CN112755051B - 一种nk细胞的制备及治疗癌症中的应用 - Google Patents

一种nk细胞的制备及治疗癌症中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种NK细胞的制备及其在治疗癌症中的应用。本发明提供了一种将NK细胞与CD105的单克隆抗体一起制备成为药物组合物，可以用于治疗结直肠癌，具有较好的应用前景。

Description

一种NK细胞的制备及治疗癌症中的应用
技术领域
本发明涉及制药领域，更具体的涉及一种NK细胞的制备及其在治疗癌症中的应用。
背景技术
NK细胞是具有多种免疫学功能的淋巴样细胞,人类NK细胞为CD56和CD16阳性.CD3和CD19为阴性。少部分NK细胞可以为CD8阳性。NK细胞杀伤肿瘤细胞不受MHC限制，也不需预先与抗原接触或显示任何记忆反应。NK细胞对肿瘤的杀伤优势表现为直接溶解和分泌细胞因子两个方面，其杀伤肿瘤既可通过穿孔素又可通过Fas配基。NK细胞可以产生TNF-a、IFN-γ和IL-1，这些细胞因子在NK细胞抗癌反应中有十分重要地位。NK细胞具有对异体骨髓快速排异的能力，但并不介导实体组织的移植排异。
在肿瘤的发生、发展过程中，NK细胞既可以通过“内识别”方式(如NCRs、NKG2D、SLAMs、DNAMs等)直接识别恶性转化癌细胞并被活化，也可以在辅助细胞(单核细胞、巨噬细胞、树突状细胞等)的作用下被活化。这些辅助细胞通过其模式识别受体(包括细胞表面受体TLR2、TLR4，胞内胞质受体RIG-1、NALP3、NOD2，内体受体TLR7、TLR9等识别多种病原体)来应答内外环境的变化，再通过分泌多种可溶性因子或直接接触的方式将信号传递至NK细胞，使NK细胞得以发挥其杀伤功能及分泌炎性细胞因子功能。在人类，已经证实存在的可溶性因子有IL-12、IL-18、IFN、IL-2及TNF；直接接触的分子有GITRL/GITR、IL-12/IL-12R、CD48/2B4、MICAorMICBorULBP1-ULBP3/NKG2D、AICL/NKp80、IL-15R-IL-15/IL-15βγ等。
采用NK细胞***不仅可使用刺激因子(如IL-2、IL-12、IL-15等)，也可以使用针对NK细胞的KIR的阻断剂。同时亦提示，阻断NK细胞的KIR的功能与采用阻断CTLA4对T细胞的阴性信号一样可以提高机体的抗癌免疫反应。上述资料提示，活化NK细胞既可以直接进行过继输注***，亦可阻断这些NK细胞的KIR以提高其抗癌效应。
最近，几种方法提高NK细胞的体外扩增，体内持续存在，促进向肿瘤微环境归巢，增加了其抗肿瘤作用。早期NK细胞扩增方法使用的培养液仅含有细胞因子，如IL-2和IL-15，只有10-20倍的扩增。随后使用饲养细胞联合细胞因子，增殖可达80-10000倍，尤其使用CD3枯竭的PBMC进行培养。最近使用CD3耗竭的单采产物，使用无饲养细胞和MEM-α培养基，含有IL-2，IL-15和维生素B3，可获得纯度>95％的NK细胞。IL-15促进NK细胞生长，增殖，而不激活Treg细胞。异二聚体IL-15(IL-15-sIL-15Rα)可更有效刺激NK细胞增殖。NK细胞表达IL-12Rβ2，高剂量IL-12对NK细胞具有免疫调节作用，并促进IFN-γ的产生。免疫调节药来那度胺间接通过IL-2和IFN-γ提高NK细胞的增殖和细胞毒作用。当PD1和PDL1-特异性单克隆抗体与来那度胺联合，增强NK细胞抗骨髓瘤的能力。PD1阻断药物可提高NK细胞诱导的ADCC以及NK细胞向肿瘤的迁徙，同时抑制Treg细胞的功能。NK细胞的死亡配体TRAIL，可诱导TRAILR表达阳性的肿瘤细胞凋亡，组蛋白乙酰化酶和蛋白酶体抑制剂可增强此通路的功能。Ⅰ期临床试验，bortezomib与自体NK细胞联合，导致难治性肾细胞癌和慢性白血病出现肿瘤消退。
结直肠癌是消化***最常见的恶性肿瘤之一，据统计发病率在全球范围内位于恶性肿瘤第3位，在西方国家和中国的经济发达地区已经上升为第2位。结直肠癌也是全球癌症导致死亡的主要原因之一。虽然贝伐单抗已经在大肠癌领域得到了广泛的应用，但贝伐单抗的毒副反应包括出血、血栓性事件也引起了人们的重视。因此，开发一种新的能够治疗大肠癌(结直肠癌)的单克隆抗体仍然有很大的应用价值。特别是使用NK细胞与单克隆抗体一起使用，是目前联合治疗的的重点方向。
发明内容
本发明克服现有技术的缺陷，提供了一种有效治疗大肠癌特别是结直肠癌的新的方法。
本发明一方面，提供一种分离的NK细胞用于治疗大肠癌特别是结直肠癌。
另外一方面，本发明还提供了一种特异性针对CD105的单克隆抗体。
具体的所述，本发明提供的CD105的单克隆抗体，其轻链可变区序列为SEQ ID NO:1，其重链可变区序列为SEQ ID NO:2。
本发明另外一方面，还提供一种药物组合物，所述药物组合物含有本发明提供的CD105的单克隆抗体，以及药学上可接受的载体。
本发明另外一方面，还提供一种药物组合物，所述药物组合物含有本发明提供的NK细胞，以及药学上可接受的载体。
本发明另外一方面，还提供一种药物组合物，所述药物组合物含有本发明提供的NK细胞以及本发明提供的CD105的单克隆抗体，以及药学上可接受的载体。
本发明还有一方面，提供一种NK细胞在制备用于治疗结直肠癌的药物中的用途。
本发明还有一方面，提供一种CD105的单克隆抗体在制备用于治疗结直肠癌的药物中的用途。
本发明还有一方面，提供一种NK细胞和CD105的单克隆抗体在制备用于治疗结直肠癌的药物中的用途。
进一步的，本发明提供的抗体为全长抗体，所述的抗体全长蛋白为本领域常规的抗体全长蛋白，其包括重链可变区、轻链可变区、重链恒定区和轻链恒定区。所述的蛋白质的重链可变区和轻链可变区与人源重链恒定区和人源轻链恒定区构成全人源抗体全长蛋白。较佳地，所述的抗体全长蛋白为IgG1、IgG2、IgG3或IgG4。
本发明还提供一种核酸，其编码上述的抗体。
本发明所用试剂和原料均市售可得。
本发明的积极进步效果在于：本发明提供了一种将NK细胞与CD105的单克隆抗体一起制备成为药物组合物，可以用于治疗结直肠癌。具有较好的应用前景。
附图说明
图1亚型鉴定结果图
图2单克隆抗体对LOVO细胞抑制效果图
图3药物对移植瘤的抑制作用效果图
具体实施方式
下面通过实施例的方式进一步说明本发明，但并不因此将本发明限制在所述的实施例范围之中。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，按照常规方法和条件，或按照商品说明书选择。
实施例1NK细胞的制备
采用Ficoll-Hypaque密度梯度离心分离脐血单个核细胞，PBS洗涤3次后，以EXvivo-15无血清培养液悬浮；将单个核细胞浓度调整为3×106个/ml，向已经CD3抗体铺板的培养瓶中加入5ml细胞悬液，及细胞因子IL-2(1000u/ml)，IL-15(50ng/ml)，IL-21(30ng/ml)。置于5％CO2，37℃连续培养18d。期间，根据培养液颜色和NK集落大小半量补液，全量补充细胞因子。第一次添加细胞因子时予以IL-2 1000u/ml，IL-1550ng/ml，IL-2130ng/ml，从第二次起，添加细胞因子IL-21000u/ml，IL-1550ng/ml。18d后流式细胞术检测扩增前后细胞表型，CD56+CD3-细胞达到分(81.53±2.53)％。
实施例2抗CD105单克隆抗体的制备
1、抗原的制备
根据人CD105的氨基酸序列，筛选获得高免疫原性的表位肽，也称抗原肽FVLRSAYSSCGMQVSASMISNEAVVNILSSSSPQRK，将所述多肽送上海生工合成备用。
2、制备杂交瘤细胞
免疫BALB/c小鼠。第1次免疫:在100μL 0.5mg/mL CD105抗原肽中加入CFA100μL进行乳化，用上述乳化液免疫8周龄小鼠。第2次免疫:完成第1次免疫的3周后，再在100μL0.5mg/mL的CD105抗原肽中加入IFA 100μL进行乳化，用上述乳化液第2次免疫小鼠。第3次免疫:完成第2次免疫的3周后进行第3次免疫。方法同第2次免疫。第3次免疫完成后的第10天进行尾部静脉取血，测定抗体滴度。用1μg/mL的CD105抗原肽抗原溶液包被96孔酶标板；将1∶100的小鼠血清在96孔酶标板中进行倍比稀释，测定小鼠血清中的抗体滴度，筛选血清抗体滴度达到1∶10000以上的3只小鼠用于的细胞融合。取出3只免疫小鼠的脾脏，在无菌的组织培养皿中加入4mL细胞培养液(含2％RPMI1640、0.2％NaHCO3、1％Penicillin-streptomycin、10％灭活胎牛血清)，将脾脏放入上述组织培养皿中打碎；将NS-1骨髓瘤细胞和小鼠脾细胞在50mL离心管中按1∶10的比例混合后，1500r/min离心5min，去上清液后慢慢加入1mL50％PEG3000；用RPMI1640培养基洗去PEG3000；采用半胶质培养基克隆法筛选杂交瘤细胞：在96孔细胞培养板中培养杂交瘤细胞(37℃，5％CO2)；培养3d后用间接ELISA法筛选阳性生长的细胞克隆孔，杂交瘤细胞的抗体阳性检出率为9.53％。将阳性最为显著的4株单克隆杂交瘤细胞采用有限稀释法进行克隆及亚克隆。
最终获得2株分泌抗CD105的单克隆抗体的杂交瘤细胞株，分别命名为1A4和4C6。
将二株杂交瘤细胞分别免疫小鼠收集小鼠腹水，将腹水中的单克隆抗体的采用蛋白A柱进行常规纯化，随后进行蛋白浓缩备用。用Lowry法测定1A4抗体浓度为2.1mg/mL，4C6为2.3mg/mL。
实施例3 4C6单克隆抗体亚型鉴定及效价评价
采用小鼠单抗分型试剂盒进行鉴定，操作步骤严格按照说明书进行。结果如图1所示。
经检测，4C6单克隆抗体为IgG1类免疫球蛋白(图1)。
单克隆抗体效价测定：将浓缩后的抗体按1：1000、1：2000、1：4000、1：8000、1：16000、1：32000、1：64000、1：128000、1：256000、1：512000稀释后，加入以抗原肽肽段包被的酶标板中，通过间接ELISA法测定其A450 nm值，以稀释度对A450 nm值画折线图，取A450 nm值为0.1时的稀释度为其效价。经检测，4C6单克隆抗体的效价约为1：256000。
实施例4 4C6单克隆抗体亲和力鉴定及序列鉴定
通过SPR法鉴定4C6单克隆抗体对抗原肽的结合能力。具体操作是:将获得的4C6单克隆抗体针对抗原肽的结合动力学通过表面等离振子共振(SRP)方法，使用BIAcoreX100仪器测量，将抗原肽直接包被于CMS生物传感器芯片。对于动力学测量，将4C6单克隆抗体用HBS-EP+1X缓冲液三倍连续稀释，在25℃进样120s，解离时间为30min，加入1OmM甘氨酸-HCl(pH2.0)再生120s。使用简单一对一Languir结合模型计算出4C6单克隆抗体与抗原肽的平衡解离常数。计算结果如表2所示。
表2单克隆抗体的解离常数
单克隆抗体 平衡解离常数
4C6单克隆抗体 4.27E-11
从表2可以看出，4C6单克隆抗体的平衡解离常数为4.27E-11，这说明本发明的4C6单克隆抗体具有较好的结合抗原肽的效果。
通过PCR鉴定了单抗的轻链可变区和重链可变区序列分别为：
轻链可变区(SEQ ID NO：1)
DIVITQSPALAAASPGEKVTITCCVSDDISASYLCWYQQKSGISPKPWIYSTAVLATGVPARFSGSGSGTSYSLTITSMEAEDAATYYCSQWYYSPLAFGAGTKLELK
重链可变区(SEQ ID NO：2)
EVQLEESGTELRRPGASVKLSCKASGYIFSQYQLSWIKQRPGQGLEWIGSIYPGKLLTRSYQKFAGKATLTADKSSSTAYMQLSSLASEDSAVYYCAGSNCASDSWGLGTTLAVSS
实施例54C6单克隆抗体抑制细胞实验
人结肠癌L0VO细胞(货号：CL-0144，武汉普诺赛生命科技有限公司)
MTT法检测4C6单克隆抗体对L0VO的细胞毒性效应。取对数生长期的LOVO细胞，用0.25％胰酶消化，制成单细胞悬液加入96孔培养板，每孔100μl，调整细胞终密度为3×103个/ml。分为实验组与对照组，每组4个复孔，置37℃、5％CO2培养24h。实验组分别加入终质量浓度为0.1，0.2，0.3，0.4，0.5mg/ml的单抗200μl；对照组加入鼠IgG培养24h。每孔加入0.5mg/ml。MTT溶液2Oμl，继续避光培养4h。弃上清，每孔加入200μl DMSO振荡，用酶标仪测490nm吸收值，测量重复3次。计算细胞抑制率(％)：抑制率＝(对照组值-实验组值)/对照组值×100％。
从图2中可以看出，4C6单克隆抗体对LOVO细胞有生长抑制作用，并随着抗体浓度的增加，LOVO细胞生长抑制率也随之增加，成明显的剂量相关性，在浓度为0.5mg/ml时期抑制率得到了82％。
实施例6Weatern blotting检测实验组对凋亡蛋白的表达影响
取对数生长期的LOVO细胞，用0.25％胰酶消化，制成单细胞悬液加入6孔培养板，细胞终密度为3X105个/ml，置37℃,5％CO2培养24h。倒掉培养液，实验组1:加终浓度为0.5mg/ml的单抗，实验组2:加终浓度为0.5mg/ml的单抗和终浓度为3X105个/ml的NK细胞，实验组3加终浓度为3X105个/ml的NK细胞，对照组用DMEM培养液，作用24h。冰上用RAPI裂解液裂解分离的LOVO细胞提取总蛋白，12％SDS-PAGE分离蛋白，将胶置于转膜液中90V,45min.蛋白电转到PVDF膜上。加入一抗，反应1h，洗涤液洗涤3次；加人HRP标记的二抗，反应1h，洗涤ECI显色。通过Western blotting检测caspase-3和cleaved caspase-3的表达。结果以对照组的表达量为相对表达量，结果如表3所示。
表3凋亡蛋白相对表达量结果图
组别 caspase-3相对表达量 cleavedcaspase-3相对表达量
实验组1 0.77±0.06 1.31±0.10
实验组2 0.60±0.05 1.57±0.08
实验组3 0.82±0.04 1.20±0.06
从表3的结果看出，实验组的结果显示三组均能导致cleaved caspase-3条带信号增强、caspase-3条带信号减弱，其中单抗和NK细胞的组合能够最有效的诱导肿瘤细胞LOVO的凋亡，所述cleaved caspase-3相对表达量也达到了1.57±0.08。
实施例7体内抗肿瘤实验观察NK细胞与本发明单抗单抗单独或联合应用对LOVO细胞移植瘤生长的影响
将处于对数生长期的L0VO细胞消化，用PBS清洗2遍，调整细胞密度为1×107/ml，每只BALB/nu雄性裸鼠皮下接种0.2ml。待瘤块长至100mm3时，裸鼠随机分为生理盐水对照组、NK联合单抗组、NK组和单抗治疗组，每组6只，分别经静脉注射药物，NK细胞100μl，浓度为11×107/ml，单抗5mg/kg，4d一次，共给药4周。治疗开始后每4d一次用游标卡尺测量裸鼠瘤体的最大纵径(a)及最大横径(b)，观察肿瘤生长的情况，肿瘤体积＝0.5×a×b2。第28天时将裸鼠处死，剥离肿瘤组织，称瘤重，计算肿瘤抑制率。肿瘤抑制率(％)＝(1－实验组平均瘤质量/对照组平均瘤质量)×100％。
从图3中可以看出NK联合单抗给药组对移植瘤的抑制作用显著强于两者单药的效果(图3)。NK联合单抗组对瘤重增长抑制最显著其体积只有144mm3左右，具有较好的抑制效果。
序列表
<110> 北京达熙生物科技有限公司
<120> 一种NK细胞的制备及治疗癌症中的应用
<160> 2
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 108
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
Asp Ile Val Ile Thr Gln Ser Pro Ala Leu Ala Ala Ala Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Lys Val Thr Ile Thr Cys Cys Val Ser Asp Asp Ile Ser Ala Ser
20 25 30
Tyr Leu Cys Trp Tyr Gln Gln Lys Ser Gly Ile Ser Pro Lys Pro Trp
35 40 45
Ile Tyr Ser Thr Ala Val Leu Ala Thr Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Thr Ser Met Glu
65 70 75 80
Ala Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Ser Gln Trp Tyr Tyr Ser Pro
85 90 95
Leu Ala Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys
100 105
<210> 2
<211> 116
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
Glu Val Gln Leu Glu Glu Ser Gly Thr Glu Leu Arg Arg Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ile Phe Ser Gln Tyr
20 25 30
Gln Leu Ser Trp Ile Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Ser Ile Tyr Pro Gly Lys Leu Leu Thr Arg Ser Tyr Gln Lys Phe
50 55 60
Ala Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Gln Leu Ser Ser Leu Ala Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Gly Ser Asn Cys Ala Ser Asp Ser Trp Gly Leu Gly Thr Thr Leu
100 105 110
Ala Val Ser Ser
115

Claims (5)

1.一种药物组合物，其特征在于所述药物组合物含有CD105的单克隆抗体，以及药学上可接受的载体；其中单克隆抗体为4C6 CD105的单克隆抗体，其轻链可变区序列为SEQ IDNO:1，其重链可变区序列为SEQ ID NO:2。
2.一种药物组合物，所述药物组合物含有NK细胞以及4C6 CD105的单克隆抗体，以及药学上可接受的载体；其中，单克隆抗体为4C6 CD105的单克隆抗体，其轻链可变区序列为SEQID NO:1，其重链可变区序列为SEQ ID NO:2；NK细胞的制备方法为：采用Ficoll-Hypaque密度梯度离心分离脐血单个核细胞，PBS 洗涤3次后，以培养液悬浮；将单个核细胞浓度调整为3×106个/ml，向已经CD3抗体铺板的培养瓶中加入5ml细胞悬液，及1000u/ml的IL-2，50ng/ml的IL-15和30ng/ml的IL-21；置于5%CO2，37℃连续培养18d；期间，根据培养液颜色和NK集落大小半量补液，全量补充细胞因子；第一次添加细胞因子时予以1000u/ml的IL-2，50ng/ml的IL-15和30ng/ml的IL-21，从第二次起，添加细胞因子1000u/ml的IL-2，50ng/ml的IL-15。
3.一种CD105的单克隆抗体在制备用于治疗结直肠癌的药物中的用途；其中单克隆抗体为4C6 CD105的单克隆抗体，其轻链可变区序列为SEQ ID NO:1，其重链可变区序列为SEQID NO:2。
4.一种NK细胞和CD105的单克隆抗体在制备用于治疗结直肠癌的药物中的用途；其中单克隆抗体为4C6 CD105的单克隆抗体，其轻链可变区序列为SEQ ID NO:1，其重链可变区序列为SEQ ID NO:2。
5.一种4C6 CD105的单克隆抗体，其特征在于其轻链可变区序列为SEQ ID NO:1，其重链可变区序列为SEQ ID NO:2。
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