CN107846860A

CN107846860A - 形成加倍单倍体植物的方法

Info

Publication number: CN107846860A
Application number: CN201680043313.2A
Authority: CN
Inventors: F·董; M·格拉汉姆; H·拉吕; D·奥瓦得雅
Original assignee: Monsanto Co
Current assignee: Monsanto Co; Monsanto Technology LLC
Priority date: 2015-07-16
Filing date: 2016-07-15
Publication date: 2018-03-27
Also published as: CN107920519A; EP3322284A1; MX2018000582A; US20200375128A1; ES2962514T3; US20190014730A1; EP3334279A1; CN113558056B; MX2018000583A; MX2021000206A; CA2991129A1; MX2021000202A; US11930752B2; AR105387A1; BR112018000794A2; CN113575427B; CN115918545A; CN113575427A; WO2017011737A1; MX2021008258A

Abstract

本发明提供了通过增加用植物生长调节剂处理单子叶植物而形成加倍单倍体种子的机会的次数来增加形成加倍单倍体植物的效率的方法。在某些实施方案中，制备包含多个共显性果穗的玉米植株。还提供了包含产生增加的加倍单倍体后代数的潜力的植株。

Description

形成加倍单倍体植物的方法

背景

植物的进化和驯化通常遵循常用模式或伴随将作物与其野生祖先区别开的“驯化综合特征(domestication syndrome)”。作物中的一种常见驯化综合特征由关于增加的顶端优势的长期选择而产生，顶端优势的特征为中心茎以及其芽和花的生长与侧茎和腋芽的生长相比相对更健壮，这使得每个植株的果实更少且更大。关于顶端优势的选择被视为许多物种中的重要驯化征兆，包括禾谷类作物，即稻米、小麦、大麦以及玉米；以及水果作物，如番茄。

驯化作物期间的一个重要挑战为与作物的祖先相比改善作物的收获量。在不利的环境中，野生植物常常快速开花并成熟；产生更小数目的分枝、花序、花以及种子，以增加产生至少一个后代来持续生命周期的可能性。在有利的环境中，野生植物通过随时间推移依序产生更多分枝、花序、花以及种子来最大化成功生殖的概率。后一种策略对于作物来说不是最佳的，因为它更高效收获较少但较大的果实或花序，这些果实或花序在植株间同步成熟，这容许在最佳果实或花序成熟时间的单次收获。因此，已选择多种作物来在主茎上产生更小数目的较大种子、果实或花序作为改善收获量的手段。

或许，最显著并且充分研究的株型改变是由玉米的驯化引起的。通过选择改善产量和机械收获量的性状，人类已将玉米祖先从具有端部带有雄花或雌花的多个伸长的侧向分枝的丛生、灌木样原种转化成当今的包含仅具有两个或三个相对短的侧向分枝的单一、直立主茎，各侧向分枝以单一雌花(果穗)封端的作物。当今普遍接受的是，在玉米中关于顶端优势的选择不仅改善理想生长条件下的总产量，而且它还使得协调品系之间的开花时间的逻辑容易得多并且简化田间维护和机械收获的过程。

玉米中顶端优势的机制涉及调节由顶端分生组织产生的激素，诸如生长素。当一级果穗开始成熟时，由顶端分生组织产生更大量的生长素。生长素被从顶端分生组织运送到植株下部并且抑制下部果穗的发育，从而导致二级果穗不太可能完全巧合或产生有活力的种子。

单倍体孢子体植株含有配子染色体数(n)并且可自发或通过人工诱导产生。单倍体与具有合子染色体数(2n)的类似基因型的孢子体相比倾向于不太旺盛并且不太可育，且因此对设法改善植株遗传学的研究者来说具有有限的直接益处。

虽然发生了自发染色体加倍，但频率太低(典型地不到5％)，以至于试图形成加倍单倍体植株(“DH植株”)的研究者常常对单倍体植株进行处理，从而促进染色体加倍。经历了染色体加倍处理的单倍体植株秧苗可产生单倍体卵和/或***，并且如果这些植株成功自交，那么在后代中合子染色体数可恢复，从而恢复对2n孢子体所期待的旺盛度和可育性。

在染色体加倍期间，各同系物被复制以形成原始物的基本上相同的拷贝并且因此通常认为DH植株的整个基因组在各基因座处为纯合的。此过程与传统的回交相比可在较少的世代中形成完全纯合和同质的品系，由此改善选择功效，降低育种周期的数目和长度，并且消耗较少的资源。

然而，使用本领域中当前已知的方法从给定单倍体植物产生大量加倍单倍体后代的可能性太低，以至于其严重降低在竞争性育种计划中将其大规模合并的优势。早在二十世纪五十年代研究者已试图改善植株中的加倍速率并且已研发出用于超过250种作物物种的技术。然而，即使所描述的最佳方法也确实产生仅12％或更小的加倍速率并且典型地取决于应用抗微管药物秋水仙碱，秋水仙碱在所需浓度下对植株为毒性的。所述作用还是高度基因型特异性的。

此外，当前的加倍方法为劳动密集型的并且常常要求在处理期间对植株处置若干次，从而使其存活率降低。单倍体植株在秋水仙碱处理期间常常变得太脆弱，以至于即使它们经受住该处理并且成功加倍，在将其移栽到田野、温室或它们可恢复并最终生长以产生种子的其他生长条件所必需的后续处置和下游处理步骤中它们也不会存活。因此，当比较一种加倍方法与另一种方法的总有效性时，植物育种者和研究者将典型地使用如下标尺，所述标尺以单倍体植株加倍的可能性以及植株存活从而产生加倍单倍体种子的可能性为特征。

概述

本文提供增加单子叶植物产生的花序数目的方法。在某些实施方案中，增加单子叶植物产生的花序数目的方法包括使单子叶植物与植物生长调节剂接触以与不与植物生长调节剂接触的对照植物相比产生更大数目的花序。

某些方面提供在玉米植株上产生共显性果穗的方法。在某些实施方案中，所述方法包括使玉米植株与植物生长调节剂接触，使得玉米植株产生共显性果穗。在某些实施方案中，玉米植株产生至少两个共显性果穗。在某些实施方案中，玉米植株产生三个、四个、五个或更多个共显性果穗。

在本文所公开的方法的某些实施方案中，植株可为单倍体植株。

某些方面提供增加从DH₀玉米植株获得或收获的DH₁种子数目的方法。某些方面提供增加由DH₀玉米植株产生的DH₁种子数目的方法。某些方面提供在DH₀玉米植株上产生共显性果穗的方法。在某些实施方案中，此类方法中的任一种包括使DH₀玉米植株在发育阶段V4、V5、V6、V7、V8、V9或V10中的任一阶段与植物生长调节剂接触，以及使DH₀玉米植株在其生命周期的任何阶段与染色体加倍剂接触。在某些实施方案中，此类方法中的任一种包括使DH₀玉米植株在发育阶段V4、V5、V6、V7、V8、V9或V10中的任一阶段与染色体加倍剂接触。在某些实施方案中，此类方法产生DH₀玉米植株，所述DH₀玉米植株产生至少一个DH₁玉米种子和至少两个共显性果穗。在某些实施方案中，由具有至少两个共显性果穗的DH₀玉米植株产生的DH₁玉米种子的总数目大于由展现单一显性果穗的对照DH₀玉米植株产生的DH₁玉米种子的数目。在某些实施方案中，DH₀玉米植株产生第一共显性果穗和第二共显性果穗，并且第二共显性果穗产生比第一共显性果穗更多的DH₁玉米种子。在某些实施方案中，DH₀玉米植株产生第一共显性果穗、第二共显性果穗以及第三共显性果穗，并且第三共显性果穗产生比第一共显性果穗更多的DH₁玉米种子。在某些实施方案中，所述方法进一步包括在使DH₀玉米植株与植物生长调节剂或染色体加倍剂接触之前对DH₀玉米植株进行基因分型。可使用此举以允许知晓关于要用于选择哪个或哪些DH₀玉米植株来进行接触或以何种方式来使它们接触以实现所需结果的DH₀玉米植株的信息。在某些实施方案中，所述方法进一步包括从DH₀玉米植株获得DH₁玉米种子。在某些实施方案中，所述方法进一步包括对从DH₀玉米植株获得的DH₁玉米种子进行基因分型或对从DH₁玉米种子生长出的植株进行基因分型。可使用关于DH₁玉米种子或植株的信息来判断在育种计划中继续使用哪些种子或植株。因此，在某些实施方案中，所述方法进一步包括使基于基因分型而选择的DH₁玉米种子生长。在某些实施方案中，所述方法进一步包括使从所选择的种子生长出的DH₁玉米植株与另一植株杂交。在某些实施方案中，此类方法中的任一种产生至少约15％的DE₄加倍效率，产生至少约15％的DE₂₀加倍效率，产生至少约15％的DE₃₀加倍效率，和/或产生至少约15％的DE₅₀加倍效率。

在本文中的方法中的任一种的某些实施方案中，通过喷淋、气体熏蒸、喷射或喷雾使植株与植物生长调节剂接触。在某些实施方案中，植物生长调节剂为植物激素、赤霉酸抑制剂、细胞***素或其任何组合。在某些实施方案中，植物生长调节剂为选自包含以下各项的组的赤霉酸抑制剂：矮壮素-CL、甲哌鎓-CL、AMO-1618、三丁氯苄膦(clorphonium)-Cl、四环唑、环丙嘧啶醇、呋嘧醇、多效唑、烯效唑-P、抗倒胺、调环酸-CA、抗倒酯、丁酰肼、外-16,17-和二氢-GA5-13-乙酸盐。

在某些实施方案中，使DH₀玉米植株在其与植物生长调节剂接触之前与诸如秋水仙碱等染色体加倍剂接触。在某些其他实施方案中，使DH₀玉米植株在其与植物生长调节剂接触之后与染色体加倍剂接触。在某些实施方案中，使DH₀玉米植株在与植物生长调节剂接触之前或之后1分钟、5分钟、15分钟、30分钟、1小时、2小时、3小时、6小时、12小时或24小时内与染色体加倍剂接触。在某些实施方案中，使染色体加倍剂和植物生长调节剂同时与DH₀玉米植株接触。

在某些实施方案中，使玉米植株在发育阶段V4、V5或V6与植物生长调节剂接触。在某些实施方案中，使玉米植株在发育阶段V6、V7、V8、V9或V10与植物生长调节剂接触。

在某些实施方案中，所述方法使得在单一玉米植株上产生三个或更多个、四个或更多个或者五个或更多个共显性果穗。某些实施方案提供包含至少两个共显性果穗的优良单倍体玉米植株。在某些实施方案中，共显性果穗中的至少一个包含加倍单倍体胚。某些实施方案提供包含至少两个共显性果穗的DH₀玉米植株，其中共显性果穗中的至少一个包含加倍单倍体胚。某些实施方案提供通过本文所描述的方法中的任一种产生的玉米植株。

图式简单说明

图1示出了根据群体谱系、在玉米秆上的位置以及它们所产生的DH₁种子数目而分类的果穗。

图2示出了从用植物生长调节剂处理的单一植株生长的八个编号的玉米共显性果穗。

图3示出了由来源于经历分蘖诱导处理的相同母本植株的分蘖所产生的平均种子总数。

图4表明用PGR处理的植株每个植株产生更多种子。

图5表明在各品系间，PGR-处理的植株每个植株产生更多种子。

详细说明

本文提供诱导或促进作物中腋生分生组织或额外侧枝或额外花序的发育的方法。在某些方面中，出于改善加倍单倍体(“DH”)植株制备的效率的目的而这样做。

应当注意，术语“一个”或“一种”实体是指一个或多个(或一种或多种)该实体；例如“一个植株”，应理解为代表一个或多个植株。因而，术语“一个”(或“一种”)、“一个或多个”以及“至少一个”在本文中可互换使用。

此外，“和/或”当在本文中使用时应视为在存在或不存在另一个的情况下特定地公开两个所规定的特征或组分中的每一个。因此，术语“和/或”当在本文中用在诸如“A和/或B”等短语中时，旨在包括“A和B”、“A或B”、“A”(单独)以及“B”(单独)。同样地，术语“和/或”当用在诸如“A、B和/或C”等短语中时，旨在涵盖以下实施方案中的每一个：A、B以及C；A、B或C；A或C；A或B；B或C；A和C；A和B；B和C；A(单独)；B(单独)；以及C(单独)。

除非另外定义，否则本文中所用的技术和科学术语具有与本公开所属领域一般技术人员通常所理解相同的含义。单位、前缀以及符号以其国际单位制(SystèmeInternational de Unites，SI)所接受的形式表示。数值范围包括界定所述范围的数字。

本文所提供的标题仅仅是为了便于参考，而不限制各个方面或本公开的方面，其可参考本说明书整体而存在。因此，下面紧接着所定义的术语通过参考本说明书全文而被更完整地定义。

定义

如本文所用，“植株”是指整个单子叶植株、其任何部分或来源于单子叶植物的细胞或组织培养物，包含以下各项中的任一个：整个植株、植物组件或器官(例如叶、茎、根等)、植物组织、种子、植物细胞和/或其子代。植物细胞为植物的生物细胞，所述生物细胞取自单子叶植物或通过培养来源于取自单子叶植物的细胞。

如本文所用，“植株的群体”或“植株群体”是指包含任何数目(包括一个)的个体、对象或数据的集合，从所述集合中取得样品以用于评估，例如估计QTL效应。最通常地，所述术语涉及植株的育种群体，在育种计划中从所述育种群体中选择成员并且杂交以产生子代。植株的群体可包括单次育种杂交或多次育种杂交的子代，并且可为实际植株或源于植株的材料，或计算机模拟表示的植株。群体成员不需要与被选择用于后续分析周期的群体成员或最终被选择来获得最终子代植株的那些群体成员相同。通常，植株群体来源于单次双亲杂交，但也可来源于相同或不同亲本之间的两次或更多次杂交。虽然植株的群体可包含任何个体数目，但本领域技术人员将认识到植物育种者通常使用在一百或两百个个体至数千个个体范围内的群体大小，并且在后续杂交中通常选择使用群体中性能最高的5-20％，以改善群体的后续世代的性能。

如本文所用，术语“基因元件”是指已***玉米基因组、核苷酸序列或植株基因组的基因座的重组DNA构建体(通常称为“转基因”)。

如本文所用，术语“促进”和“诱导”可互换地用于意指促进例如从先前存在的芽发育腋芽以及诱导例如从头形成腋芽。

如本文所用，术语“非天然存在的”物质、组合物、实体和/或物质、组合物或实体的任何组合或其任何语法变化型式是一个条件性术语，该术语明确排除(但仅排除)由所述物质、组合物、实体和/或物质、组合物或实体的任何组合的由本领域一般技术人员充分理解为“天然存在”或由判断者或行政或司法机构确定或解释为或可能在任何时候为“天然存在”的那些形式。

如本文所用，术语“花”和“花序”可互换使用。

如本文所用，术语“玉米”和“玉蜀黍”可互换使用。

如本文所用，术语“优良”、“优良植株”等描述由人类指导的育种和针对优良农艺学性能的选择产生的至少一种作物的组、种质或群体。“优良群体”为可用于就诸如玉米等给定作物物种的农艺学优良基因型而言代表现有技术水平的一批优良个体或品系。类似地，“优良种质”或“优良种质品种”为典型地来源于和/或能够产生具有优良农艺学性能的植株的农艺学优良种质，诸如现有或新研发的优良玉米品系。相比之下，“外来植株”、“外来品系”或“外来种质”为来源于不属于可用优良品系或种质品种的植株的植株、品系或种质。在两个植株或种质品系之间杂交的情形中，外来种质不因世系而与和其杂交的优良种质紧密相关。最通常地，外来种质不来源于作物的任何已知优良品系，而是被选择来向育种计划中引入基因元件(典型地为所需等位基因)。

玉米植株倾向于产生发育最快且最完全的单一显性或一级果穗。有时从显性果穗向下在茎的下部形成额外的果穗(二级果穗为从一级果穗向下接下来的果穗，三级果穗为接下来最低的等等，所有这些可统称为二级果穗)，但其发育典型地相对于显性果穗有所延迟。因为额外或非显性果穗的发育通常有所延迟，所以显性果穗典型地为唯一一个完全巧合的果穗。

如本文所用，术语“共显性果穗”是指玉米植株上以类似速率/在类似时间成熟从而在重叠的时间框内产生易于接受花粉萌发的穗丝的果穗。具有共显性果穗的植株将具有至少两个共显性果穗。可根据共显性果穗在茎上的位置对其进行编号，即顶部共显性果穗为第一共显性果穗，从第一共显性果穗向下接下来的共显性果穗为第二共显性果穗，第三共显性果穗为接下来最低的等等。

如本文所用，对照植株(例如单子叶对照植株、玉米对照植株等)为如下植株(或植株群体)，所述植株(或植株群体)被识别为具有尚未用植物生长调节剂处理，但在诸如基因组成和生长条件等其他方面类似于用植物生长调节剂处理的植株的植株的代表性表型(例如花序数目、分蘖数目、果穗数目、籽粒/种子数目、高度、生物质等)。举例来说，本领域一般技术人员将了解对照植株具有以下属性中的一个或多个：由来源于相同诱导杂交的种子产生；具有至少一个与所处理的植株同样的亲本；在十二代以内与所处理的植株拥有共同的原种；与所处理的植株拥有充足的共同基因遗传性，从而植物育种领域的一般技术人员将认可该对照植株为用于在植物生长调节剂的应用与所得表型之间建立相关性的有效比较；和/或具有一个显性果穗并且没有共显性果穗(玉米)。本领域一般技术人员将认识到因偶然(例如统计逸出值)、因另外一些类型的操纵或其他原因而包含不同于未处理植株的代表性表型的表型的未处理植株将不是适当的对照植株。

加倍效率

被称为DH₀植株的经历染色体加倍处理的单倍体植株(或在某些实施方案中为要进行染色体加倍处理的单倍体植株)通过与染色体加倍剂接触可产生单倍体卵和/或***，并且如果DH₀植株成功自交，那么在后代(称为DH₁种子、植株等)中合子染色体数可恢复，从而恢复对2n孢子体所期待的旺盛度和可育性。“加倍效率”(DE)为通过用产生DH₁种子的名称的DH₀植株的数目除以经历染色体加倍处理的名称的DH₀植株的总数目所计算的加倍成功的总标尺。

虽然单一DH₁种子的回收在技术上可算作是成功加倍事件，但植物育种者通常需要具有至少若干个植株的群体，以产生从对群体进行的基因和统计测试得出有把握的结论所必需的统计功效。举例来说，仅产生一个或几个DH₁种子的加倍处理将在竞争性育种计划中具有有限用途，因为将需要至少一个额外世代的种植、生长、授粉以及收获来产生足够的群体大小以进行准确统计测试，尤其是如果计划在多个环境间进行比较。在相对大的育种计划中，此种子“增量”步骤可能会将所述群体的测试推后一整个季节，这典型地延迟商业产品发布，潜在地导致有价值市场份额的损失。由于本文所描述的方法可增加在单一世代中由DH₀植株产生的DH₁种子的数目，它们还可降低将必需额外世代来增多(增加)来自给定杂交的DH₁种子的数目以便将所述群体推进至育种过程中的后续步骤(例如田间测试)的可能性。因此，本文所描述的方法的使用者将能够比使用别处描述的当前方法的使用者更快地为市场研制出改善的种质。

为了更好地定量加倍处理功效，在计算DE的过程期间可应用最低产量约束条件，使得给定DH₀植株在其被算入成功加倍事件的比例内(即用于分子中)之前必须至少产生最少数目的DH₁种子。可使用下标来表示最低产量约束条件，使得DE₂₀为当仅用产生至少20个DH₁种子的DH₀植株除以经历加倍处理的DH₀植株的总数目时所计算的加倍效率。DE₃₀表示当仅用产生至少30个DH₁种子的DH₀植株除以经历加倍处理的DH₀植株的总数目时的DE。类似地，DE₅₀表示当仅用产生至少50个DH₁种子的DH₀植株除以经历加倍处理的DH₀植株的总数目时的DE等等。

腋芽诱导和促芽

本文描述了以下发现：现在有可能显著增加在单一世代中从DH₀单子叶植株回收目标数目的种子的可能性。方法包括诱导或促进单子叶植株发育出可产生额外花序的多种不同类型的腋芽中的至少一种。腋芽诱导和/或在不同生长阶段处理植株以控制产生的腋芽类型的不同实施方案为可能。非限制性实例包括多芽体(multibud)、分蘖以及共显性果穗，这些在本文中有详细定义。

单子叶植物中的腋芽诱导缓和通常抑制侧枝和/或二级花或花序发育的顶端优势。在某些实施方案中，与当前集中于最大化单一雌性花序发育的植物育种和作物栽培方法相比，使用者使母本植株产生更大数目的可育雌性花序和可育雌性卵。

虽然已知有时会自发地产生和发育，但玉米中腋芽的形成或发育目前为一种不希望的性状，出于本文所描述的许多原因将这种性状从育种计划中清除。以下想法在这些原因之中：负责维持顶端优势的激素将抑制腋芽花的发育，所以如果植株不浪废资源使它们或支持它们的营养结构发育，那么会更高效。在现代玉米杂交种中这尤其明显，其中典型地在良好环境中通过使杂交种生长来使产量最大化，所述杂交种经选择以将其资源集中于使完全巧合的单一、超性能果穗发育，而使任何腋芽或二级花序的发育降至最低程度。

然而，已发现，通过在植物生命周期中的许多可能的点中的一个或多个点对单子叶植株进行若干可能的腋芽诱导处理中的至少一种，有可能释放更大的植物育种者已选择过的顶端优势的发育程序化。在某些实施方案中，使用者对单子叶植株进行处理，从而促进至少一个预先存在的或原始的腋芽的发育，使得它在玉米植株的主茎上形成侧边枝条(例如分蘖)或二级(或三级、或四级等)花序。使用者可使玉米植株上至少一个腋芽的发育与玉米植株上其他芽的发育同步，以实现植株上展现对显性果穗所期待的性状(包括在大致相同的时间易于接受授粉)的至少两个果穗(例如共显性果穗)的同时和协调发育。本文中的描述和实例使使用者能够从广泛范围的选择中选择和/或研发出适当的诱导处理参数组合来符合特定需要。某些实施方案包括对植株进行处理，从而重新设定主茎结节区中的至少一个细胞的发育程序，使得它产生至少一个新的侧向枝条分生组织，从而发育成能够产生可育花序(例如多芽体)的新侧向分枝。

因此，在某些实施方案中，使用者可如下有把握地从DH₀单子叶植株回收目标数目的种子：对它进行诱导以从腋芽形成额外的花，对这些花授粉，并且然后收获由这些额外的花形成的种子，直到获得目标数目的种子。通过将由经过诱导以形成额外腋芽的植株产生的所有种子组合，可增加在单一世代中从单一母本植株产生所需种子数目的机会。

巧合性

在玉米中，成功形成籽粒需要支持受精所必需的雌性结构功能完全时的时间框与花粉有活力并且从雄穗释放时的时间框重叠。良好巧合描述这些时间框的重叠足以使果穗上的大部分(如果不是全部)的可用子房受精时的情况。因为花粉可能对干燥、热以及其他环境因素敏感，所以良好巧合的时间框常常限于若干天或甚至几个小时。如果花粉释放太早，使得到雌花易于接受授粉时其大部分或全部为非活力的，那么巧合性将欠佳，从而产生许多未受精的卵和不良种子集合。当花粉释放太晚，以至于穗丝死亡或雌花以其他方式不再易于接受和/或能够支持受精时，也预期巧合性欠佳。在正常生长条件下，二级果穗的发育通常被抑制和延迟，使得一级果穗典型地为仅有的发育足够与雄穗一致以产生良好巧合的果穗。

巧合性在玉米生命周期中起到如此重要的连接作用，以至于商业生产者和玉米育种者相似地耗费大量资源帮助确保巧合性。竞争性或工业育种计划中剔除以其他方式展现优良性能但不完全巧合并且因此维护变得不经济的品系并不罕见。举例来说，DH₀植株的群体可展现极高加倍速率并且含有优良遗传特征，但如果它巧合性太差以致难以产生足够的种子来进行自交和/或维持，或者如果需要超过一代来产生足够的种子用于性能测试，那么可能仍会被从进一步研发中清除出来。

植物处理剂

在本文所提供的某些实施方案中，可使植株与多种“植物处理剂”接触。因此，如本文所用，“植物处理剂”或“处理剂”或“药剂”可指任何外源提供的可引入植株表面并且转移至植物组织中的化合物。在一些实施方案中，植物处理剂在植物组织内在细胞外起作用，诸如与外部细胞表面上的受体相互作用。在一些实施方案中，植物处理剂进入组织内的细胞中。在一些实施方案中，植物处理剂含于液体内。此类液体包括但不限于溶液、悬浮液、乳液以及胶体分散液。

使植株与处理剂接触可在施加其他物质之前、期间或之后进行。在某些实施方案中，通过将植株浸渍、浸没或以其他方式***到包含植物处理剂的液体的储集器中来实现植株与处理剂之间的接触。使植株与处理剂接触的其他方法包括用包含植物处理剂的溶液对植株进行喷雾或喷洒或者在包含植物处理剂的溶液中搅动或翻动植株。在某些实施方案中，通过土壤喷淋来实现植株与处理剂之间的接触，此举包括将液体处理剂添加至将生长植株的靠近根的土壤或生长培养基中。

在某些实施方案中，液体具有水性性质。在某些实施方案中，水性液体可包含水溶性组分。在某些实施方案中，水性液体可包含水不溶性组分，可包含通过添加表面活性剂变得可溶于水的不溶性组分，或可包含可溶组分、不溶性组分以及表面活性剂的任何组合。

“植物处理溶液”或“处理溶液”可指包含植物处理剂的液体的任何溶液。在某些实施方案中，植物处理溶液包含植物处理剂，并且这两个术语常常可被用作同义词。举例来说，将包含植物处理剂秋水仙碱的植物处理溶液递送至植株分生组织与将包含秋水仙碱的植物处理剂递送至植株分生组织基本上同义。

植物处理剂包括但不限于大分子，包括多核苷酸，包括核酸(例如DNA和/或RNA)、多肽、多糖、聚酮等。多核苷酸可为单链或双链的并且可包括反义分子和干扰RNA。多核苷酸可包括本领域中熟知的突变和/或诸如对其主链的各种其他修饰。多核苷酸包括“基因元件”，所述基因元件包含已***植株基因组或核苷酸序列或植株基因组的基因座中的重组DNA构建体(通常称为“转基因”)。因此，在某些实施方案中，本发明的使用者可将DNA或RNA的序列递送至靶组织以改变植株性状的表达或遗传，例如通过将基因元件***其基因组中来有效“转化”植株。

植物处理剂还可包含各种植物激素、植物激素激动剂、植物激素拮抗剂或刺激或抑制植物激素感知、信号传导或合成的药剂。在某些实施方案中，植物处理剂包含植物生长调节剂(PGR)。PGR为影响植株或植株部分的细胞进程、生长、发育或行为的一类化合物。在一些实施方案中，PGR负责加快或阻滞生长或成熟的速度或以其他方式改变植株或植株部分的行为。在一些实施方案中，PGR为天然存在的植物激素。在一些实施方案中，PGR为改变开花、节间长度、顶端优势、成熟、根构型或结果实的化学品，包括影响单子叶植物的生长、发育、行为或生殖的任何物质。植物生长调节剂包括生长素(例如IAA)和生长素抑制剂、细胞***素(例如BAP)和细胞***素抑制剂、可刺激乙烯产生的化合物(即ACC等)以及可抑制乙烯产生的化合物(AVG等)以及抑制乙烯感知的化合物(银等)。植物生长调节剂还包含调节植株感知、信号传导和/或行为的化合物，诸如赤霉素和其抑制剂(例如多效唑(PBZ)或烯效唑)、脱落酸和其抑制剂以及茉莉酸和其抑制剂。其他实例包括肽激素，例如***素(systemin)、植物磺肽素(phytosulfokine)、快速碱化因子等。

IAA为吲哚-3-乙酸，而IBA为吲哚-3-丁酸。两者均为称为生长素的一类植物激素的天然存在的形式。可使用生长素的其他变化型式，包括合成生长素，诸如2,4-D(2,4-二氯苯氧乙酸和α-NAA(α-萘乙酸)。

如本文所用，PBZ为多效唑，即(2S,3S)-1-(4-氯苯基)-4,4-二甲基-2-(1,2,4-***-1-基)戊-3-醇，也写作C15H10CIN30，是一种植物生长调节剂和***杀真菌剂。它是植物激素赤霉素的已知拮抗剂，抑制赤霉素生物合成，减少节间生长并且增加茎围。BAP为6-苯甲酸嘌呤，即N-(苯基甲基)-7H-嘌呤-6-胺，也写作C12H11N5。IAA为吲哚-3-乙酸，而IBA为吲哚-3-丁酸。两者均为称为生长素的一类植物激素的天然存在的形式。在本发明情况下可使用的生长素的其他变化型式包括合成生长素，诸如2,4-D(2,4-二氯苯氧乙酸)和1-NAA(1-萘乙酸)。

如本文所用，烯效唑为(e)-(+/-)-β-((4-氯苯基)亚甲基)-α-(1,1-二甲基乙基)-1h-1,2,4-***-1-醇，也写作C15H18CIN3O，也称为烯效唑-P。它是一种***型植物生长阻滞剂和植物激素赤霉素的已知拮抗剂，减少节间生长并且增加茎围。

一般来说，本文中所用的植物处理剂将为水溶性药剂。然而，在某些实施方案中，可通过使用还包含各种转移或调节剂的液体组合物来促进具有高、中、低或可忽略的水溶性的植物处理剂的使用。转移或调节剂可包含促进植物处理剂迁移至植株(例如植物细胞)和/或促进植物处理剂由植株吸收的任何药剂。转移或调节剂包括但不限于(a)表面活性剂、(b)有机溶剂或有机溶剂的水溶液或水性混合物、(c)氧化剂、(d)酸、(e)碱、(f)油、(g)酶或其组合。在某些实施方案中，方法可任选包括孵育步骤、中和步骤(例如将酸、碱或氧化剂中和，或使酶失活)、冲洗步骤或其组合，借此在递送至植株之前或之后对液体和其中所含的植物处理剂进行处理。因此，转移或调节剂包括但不限于乳液、反向乳液、脂质体以及其他胶束样组合物。适用的佐剂的实例包括表面活性剂和其中所含的有效分子，所述有效分子包括脂肪酸(诸如牛脂或牛脂基伯胺或磷脂)的钠盐或锂盐。转移或调节剂可包含盐，包括但不限于钠、铵、钙、锂、镁的氯化物、硫化物以及硫酸盐。本文所提供的方法的某些实施方案使用反离子或已知与植物处理剂缔合的其他分子。对于某些带负电荷的植物处理剂，诸如多核苷酸，可使用阳离子，诸如无机铵离子、烷基铵离子、锂离子；聚胺，诸如精胺、亚精胺或腐胺；等。适合用于将植物细胞调节成在包括但不限于多核苷酸的某些植物处理剂情况下渗透的有机溶剂为诸如DMSO、DMF、吡啶、N-吡咯烷、六甲基磷酰胺、乙腈、二噁烷、聚丙二醇等溶剂或可与水混溶的其他溶剂。在存在或不存在表面活性剂或乳化剂的情况下可使用天然衍生的或合成的油，例如可使用植株来源油、作物油(诸如在万维网(因特网)上在“herbicide.adjuvants.com”公共可获得的第9版Compendium of Herbicide中所列的作物油)。适合于在本文所提供的方法中使用的某些液体组合物中的油包括但不限于石蜡烃油、多元醇脂肪酸酯或具有用酰胺或聚胺(诸如聚乙烯亚胺或N-吡咯烷)改性的短链分子的油。

在某些实施方案中，植物处理剂可为染色体加倍剂。使用染色体加倍剂来产生加倍单倍体植物细胞和加倍单倍体植株。染色体加倍剂可包含引起染色体加倍的各种有丝***抑制剂。在某些实施方案中，染色体加倍剂可为诸如以下的化合物：秋水仙碱、甲基胺草磷、氟乐灵(trifluralin)、胺磺灵(oryzalin)、拿草特(pronamide)或氯苯胺灵(chloropropham)。在其他实施方案中，染色体加倍剂可为低哺乳动物毒性染色体加倍剂。可使用的各种低哺乳动物毒性染色体加倍剂包括但不限于诸如以下的化合物：i)美国专利申请公布2010/0169999中所公开的1,2,3-三甲氧基-4-((1S,6R)-6-硝基-环己-3-烯基)-苯和其他相关化合物；以及ii)Michelotti等人的美国专利号5,866,513中所公开的化合物。美国专利申请公布2010/0169999和美国专利号5,866,513以全文引用的方式并入本文中。具体地说，美国专利号5,866,513的表I和1a中3-4、5-6以及7-8栏上所公开的76种化合物各自以引用的方式并入本文中。在某些实施方案中，染色体加倍剂为多核苷酸。

在某些实施方案中，可结合这些方法使用广泛范围的化学浓度和投用时间表，并且本领域一般技术人员可最佳化向给定基因型施用的剂量以最大化共显性果穗形成和/或最大化共显性果穗间的巧合和/或受精。

植物类型

除非另外指明，否则本公开不限于任何特定单子叶植物类型。举例来说，在某些实施方案中，单子叶植物为禾本科的成员：小麦植株、玉米植株、甜玉蜀黍植株、稻米植株、野生稻植株、大麦植株、黑麦、小米植株、高粱植株、甘蔗植株、草坪草植株、竹子植株、燕麦植株、雀麦草植株、芒草植株、蒲苇植株、柳枝稷(黍属)植株和/或大刍草植株；或为葱科的成员：洋葱植株、韭葱植株、大蒜植株。

除非另外指明，否则如本文所用，植株可为任何整个单子叶植株，或单子叶植物的一部分，或来源于单子叶植物的组织培养物，或单子叶植物种子；具有可递送植物处理剂的组织。植株可具有各种染色体含量，诸如单倍体、二倍体、三倍体、四倍体等。多倍性通常指具有大于三倍体的倍数性水平的状况。在某些实施方案中，在组织培养与非组织培养植物中生长出的植物组织之间加以区分。

除非另外指明，否则如本文所用，植株的表面是指通常暴露于植株周围的外部环境的表面，而未对植株进行牵拉、切割等以暴露额外区域。举例来说，如果将植株完全浸没于溶液中，那么植株的表面通常为植株中将接触溶液的部分。

植物组织可为任何植物组织。在某些实施方案中，植物组织可包括功能性分生组织或能够形成功能性分生组织的成组的细胞。功能性分生组织被定义为具有产生新的植物组织或器官的能力的多能细胞的中心。在某些实施方案中，植物组织包含分生组织，诸如根顶端分生组织或枝条顶端分生组织。

在某些实施方案中，将植物处理剂递送至所靶向或所选择的植株组织。可基于组织对植物处理剂做出的反应和/或对设法实现的植株生长、特征、遗传学、产量等的影响来靶向或选择植物组织。举例来说，可选择特别是DH₀植株的枝条顶端分生组织用于递送染色体加倍剂。所选择的组织可定位于植株的表面和/或它可定位于植株表面的下方或植株表面的一部分的下方。因此，在甚至植株的整个表面都诸如通过将植株完全浸没而由包含植物处理剂的溶液接触的某些实施方案中，所选择的组织中也有至少一部分可能不被溶液接触。

植物处理剂接触以将处理剂递送至植株的至少一个所选组织。在某些实施方案中，在种子萌芽之前使用本领域中已知的胚拯救技术从种子切去胚，以更好地使胚与处理剂接触。在切去之后，可在促进胚存活并发育成秧苗的条件下对其进行离体培养或以其他方式使其生长。因此，在萌芽之前将植物处理剂递送至植株的所选组织可使用当前本领域中已知的多种技术，包括胚拯救技术来进行改进，由此允许胚被植物处理剂接触。在某些实施方案中，使用这些方法来将加倍剂递送至单倍体胚的分生组织，以形成至少一个能够产生功能性单倍体配子的加倍单倍体生殖组织。

单子叶植株在本文所描述的方法中的使用可以是在各种发育阶段中的任一阶段。举例来说，可根据营养生长和生殖阶段来描述玉米植株，并且如本文所用，玉米籽粒发育阶段(叶枕法(Leaf Collarmethod)：V1-Vn、Vt、R1-R6等)如Abendroth,L.J.,R.W.Elmore,M.J.Boyer以及S.K.Marlay,2011,Corn Growth and Development,PMR1009,Iowa StateUniversity Extension,Ames,Iowa中所描述。

在某些实施方案中，单子叶植物为玉米植株。在某些实施方案中，单子叶植株为玉米植株，并且植物组织为分生组织。在某些实施方案中，单子叶植物为玉米植株，并且植物组织包含枝条顶端分生组织(SAM)。在某些实施方案中，单子叶植株为玉米植株，植物组织包含枝条顶端分生组织，并且玉米植株在种子内或正在萌芽或处于VE、V1、V2、V3、V4、V5、V6、V7、V8、V9、V10、V11或V12营养生长阶段或在其之间。在某些实施方案中，单子叶植物为单倍体玉米植株，植物组织包含枝条顶端分生组织，玉米植株在种子内或正在萌芽或处于E、V1、V2、V3、V4、V5、V6、V7、V8、V9、V10、V11或V12营养生长阶段或在其之间。

本文所描述的方法不受植物发育的某些阶段的限制。可以预料的是，可将延长或以其他方式修改生长阶段持续时间的技术与本发明结合使用以扩展使用者在施加PGR来诱导额外枝条顶端分生组织和/或腋芽和/或共显性果穗发育时的选择。

制备加倍单倍体植株的方法

本文所描述的某些实施方案提供对本领域一般技术人员已努力解决数十年的问题的解决方案。此问题为如何确保基本上任何加倍DH₀植株将在单一世代中产生所需数目的DH₁种子。在某些实施方案中，可通过诱导或促进DH₀植株发育出至少一个额外腋芽来提高从DH₀植株回收至少最少数目的DH₁种子(例如至少一个DH₁种子、至少四个DH₁种子、至少二十个DH₁种子等)的可能性。可在其他腋芽情况下同时和/或依序重复此过程，直到产生目标数目的种子。通过将由至少一个腋芽产生的种子与由至少一个其他腋芽产生的种子和/或由DH₀母本植株的一级芽产生的种子组合，这些方法可提高从单一DH₀植株回收数十、数百或甚至数千个DH₁种子的可能性。

基于秋水仙碱的染色体加倍方案通常暗示暴露若干分钟至若干小时并且依赖于希望不仅在此时间内秋水仙碱特定地接触将产生生殖器官的枝条顶端分生组织的细胞，而且在细胞周期的发生染色体加倍所必需的特定时间内发生接触。这种情况的不确定性转化成低玉米加倍可预测性的问题以及植物育种者多年来努力解决的效率问题。

在某些实施方案中，可通过增加各单一母本DH₀玉米植株满足产生加倍单倍体花序所必需条件的机会的次数来降低当前DH方法的不可预测性。已发现，现在可对单一单倍体玉米植株进行诱导以按大得多的频率和可靠性产生目标数目的DH₁后代。可对单倍体植株进行诱导以在可育挂果结构中形成多个腋生分生组织，从而与尚未以此类方式加以诱导的对照植株相比产生更大数目的DH₁种子。

可通过任何方法取得用于获得加倍单倍体植株、种子和/或细胞的单倍体单子叶植物。在某些实施方案中，可通过使诱导系(雄性)与所需系(作为雌性)杂交以诱导在雌系中形成单倍体植物细胞来获得单倍体玉米植株或来源于它们的单倍体果穗。用于玉米的示例性诱导系包括但不限于Stock 6、RWS、KEMS、Krasnodar单倍体诱导剂(KHI)、KMS或ZMS、包含不确定配子体(ig)突变的品系以及其衍生物。在其他实施方案中，可使用远缘杂交(widehybridization cross)来产生单倍体。可在Kasha和Kao,1970,Nature 225:874-876中发现远缘杂交的示例性描述。还可将任何其他单倍体诱导方法与这些方法一起使用，包括分子或基于转基因的方法，例如涉及CENH3改变的那些方法或其他基于基因组退化的方法。

某些实施方案提供获得加倍单倍体玉米植物细胞的方法，所述方法包括使玉米植株与包含植物处理剂的溶液接触，其中植物处理剂为染色体加倍剂，并且允许加倍剂引起至少一个加倍单倍体植物细胞的形成。本文中还提供获得加倍单倍体玉米植物细胞的方法，所述方法包括从包含加倍单倍体植物细胞的种子收获加倍单倍体植物细胞。在某些实施方案中，当从种子收获植物细胞时种子位于玉米果穗上。

某些实施方案提供获得加倍单倍体玉米植株的方法，所述方法包括获得通过本文所提供的方法中的任一种得到的加倍单倍体玉米胚并且向胚供应足够的营养物以容许胚发育成加倍单倍体玉米植株种子。可通过包括以下步骤的方法来形成加倍单倍体玉米胚：进行上述将包含植物处理剂的溶液递送至枝条顶端分生组织中的方法中的任一种，其中植物处理剂为染色体加倍剂；以及允许加倍剂诱导染色体加倍。

在这些方法的某些实施方案中，从第三方获得加倍单倍体玉米植物细胞。换言之，引起加倍单倍体玉米植物细胞形成的一方不一定是供应营养物以容许植物细胞发育成加倍单倍体玉米植株的一方。

本文还提供获得包含加倍单倍体玉米植物细胞的种子的方法，所述方法包括收获通过获得加倍单倍体玉米植物细胞的方法获得的包含加倍单倍体植物细胞的种子。可通过包括以下步骤的方法获得加倍单倍体玉米植物细胞：进行上述将包含植物处理剂的溶液递送至植株中的方法中的任一种，其中植物处理剂为染色体加倍剂；以及允许加倍剂诱导至少一个种子中形成至少一个加倍单倍体植物细胞。在某些实施方案中，所收获的种子为生理上成熟的种子。

本文还提供获得加倍单倍体玉米植株的方法，所述方法包括播种通过获得包含加倍单倍体玉米植物细胞的种子的方法所获得的包含加倍单倍体玉米植物细胞的种子，以及容许所播种的种子发育成加倍单倍体玉米植株。在某些实施方案中，从第三方获得包含加倍单倍体玉米植物细胞的种子。换言之，收获种子的一方不一定是播种包含加倍单倍体植物细胞的种子并且容许所播种的种子发育成加倍单倍体玉米植株的一方。

在某些实施方案中，可通过从通过本文所提供的方法用染色体加倍剂处理的DH₀植株上所形成的DH玉米果穗收获DH₁种子来获得加倍单倍体植物细胞。可收获来源于DH₀母本植株上的DH果穗的生理上成熟的DH₁种子，以获得种子中所含的加倍单倍体植物细胞。还可播种来自DH₀植株上的经过处理的DH果穗的生理上成熟的DH₁种子并且允许其萌芽以获得加倍单倍体玉米植株。

在某些实施方案中，可通过从果穗上的籽粒拯救植物细胞而从用染色体加倍剂处理的玉米果穗回收单倍体植物细胞。可如果进行植物细胞拯救：从果穗上去除处理过的植物细胞，将植物细胞放置于为植物细胞和/或植物发育而提供的培养基中，并且允许植物细胞和/或植物发育至出现。在某些实施方案中，为植物细胞和/或植物发育而提供的培养基可包括一种或多种植物激素、盐和/或糖。Matthys-Rochon等人,Journal of ExperimentalBotany,第49卷,第322期,第839-845页,1998中描述了用于植物细胞拯救的各种培养基和技术。

可针对广泛范围的参数对这些方法加以调整，以使植株的基本上任何基因型的共显性果穗间的巧合最大化。本领域一般技术人员可针对已知结合这些方法影响植物发育的任何数目的变量对这些方法加以调整，包括改变种植密度、剂量、化学处理方法或为改善各种各样的植株基因型或种质的巧合性和/或受精和/或种子产生而进行的时间安排。在某些实施方案中，可以不同的密度种植植株以影响共显性果穗形成。在某些实施方案中，可用许多可能的化学剂中的至少一种(例如影响果穗形成的药剂，如GA-抑制剂)使用许多可能的剂量水平中的至少一种来处理植株，以最佳化在基本上任何基因型或基因型集合中至少两个共显性果穗的形成和其间的巧合。在一些实施方案中，可提供本领域中已知影响植物发育的另外一些处理以最佳化共显性果穗形成。在一些实施方案中，可使用以上内容的组合来最佳化共显性果穗形成。在一些实施方案中，可对不同的基因型使用不同的处理以最佳化总体共显性果穗形成。

植物育种

可使用本文所提供的方法通过增加给定母本植株在单一世代中产生的重组后代的数目来增加在单子叶植物中植物育种的效率。此认识对植物育种来说具有显著且广泛的应用，因为它增加了单一单子叶植物将产生含有统计学上不太可能却优良的基因元件组合的后代的可能性。植物育种者采用这些方法来将某些DNA序列、基因型和/或表型性状整合至目标种质和/或基因组中将能够使用比育种者使用当前本领域中已知的方法更少的母本植株并且使用更少的资源形成含有包含特定基因元件集合的DNA序列的配子。这部分归因于以下事实：本文所描述的方法有效地使使用者能够诱导母本植株以每个植株产生更多的种子，这相当于每个植株更多减数***，这相当于每个植株更多发生所需遗传重组的机会。因此，每个植株更多重组机会转化为达到实现高的回收至少一个具有所需基因元件组合的植株的可能性所必需的有效群体大小需要更少的植株(以及更少的资源)。

举例来说，当植物育种者使用轮回选择来将所需基因元件种质渗入至目标种质中时，他们依赖于在目标种质与供体种质的同源梁色体之间在基因组中侧接所需基因座的基因座中发生遗传重组。这些方法的使用者将更可能产生具有包含仅由供体基因组中赋予所需基因元件所必需的序列修饰的目标种质的基因组的母本植株，因为这些方法产生每个母本植株的更多重组事件，并且因此使用者将比其他性状整合方法的使用者更可能形成含有并入基因组的基因元件的所需排列的植株。

当设法将多个基因元件种质渗入至目标种质中时，此举的益处变得甚至更明显的，因为将额外基因元件种质渗入至目标种质中所需的遗传重组事件的数目随希望种质渗入的额外基因元件的数目增加而快速增加。这些方法的使用者将发现与使用当前本领域中忽略腋芽和/或不有意诱导腋芽产生果实的方法的使用者相比，他们需要少得多的母本植株来实现高的重新获得所需种质渗入事件的可能性，并且因此，可显著增加在配子中形成所需基因元件排列的效率。

此认识尤其适合于开花单子叶物种，例如玉米，因为每一次诱导形成额外的花序时，整个果穗就具有潜在胚珠的价值(平均500个籽粒或对于高产量杂交种来说则更多)，各代表一次在减数***期间发生所需遗传重组的机会。因此，具有本领域一般技术的育种者可使用这些方法与使用当前本领域中忽略腋芽或不有意诱导其形成和产生果实的方法的使用者相比显著增加在配子中形成所需基因元件排列的效率。

可将这些方法与本领域中已知的延长巧合、延长花粉脱落或延长果穗易于接受授粉和受精的时间段的任何方法相组合。举例来说，可对雄穗进行处理，从而延长雄穗使花粉脱落的时间段。可将脱落的花粉保留以延长能够成功授粉并且随后成功受精的时间段。还可采用已知改善或延长巧合的其他方法。

在某些实施方案中，可在VE、V1、V2、V3、V4、V5、V6、V7、V8、V9、V10、V11或V12生长阶段或其任何组合中应用腋芽诱导处理。

多芽体

一种类型的诱导的腋芽为“多芽体”，所述多芽体是通过对植株进行诱导以从分化细胞形成从头腋芽而得到。此方法有效地对植株的一个或多个细胞进行程序化以产生从头分生组织、枝条或腋芽。

在某些实施方案中，可在仍连接至种子的同时对单子叶秧苗或单子叶植株胚进行腋芽诱导(直接种子法)，或者可在萌芽之前从种子解剖秧苗/胚(解剖胚法)，或者可在萌芽之后将秧苗/胚与种子分离(胚轴法)。

本文公开了关于多芽体在单子叶植物中的若干新颖用途的发现，包括通过确保由杂交或自交产生目标数目的种子来改良加倍效率(“DH”)。在某些实施方案中，希望确保在单一世代中由DH₀植株产生至少最少数目的种子的使用者对DH₀植株进行诱导以形成至少一个加倍单倍体多芽体。在某些实施方案中，使这些多芽体中的至少一个成长为自交产生DH₁种子的成熟单倍体植株。可同时和/或依序重复此过程直到产生所需目标数目的种子。

在某些实施方案中，这些方法首先可通过诱导二倍体亲本植株以产生至少两个然后成长为成熟二倍体植株的二倍体多芽体来增加回收的加倍单倍体种子的数目。然后可在诱导剂存在下对这些多芽体衍生的亲本植株进行授粉以形成至少一个单倍体种子，所述至少一个单倍体种子随后可成长为秧苗并且经受本领域中已知的染色体加倍技术以使单倍体转化成DH₀植株群体。然后，可使DH₀植株生长，直到它们产生花，并且然后进行授粉以产生DH₁种子。

在某些实施方案中，可对单一二倍体植株进行多芽体诱导处理，以产生若干二倍体多芽体。可将这些多芽体与母本植株分离并且使其生长，直到其产生花，此时可通过诱导剂对其进行授粉。即使一些多芽体衍生的果穗产生非常少或不产生种子，也预期可依序或同时重复此方法，直到当将来自多芽体衍生的果穗的所有种子组合时产生目标数目的种子。可对与所必需的一样多的这些单倍体植株进行染色体加倍以产生所需数目的DH植株。

可对从至少一个多芽体诱导果穗回收和汇集的单倍体种子进行使用者认为适当的任何方式的分析以测定哪些种子含有特定性状。这些分析可包括对种子(包括胚和种子的所有其他组织)进行分选以识别并且分离出二倍体种子，包括以US20140266196A1公布并且以全文引用的方式并入本文中的美国专利申请14/206,238中所描述的单倍体分选方法。分析还可包括使用本领域中已知的方法对组织进行基因分型。不管如何分析单倍体种子，都可基于任何准则来选择群体的子集以限制经历后续加倍步骤的植株的数目。因此，这些方法可减少对不满足目标选择阈值的植株进行加倍所耗费的资源量。

不同于当前产生DH植株的方法，这些方法的使用者不仅仅依赖于对细胞进行加倍时产生含有至少目标数目的单倍体卵的果穗所必需的单一机会。相反地，使用者能够从单一DH₀植株产生多个果穗，并且因此组合多个加倍机会以实现目标数目的单倍体卵。

分蘖

分蘖为一种类型的腋芽。在单子叶植物中诱导分蘖缓解抑制腋芽发育的抑制程度，使得腋芽能够形成伸长的侧枝，所述伸长的侧枝最终产生雄穗和至少一个称为果穗的雌花。虽然已知为自发形成的，但分蘖的形成是一种不希望的性状，出于许多原因将其从玉米育种计划中清除，包括以下事实：它们使得保留相邻植株身份更困难并且增加不同实验处理交叉污染种子的可能性。它们还倾向于长满正常分配给个别植株的区域，这扰乱种植安排，使人类和机器到达更困难，并且干扰高效田间维护、栽培以及收获。此外，分蘖与母本植株(即衍生出分蘖的主茎)竞争附近的资源，从而降低表型评估的准确性以及每单位英亩的总产量。出于这些和其他原因，通常将分蘖从研究策划以及商业操作中清除。

然而，已发现，通过在植物生命周期中在特定时间对玉米植株进行腋芽诱导处理有可能从单一母本植株产生多个分蘖枝条，从而产生与相同枝条的雄穗完全巧合的果穗并且当授粉时产生优良的种子集合。因此，通过诱导单一玉米植株以形成分蘖，从而允许这些分蘖产生他们自己的果穗，并且然后从由至少一个分蘖产生的至少一个果穗收获种子，这些方法可增加回收由单一玉米植株产生的目标数目的种子的机会。通过将由至少一个分蘖产生的种子与由至少一个其他分蘖产生的种子和/或由母本植株产生的种子组合，这些方法可增加从单一植株回收数十、数百或甚至数千个种子的机会。

在某些实施方案中，方法包括诱导DH₀植株以形成至少一个加倍单倍体分蘖。使这些分蘖中的至少一个成长为自交产生DH₁种子的成熟单倍体植株。可同时和/或依序重复所述过程，直到产生目标数目的种子。通过将由至少一个分蘖产生的种子与由至少一个其他分蘖产生的种子和/或由DH₀母本植株产生的种子组合，这些方法可增加从单一DH₀植株回收数十、数百或甚至数千个种子的机会。

不同于当前产生DH植株的方法，这些方法不限制于在对细胞进行加倍时产生含有至少目标数目的单倍体卵或花粉的果穗或雄穗所必需的单一机会。相反地，它们从单一DH₀植株产生多个果穗和雄穗，因此组合多个加倍机会以产生含有至少目标数目的单倍体卵和花粉并且在授粉和受精之后含有目标数目的DH₁种子的果穗。

共显性果穗

某些实施方案提供共显性果穗的制备。在某些实施方案中，协调共显性果穗的发育使得至少两个共显性果穗在与从相同植株的雄穗脱落的花粉重叠时易于接受授粉。在某些实施方案中，协调共显性果穗的发育使得至少两个共显性果穗在与从另一所需种质的雄穗脱落的花粉重叠时易于接受授粉。

某些实施方案包括在植物生命周期中在特定时间对植株进行腋芽诱导处理。有可能在单一植株上产生至少两个共显性果穗，其发育经过协调使得果穗完全巧合并且当授粉时产生优良种子集合。这些方法可通过诱导亲本植株以形成全部在时间框重叠时易于接受授粉的多个共显性果穗而使从单一亲本植株回收目标数目的后代种子有所增加。

在某些实施方案中，通过在加倍处理之后诱导DH₀植株形成至少两个共显性果穗而由DH₀植株在单一世代中产生种子。不同于产生DH植株的常规方法，这些方法不仅仅依赖于在对细胞进行加倍时产生含有至少目标数目的单倍体卵的果穗所必需的单一机会。相反地，从单一DH₀植株产生多个果穗，因此组合多个加倍机会以产生至少目标数目的单倍体配子，并且在授粉和受精之后，例如产生目标数目的DH₁种子。

一个意外观测结果对DH制备有相当大的影响。一旦用诱导剂处理了DH₀植株，就不可完全预测DH₀植株上的哪个果穗将产生最大数目的DH₁种子。在一些情况下，第二和/或第三果穗具有比第一果穗更好的种子集合。令人惊讶地，在一些情况下，第一果穗产生几个种子或不产生任何种子，而第二和/或第三果穗产生丰富的种子。

此外，本文所描述的代表性结果表明哪个果穗具有最大加倍潜能为随机的。据证实，甚至在密切相关的近交系成员间也不可预测沿枝条的哪些腋生分生组织最可能通过染色体加倍处理发生加倍。

在母本植株上已形成太多的共显性果穗以至于没有足够的资源来充分支持其发育的情况下，可例如在体外、在单独的盆中或以本领域中已知的任何其他方式将果穗分开培养。

在某些实施方案中，共显性果穗诱导处理包括将植物处理剂施加至植株。在某些实施方案中，植物处理剂为植物激素或植物激素组合。在某些实施方案中，共显性果穗诱导处理包括施加赤霉酸抑制剂，诸如PBZ、烯效唑、矮壮素-CL、甲哌鎓-CL、AMO-1618、三丁氯苄膦-Cl、四环唑、环丙嘧啶醇、呋嘧醇、多效唑、烯效唑-P、抗倒胺、调环酸-CA、抗倒酯、丁酰肼、外-16,17-或二氢-GA₅-13-乙酸盐或任何植物处理剂的组合，例如GA抑制剂与细胞***素的组合。

在某些实施方案中，在不同的枝条上形成共显性果穗。举例来说，使用者可用植物处理剂处理主茎(即母本植株)以使主茎形成至少一个分蘖。使用者安排处理的时间以协调分蘖上的果穗(即分蘖果穗)与母本植株上的果穗的发育，使得两个果穗在基本上重叠的时间框内产生穗丝并且易于接受授粉。在某些实施方案中，使用者对母本植株进行处理以形成至少两个分蘖并且安排处理的时间以协调从不同分蘖生长的至少两个分蘖果穗的发育，使得所述至少两个分蘖果穗在基本上重叠的时间框内产生易于接受授粉的穗丝。因此，涉及分蘖的方法和涉及共显性果穗的方法不互相排斥；在某些情况下有可能将两种类型的腋芽形成方法合并以实现增强的结果。

应了解，对于本文所公开的方法中的任一种，所述方法可进一步包括例如基于诸如分蘖数目、共显性果穗数目、加倍效率等所需属性来选择植株。

实施例

包括以下实施例以证实本发明的某些实施方案。本领域技术人员应了解，接下来的实施例中所公开的技术代表由本发明人发现的在本发明的实践中良好发挥功能的技术。然而，根据本公开，本领域技术人员了解可在所公开的具体实施方案中作出许多改变并且仍获得同样或类似结果，而不会背离本发明的精神和范围。

在以下实施例中，通过用来自单倍体诱导系的花粉对含有所需遗传特征的F1或F2雌花授粉来获得单倍体玉米种子。当种子成熟时收获果穗，然后将果穗去壳，并且然后将种子分选为单倍体和二倍体。通过用来自单倍体诱导系的花粉对F1或F2玉米植株授粉以形成F1杂交种衍生的单倍体诱导群体来获得本文中所用的单倍体玉米植株。当种子成熟时收获果穗，去壳，并且通过本领域的标准方法回收单倍体种子。

可用于重复以下实验的单倍体诱导系的非限制性实例包括Stock6(Coe 1959)、RWS(Rober等人1005)、KEMS(Deimling等人1997)、KMS或ZMS(Chalyk等人3994；Chalyk和Chebotar 1000)或来源于这些诱导系的其他诱导系。诱导系还可带有至少一种标记物性状以有助于单倍体后代的识别。可使得单倍体汇集物的纯度为95％或更大，并且可使用本领域中已知的多种方法加以验证。

实施例1.可操纵玉米果穗多产性以在多种种质间每个植株产生多个果穗.

如下对两个独特的F1杂交种衍生的单倍体玉米系的来源于雌性杂种优势群(种质A)或雄性杂种优势群(种质B)的V1-V3秧苗进行整体基于秋水仙碱的染色体加倍处理：在V1-V3生长阶段从土壤或生长培养基中移去秧苗并且将它们的茎对齐并将其与若干木棒一起绕成一束，通过一条铝箔(大致箔条尺寸为6in x 18in)固定在一起。将扎成束的植株浸没在离心机容器中的包含1250ppm秋水仙碱的植物处理溶液中，并且然后将整个样品以50g离心3min，同时将剩余的枝条顶端分生组织(SAM)浸没在植物处理剂溶液中。

在第一次离心之后，将植物处理溶液倾析并且以335g再对秧苗进行离心达3min。在第二次离心期间，棒绕束支撑秧苗并且防止SAM在施加离心力期间接触未被植株吸收的保留处理剂。

在第二次离心之后，从离心容器和棒绕束移去植株并且用水冲洗以移除任何剩余的秋水仙碱溶液，并且然后回收并且在光、湿度以及温度受控的温室中照料若干天，然后移栽至苗圃温室。以全文引用的方式并入本文中的国际申请号PCT/US2015/028955中更详细描述了这些基于离心的处理方法，然而，也可将标准加倍处理应用于本文中提到的单倍体加倍步骤中的任一步骤。

在秋水仙碱加倍处理之后，以两种不同密度将来自各种质的15-20个植株种植在盆中；以每个盆单个植株的形式(单个)，或以每个盆两个植株的形式(配对)。

接着，各植株接受两种不同剂量的PBZ中的一种：50mL(低剂量)或60mL(高剂量)的2.5％PBZ水溶液(v/v；0.4％的活性成分)。在分别在对秧苗进行染色体加倍处理之后总共23或26天时出现的V7或V8生长阶段通过土壤喷淋施加这两种不同剂量。对照组的植株未接受处理溶液，但以单个形式确切地作为实验组植株以其他方式加以处理。当花粉从雄穗开始脱落时，针对各剂量、种质以及处理时间计算产生穗丝的果穗(即共显性果穗)的平均数目并且将结果概括于表1中。

表1.在染色体加倍处理之后在两个不同发育阶段中的一个阶段以两种不同剂量的PBZ中的一种处理之后在两种独特的诱导的单倍体种质(A和B)中每个植株所形成的共显性果穗的数目.

V7在染色体加倍处理之后23天时出现；V8在染色体加

倍处理之后26天时出现。

种质A和种质B的对照植株分别产生1.4EP和1.1EP。

这些结果表明在不同植株密度间这些方法仍然适用。不管处理时间安排如何，当单个地将个体种植在盆中时两种种质均形成更多共显性果穗。不管剂量或处理时间安排如何，所有配对的种质B植株均产生比单个的种质B植株中的任一个更少的果穗，并且高剂量V8种质B群体产生其加倍对应物的超过两倍。种植密度对不同种质产生的影响的这种变化为使用者提供如下理解，可结合这些方法采用的植株密度的最佳范围可在各种质间有所不同。预期使用者可调整处理时间安排以及其他生长或处理条件以最佳化这些方法在不同种质情况下的使用。

这些结果表明在剂量、密度以及种质的变量间，与对照相比，两种种质在V7与V8所应用的处理一致地产生更多共显性果穗。因此，这些方法不限于在植物发育的特定点内应用共显性果穗诱导处理。在一个实施方案中，按使用者所选择的时间范围进行共显性果穗诱导处理，此增加由用染色体加倍剂处理的单倍体植株产生的种子数目。

结果表明这些方法不限于在特定种质或植株基因型情况下使用。此外，两种种质展示视其他变量(诸如种植密度、处理时间表、剂量以及其他变量)而变化的改善。在不同的处理时间表范围内针对两种显著分歧基因型改善共显性果穗的数目。可以预料，使用者将在广泛范围的其他种质情况下使用这些方法并且将能够调整参数，诸如种植密度、果穗诱导处理的时间安排、在果穗诱导处理期间所用化学品的剂量以及影响果穗发育的其他变量，以最大化共显性果穗间的巧合性并且增加在给定世代中产生的种子数目。

这些结果表明这些方法的使用不限于诱导果穗形成的特定剂量的化学品。多种不同的每个植株果穗数(EP)的的改善似乎与剂量有关。对于一种，用高剂量处理的所有植株的平均EP比用低剂量处理的所有植株的EP大0.31。当仅考虑单个植株时此关系甚至更显著(高剂量EP平均值比低剂量高0.55)。此外，经受低剂量的单个植株仍相较于对照植株产生最小1.2EP的增加，表明甚至在可与这些方法结合使用的在此所测试的范围以外也存在剂量效应。

实施例2.收获和汇集共显性果穗的种子改善在单一世代中DH₁种子的回收.

使来源于雌性近交玉米植株种质A的F1杂交种衍生的单倍体诱导群体在土壤中萌芽并且在标准温室玉米生长条件下照料约七天。然后如上文所描述对秧苗进行整体基于秋水仙碱的染色体加倍处理。在处理之后，将秧苗移栽至盆中并且在温室中在标准温室玉米生长条件下照料至回收。

在秋水仙碱加倍处理之后二十九天时，对DH₀秧苗中的77个进行共显性果穗诱导处理，包括添加60mL的2.5％PBZ(v/v)水溶液，将其倾倒至各植株的根周围的土壤中。然后在标准温室玉米生长条件下照料秧苗直到它们开花，在此时产生花粉的各植株进行自花授粉。在约3-4周之后，收获果穗并且对处理的DH₀植株上所形成的籽粒(DH₁种子)进行计数以确定加倍效率。

视果穗为甚至被包括在计算中而必须产生的最少籽粒数目而定，在四种不同约束条件下计算加倍效率(DE)。DE₀₄表示所有加倍DH₀植株中当考虑所有果穗时产生总共至少四个种子的部分。DE₂₀表示所有加倍DH₀植株中当考虑所有果穗时产生总共至少20个籽粒的部分。类似地，DE₃₀表示加倍DH₀植株中当考虑所有果穗时产生总共至少30个籽粒的部分，而DE₅₀表示加倍DH₀植株中当考虑所有果穗时产生总共至少50个籽粒的部分。

此外，通过仅考虑在各植株的一级果穗(果穗₁)上所形成的籽粒计算一次以上加倍效率，通过仅考虑各植株的一级和二级果穗(果穗₂)上所形成的籽粒计算一次，通过仅考虑各植株的一级、二级以及三级果穗(果穗₃)上所形成的籽粒计算一次，并且最后通过考虑各植株的所有果穗(果穗_所有)上所形成的所有籽粒来计算。

表2.在各种最小籽粒/植株阈值下通过共显性果穗诱导产生的加倍效率的比较.下标表示植株为被考虑在DE的计算中而必须产生的最少籽粒数目。

这些结果表明无论何时包括共显性果穗的籽粒时均获得更大加倍效率。当应用针对所要包括的果穗的最低产量约束条件时此关系变得甚至更明显。对于DE₂₀、DE₃₀以及DE₅₀，包括由各植株上的所有果穗产生的籽粒使DE在各情况下相较于果穗₁DE近似加倍。这表明这些方法在广泛范围的最低产量约束条件下的功效。

这些结果表明这些方法的使用者在多种不同最低产量约束条件间会经历与当前本领域中已知的方法相比更一致的DE。虽然在DE₀₄与DE₂₀之间果穗₁DE下降几乎一半(从71％至37％)，但仅包括一个额外的果穗(果穗₂)在DE₀₄与DE₂₀之间仅产生22％的DE降低(从76％至59％)。对于果穗₃和果穗_所有，此DE₀₄与DE₂₀之间的降低甚至更小。

由于DE为具有在给定世代从个别植株回收的某一数目的种子的果穗的数目的一个因素，所以这些方法的使用者可预期从给定植株回收更大数目的种子，并且因此将比使用目前本领域中已知的方法的使用者更可能从任何特定杂交回收至少最少数目的种子。因此，这些方法的使用者将更成功地在单一世代中从杂交回收最少数目的种子，这是在育种计划中高效测试所述群体以形成准确的进步判断并且更快地将产品带到市场上所必需的。这些方法的使用者还将更能够预测不同最低产量阈值间的DE并且因此更能够预料来源于至少一次诱导杂交的群体间的资源分配。

实施例3.共显性果穗的诱导改善多种种质的DE.

此实验中测试了两个F1杂交种衍生(一个为雄性，而另一个为雌性)的单倍体群体(在本文中称为H1和H2)以及两个近交种衍生的单倍体品系(雄性种质B和雌性种质A)。在种植之后七天时，从土壤中移出各组的数十棵秧苗并且如上文所描述进行整体基于秋水仙碱的染色体加倍处理。在染色体加倍处理之后，将秧苗移栽至土壤中并且在温室中在标准玉米生长条件下照料。当秧苗已大致达到V7或V8阶段时(在所用生长条件下加倍之后约29天时)，对秧苗进行共显性果穗诱导处理，包括将60mL的2.5％PBZ添加至各***部周围的土壤中。

然后在标准温室玉米生长条件下照料秧苗直到它们开花，在此时产生花粉的各植株自花授粉并且然后保持不受干扰以等候受精和产生籽粒。在约2-3周之后，收获果穗并且计算果穗上所形成的籽粒(DH₁)以确定加倍效率。

在先前实施例中所描述的不同约束条件下计算加倍效率(DE)，以产生四种基因型中的每一种的DE₀₄、DE₂₀、DE₃₀以及DE₅₀的值。此外，通过仅考虑在各植株的一级果穗(果穗₁)上所形成的籽粒计算一次以上加倍效率，通过仅考虑各植株的一级和二级果穗(果穗2)上所形成的籽粒计算一次，通过仅考虑各植株的一级、二级以及三级果穗(果穗3)上所形成的籽粒计算一次，并且最后通过考虑各植株的所有果穗(果穗_所有)上所形成的所有籽粒来计算。

表3.视仅收获一级果穗(果穗₁)还是收获所有果穗(果穗_所有)而定的四种种质的加倍效率.

表3表明这些方法可在各种各样的种质情况下使用，包括在来自不同杂种优势群的近交系之间以及来源于来自不同杂种优势群的近交种的杂交种之间。还表明在所有种质和最低产量阈值之间，果穗_所有结果总是优于果穗₁结果，证实这些方法的使用者通过包括由所有额外的共显性果穗所产生的籽粒可预期改善DE。这些结果表明这些方法可适合于在基本上任何玉米基因型或种质的情况下使用。

实施例4.共显性果穗诱导组合多个腋生分生组织的加倍几率以改善DE和种子集合.

当在实施例3中所描述的实验中收获DH₁果穗时，对从各种质随机选择的四个DH₀植株进行进一步考查，包括记录由各植株的头3个共显性果穗所产生的大致种子数目。图1示出了从这四个植株中的每一个所收获的头三个果穗，并且该图还呈现于下表4中。在表4中，将果穗视其产生的大致种子数目而定分配至4个类别中的一个：A类果穗产生约50个种子，B类果穗产生约20-49个种子，C类果穗产生约1-20个种子，而0类果穗产生零个种子。两个植株未能产生第三个果穗。

表4.根据产生的DH₁种子数目归类的果穗.“-”表示植株未形成第三个果穗的情况。各植株-种质组合的最高产量果穗为粗体以有助于比较。

这些结果揭示不同共显性果穗具有不同加倍潜能的发现。还揭示如下令人惊讶的结果，最高产量果穗可能不是第一个果穗，或甚至第一个或第二个果穗。举例来说，在对照A、种质A和种质B的植株1上第二果穗产生最多的种子。对于对照B的植株1和种质A的植株3，第三果穗展现最大的加倍潜能。

此实验还揭示如下令人惊讶的结果，经历共显性果穗诱导处理的单倍体植株将投入更多资源来使已成功加倍并且能够产生有活力的二倍体后代的果穗发育，这与果穗在茎上的相对位置无关。未加倍并且因此不可能产生种子的单倍体果穗的发育似乎被抑制。举例来说，在H2种质的植株#2和植株#3上，不产生种子或产生非常少的(1-4个)种子的果穗似乎已被抑制，而植株明显持续投入资源来使产生种子的果穗发育。这表明当DH₀植株上生长的诱导共显性果穗的发育被抑制时，它是因为果穗未加倍，而不是因为果穗在茎上的位置。因此，从较低节点生长的诱导共显性的并且成功加倍的果穗比在茎上部较高处生长的未成功加倍的果穗更可能遵循对共显性果穗所期待的发育时间表。

实施例5.共显性果穗诱导显著增加二倍体的种子产量.

将玉米近交系种质A和LH244的种子种在土壤中，使其萌芽，并且然后在约一周之后移栽至10-英寸盆中，每个盆一棵秧苗。在V8阶段对植株进行共显性果穗诱导处理，包括用50mL的2.5％PBZ溶液(v/v；0.4％的活性成分)喷淋各植株的根周围的土壤。在温室中照料植株直到性成熟，然后使其自花授粉。当已完成种子集合时，计算由各植株产生的共显性果穗数目和总籽粒数目。以与处理组相同的方式对各种质的对照植株进行处理，除了不对对照植株进行共显性果穗诱导处理。

表5.从经历共显性果穗诱导处理与对照处理的两种基因型回收的平均每个植株果穗数目和平均每个植株总籽粒数.

表5揭示如下令人惊讶的结果，通过对植株进行共显性果穗诱导处理有可能显著增加由两个不同近交系产生的平均每个植株总籽粒数。彼此非常不同的两种种质通过不只使平均每个植株总籽粒数以及平均每个植株果穗数加倍而对共显性果穗诱导处理起反应。此外，在表5中从处理组记录的所有果穗为共显性的。

图2中示出了在用这些方法处理之后产生8个果穗的种质A植株的代表性实例。

虽然对照植株产生多个果穗，但它们不产生共显性果穗；对照植株上仅一级果穗完全巧合，足以产生任何种子。

实施例6.分蘖诱导显著增加二倍体的种子产量.

对常见近交系的二倍体玉米植株进行分蘖诱导处理，包括在萌芽之后约一周时用100mL的2.5％PBZ溶液(v/v；0.4％的活性成分)喷淋根周围的土壤并且然后使其在温室中在10-英寸盆中生长至性成熟。使植株的对照组在相同情况下生长，除了不对其进行分蘖诱导处理。

GA抑制剂使得母本植株展示缩短的节间部，并且诱导母本植株产生分蘖。然后由分蘖形成三个处理组：允许“共栖(Co-hab)”处理的分蘖与母本植株一起在相同的盆中持续生长；“-母本”处理的那些分蘖也被保留在相同的盆中，但从盆中移除母本植株；而“移栽”处理组的那些分蘖被从含有母本植株的盆移栽至单独的10-英寸盆中，每个盆一个植株。允许由对照组产生的任何天然存在的分蘖与母本植株在相同的盆中生长，类似于共栖处理。允许所有植株生长至性成熟并且当形成穗丝和雄穗时进行自花授粉。当完成种子集合时，计算由来源于相同母本植株种子的所有植株产生的平均种子总数目并在图3中绘图。

这些结果表明通过对植株进行分蘖诱导处理有可能显著增加平均每个植株总种子数，这由移栽处理组产生超过两倍于对照组的种子数目得到证实。还表明当将分蘖移栽远离母本植株时发生种子的最佳回收。

实施例7.分蘖诱导方法和对单倍体植株进行加倍.

将对单倍体母本植株进行加倍处理并且此后种植于盆中，用100mL的2.5％的多效唑喷淋根周围的土壤，并且然后在标准玉米温室生长条件下照料若干天。GA抑制剂将使得母本植株展示缩短的节间部以及增加的分蘖产量。可将所得子代分蘖植株中的一个与母本植株分离，移栽至单独的盆中，并且经由标准温室管理程序使其生长至最终回收具有正常单倍体形态的子代植株。此子代植株将产生丰富的花粉和健壮的果穗，所述果穗完全巧合并且当自交时产生数十个DH₁种子。

可以预料，可将这些分蘖诱导方法与DH方法结合使用以显著增加从给定DH₀母本植株回收DH₁种子的可能性。可以预料，使用者可诱导DH₀植株形成加倍单倍体分蘖，所述加倍单倍体分蘖各自产生果穗，所述果穗与相应雄穗完全巧合以产生数十个加倍单倍体种子。预期可使用这些方法来产生与获得使用者所需的DH₁种子量所必需的一样多的分蘖。

实施例8.可将多芽体诱导与DH方法结合使用来快速产生关于多个性状纯合的植株.

对二倍体玉米植株的种子进行表面灭菌，包括使用本领域的标准方法进行浸泡并且然后使其在体外在生长培养基中萌芽。在萌芽之后两天时将所得秧苗中的一棵从其种子上解剖下来(胚轴法)。然后对解剖的胚轴进行多芽体诱导处理，包括转移至含有呈10mg/LBAP形式的细胞***素的新鲜多芽体诱导培养基中。在多芽体芽诱导培养基中七天之后，将处理的秧苗转移回不含激素的再生培养基中。

在约二十天之后，可看到诱导的多芽体从茎的结节区生长。将这些多芽体从母本植株解剖下来并且转移至包含IBA和IAA的生根培养基中。在约一周之后，将多芽体衍生的植株移栽至10英寸盆中，并且允许其在温室中生长直到各个自发生长的多芽体衍生枝条明显已形成巧合的果穗和雄穗。然后使各果穗从在相同盆中生长的雄穗受粉并且然后允许所有植株在温室条件下生长直到完成种子集合。在各情况下，多芽体衍生的植株产生各带有数十个种子的果穗。

此实施例表明可对从单一母本植株诱导的多芽体进行培养以产生完全巧合并且产生优良种子集合的可育果穗和雄穗。因此，预期这些方法的使用者可使用多芽体来增加从给定植株回收至少一个种子的可能性。

在一个实施方案中，使用者根据多芽体诱导处理对经历染色体加倍的母亲单倍体植株进行诱导以产生多个加倍单倍体芽。可对这些多芽体进行培养以产生DH种子。

在另一实施方案中，使用者对在杂合状态下含有至少一种所需性状的二倍体植株进行多芽体诱导处理以产生若干二倍体多芽体。使这些多芽体与母本植株分离并且生长至产生雄穗和果穗。接着，使用者用母体单倍体诱导剂对多芽体衍生的二倍体植株进行授粉以产生单倍体后代，其中的至少一个含有所述性状的所需等位基因。然后可对单倍体后代进行秋水仙碱加倍处理以产生在纯合条件下含有所需性状的加倍单倍体植株。此方法具有显著增加形成对于超过一种性状来说纯合的植株的效率的潜能，因为使用者可诱导从单一母本植株形成许多新的花序，由此增加从母本植株产生在纯合状态下含有所需性状的卵的可能性。一旦产生了在纯合条件下含有所需性状的单倍体植株，使用者即可对植株进行染色体加倍处理以回收纯合二倍体。

实施例9.使用植物生长调节剂多效唑操纵加倍单倍体群体中的每个植株的籽粒.

在用单倍体加倍剂秋水仙碱处理之后一天并且在萌芽之后总共七天时，将加倍单倍体秧苗种植到土壤中。在种子吸胀之后约37天(约V11阶段)时用Paczol(2.5％于60mL中，等效于0.4％活性成分多效唑)处理四种不同种质的植株以形成多个共显性果穗。对所有植株人工授粉达两个连续日。对具有共显性果穗的植株对各植株上的两个单独的果穗(一级与二级果穗均位于主茎上)进行人工授粉。在实验完成时，测定每个植株的总籽粒数目。下表6说明各种质群体中未处理和处理的植株的结果。

表6.双单倍体种质群体的Paczol处理.

在用Paczol处理后每个植株的籽粒数目几乎加倍。参见图4和5。

已说明并描述了这些方法的原理，本领域技术人员应显而易知，可在布置和细节上对所述方法进行修改而不会背离此类原理。因为可对本文所描述和说明的结构进行各种修改而不会背离本发明的范围，所以前述描述中含有或随附图式中示出的所有物质旨在应解释为说明性而非限制性的。

虽然本文所公开的材料和方法是就各种实施方案和说明性实施例来描述，但本领域技术人员将显而易知，可对本文所描述的材料和方法应用诸多变化而不会背离本发明的概念、精神以及范围。对本领域技术人员来说显而易见的所有此类类似取代和修改被认为在如随附权利要求书所界定的本发明精神、范围以及概念内。

本公开的广度和范围不应受上文所描述的示例性实施方案中的任一个的限制，而应仅根据以下权利要求和其等效物来界定。

Claims

1.一种在单倍体玉米植株上产生共显性果穗的方法，所述方法包括使所述单倍体玉米植株与植物生长调节剂接触，其中所述单倍体玉米植株产生共显性果穗。

2.一种增加从DH₀玉米植株收获的DH₁种子数目的方法，所述方法包括使所述DH₀玉米植株在发育阶段V2、V3、V4、V5、V6、V7、V8、V9、V10、V11、V12*与植物生长调节剂接触，以及使所述DH₀玉米植株在其生命周期的任何阶段与染色体加倍剂接触，以制备产生至少一个DH₁玉米种子及至少两个共显性果穗的DH₀玉米植株。

3.如权利要求2所述的方法，其中由具有至少两个共显性果穗的所述DH₀玉米植株产生的DH₁玉米种子的总数目大于由展现显性果穗的对照DH₀玉米植株产生的DH₁玉米种子的数目。

4.如权利要求2或3所述的方法，其中所述DH₀玉米植株产生第一共显性果穗和第二共显性果穗，并且所述第二共显性果穗产生比所述第一共显性果穗更多的DH₁玉米种子。

5.如权利要求2或3所述的方法，其中所述DH₀玉米植株产生第一共显性果穗、第二共显性果穗以及第三共显性果穗，并且所述第三共显性果穗产生比所述第一共显性果穗更多的DH₁玉米种子。

6.如权利要求2至5中任一项所述的方法，其进一步包括在使所述DH₀玉米植株与所述植物生长调节剂或所述染色体加倍剂接触之前对所述DH₀玉米植株进行基因分型。

7.如权利要求2至6中任一项所述的方法，其进一步包括从所述DH₀玉米植株获得DH₁玉米种子。

8.如权利要求7所述的方法，其进一步包括对从所述DH₀玉米植株获得的所述DH₁玉米种子进行基因分型或对从所述DH₁玉米种子生长出的植株进行基因分型。

9.如权利要求8所述的方法，其进一步包括使基于所述基因分型而选择的DH₁玉米种子生长。

10.如权利要求2至9中任一项所述的方法，其中所述方法产生至少约15％的DE₄加倍效率，产生至少约15％的DE₂₀加倍效率，产生至少约15％的DE₃₀加倍效率，和/或产生至少约15％的DE₅₀加倍效率。

11.如权利要求1至10中任一项所述的方法，其中所述植物生长调节剂是选自由以下各项组成的组：植物激素、赤霉酸抑制剂、细胞***素以及其任何组合。

12.如权利要求11所述的方法，其中所述植物生长调节剂为赤霉酸抑制剂。

13.如权利要求12所述的方法，其中所述赤霉酸抑制剂是选自包含以下各项的组：矮壮素-CL、甲哌鎓-CL、AMO-1618、三丁氯苄膦-Cl、四环唑、环丙嘧啶醇、呋嘧醇、多效唑、烯效唑-P、抗倒胺、调环酸-CA、抗倒酯、丁酰肼、外-16,17-和二氢-GA5-13-乙酸盐。

14.如权利要求1至13中任一项所述的方法，其中通过喷淋、气体熏蒸、喷射或喷雾使所述植株与所述植物生长调节剂接触。

15.如权利要求2至14中任一项所述的方法，其中所述DH₀玉米植株在其与所述植物生长调节剂接触之前与所述染色体加倍剂接触。

16.如权利要求2至14中任一项所述的方法，其中所述DH₀玉米植株在其与所述植物生长调节剂接触之后与所述染色体加倍剂接触。

17.如权利要求2至16中任一项所述的方法，其中所述DH₀玉米植株在与所述植物生长调节剂接触之前或之后1分钟、5分钟、15分钟、30分钟、1小时、2小时、3小时、6小时、12小时或24小时内与所述染色体加倍剂接触。

18.如权利要求17所述的方法，其中所述染色体加倍剂和所述植物生长调节剂同时与所述DH₀玉米植株接触。

19.如权利要求1至18中任一项所述的方法，其中所述玉米植株在发育阶段V4、V5或V6与所述植物生长调节剂接触。

20.如权利要求1至18中任一项所述的方法，其中所述玉米植株在发育阶段V6、V7、V8、V9或V10与所述植物生长调节剂接触。

21.如权利要求2至20中任一项所述的方法，其中产生三个或更多个、四个或更多个或者五个或更多个共显性果穗。

22.一种优良单倍体玉米植株，其包含至少两个共显性果穗。

23.如权利要求22所述的优良玉米植株，其中所述共显性果穗中的至少一个包含加倍单倍体胚。

24.一种包含至少两个共显性果穗的DH₀玉米植株，其中所述共显性果穗中的至少一个包含加倍单倍体胚。

25.如权利要求22至24中任一项所述的玉米植株，其是通过如权利要求1至21中任一项所述的方法制备。