 h，继续第13步；
(12)扩增剩余洗脱物：将洗脱物加入到20mL ER2738培养物中(菌体处于对数前期)， 37℃剧烈摇动培养4.5h；
(13)将培养物转入一离心管中，然后，4℃10,000rpm离心10min。上清液转入另一离 心管中，再离心；
(14)将上清的上部80％转入一新鲜管中，加入1/6体积的PEG/NaCl，让噬菌体4℃沉淀至 少60min，过夜；
第三天
(15)4℃10,000rpm离心PEG沉淀15min，倒掉上清液，再短暂离心，吸去残留上清液；
(16)沉淀物重悬于1mL TBS中，悬液转入微量离心管中，4℃离心5min使残余细胞沉 淀；
(17)上清转入另一新鲜微量离心管，用1/6体积的PEG/NaCl再沉淀，冰上孵育15-60min， 4℃离心10min，弃上清，再短暂离心，用微量移液器吸去残余上清；
(18)沉淀物重悬于200μL TBS，0.02％NaN3中，离心1min，沉淀任何残余的不溶物，上清转入新鲜管中，此即为扩增后的洗脱物；
(19)根据上述常规M13方法用LB/IPTG/Xgal平板滴定扩增后的洗脱物，4℃贮存；
(20)再包被一个板或孔准备第二轮淘选时用；
第四和第五天
(21)计数板上蓝斑数确定滴度，用这个值来计算相应于1-2×1011pfu的加入量；若滴度 太低，接下来的几轮淘选可用低至109pfu的噬菌体加入量进行试验；
(22)进行第二轮淘选：用第一轮淘选扩增的洗脱物中1-2×1011pfu的噬菌体量重复步骤 4-18，在清洗步骤中将Tween的浓度增至0.5％(v/v)；
(23)在LB/IPTG/Xgal平板上测定第二轮淘选所得洗脱物扩增后的滴度；
(24)再包被一个板或孔准备第三轮淘选时用；
第六天
(25)进行第三轮淘选：用第二轮淘选扩增的洗脱物中2×1011pfu的噬菌体量重复步骤4-11，清洗步骤中同样用0.5％(v/v)的Tween；
(26)在LB/IPTG/Xgal平板上测定第三轮淘选所得洗脱物未扩增时的滴度，第三轮洗脱 物不必再扩增，除非还要进行第四轮淘选，滴度测定时得到的噬菌斑可做测序用：只要注意 平板培养时间不要超过18h，培养时间过长容易出现缺失，其余洗脱物4℃贮存；
(27)挑一ER2738单克隆于LB-Tet培养基中培养过夜。
4、实验结果
实验结果显示，筛选得到的与PSMA特异性结合的多肽WTN，其氨基酸序列为WTNHHQHSKVRE(SEQ ID NO:1)。
实施例2 WTN多肽特异性的验证
1、实验方法
将WTN多肽分别与PSMA表达量较高的Lncap细胞系及PSMA表达量低的PC3细胞 系进行免疫荧光检测，所用荧光标记物为FITC(即FITC标记的WTN多肽)。
2、实验结果
WTN多肽与Lncap细胞系的荧光检测如图1所示，WTN多肽与PC3细胞系的荧光检 测如图2所示；图1中圆点中心是细胞核，圆点周围的浅色是WTN与细胞表面抗原PSMA 结合而展现的荧光；图2中仅有细胞核的染色，可见WTN所标记的细胞表面荧光只在图1 中出现，证明了WTN与细胞表面抗原PSMA的结合具有很高的特异性。
实施例3本发明所涉及的细胞系、及其培养方法、构建方法
1、TABP-EIC-WTN的构建方法
(1)制备TABP-EIC-WTN细胞
本专利涉及实验使用到的NK细胞均为来源于外周血单核细胞(PBMC)扩增获得。
(2)肿瘤抗原结合肽表达载体的构建
肿瘤抗原结合肽结构(完整结构为：WTN多肽区-CD8α铰链区-2B4跨膜结构域-2B4共刺激结构域-NKG2D初级信号传导结构域，核酸序列如SEQ ID NO:12所示)序列均为基 因合成获得(通用生物)，表达载体为pLenti-EF1a-Backbone(NN)(addgene#27961)。 肿瘤抗原结合肽结构***酶切位点为BsiWI及EcoRI(即将SEQ ID NO:12所示序列替换酶 切位点BsiWI-EcoRI之间的序列)。***肿瘤抗原结合肽结构后该载体称为TABP-EIC-WTN 骨架载体，该载体即可表达氨基酸序列为SEQ ID NO:11的肿瘤抗原结合肽。
(3)慢病毒包装
将TABP-EIC-WTN骨架载体及辅助载体pMD2.G(addgen#12259)、pMDLg/pRRE(addgene#12251)、pRSV-Rev(addgene#12253)按10:7:5:3比例混合，20μg质粒每10mL 转染体系，转染293T细胞。转染后48小时、72小时收集上清，纯化浓缩后获得慢病毒。
(4)慢病毒转导
将浓缩后的慢病毒与NK细胞按每100万细胞200μL纯化后慢病毒混合，之后置于37℃ 培养箱5％CO2条件培养，24小时后完全换液。
(5)TABP-EIC-WTN细胞的扩增：将慢病毒感染后获得的TABP-EIC细胞正常培养扩增。
(6)TABP-EIC-WTN细胞肿瘤抗原结合肽表达效率的检测：(为单克隆100％阳性)。
2、其他细胞系的培养方法
(1)C4-2细胞：表达PSMA的人CRPC细胞系(***癌细胞系)，C4-2细胞在含有10％胎牛血清FBS(Biological Industries)和1％青霉素/链霉素(Hyclone)的RPMI-1640培 养基(Servicebio)中培养；
为方便观察肿瘤抑制情况，通过单细胞克隆方法建立了稳定表达GFP的C4-2细胞系以 下简称为C4-2 GFP。
(2)NK92细胞：人恶性非霍奇金淋巴瘤自然杀伤细胞系，NK92和TABP-EIC-WTN细胞在补充有20％FBS、0.2mM肌醇(Sigma)、0.1mMβ-巯基乙醇(PAN-Biotech)、0.02mM 叶酸(Sigma)、200U/mL的重组人IL-2(SL Pharm)和1％青霉素-链霉素alpha MEM培 养基(Gibco)中培养。
(3)293T细胞：人胚胎肾细胞系，来自美国典型培养物保藏中心ATCC，293T细胞在DMEM培养基(Hyclone)或opti-MEM(Gibco)中培养；
(4)PCa细胞(***癌细胞)：来自一名接受根治性***切除术的CRPC患者的***组织。
本发明所述的细胞培养均在37℃、5％CO2的潮湿环境中培养。
实施例4与TABP-EIC-WTN细胞共培养的C4-2细胞上PD-L1的表达上调依赖于IFN-γ
将C4-2 GFP细胞与TABP-EIC-WTN细胞共同培养，在第2、6、12、24小时进行流式 检测，结果如图3所示：并且对C4-2细胞表达的PD-L1进行检测，结果如图3所示：C4-2 细胞的PD-L1的平均荧光强度(MFI)和表达PD-L1的C4-2细胞所占百分比随时间增长显 著上调。
对TABP-EIC-WTN细胞进行培养，在有无C4-2 GFP共培养的情况下，通过ELISA测量培养基上清液中第2、6、12、24小时时间点的IFN-γ分泌水平，结果如图4所示。
向C4-2细胞中加入IFN-γ，并在不同浓度IFN-γ下C4-2细胞上PD-L1的表达量，结果 如图5所示：PD-L1的平均荧光强度(MFI)和表达PD-L1的C4-2细胞所占百分比都以浓 度依赖性的方式增加。
而在使用IFNγ阻滞剂(IFNγ单抗)的情况下，与TABP-EIC-WTN细胞共培养24小时的C4-2细胞上PD-L1的表达量检测结果如图6所示：IFNγ阻滞剂完全逆转了与 TABP-EIC-WTN细胞共培养的C4-2的PD-L1的上调。
以上实验结果表明了与TABP-EIC-WTN细胞共培养的C4-2细胞上PD-L1的表达上调依赖于IFN-γ。
实施例5与C4-2细胞共培养的TABP-EIC-WTN细胞上PD-L1表达的上调依赖于直接细 胞接触
共培养TABP-EIC-WTN细胞与C4-2细胞，在第2、6、12、24小时测量TABP-EIC-WTN 的PD-L1和PD-1的表达量，结果分别如图7、图8所示。结果显示：PD-L1或PD-1阳性 的TABP-EIC-WTN的百分比随时间延长显著上调。
使用不同浓度IFN-γ刺激TABP-EIC-WTN细胞，TABP-EIC-WTN细胞上PD-L1的表达量的流式检测图如图9所示。IFN-γ刺激后，TABP-EIC-WTN细胞的PD-L1的表达量没有 显著变化。
实施例6 TABP-EIC-WTN/C4-2细胞的共培养/单独培养的转录差异分析
使用TRIzol(Invitrogen)从样品中提取总RNA。在通过DNaseI提取RNA后进行DNA消化。RNA质量通过使用NanodropTM OneC分光光度计(Thermo Fisher Scientific Inc)检查A260/A280来确定。RNA完整性通过1.5％琼脂糖凝胶电泳确认。最终通过Qubit3.0和QubitTM RNA Broad Range Assay kit(Life Technologies)对合格的RNA进行定量。
使用KC-Digital TM Stranded mRNA Library Prep Kit for
Figure BDA0003510166760000151
(SeqhealthTechnology Co.，Ltd.)将2μg总RNA用于RNA测序文库制备。对应于200-500bps的文库产物在Illumina Novaseq 6000上被富集、定量并最终测序。
原始测序数据首先由Trimmomatic(0.36版)过滤，使用内部脚本进一步处理CleanReads， 以消除文库制备和测序中引入的重复偏差。简而言之，clean read首先根据UMI序列进行聚 类，其中具有相同UMI序列的read被分组到同一簇中，从而产生65，536个簇。通过成对 比对将同一簇中的读数相互比较，然后将序列同一性超过95％的读数提取到新的子簇中。 子集群生成后，进行多序列比对以获得每个子簇的一个共有序列。在这些步骤之后，消除了 由PCR扩增或测序引入的任何错误和偏差。
使用STAR软件(版本2.5.3a)将它们映射到来自Homo_sapiens.GRCh38 (ftp://ftp.ensembl.org/pub/release-87/fasta/homo_sapiens/dna/)的智人参考基因组数据。通过 特征计数(Subread-1.5.1；Bioconductor)计算映射到每个基因外显子区域的读数，然后计算 RPKM。使用edgeR包(版本3.12.1)鉴定组间差异表达的基因。FDR校正的p值截止值为 0.05，倍数变化截止值为2，用于判断基因表达差异的统计显著性。
差异表达基因的基因本体(GO)分析和KEGG富集分析均由KOBAS软件(版本：2.1.1)实施，校正P值截止值为0.05，以判断具有统计学意义的富集。通过使用rMATS(版本3.2.5)检测可变剪接事件，FDR值截止值为0.05，Δψ绝对值为0.05。
共培养的TABP-EIC-WTN和单独培养的TABP-EIC-WTN细胞之间失调基因的火山图如 图13A所示，共培养的C4-2和单独培养的C4-2细胞之间失调基因的火山图如图13B所示。在图13中，倍数变化大于2.0且P<0.05的差异表达基因用颜色标记。P值是使用双侧非配 对学生t检验计算的。
对图13A中共培养中上调基因的KEGG通路富集分析如图14A所示、下调基因如图14B 所示。对图13B中共培养中上调基因的KEGG通路富集分析如图14C所示。在图14中， 圆点的颜色代表丰富因子，大小代表每个KEGG词条的输入数量。横轴表示富集的重要性。 纵轴表示富集的KEGG通路。
TABP-EIC-WTN细胞上NKG2D表达量检测如图15A所示。C4-2细胞上MICA/B表达 量检测如图15B所示。图15为细胞表面marker检测(确定对应标志物表达量)。
实施例7 TABP-EIC-WTN和C4-2细胞共培养时涉及PD-L1表达的信号通路
TABP-EIC-WTN单独培养或与C4-2细胞(E：T＝1：1)共培养24小时，然后提取蛋白进行检测。
图16-17是对蛋白水平的检测分析，共培养的TABP-EIC-WTN中的PD-L1(图16A、17A)、p-PI3K(图16A、17B)、p-AKT(图16A、17C)、p-mTOR(图16A、17D)的 蛋白质印迹分析分别如图中的标注所示。TABP-EIC-WTN，阻断TABP-EIC-WTN，NK92， 共培养NK92，阻断NK92细胞。
在与C4-2细胞共培养之前，将NKG2D阻断剂(NKG2D单抗)加入TABP-EIC-WTN 或NK92细胞并在37℃下孵育1小时。NKG2D阻断剂抑制NK92细胞而非TABP-EIC-WTN 细胞中PI3K/AKT/mTOR通路的激活。
IFNγ介导的JAK/STAT激活蛋白成员的蛋白质印迹分析包括与TABP-EIC-WTN细胞共 培养的C4-2细胞中的p-JAK1(图16B、17E)、p-JAK2(图16B、17H)和p-STAT1(图 16B、17G)与未经任何处理的C4-2细胞相比。
以上实验结果表明了TABP-EIC-WTN和C4-2细胞共培养时涉及PD-L1表达的信号通路。
实施例8用atezolizumab或nivolumab处理的TABP-EIC-WTN细胞的细胞毒活性检测
对与C4-2 GFP细胞共培养的TABP-EIC-WTN进行发光强度检测，结果如图18所示：与TABP-EIC-WTN共培养的C4-2 GFP细胞在用10、20、40μg/mL浓度的atezolizumab或nivolumab处理时的生物发光强度(BLI)。
CCK-8检测结果显示atezolizumab(20μg/mL)显著增强了TABP-EIC-WTN对***癌细胞的抑制率，而nivolumab(20μg/mL)略微增强了TABP-EIC-WTN对***癌细胞的 抑制率。E：T为1：1、5：1时的结果分别如图19A和图19B所示。表明了TABP-EIC-WTN 和PD-L1抑制剂联合可有效治疗***癌。
使用ELISA，在加入Atezolizumab或nivolumab第2、6小时检测Atezolizumab或nivolumab对TABP-EIC-WTN细胞的IFN-γ分泌的影响，结果如图20所示：Atezolizumab(10、20、40μg/mL)增加了与C4-2细胞孵育的TABP-EIC-WTN细胞的IFN-γ分泌。
TABP-EIC-WTN细胞在37℃下以1：1的比例与C4-2细胞共孵育20小时后，然后收集TABP-EIC-WTN细胞并用atezolizumab(20μg/mL)或nivolumab(20μg/mL)处理，然后 使用流式细胞仪检测在存在atezolizumab或nivolumab的情况下，由C4-2细胞诱导的TABP-EIC-WTN细胞中CD107a的表达情况，结果如图21所示，说明激活的NK细胞主要 通过两种的细胞信号通路产生细胞毒性作用，一种涉及穿孔素和颗粒酶B，另一种涉及目标 细胞死亡配体，包括TRAIL和FASL。在atezolizumab存在条件下，CD107a以依赖ADCC 的方式在TABP-EIC-WTN细胞中的表达显著增加。此外，图19-21的结果表明了atezolizumab 的效果显著优于nivolumab。
实施例9 TABP-EIC-WTN与atezolizumab或nivolumab在体内CD8+T细胞存在或不存在 的情况下对C4-2细胞的抗肿瘤作用
1、制备与C4-2细胞共培养的DC-CIK
外周血单个核细胞(PBMC)或淋巴细胞(PBL)从正常健康受试者的捐献血样中通过Ficoll-Paque(TBD science)分离，然后以460g密度梯度离心40分钟，用盐水洗涤两次并在DC贴壁培养基中培养，DC贴壁培养基由X-VIVO(Lonza)和5％FBS(Gibco)组成。 孵育1小时后，收集粘附的PBMC(单核细胞)用于DC培养，收集悬浮的PBL用于细胞 因子诱导的杀伤细胞(CIK)培养(第0天)。
贴壁单核细胞在由X-VIVO(Lonza)组成的DC生长培养基中培养，培养基中还含有5％FBS和2U/mL DC培养因子(Novoprotein)，在37℃，CO2培养箱中的培养，然后在 第3天更换DC生长培养基一半，第6天添加DC成熟因子(Novoprotein)(最终浓度为2 U/mL)，第8天最后收集。
对于CIK的培养，调整悬浮的PBLs密度至1.5×106/mL并在含有KBM551(康宁)、3％FBS、50ng/mL抗CD3抗体(北京天联生物科技)、1000U/mL IFN-γ(北京天联生物 科技)、100U/mL IL-1α(北京天龙生物科技)和500U/mL IL-2(SL Pharm)的CIK活化 培养基中培养。在第3天、第4天和第6天用含有KBM551、3％FBS和500U/mL IL-2的 CIK增殖培养基补充细胞培养物，在此期间细胞密度保持在1.5×106个细胞/mL以上。
在第8天，收获约4×107DC和1×108CIK，离心，然后在150mL CIK增殖培养基中混合。然后将DC-CIK混合物加入到接种含有1×107个C4-2贴壁细胞的T75培养瓶中，并在 5％CO2的湿润环境中在37℃下共培养。
共培养24小时后，收获悬浮的DC-CIK混合物并将其命名为“共培养CIK(图上标记为cocultured CIK)”。
2、模型小鼠的构建及培养
5周龄雄性NOD/SCID小鼠购自北京维塔尔河实验动物技术公司，饲养于国家癌症中心 分子肿瘤学国家重点实验室无特定病原体动物设施。所有实验程序均经我院伦理委员会批准， 并按照实验动物护理原则(NIH出版物第25卷，1996年修订第28期)进行。在小鼠上腹 部皮下接种悬浮在200μL PBS中的2×106C4-2细胞。在第7天肿瘤体积达到100-200mm3时开始治疗，将接种C4-2的小鼠随机分为七组：
(i)对照(Control)组，
(ii)TABP-EIC-WTN组，
(iii)TABP-EIC-WTN+nivolumab组，
(iv)TABP-EIC-WTN+atezolizumab组，
(v)TABP-EIC-WTN+共培养的CIK(cocultured CIK)组，
(vi)TABP-EIC-WTN+nivolumab+共培养的CIK组，
(vii)TABP-EIC-WTN+atezolizumab+共培养的CIK组。
在肿瘤接种后第7、9、11、13、15天施用PD-L1抗体atezolizumab(GlpBio，GC32704)(20mg/kg)或PD-1抗体nivolumab(GlpBio，GC34218)(10mg/kg)或对照PBS尾静脉 注射共5剂，而TABP-EIC-WTN治疗是在PD-L1/PD-1抗体治疗后第8、10、12、14、16 天注射5×106TABP-EIC-WTN，用于共静脉注射5剂。
第17天在TABP-EIC-WTN治疗的基础上静脉注射共培养CIK，加或不加PD-L1/PD-1抗体。
肿瘤体积计算公式：L×W2/2，其中L和W代表最长和最短在第7、10、14、16、18、 20天通过卡尺测量的直径。还通过使用
Figure BDA0003510166760000181
光谱CT检测生物发光强度(BLI)评估治疗 前后的肿瘤大小，如在肿瘤细胞植入后第7、14、21天所述，测量BLI并表示为辐射度 (p/sec/cm2/sr)。
在第21天处死所有小鼠，收集肿瘤、拍照、称重并收集用于组织学检查。
3、实验结果
在第7、14、21天测量以上各组植入C4-2 GFP细胞小鼠的肿瘤大小(n＝3-4)，结果图 如图22所示。对有无共培养的CIK处理的小鼠的肿瘤大小分别进行统计，在无共培养的CIK治疗的各小组的肿瘤体积统计如图25A，有共培养的CIK治疗的各小组的肿瘤体积统 计如图25B。
切除的肿瘤的实物图如图26A所示，肿瘤重量的统计分析如图26B所示，图上数值表 示为平均值±SD，*代表P<0.05；NS代表无显著差异。
为分析共培养的CIK对肿瘤的抑制作用，分别测量加或不加共培养的CIK时的肿瘤抑 制情况，在第7、14、21天，对对照组、TABP-EIC-WTN治疗组、TABP-EIC-WTN+nivolumab 治疗组、TABP-EIC-WTN+atezolizumab治疗组进行定量BLI检测，结果如图23A。对对照 组、TABP-EIC-WTN治疗组、TABP-EIC-WTN+共培养CIK治疗组、 TABP-EIC-WTN+nivolumab+共培养CIK治疗组、TABP-EIC-WTN+atezolizumab+共培养CIK 治疗组进行定量BLI检测，结果如图23B。
对肿瘤细胞进行免疫组化染色，坏死的组织用10％中性缓冲***固定，石蜡包埋， 切成4μm厚切片，苏木精伊红(HE)染色进行光镜检查。坏死区在光学显微镜下被染成红 色，没有完整的细胞结构。NDP.view2查看软件(Hamamatsu Photonics，Shizuoka，Japan) 用于量化红色坏死区域相对于整个区域的百分比，大血管被排除在上述图像分析之外。结果 如图24A所示，在TABP-EIC-WTN治疗组中观察到明显的肿瘤坏死，atezolizumab的加入 显著增加了TABP-EIC-WTN治疗组肿瘤坏死的严重程度，统计结果如图24B所示。
以上实验结果表明了TABP-EIC-WTN和/或atezolizumab和/或共培养的CIK联合能够 有效***，即TABP-EIC-WTN与atezolizumab两者联合能够有效***； TABP-EIC-WTN与共培养的CIK两者联合能够有效***；TABP-EIC-WTN、atezolizumab 与共培养的CIK三者联合能够有效***。
实施例10共培养CIK的构成和功能鉴定
使用流式细胞术检测共培养CIK中的CD3、CD8和CD56表达，检测中细胞用以下抗体染色：来自BD Bioscience的CD3-APC、CD8-FITC、CD56-PerCP；对检测结果进行统计 分析的结果如图27所示。
第5天和第10天对对照组、CIK治疗组和共培养CIK治疗组小鼠进行荧光成像检测，C4-2 GFP植入肿瘤活性的BLI测量值和统计分析(n＝3)如图28所示。在第5、10、20天 进行测量并计算肿瘤体积，结果如图29所示。
以上实验结果表明了CIK、共培养CIK对肿瘤均有一定的治疗效果，本发明制备得到 的共培养CIK的治疗效果更好，显著优于对照组和CIK组。
实施例11 Atezolizumab在体外增强了TABP-EIC-WTN对来自一名***癌患者的CRPC 细胞的细胞毒性
随机挑选一位***癌患者，记录其接受ADT后的血清睾酮和PSA水平，结果分别如 图30A和图30B所示，在ADT后睾酮去势水平下，PSA水平从2021年5月开始连续上升 超过最低点。
2021年5月26日，患者在全身麻醉下成功接受机器人辅助***根治术(RARP)和双侧盆腔***清扫术。部分新鲜标本在从体内取出后2小时内送至实验室进行PCa细胞(***癌细胞)的原代培养。程序如下：CRPC组织用无菌生理盐水冲洗数次并切成3mm 厚的片。然后这些组织片被在37℃下用0.1％胶原酶I(Sigma)在alpha-MEM(Corning) 中消化2小时在摇动培养箱中。这些组织片用PBS洗涤3次，300g低速离心5分钟，去除 胶原酶I。用FBS(Gibco)预涂10cm细胞培养皿。
将组织接种在不含FBS的培养皿上，在37℃下在5％CO2的加湿培养箱中培养24小时， 然后加入10mLα-MEM并添加10％FBS至培养皿中进行进一步的细胞培养。
对肿瘤切片进行HE染色(×100)，染色结果如图31A所示，图31B为第14天原发性***癌细胞的光学显微照片(×200)。
将PCa(***癌细胞)与TABP-EIC-WTN细胞孵育24小时，流式检测PCa上PD-L1 的表达，结果如图32A和图32B所示，证明了Atezolizumab增强了TABP-EIC-WTN对CRPC 细胞的细胞毒性。
CCK-8测定分析加入atezolizumab/nivolumab时TABP-EIC-WTN细胞对肿瘤的抑制效果 (E：T＝1：1)，统计如图32C所示，结果表明atezolizumab(20μg/mL)显著增强了 TABP-EIC-WTN的抑制率(E:T＝1:1)，进一步表明了PD-L1抑制剂和TABP-EIC-WTN联 合可有效治疗***癌。
上述实施例的说明只是用于理解本发明的方法及其核心思想。应当指出，对于本领域的 普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明进行若干改进和修饰， 这些改进和修饰也将落入本发明权利要求的保护范围内。
序列表
<110> 呈诺再生医学科技（珠海横琴新区）有限公司
<120> 共培养CIK细胞和TABP-EIC-WTN细胞联合在治疗***癌中的用途
<141> 2022-02-17
<150> 2021107975479
<151> 2021-07-14
<160> 12
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
Trp Thr Asn His His Gln His Ser Lys Val Arg Glu
1 5 10
<210> 2
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
tggaccaacc accaccagca cagcaaggtg agagag 36
<210> 3
<211> 45
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala
1 5 10 15
Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly
20 25 30
Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp
35 40 45
<210> 4
<211> 135
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
accactaccc cagcaccgag gccacccacc ccggctccta ccatcgcctc ccagcctctg 60
tccctgcgtc cggaggcatg tagacccgca gctggtgggg ccgtgcatac ccggggtctt 120
gacttcgcct gcgat 135
<210> 5
<211> 35
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
Gln Asp Cys Gln Asn Ala His Gln Glu Phe Arg Phe Trp Pro Phe Leu
1 5 10 15
Val Ile Ile Val Ile Leu Ser Ala Leu Phe Leu Gly Thr Leu Ala Cys
20 25 30
Phe Cys Val
35
<210> 6
<211> 105
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
caggactgtc agaatgccca tcaggaattc agattttggc cgtttttggt gatcatcgtg 60
attctaagcg cactgttcct tggcaccctt gcctgcttct gtgtg 105
<210> 7
<211> 120
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
Trp Arg Arg Lys Arg Lys Glu Lys Gln Ser Glu Thr Ser Pro Lys Glu
1 5 10 15
Phe Leu Thr Ile Tyr Glu Asp Val Lys Asp Leu Lys Thr Arg Arg Asn
20 25 30
His Glu Gln Glu Gln Thr Phe Pro Gly Gly Gly Ser Thr Ile Tyr Ser
35 40 45
Met Ile Gln Ser Gln Ser Ser Ala Pro Thr Ser Gln Glu Pro Ala Tyr
50 55 60
Thr Leu Tyr Ser Leu Ile Gln Pro Ser Arg Lys Ser Gly Ser Arg Lys
65 70 75 80
Arg Asn His Ser Pro Ser Phe Asn Ser Thr Ile Tyr Glu Val Ile Gly
85 90 95
Lys Ser Gln Pro Lys Ala Gln Asn Pro Ala Arg Leu Ser Arg Lys Glu
100 105 110
Leu Glu Asn Phe Asp Val Tyr Ser
115 120
<210> 8
<211> 360
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
tggaggagaa agaggaagga gaagcagtca gagaccagtc ccaaggaatt tttgacaatt 60
tacgaagatg tcaaggatct gaaaaccagg agaaatcacg agcaggagca gacttttcct 120
ggagggggga gcaccatcta ctctatgatc cagtcccagt cttctgctcc cacgtcacaa 180
gaaccagcat atacattata ttcattaatt cagccttcca ggaagtctgg ttccaggaag 240
aggaaccaca gcccttcctt caatagcact atctatgaag tgattggaaa gagtcaacct 300
aaagcccaga accctgctcg attgagccgc aaagagctgg agaactttga tgtttattcc 360
<210> 9
<211> 51
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
Met Gly Trp Ile Arg Gly Arg Arg Ser Arg His Ser Trp Glu Met Ser
1 5 10 15
Glu Phe His Asn Tyr Asn Leu Asp Leu Lys Lys Ser Asp Phe Ser Thr
20 25 30
Arg Trp Gln Lys Gln Arg Cys Pro Val Val Lys Ser Lys Cys Arg Glu
35 40 45
Asn Ala Ser
50
<210> 10
<211> 153
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
atggggtgga ttcgtggtcg gaggtctcga cacagctggg agatgagtga atttcataat 60
tataacttgg atctgaagaa gagtgatttt tcaacacgat ggcaaaagca aagatgtcca 120
gtagtcaaaa gcaaatgtag agaaaatgca tct 153
<210> 11
<211> 316
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu
1 5 10 15
His Ala Ala Arg Pro Trp Thr Asn His His Gln His Ser Lys Val Arg
20 25 30
Glu Gly Gly Gly Ser Trp Thr Asn His His Gln His Ser Lys Val Arg
35 40 45
Glu Gly Gly Gly Ser Trp Thr Asn His His Gln His Ser Lys Val Arg
50 55 60
Glu Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile
65 70 75 80
Ala Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala
85 90 95
Gly Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp Gln Asp
100 105 110
Cys Gln Asn Ala His Gln Glu Phe Arg Phe Trp Pro Phe Leu Val Ile
115 120 125
Ile Val Ile Leu Ser Ala Leu Phe Leu Gly Thr Leu Ala Cys Phe Cys
130 135 140
Val Trp Arg Arg Lys Arg Lys Glu Lys Gln Ser Glu Thr Ser Pro Lys
145 150 155 160
Glu Phe Leu Thr Ile Tyr Glu Asp Val Lys Asp Leu Lys Thr Arg Arg
165 170 175
Asn His Glu Gln Glu Gln Thr Phe Pro Gly Gly Gly Ser Thr Ile Tyr
180 185 190
Ser Met Ile Gln Ser Gln Ser Ser Ala Pro Thr Ser Gln Glu Pro Ala
195 200 205
Tyr Thr Leu Tyr Ser Leu Ile Gln Pro Ser Arg Lys Ser Gly Ser Arg
210 215 220
Lys Arg Asn His Ser Pro Ser Phe Asn Ser Thr Ile Tyr Glu Val Ile
225 230 235 240
Gly Lys Ser Gln Pro Lys Ala Gln Asn Pro Ala Arg Leu Ser Arg Lys
245 250 255
Glu Leu Glu Asn Phe Asp Val Tyr Ser Met Gly Trp Ile Arg Gly Arg
260 265 270
Arg Ser Arg His Ser Trp Glu Met Ser Glu Phe His Asn Tyr Asn Leu
275 280 285
Asp Leu Lys Lys Ser Asp Phe Ser Thr Arg Trp Gln Lys Gln Arg Cys
290 295 300
Pro Val Val Lys Ser Lys Cys Arg Glu Asn Ala Ser
305 310 315
<210> 12
<211> 951
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
atggccttac cagtgaccgc cttgctcctg ccgctggcct tgctgctcca cgccgccagg 60
ccgtggacca accaccacca gcacagcaag gtgagagagg gcggcggcag ctggaccaac 120
caccaccagc acagcaaggt gagagagggc ggcggcagct ggaccaacca ccaccagcac 180
agcaaggtga gagagaccac taccccagca ccgaggccac ccaccccggc tcctaccatc 240
gcctcccagc ctctgtccct gcgtccggag gcatgtagac ccgcagctgg tggggccgtg 300
catacccggg gtcttgactt cgcctgcgat caggactgtc agaatgccca tcaggaattc 360
agattttggc cgtttttggt gatcatcgtg attctaagcg cactgttcct tggcaccctt 420
gcctgcttct gtgtgtggag gagaaagagg aaggagaagc agtcagagac cagtcccaag 480
gaatttttga caatttacga agatgtcaag gatctgaaaa ccaggagaaa tcacgagcag 540
gagcagactt ttcctggagg ggggagcacc atctactcta tgatccagtc ccagtcttct 600
gctcccacgt cacaagaacc agcatataca ttatattcat taattcagcc ttccaggaag 660
tctggttcca ggaagaggaa ccacagccct tccttcaata gcactatcta tgaagtgatt 720
ggaaagagtc aacctaaagc ccagaaccct gctcgattga gccgcaaaga gctggagaac 780
tttgatgttt attccatggg gtggattcgt ggtcggaggt ctcgacacag ctgggagatg 840
agtgaatttc ataattataa cttggatctg aagaagagtg atttttcaac acgatggcaa 900
aagcaaagat gtccagtagt caaaagcaaa tgtagagaaa atgcatctta a 951

Claims (10)

1.一种用于治疗癌症的药物组合物，其特征在于，所述药物组合物包含共培养CIK细胞和肿瘤抗原结合肽-工程化免疫细胞；
优选地，所述癌症为***癌。
2.根据权利要求1所述的药物组合物，其特征在于，所述肿瘤抗原结合肽-工程化免疫细胞中肿瘤抗原结合肽的构成为WTN多肽区-铰链区-跨膜结构域-共刺激结构域-初级信号传导结构域；
优选地，所述WTN多肽区包括多个WTN多肽的重复和多个WTN多肽的重复之间的linker；
更优选地，所述WTN多肽为一种与PSMA特异性结合的多肽；
最优选地，所述WTN多肽选自以下组中的任意一种：
(1)如SEQ ID NO:1所示的多肽；
(2)与如SEQ ID NO:1所示的多肽相比，具有一个或几个氨基酸的置换、缺失或添加的物质；
(3)与如SEQ ID NO:1所示的多肽的氨基酸序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％的相同性的多肽；
最优选地，所述WTN多肽为如SEQ ID NO:1所示的多肽；
最优选地，所述WTN多肽的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示。
3.根据权利要求2所述的药物组合物，其特征在于，所述肿瘤抗原结合肽的铰链区为CD8α铰链区；
优选地，所述CD8α铰链区的氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示；
更优选地，所述CD8α铰链区的核苷酸序列如SEQ ID NO:4所示；
优选地，所述跨膜结构域为2B4跨膜结构域；
更优选地，所述2B4跨膜结构域的氨基酸序列如SEQ ID NO:5所示；
最优选地，所述2B4跨膜结构域的核苷酸序列如SEQ ID NO:6所示；
优选地，所述共刺激结构域为2B4共刺激结构域；
更优选地，所述2B4共刺激结构域的氨基酸序列如SEQ ID NO:7所示；
最优选地，所述2B4共刺激结构域的核苷酸序列如SEQ ID NO:8所示；
优选地，所述初级信号传导结构域为NKG2D初级信号传导结构域；
更优选地，所述NKG2D初级信号传导结构域的氨基酸序列如SEQ ID NO:9所示；
最优选地，所述NKG2D初级信号传导结构域的核苷酸序列如SEQ ID NO:10所示；
最优选地，所述肿瘤抗原结合肽的组成为WTN多肽区-CD8α铰链区-2B4跨膜结构域-2B4共刺激结构域-NKG2D初级信号传导结构域；
最优选地，所述肿瘤抗原结合肽的氨基酸序列如SEQ ID NO:11所示；
最优选地，所述肿瘤抗原结合肽的核苷酸序列如SEQ ID NO:12所示。
4.根据权利要求1所述的药物组合物，其特征在于，所述肿瘤抗原结合肽-工程化免疫细胞包括肿瘤抗原结合肽-工程化NK细胞、肿瘤抗原结合肽-工程化T细胞、肿瘤抗原结合肽-工程化B细胞、肿瘤抗原结合肽-工程化巨噬细胞；
优选地，所述肿瘤抗原结合肽-工程化免疫细胞为肿瘤抗原结合肽-工程化NK细胞。
5.根据权利要求1所述的药物组合物，其特征在于，共培养CIK细胞为与***癌细胞共培养的DC-CIK细胞；
优选地，所述共培养CIK细胞中包含CD8+T细胞。
6.共培养CIK细胞和肿瘤抗原结合肽-工程化免疫细胞联合在制备用于治疗癌症的药物中的应用；
优选地，所述癌症为***癌。
7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述肿瘤抗原结合肽-工程化免疫细胞为权利要求1-4任一项中所述的肿瘤抗原结合肽-工程化免疫细胞，所述共培养CIK细胞为权利要求5中所述的共培养CIK细胞。
8.一种共培养CIK细胞的制备方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：
(1)DC细胞的培养；
(2)CIK细胞的培养；
(3)将步骤(1)培养得到的DC细胞和步骤(2)培养得到的CIK细胞在培养基中混合，加入***癌细胞共培养，收集悬浮的DC-CIK混合物即为共培养CIK细胞。
9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述步骤(1)包括如下步骤：
(a)第0天，在DC细胞生长培养基中培养PBMC细胞；
(b)第3天，更换DC细胞生长培养基；
(c)第6天，在DC细胞生长培养基中添加DC细胞成熟因子；
(d)第8天，收集细胞，得到DC细胞；
优选地，步骤(a)中所述DC细胞生长培养基中添加的物质包括FBS、DC细胞培养因子；
更优选地，步骤(a)中所述DC细胞生长培养基中添加的物质包括5％FBS、2U/mL DC细胞培养因子；
优选地，步骤(c)中所述DC细胞成熟因子最终浓度为2U/mL；
优选地，所述步骤(2)包括如下步骤：
(a)第0天，在CIK细胞活化培养基中培养PBL细胞；
(b)第3、4、6天，用CIK细胞增殖培养基补充细胞培养物；
(c)第8天，收集细胞，得到CIK细胞；
更优选地，步骤(a)中所述CIK细胞活化培养基中添加的物质包括KBM551、FBS、抗CD3抗体、IFN-γ、IL-1α、IL-2；
最优选地，步骤(a)中所述CIK细胞活化培养基中添加的物质包括KBM551、3％FBS、50ng/mL抗CD3抗体、1000U/mL IFN-γ、100U/mL IL-1α、500U/mL IL-2；
更优选地，步骤(a)中所述PBL细胞的细胞密度为1.5×106/mL；
更优选地，步骤(b)中所述CIK细胞增殖培养基中添加的物质包括KBM551、FBS、IL-2；
最优选地，步骤(b)中所述CIK细胞增殖培养基中添加的物质包括KBM551、3％FBS和500U/mL IL-2；
优选地，所述步骤(3)中培养基为CIK细胞增殖培养基；
更优选地，所述DC细胞的细胞密度为4×107/mL；
更优选地，所述CIK细胞的细胞密度为1×108/mL；
更优选地，所述***癌细胞的细胞密度为1×107/mL；
更优选地，所述共培养的条件为5％CO2、37℃、24h；
最优选地，所述***癌细胞包括C4-2、LNCaP、PC-3、DU145；
最优选地，所述***癌细胞为C4-2。
10.根据权利要求8或9所述的方法制备得到的共培养CIK细胞在制备用于治疗癌症的药物中的应用；
优选地，所述癌症为***癌。
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刘畅等: "抗原致敏的DC-CIK对***癌细胞DU145杀伤的作用", 《解剖科学进展》, vol. 18, no. 03, pages 222 - 226 *

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