CN110144307A

CN110144307A - 一种抗肠出血性大肠杆菌的格氏乳杆菌及制备的禽用复合益生菌制剂及应用

Info

Publication number: CN110144307A
Application number: CN201910392302.0A
Authority: CN
Inventors: 金梅林; 杨丽; 康超; 孙小美
Original assignee: Huazhong Agricultural University
Current assignee: Huazhong Agricultural University
Priority date: 2019-05-13
Filing date: 2019-05-13
Publication date: 2019-08-20
Anticipated expiration: 2039-05-13
Also published as: CN110144307B

Abstract

本发明涉及生物制剂技术领域，公开了一种抗肠出血性大肠杆菌的格氏乳杆菌及制备的禽用复合益生菌制剂及应用。本发明提供的格氏乳杆菌（Lactobacillus gasseri）YD2‑2，保藏编号为CCTCC NO：M 2019340，特别是对肠出血性大肠杆菌具备高效抑菌性，将其与其他菌株混配后，可制备成抗肠出血性禽用复合益生菌制剂，该制剂能够促进动物的生长，改善动物肠道微生态环境，促进肠粘膜的发育，增加肠粘膜可溶性IgA含量和血清IgG的含量，减少抗生素作为预防和治疗动物疾病的作用在饲料中的长期亚治疗剂量和超高剂量添加，避免饲用抗生素滥用导致的细菌耐药性、抗生素药物残留和食品安全等方面的危害。

Description

一种抗肠出血性大肠杆菌的格氏乳杆菌及制备的禽用复合益生菌制剂及应用

技术领域

本发明涉及生物制剂技术领域，具体涉及一种抗肠出血性大肠杆菌的格氏乳杆菌及制备的禽用复合益生菌制剂及应用。

背景技术

肠道微生物与宿主在长期的进化过程中形成了稳定的共生关系，肠道微生物数量巨大，种类众多，在机体健康的状态下，各种细菌相互影响，相互制衡，共同维持着肠道微生态的平衡。但是，随着畜禽养殖业集约化的发展及养殖过程中抗生素的滥用，对动物机体产生极大的应激反应；同时，由于养殖密度过高，养殖舍内有害气体蓄积和病原微生物的大量繁殖，导致动物机体内外微生态失衡、免疫性能和生产性能下降，造成严重经济损失，更危害食品安全。

大肠杆菌是一类条件致病菌，也是动物及人体肠道内的正常细菌，肠道微生态平衡时不会对机体产生健康威胁。但是，肠出血性大肠杆菌等高致病性大肠杆菌对机体的伤害极大。肠出血性大肠杆菌是一种重要的人畜共患传染性病原菌，是典型的食源性致病菌，能够导致感染动物水样或血样腹泻、出血性肠炎等，人感染后可引起出血性肠炎并发溶血性***。牛、羊、猪、家禽是肠出血性大肠杆菌最主要的携带者。肠出血性大肠杆菌广泛分布于自然界，感染力强，在全世界大部分地区都有爆发流行和散发病例的报道，引起人们的广泛关注。肉鸡生长速度快，从雏鸡到商品肉鸡一般为42天，在42日龄出栏前有停药期，此时肉鸡的粪便排放量大，环境中的机会致病菌多，尤其是大肠杆菌等条件致病菌极易趁虚而入，很容易引起病原菌感染。

肠道微生物参与了宿主的肠道形态组成和发育、营养物质吸收和免疫反应等生理生化过程，因此它对机体的健康起着至关重要的作用。益生菌是一类能通过调控机体微生态平衡进而有效促进宿主健康的活微生物制剂，作为一种活菌制剂，具有促进营养物质代谢吸收，刺激动物免疫***，增强动物抗病能力，特别是肠道益生菌，可以促进动物肠道免疫***的发生发展。与抗生素相比，益生菌具有无毒、无抗药性、无残留、绿色安全的优点。大肠杆菌血清型较多，具有地方流行血清型的特点，目前研制的疫苗通常血清型较单一，使用疫苗防制效果不佳；使用抗生素又会产生药物残留和耐药性。而益生菌用于预防畜禽大肠杆菌感染是目前研究的热点。

发明内容

本发明的目的在于提供了一种格氏乳杆菌，所述的格氏乳杆菌分离自鸡肠道样品，该菌株已于2019年5月9日保藏与中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，分类命名：格氏乳杆菌(Lactobacillus gasseri)YD2-2，保藏编号为CCTCC NO：M 2019340，地址：中国武汉武汉大学。

本发明的另一个目的在于提供了一种格氏乳杆菌在制备细菌抑菌剂中的应用。本发明提供的格氏乳杆菌对肠出血性大肠杆菌对大肠杆菌、肠出血性大肠杆菌、鸡白痢沙门氏菌、表皮葡萄球菌或金黄色葡萄球菌都具有具有高效的抑制作用，特别是对肠出血性大肠杆菌的抑制作用良好，可用于制备抑菌剂。

本发明还有一个目的在于公开了一种抗肠出血性大肠杆菌感染的禽用复合益生菌制剂，所述复合益生菌制剂包括枯草芽孢杆菌、凝结芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、格氏乳杆菌、植物乳杆菌。

本发明的最后一个目的在于提供了禽用复合益生菌制剂的应用，所述的禽用复合益生菌制剂可用于制备饲料添加剂或是预防或治疗抗肠出血性大肠杆菌的药物。所述的复合益生菌菌剂饲喂禽类后，能够促进动物的生长，改善动物肠道微生态环境，促进肠粘膜的发育，增加肠粘膜可溶性IgA含量和血清IgG的含量。

为了达到上述目的，本发明采取以下技术措施：

格氏乳杆菌分离自健康鸡肠道样品，经筛选后对多种细菌都具备抑制作用，特别是对肠出血性大肠杆菌高效抑制，该菌株已于2019年5月9日保藏与中国典型培养物保藏中心 (CCTCC)，分类命名：格氏乳杆菌(Lactobacillus gasseri)YD2-2，保藏编号为CCTCCNO： M 2019340，地址：中国武汉武汉大学。

所述的格氏乳杆菌具有如下生物学特性：

在MRS琼脂培养基上菌落直径0.1-1mm，乳白色，呈圆形凸起，表明光滑，兼性厌氧。该菌株为革兰氏阳性，圆端直杆状、单个、成对或短链状，不产生芽孢、不运动。最适生长温度30-37℃，最适生长pH6-6.5。本发明中所述的格氏乳杆菌(Lactobacillus gasseri)YD2-2 能够产生细菌素类抑菌杀菌物质，杀灭大肠杆菌等致病性病原菌；本发明中所述的格氏乳杆菌(Lactobacillus gasseri)YD2-2还能够产生一些酸类物质，能够调节肠道微酸环境，利于肠道有益微生物的增殖，抑制大肠杆菌类在中性pH值下生长旺盛的病原菌的繁殖。

格氏乳杆菌在制备细菌抑菌剂中的应用，包括以格氏乳杆菌YD2-2为唯一有效成分或有效成分之一，制备成细菌抑菌剂，所述的细菌为大肠杆菌、肠出血性大肠杆菌、鸡白痢沙门氏菌、表皮葡萄球菌或金黄色葡萄球菌。

一种抗肠出血性大肠杆菌感染的禽用复合益生菌制剂，包括：枯草芽孢杆菌、凝结芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、格氏乳杆菌、植物乳杆菌。

以上所述的禽用复合益生菌制剂，优选的，枯草芽孢杆菌活菌数为10^8～10⁹CFU/g、凝结芽孢杆菌活菌数为10^7～10⁸CFU/g、解淀粉芽孢杆菌活菌数为10^7～10⁸CFU/g、格氏乳杆菌活菌数为10^8～10⁹CFU/g、植物乳杆菌活菌数为10^8～10⁹CFU/g。

以上所述的禽用复合益生菌制剂，优选的，所述的解淀粉芽孢杆菌为解淀粉芽孢杆菌 H6，CCTCC NO:M2013249；植物乳杆菌为植物乳杆菌ZN-3，CCTCC NO：M 2017286。

一种抗肠出血性大肠杆菌感染的禽用复合益生菌制剂的应用，包括利用该制剂制备成禽用饲料添加剂或是制备成预防或治疗肠炎性大肠杆菌感染的药物。

与现有技术相比，本发明具有以下优点：

1.本发明所提供的格氏乳杆菌具有宿主同源性，能够在鸡肠道更好的发挥抑制病原菌调节肠道微环境的作用。

2.本发明中的复合益生菌制剂不仅能够提高动物的生长性能，还能够增强机体对病原菌的抵抗力，刺激机体免疫应答的产生，并维持机体较高水平的免疫应答。

3.给动物饲喂本发明中的复合益生菌制剂，在大肠杆菌感染的情况下能够显著改善机体肠道微生态环境，提高机体对病原菌的抵抗力。

4.本发明所述的复合益生菌制剂能够抑制有害病原菌的定植和繁育，减少抗生素作为预防和治疗动物疾病的作用在饲料中的长期亚治疗剂量和超高剂量添加，避免饲用抗生素滥用导致的细菌耐药性、抗生素药物残留和食品安全等方面的危害。

5.本发明中的复合益生菌制剂能够显著提高肠粘膜免疫水平，减少或避免肠道疾病的发生，维持肠道的微生态平衡。

附图说明

图1为格氏乳杆菌YD2-2光学显微图及对肠出血性大肠杆菌的抑制作用示意图。

图2为动物实验设计流程图。

图3为添加复合益生菌制剂对肠出血性大肠杆菌感染试验肉鸡生长性能的影响。

图4为添加复合益生菌制剂对肠出血性大肠杆菌感染试验肉鸡肠粘膜组织结构形态的影响。

图5为添加复合益生菌制剂对肠出血性大肠杆菌感染试验肉鸡盲肠微生物种类花瓣图。

图6为添加复合益生菌制剂对肠出血性大肠杆菌感染试验肉鸡盲肠微生物群落结构组成的影响。

图7为添加复合益生菌制剂对肠出血性大肠杆菌感染试验肉鸡盲肠微生物组间群落显著差异物种分析图。

具体实施方式

本发明实施例中试验方法和条件如无特别说明，均为常规方法。这些实施例仅用于说明本发明，本发明的保护范围不受这些实施例的限制。本发明所述技术方案，如未特别说明，均为本领域的常规方案；所述试剂或材料，如未特别说明，均来源于商业渠道。以下具体实施例对本发明作进一步阐述。

实施例1：

格氏乳杆菌YD2-2的分离鉴定：

1)从咸宁某鸡场购买健康散养鸡，解剖取肠道，无菌环境取肠道内容物，震荡混匀后倍比稀释，选取适当稀释度涂布于乳酸菌选择性培养基MRS琼脂培养基上，37℃厌氧培养24-48h,挑取平板上单菌落，在MRS培养基平板上多次划线纯化，37℃有氧培养，得到纯的菌落。对纯化菌株进行菌落形态观察和革兰氏染色，挑选革兰氏阳性杆菌。本发明菌株在 MRS培养基上菌落直径0.5-1mm，乳白色，凸起，呈圆形，表面光滑，兼性厌氧。该菌株为革兰氏阳性，圆端直杆状、单个、成对或短链状，不产生芽孢、不运动(图1中A)。

采用牛津杯平板抑菌法对分离纯化获得的革兰氏阳性杆菌进行抑菌性能测定，经过大量筛选，获得1株对肠出血性大肠杆菌表现出良好抑制作用的菌株，命名为YD2-2，用牛津杯平板抑菌法检测的YD2-2对不同菌株的抑菌效果见表1。

表1 YD2-2对不同菌株的抑菌活性

菌株名称	抑菌活性(mm)
		大肠杆菌62#	23.97
大肠杆菌ATCC35150	24.58
		鸡白痢沙门氏菌S06004	18.85
表皮葡萄球菌CAU0244	11.69
		金黄色葡萄球菌J9	18.17

2)通过液体培养法测定所分离的菌株YD2-2对肠出血性大肠杆菌生长性能的影响：

将在MRS琼脂培养基上活化的YD2-2挑取单菌落接种于50毫升MRS液体培养基，37℃培养24h，2000rpm离心取发酵上清液，用无菌0.22um滤器过滤，过滤发酵液放4℃备用。

用NB液体培养基对上述YD2-2发酵液进行2倍倍比稀释至1:32，取不同稀释倍数样品200ul于微孔培养板，每个稀释倍数3个平行，接种1％(v/v)肠出血性大肠杆菌(ATCC35150) 种子液，37℃震荡培养24h，每30min测定一次OD600值绘制生长曲线图，观察大肠杆菌的生长情况，结果发现，与对照比较，YD2-2稀释32倍也能够完全抑制肠出血性大肠杆菌的生长，见图1中B。

3)对获得的菌株YD2-2进行生理生化鉴定和16S rDNA鉴定。依据《伯杰细菌鉴定手册》进行生理生化实验。利用16S通用引物对菌株YD2-2的16SrDNA基因序列进行扩增和测序，测序序列在NCBI进行blastn比对，同源性比对结果显示其16SrRNA与格氏乳杆菌(KM056281.1)序列同源性最高，相似性为99.73％。结合生理生化特征和16SrRNA比对结果，确认分离菌株YD2-2为格氏乳杆菌(Lactobacillus gasseri)，该菌株已于2019年5月 9日保藏与中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，分类命名：格氏乳杆菌(Lactobacillusgasseri) YD2-2，保藏编号为CCTCC NO：M 2019340，地址：中国武汉武汉大学。

实施例2：

格氏乳杆菌YD2-2对小鼠免疫细胞因子的影响：

选择4周龄雌性昆明鼠实验动物，采用灌胃方法，连续灌胃1周，每天一次，每次0.2mlYD2-2发酵液，发酵液所含菌量为10⁸～10⁹cfu/ml。灌胃前正常饲养一周，灌胃后正常饲养一周。整个实验21天，实验结束后，眼球采血测细胞因子，采用荧光定量PCR测定 YD2-2对小鼠IFNβ、IL-1β细胞因子的影响，以GAPDH为内参基因。IFNβ、IL-1β荧光定量检测结果如下表：

表2 格氏乳杆菌YD2-2对小鼠免疫细胞因子的影响。

假设目的基因和参照基因扩增效率都接近100％，且相对偏差不超过5％。根据ΔΔCt法计算试验组和对照组目的基因相对表达量：

F＝2^{-{[待测组目的基因平均Ct值-待测组看家基因平均Ct值]-[对照组目的基因平均Ct值-对照组看家基因平均Ct值]}

IFNβ比率＝2^{-{[32.722-20.668]-[33.948-21.469]}}＝2^0.425＝1.343

IL-1β比率＝2^{-{[21.828-20.668]-[23.289-21.469]}}＝2^0.66＝1.580

因此饲喂YD2-2后小鼠IFNβ表达量提高1.343倍，IL-1β表达量提高1.58倍。并且在整个试验周期中小鼠健康状况和精神状况均良好。

实施例3：

一种抗肠炎性大肠杆菌感染的复合益生菌制剂，包括枯草芽孢杆菌、凝结芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、格氏乳杆菌和植物乳杆菌；枯草芽孢杆菌活菌数为10⁹CFU/g、凝结芽孢杆菌活菌数为10⁸CFU/g、解淀粉芽孢杆菌活菌数为10⁸CFU/g、格氏乳杆菌活菌数为10⁸CFU/g、植物乳杆菌活菌数为10⁸CFU/g。

所述的解淀粉芽孢杆菌为解淀粉芽孢杆菌H6，CCTCC NO:M2013249；植物乳杆菌为植物乳杆菌ZN-3，CCTCC NO：M 2017286，格氏乳杆菌为格氏乳杆菌YD2-2，CCTCC NO： M2019340，其余菌株购自于商业渠道。

实施例3中制得的复合益生菌制剂用于以下实施例。

实施例4：

实施例3中所制备的复合益生菌制剂在肉鸡上的应用，其应用过程如下：

将0日龄肉鸡随机分为3组，对照组(EPC)：不添加益生菌感染肠出血性大肠杆菌；试验组1(EPI):攻毒前添加益生菌；试验组2(EPS)：攻毒前后连续添加益生菌。对照组全程不添加益生菌；试验组在第8日龄开始添加益生菌，添加量为2‰，连续添加21天；第28日龄口服感染肠出血性大肠杆菌，感染剂量为0.5ml，大肠杆菌活菌含量为 1.0×10¹⁰CFU/ml，试验组1感染前添加益生菌，试验组2持续添加益生菌；各组于感染后第 3天和第10天采血并剖杀取样。

通过翅下静脉采血采集试验肉鸡的血样并分离血清，采用酶联免疫吸附(ELASA)试剂盒测定血清IgG和细胞因子；采血后剖杀试验鸡取十二指肠、空肠甲醛固定液固定，切片观察肠道组织结构形态；取肠道黏膜组织样品，使用ELASA试剂盒测定肠粘膜可溶性IgA含量；并取盲肠内容物进行16S扩增子高通量测序，分析肠道菌群的变化及差异。

1.添加复合益生菌制剂对肠出血性大肠杆菌感染肉鸡生长性能的影响

1.1试验动物分组及饲喂

从荆门某肉鸡孵化厂购买0日龄肉鸡作为试验动物，暂养1周后随机分为3组：

肠出血性大肠杆菌阳性对照组(EPC)，饲喂基础日粮，28日龄大肠杆菌攻毒；

大肠杆菌感染前添加复合益生菌组(EPI)，于8日龄分组时开始在基础日粮中添加2‰实施例2中配制的复合益生菌制剂至28日龄肠出血性大肠杆菌攻毒后停止添加，连续添加 21天；

大肠杆菌感染前后连续添加复合益生菌组(EPS)，于8日龄分组时开始在基础日粮中添加2‰实施例2中配制的复合益生菌制剂至整个试验结束；

并分别于8、15、23、28、31、35、38、42日龄进行称重，比较3组之间试验动物生长速度的差异。

1.2攻毒用肠出血性大肠杆菌菌悬液的准备：

购买于广东微生物菌种保藏中心的肠出血性大肠杆菌ATCC35150，在NA平板上划线培养，用接种环挑取平板菌落接种于NB液体培养基中，37℃，180rpm摇床培养18-24h， NA平板测定发酵液中的菌含量，8000rpm离心5min，取出上清，收集沉淀，用无菌生理盐水重悬，测定浓缩菌悬液中的活菌数，根据计数结果，调整菌悬液活菌含量为1.0×10¹⁰CFU/ml，4℃备用(24h内使用)。

1.3肠出血性大肠杆菌感染试验动物

试验动物在28日龄时口服感染肠出血性大肠杆菌，感染前12h停水停食，感染前30min 每只鸡灌服0.5ml无菌碳酸氢钠以中和胃酸，灌服碳酸氢钠30min后每只鸡灌服0.5ml活菌数为1.0×10¹⁰CFU/ml肠出血性大肠杆菌，感染肠出血性大肠杆菌4小时后开始饮水和采食。攻毒后每日观察鸡只健康状况。

由表3可知，在8日龄至28日龄期间，添加复合益生菌制剂组EPI和EPS鸡只体重增长速度基本一致，均高于未添加益生菌对照组EPC，28日龄时，EPI组增重比对照组提高12.32％，EPS组增重比对组提高12.73％。28日龄攻毒后至42日龄试验结束，未添加益生菌攻毒组(EPC)的增重速度明显低于大肠杆菌感染前后连续添加复合益生菌组，也低于攻毒前添加益生菌组，至42日龄试验结束时，EPI组整个试验周期中增重比对组提高21.14％，EPS组整个试验周期中增重比对组提高39.98％。

表3 添加复合益生菌制剂对肠出血性大肠杆菌感染肉鸡生长性能的影响

2.添加复合益生菌制剂对肠出血性大肠杆菌感染试验肉鸡血清中细胞因子的影响

试验动物于攻毒后的第3天和第10天，每组随机取5只肉鸡，使用无菌真空非抗凝采血管，通过翅下静脉采血采集试验肉鸡的血样，37℃静置2h后3000prm离心10min，取上清分装与0.2mlEP管中，冻存于-20℃待用。

血清IL-4、IL-10含量的测定：

采用酶联免疫吸附(ELISA)试剂盒测定血清细胞因子，鸡白介素4(IL-4)酶联免疫试剂盒(产品编号：CSB-E06756CH)和鸡白介素10(IL-10)酶联免疫试剂盒(产品编号：CSB-E12835C)购买自武汉华美生物工程有限公司。

上述指标测定都按照测定试剂盒说明书的方法进行。

针对IL-4指标，攻毒3天后，连续添加复合益生菌组和攻毒前添加复合益生菌组血清 IL-4含量高于大肠杆菌阳性对照组，分别高出5.82％和13.19％；攻毒后10天，连续添加复合益生菌组血清IL-4显著高于大肠杆菌阳性对照组36.34％，攻毒前添加益生菌组高于大肠杆菌阳性对照组5.67％。

针对IL-10指标，攻毒3天后，连续添加复合益生菌组和攻毒前添加益生菌制剂组血清中IL-10的含量均显著高于大肠杆菌阳性对照，分别高出320.10％和213.26％。此外，连续添加复合益生菌制剂组血清IL-10含量明显高于攻毒前添加益生菌制剂组34.10％。攻毒10 天后，连续添加复合益生菌组血清中IL-10的含量比大肠杆菌阳性对照高34.67％，攻毒前添加复合益生菌组血清中IL-10的含量显著高于大肠杆菌阳性对照13.75％。

以上结果表明，日粮中添加复合益生菌制剂有利于提高并维持大肠杆菌攻毒处理后肉鸡血清中细胞因子含量，促进机体免疫机能的增强，特别是在攻毒前后连续添加效果更明显。

表4 添加复合益生菌制剂对大肠杆菌感染试验肉鸡血清细胞因子的影响

注：dpi3为感染后第3天；dpi10为感染后第10天；数据后所标字母相同表示差异不显著(P＞0.05)，所标字母不同表示差异显著(P＜0.05)。

3.添加复合益生菌制剂对大肠杆菌感染试验肉鸡肠粘膜组织结构形态的影响

上述采血后的肉鸡，剖开腹腔，将肠道整理出，各取十二指肠处1cm左右的肠段和空肠接近卵黄蒂处1cm左右的肠段，浸入4％***溶液中固定，石蜡包埋，HE染色封片，光学显微镜拍照测量并观察肠绒毛高度和相应的隐窝深度。绒毛高度为肠腺开口至绒毛顶端的垂直高度，隐窝深度为绒毛根部上皮凹陷到固有层的距离。应用IPWIN60软件测量。

从复合益生菌制剂对大肠杆菌感染试验肉鸡十二指肠黏膜组织形态结构的影响结果可知，肉鸡感染大肠杆菌3天后，连续添加复合益生菌制剂组十二指肠肠绒毛高度显著高于大肠杆菌感染对照组28.12％，隐窝深度低于对照组6.67％，绒毛高度与隐窝深度比值高于对照组40.61％；攻毒前添加益生菌组绒毛高度、绒毛高度与隐窝深度比值比对照组提高12.86％、20.55％。感染10天后，连续添加复合益生菌制剂组十二指肠肠绒毛高度显著高于大肠杆菌感染对照组19.07％，隐窝深度低于对照组16.12％，绒毛高度与隐窝深度比值高于对照组 22.85％，攻毒前添加益生菌组绒毛高度、绒毛高度与隐窝深度比值比对照提高12.20％、 11.34％。

从复合益生菌制剂对大肠杆菌感染试验肉鸡空肠黏膜组织形态结构的影响结果可知，感染3天后，连续添加益生菌组和攻毒前添加益生菌组肠绒毛高度显著高于大肠杆菌感染对照组59.94％、42.81％，绒毛高度与隐窝深度比值也显著高于对照组，分别提高93.32％、54.76％，隐窝深度连续添加组和攻毒前添加组分别比对照低18.81％、7.18％。感染10天后，连续添加益生菌组和攻毒前添加益生菌组绒毛高度显著高于对照组59.62％、27.56％；攻毒前添加益生菌组绒毛高度与隐窝深度比值比对照组增加43.95％。

表5 添加复合益生菌制剂对大肠杆菌感染试验肉鸡十二指肠黏膜组织形态结构的影响

注：“—”表示肠绒毛断裂破坏严重，无法测定绒毛高度；数据后所标字母相同表示差异不显著(P＞0.05)，所标字母不同表示差异显著(P＜0.05)；V/C为绒毛高度和隐窝深度比值。

表6 添加复合益生菌制剂对大肠杆菌感染试验肉鸡空肠黏膜组织形态结构的影响

注：数据后所标字母相同表示差异不显著(P＞0.05)，所标字母不同表示差异显著(P＜0.05)。

4.添加复合益生菌制剂对大肠杆菌感染试验肉鸡血清IgG的影响

试验动物采样保存于-20℃的血清样品，采用酶联免疫吸附(ELISA)试剂盒测定血清IgG，鸡IgG酶联免疫试剂盒(产品编号：ECH0031)购买自武汉菲恩生物科技有限公司，测定方法按照试剂盒说明书的方法进行。

根据检测结果，攻毒3天后，连续添加复合益生菌组和攻毒前添加益生菌组中血清IgG的含量均显著高于大肠杆菌阳性对照134.51％、113.26％，说明攻毒后，添加复合益生菌制剂可以引起机体强烈的免疫反应，快速产生免疫应答阻止病原菌的入侵。攻毒后10天后,连续添加复合益生菌组和攻毒前添加益生菌组血清IgG含量也均显著高于大肠杆菌阳性对照组，连续添加组比对照组提高96.79％，攻毒前添加益生菌组比对照组高73.76％。

表7 添加复合益生菌制剂对大肠杆菌感染试验肉鸡血清IgG的影响

5.添加复合益生菌制剂对大肠杆菌感染试验肉鸡肠粘膜可溶性IgA(sIgA)的影响

上述肉鸡解剖整理肠道并采集肠道组织形态观察的肠段后，剩余小肠段用无菌生理盐水冲洗掉内容物后，用灭菌镊子固定一端，用无菌剪刀沿肠管壁轻轻剖开，平铺于滤纸上，用无菌玻片刮取肠粘膜组织，置于2ml离心管中，-20℃保存备用。

称取1g保存的肠粘膜样品，加入9倍质量的生理盐水做10倍稀释，加入磁珠，用匀浆仪匀浆后，4℃、6000rpm离心30min，取上清。采用酶联免疫吸附法检测肠粘膜 sIgA的含量，鸡分泌型免疫球蛋白A(sIgA)酶联免疫试剂盒(产品编号：CSB-E10097Ch) 购买自武汉华美生物工程有限公司。

根据检测结果可知，在大肠杆菌感染的情况下，添加复合益生菌制剂可以显著提高肠粘膜可溶性IgA(sIgA)的含量，产生强烈的肠道黏膜免疫反应，提高机体对病原菌特别是肠道病原菌的抵抗能力。感染后3天，连续添加益生菌组肠粘膜sIgA含量显著高于大肠杆菌对照组446.99％；攻毒前添加益生菌组sIgA含量比对照组增加281.81％。感染后10天，连续添加益生菌组和攻毒前添加益生菌组均显著高于大肠杆菌氏菌对照组543.10％、207.26％。

表8 添加复合益生菌制剂对大肠杆菌感染试验肉鸡肠粘膜可溶性IgA的影响

6.添加复合益生菌制剂对大肠杆菌感染试验肉鸡盲肠微生物菌群的影响

上述肉鸡解剖后整理出盲肠，用无菌剪刀取盲肠，收集盲肠内容物至2ml冻存管中，液氮速冻2h，转移至-80℃保存。提取盲肠内容物基因组DNA，对基因组DNA进行16SV4 区域扩增子测序，分析添加复合益生菌制剂对大肠杆菌感染肉鸡盲肠微生物物种分类及丰度、种群结构、***进化的影响。

DNA提取及测序流程如下：

样品准备→DNA提取与检测→PCR扩增→产物纯化→文库制备及库检→lonS5^TMXL上机测序。

对测序得到的原始数据进行拼接、过滤、得到有效数据。基于有效数据进行OUTS(操作分类单元)聚类和物种分类分析，根据OTUs聚类结果，一方面对每个OTU的序列做物种注释，得到对应的物种信息和基于物种的丰度分布情况。同时，对OTUs进行丰度、Alpha 多样性计算、花瓣图分析，以得到样本内物种丰富度和均匀度信息、不同样本或分组间的共有和特有OTUs信息等。另一方面，可以对OTUs进行多序列比对并构建***发生树，通过降维分析和样本聚类树展示，探究不同样本或组别间群落结构的差异。为进一步挖掘分组样本间的群落结构差异，利用统计分析方法对分组样本的物种组成和群落结构进行差异显著性检验。扩增子的注释结果和相应的功能数据库相关联，选用Tax4Fun软件对生态样本中的微生物群落进行功能预测分析。

通过16s RNA扩增子测序，共获得2085634条原始数据、质控后共得到1626254条有效数据，平均每个样品得到67760条有效数据，质控有效率达到94.82％。以97％的一致性(Identity)将序列聚类成为OTUs，感染后3天和感染后10天2个时间点六个组(EPC1：对照组大肠杆菌感染后3天；EPC2：对照组大肠杆菌感染后10天；EPI1：感染大肠杆菌前添加益生菌组感染后3天；EPI2：感染大肠杆菌前添加益生菌组感染后10天；EPS1：连续添加益生菌组感染后3天；EPS2：连续添加益生菌组感染后10天)共有OUT数目1910个，相同OTU数目887个，各组特有OTUs数目各组分别为EPC1组26个、EPC2组47个、EPI1 组30个、EPI2组16个、EPS1组19个、EPS2组30个。见图5。

测序结果显示，肉鸡在感染大肠杆菌情况下添加益生菌对可以显著增加拟杆菌属的相对丰度，感染后3天，与大肠杆菌感染对照组相比较连续添加益生菌组拟杆菌属相对丰度增加 194.27％，感染前添加益生菌组拟杆菌属相对丰度增加23.25％；感染后10天，连续添加益生菌组和感染前添加益生菌组拟杆菌属分别比对照组增加197.66％、221.36％。感染后3天对照组粪杆菌属显著低于连续添加益生菌组和感染前添加益生菌组62.44％、98.05％，但感染后10天，对照组粪杆菌属却显著增加，高于连续添加益生菌组和感染前添加益生菌组 45.54％、38.13％，连续添加益生菌组和感染前添加益生菌组粪杆菌属相对丰度保持稳定。结果表明，添加益生菌可以保持肠道微生态***的平衡稳定，促进肠道有益微生物的繁殖，在大肠杆菌入侵时能够抵抗入侵和定植，避免肠道黏膜屏障的损伤。见图6。

根据metastats组间群落显著性差异分析(图7)，大肠杆菌感染对照组Barnesiella属菌显著性高于添加益生菌组，根据已有的文献报道，Barnesiella菌具有清除病原菌的作用，说明未添加益生菌组在感染大肠杆菌后，大肠杆菌大量在肠道繁殖，诱导Barnesiella菌的急剧增加来清除大肠杆菌，而添加益生菌组能够拮抗病原菌，感染后大肠杆菌不能在肠道大量繁殖，对肠道造成的不良影响较小，降低了大肠杆菌引起的肠道病原性感染应激。同时也发现，添加益生菌可以显著性提高mucispirillum属细菌的含量，mucispirillum在病原菌感染时会减少，在病原菌被清除之后才会回到正常水平，这也说明了添加益生菌能够拮抗大肠杆菌的感染。

对肠道样品进行微生物多样性和群落结构分析，感染未添加益生菌对照组肠道微生物群落结构和微生物功能基因表达差异较大，添加益生菌可以增加肠道微生物的多样性，提高肠道微生态***的稳定性。

Claims

1.一株分离的格氏乳杆菌，所述的格氏乳杆菌为格氏乳杆菌（Lactobacillus gasseri）YD2-2，保藏编号为CCTCC NO：M 2019340。

2.权利要求1所述的格氏乳杆菌在制备细菌抑菌剂中的应用，所述的细菌为大肠杆菌、肠出血性大肠杆菌、鸡白痢沙门氏菌、表皮葡萄球菌或金黄色葡萄球菌。

3.一种抗肠出血性大肠杆菌感染的禽用复合益生菌制剂，包括：枯草芽孢杆菌、凝结芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、格氏乳杆菌、植物乳杆菌。

4.根据权利要求3所述的禽用复合益生菌制剂，其特征在于，所述的枯草芽孢杆菌活菌数为10^8~10⁹CFU/g、凝结芽孢杆菌活菌数为10^7~10⁸CFU/g、解淀粉芽孢杆菌活菌数为10^7~10⁸CFU/g、格氏乳杆菌活菌数为10^8~10⁹CFU/g、植物乳杆菌活菌数为10^8~10⁹CFU/g。

5.根据权利要求4所述的禽用复合益生菌制剂，所述的解淀粉芽孢杆菌为解淀粉芽孢杆菌H6，CCTCC NO:M2013249；植物乳杆菌为植物乳杆菌ZN-3，CCTCC NO：M 2017286。

6.权利要求3所述的禽用复合益生菌制剂在制备禽用饲料添加剂中的应用。

7.权利要求3所述的禽用复合益生菌制剂在制备预防或治疗肠炎性大肠杆菌感染的药物。