BR112018000666B1 - Métodos de produção de espigas codominantes em uma planta jovem de milho haploide e de melhoramento do número de sementes dh1 colhidas de uma planta de milho dh0 - Google Patents

Métodos de produção de espigas codominantes em uma planta jovem de milho haploide e de melhoramento do número de sementes dh1 colhidas de uma planta de milho dh0 Download PDF

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Abstract

São fornecidos métodos para aumentar a eficiência da criação de plantas duplo haploides através do aumento do número de chances de formar uma semente duplo haploide através do tratamento de uma planta monocotiledônea com um regulador de crescimento vegetal. Em certas modalidades, são produzidas plantas de milho que compreendem múltiplas espigas codominantes. Também são fornecidas plantas que compreendem o potencial de gerar números maiores de descendentes duplo haploides.

Description

ANTECEDENTES
[0001] A evolução e a domesticação de plantas geralmente segui ram um padrão comum ou "síndrome de domesticação" que distingue culturas de seus progenitores selvagens. Uma característica comum da síndrome de domesticação entre culturas surgiu a partir da seleção em longo prazo para a dominância apical aumentada, a qual se caracteriza pelo crescimento relativamente mais robusto de um caule central e seus gomos e flores em comparação com o crescimento de hastes laterais e gomos axilares, o que resultou em frutos cada vez maiores por planta. A seleção para dominância apical é considerada um sintoma importante de domesticação em muitas espécies, incluindo as culturas de cereais de arroz, trigo, cevada e milho, bem como culturas frutíferas como o tomate.
[0002] Um desafio crítico durante a domesticação das plantas cul tivadas foi melhorar a capacidade de colheita da cultura em relação a sua progenitora. Em ambientes desfavoráveis, plantas selvagens muitas vezes florescem e amadurecem rapidamente, produzindo números menores de ramos, inflorescências, flores e sementes, a fim de aumentar a probabilidade de produção de pelo menos uma prole para continuar o ciclo de vida. Em ambientes favoráveis, plantas selvagens maximizam a probabilidade de reprodução bem sucedida através da produção sequencial de mais ramos, inflorescências, flores e sementes ao longo do tempo. Esta última estratégia não é ótima para uma cultura, uma vez que é mais eficaz para colher menos frutas ou inflo- rescências, porém maiores, que amadurecem de forma síncrona de planta para planta, o que permite uma única colheita em um ótimo momento de maturação de frutas ou inflorescências. Assim, diversas culturas foram selecionadas para produzir números menores de sementes, frutas ou inflorescências maiores no caule principal como meio de melhorar a capacidade de colheita.
[0003] Talvez a alteração mais marcante e bem estudada na arqui tetura vegetal tenha sido provocada pela domesticação do milho. Ao selecionar os traços que melhoram o rendimento e a capacidade de colheita mecânica, os seres humanos transformaram o progenitor do milho de um antepassado espesso semelhante a um arbusto com múltiplos ramos laterais alongados terminados com florescências masculinas ou femininas na cultura de hoje, compreendendo um único caule principal ereto com somente dois ou três ramos laterais relativamente abreviados, cada um terminando em uma única flor feminina (espiga). Hoje é geralmente aceito que a seleção da dominância apical no milho não somente melhora o rendimento global em condições de crescimento ideais, mas também torna muito mais fácil a logística de coordenação dos tempos de floração entre linhagens e simplifica a manutenção do campo e a capacidade de colheita mecânica.
[0004] O mecanismo de dominância apical no milho envolve a re gulação de hormônios, tais como a auxina, que é produzida pelo me- ristema apical. À medida que a espiga primária começa a amadurecer, maiores quantidades de auxina são produzidas pelo meristema apical. A auxina é transportada do meristema apical para baixo na planta e suprime o desenvolvimento de espigas inferiores, resultando em espigas secundárias que são menos propensas a se dividir (nick) bem ou produzir sementes viáveis.
[0005] As plantas de esporófitos haploides contêm um número de cromossomos gamético (n) e podem se originar espontaneamente ou através de indução artificial. Haploides tendem a ser menos vigorosos e menos férteis do que um esporófito de genótipo semelhante com o número de cromossomos zigótico (2n), e por isso são de benefício direto limitado para pesquisadores que buscam melhorar a genética vegetal.
[0006] Embora a duplicação espontânea de cromossomos ocorra, a frequência é tão baixa (tipicamente inferior a 5%) que os pesquisadores que tentam criar plantas duplo haploides ("plantas DH") frequentemente submetem plantas haploides a tratamentos que promovam a duplicação cromossômica. Mudas de plantas haploides submetidas a um tratamento de duplicação de cromossomos podem produzir óvulos e/ou esperma haploide, e se essas plantas forem capazes de se auto- polinizar com êxito, o número de cromossomos zigótico pode ser recuperado na prole, restaurando, assim, o vigor e a fertilidade esperados de um esporófito 2n.
[0007] Durante a duplicação de cromossomos, cada homólogo é replicado para criar uma cópia substancialmente idêntica do original e, assim, todo o genoma de uma planta DH geralmente é considerado homozigótico em cada locus. Esse processo pode criar linhagens completamente homozigóticas e homogêneas em menos gerações do que o retrocruzamento tradicional, melhorando, desse modo, a eficácia da seleção, reduzindo o número e duração dos ciclos de reprodução e consumindo menos recursos.
[0008] A probabilidade de gerar grandes números de descenden tes duplo haploides a partir de uma dada planta haploide usando métodos atualmente conhecidos na técnica é tão baixa, no entanto, que reduz severamente as vantagens de incorporá-los em larga escala em um programa de reprodução competitivo. Desde a década de 1950 pesquisadores têm tentado melhorar as taxas de duplicação em plantas e têm desenvolvido técnicas para mais de 250 espécies de culturas. No entanto, até mesmo os melhores métodos descritos de forma confiável produzem taxas de duplicação de somente 12% ou menos e tipicamente dependem da aplicação da droga antimicrotúbulos colchi- cina, que é tóxica para plantas nas concentrações necessárias. Os efeitos também são altamente específicos para genótipo.
[0009] Além disso, os métodos atuais de duplicação são intensivos em mão-de-obra e muitas vezes exigem que as plantas sejam manipuladas várias vezes durante o tratamento, reduzindo sua taxa de sobrevivência. Plantas haploides muitas vezes se tornam tão frágeis durante o tratamento com colchicina que, mesmo que sobrevivam a ele e sejam duplicadas com sucesso, não sobrevivem à manipulação subsequente e etapas de processamento à jusante necessárias para transplantá-las para um campo, estufa ou outras condições de crescimento onde possam se recuperar e eventualmente crescer para produzir sementes. Assim, criadores de plantas e pesquisadores normalmente usarão uma medida que caracterize tanto a probabilidade de uma planta haploide ser duplicada quanto à probabilidade de a planta sobreviver para produzir sementes duplo haploides ao comparar a eficácia global de um método de duplicação com outro.
SUMÁRIO
[0010] São providos neste documento métodos para aumentar o número de inflorescências que uma planta monocotiledônea produz. Em certas modalidades, métodos de aumentar o número de inflores- cências que uma planta monocotiledônea produz compreendem contatar a planta monocotiledônea com um regulador de crescimento vegetal para produzir um maior número de inflorescências do que uma planta controle que não tenha sido contatada com o regulador de crescimento vegetal.
[0011] Certos aspectos proveem métodos para produzir espigas codominantes em uma planta de milho. Em certas modalidades, os métodos compreendem contatar uma planta de milho com um regula- dor de crescimento vegetal, de forma tal que a planta de milho produza espigas codominantes. Em certas modalidades, a planta de milho produz pelo menos duas espigas codominantes. Em certas modalidades, a planta de milho produz três, quatro, cinco ou mais espigas codomi- nantes.
[0012] Em certas modalidades de qualquer um dos métodos des critos neste documento, a planta pode ser uma planta haploide.
[0013] Certos aspectos proveem métodos para melhorar o número de sementes DH1 obtidas ou colhidas de uma planta de milho DH0. Certos aspectos proveem métodos para aumentar o número de sementes DH1 produzidas por uma planta de milho DH0. Certos aspectos proveem métodos para produzir espigas codominantes em uma planta de milho DH0. Em certas modalidades, qualquer um desses métodos compreende contatar uma planta de milho DH0 com um regulador de crescimento vegetal em qualquer um dos estágios de desenvolvimento V4, V5, V6, V7, V8, V9 ou V10 e contatar a planta de milho DH0 com um agente de duplicação de cromossomos em qualquer estágio do seu ciclo de vida. Em certas modalidades, qualquer um desses métodos compreende contatar uma planta de milho DH0 com o agente de duplicação de cromossomos em qualquer um dos estágios de desenvolvimento V4, V5, V6, V7, V8, V9 ou V10. Em certas modalidades, tais métodos produzem uma planta de milho DH0 que produz pelo menos uma semente de milho DH1 e pelo menos duas espigas codomi- nantes. Em certas modalidades, o número total de sementes de milho DH1 produzidas pela planta de milho DH0 com pelo menos duas espigas codominantes é maior do que o número de sementes de milho DH1 produzidas pelas plantas de milho DH0 controle que exibem uma única espiga dominante. Em certas modalidades, a planta de milho DH0 produz uma primeira espiga codominante e uma segunda espiga codominante e a segunda espiga codominante produz mais sementes de milho DH1 do que a primeira espiga codominante. Em certas moda-lidades, a planta de milho DH0 produz uma primeira espiga codominan- te, uma segunda espiga codominante e uma terceira espiga codomi- nante e a terceira espiga codominante produz mais sementes de milho DH1 do que a primeira espiga codominante. Em certas modalidades, os métodos compreendem adicionalmente a genotipagem da planta de milho DH0 antes de contatar a planta de milho DH0 com o regulador de crescimento vegetal ou o agente de duplicação de cromossomos. Isso pode ser usado para permitir que informações sobre a planta de milho DH0 sejam usadas para selecionar qual planta ou plantas de milho DH0 serão contatadas ou de que maneira contatá-las para atingir os resultados desejados. Em certas modalidades, os métodos compreendem adicionalmente a obtenção de sementes de milho DH1 a partir da planta de milho DH0. Em certas modalidades, os métodos compreendem adicionalmente a genotipagem das sementes de milho DH1 obtidas a partir da planta de milho DH0 ou genotipagem de uma planta cultivada a partir das sementes de milho DH1. Informações sobre as sementes ou plantas de milho DH1 podem ser usadas para decidir qual(is) se- mentes(s) ou planta(s) escolher para seguir adiante em um programa de reprodução. Assim, em certas modalidades, os métodos compreendem adicionalmente o cultivo de uma semente de milho DH1 selecionada com base na genotipagem. Em certas modalidades, os métodos compreendem adicionalmente o cruzamento de uma planta de milho DH1 cultivada a partir de sementes selecionadas com outra planta. Em certas modalidades, qualquer um desses métodos resulta em uma eficácia de duplicação de DE4 de pelo menos cerca de 15%, resulta em uma eficácia de duplicação de DE20 de pelo menos cerca de 15%, resulta em uma eficácia de duplicação de DE30 de pelo menos cerca de 15%, e/ou resulta em uma eficácia de duplicação de DE50 de pelo menos cerca de 15%.
[0014] Em certas modalidades de qualquer um dos métodos neste documento, uma planta é contatada com o regulador de crescimento vegetal por umedecimento, gaseificação, injeção ou pulverização. Em certas modalidades, o regulador de crescimento vegetal é um hormônio vegetal, inibidor de ácido giberélico, citocinina ou qualquer combinação dos mesmos. Em certas modalidades, o regulador de crescimento vegetal é um inibidor de ácido giberélico que é selecionado dentre o grupo que compreende clormequat-CL, mepiquat-CL, AMO-1618, clorfônio-Cl, tetcilacis, ancimidol, flurprimidol, paclobutrazol, unicona- zol-P, inabenfido, pro-hexadiona-CA, trinexapac-etila, daminozida, exo-16,17 e di-hidro-GA5-13-acetato.
[0015] Em certas modalidades, a planta de milho DH0 é contatada com um agente de duplicação de cromossomos, tal como colchicina, antes de ser contatada com o regulador de crescimento vegetal. Em certas outras modalidades, a planta de milho DH0 é contatada com um agente de duplicação de cromossomos depois de ser contatada com o regulador de crescimento vegetal. Em certas modalidades, a planta de milho DH0 é contatada com o agente de duplicação de cromossomos dentro de 1 minuto, 5 minutos, 15 minutos, 30 minutos, 1 hora, 2 horas, 3 horas, 6 horas, 12 horas ou 24 horas antes ou depois do contato com o regulador de crescimento vegetal. Em certas modalidades, o agente de duplicação de cromossomos e o regulador de crescimento vegetal são contatados com a planta de milho DH0 ao mesmo tempo.
[0016] Em certas modalidades, uma planta de milho é contatada com o regulador de crescimento vegetal no estágio de desenvolvimento V4, V5 ou V6. Em certas modalidades, uma planta de milho é contatada com o regulador de crescimento vegetal no estágio de desenvolvimento V6, V7, V8, V9 ou V10.
[0017] Em certas modalidades, o método resulta em três ou mais, quatro ou mais, ou cinco ou mais espigas codominantes produzidas em uma única planta de milho. Certas modalidades proveem uma planta de milho haploide de elite compreendendo pelo menos duas espigas codominantes. Em certas modalidades, pelo menos uma das espigas codominantes compreende um embrião duplo haploide. Certas modalidades proveem uma planta de milho DH0 compreendendo pelo menos duas espigas codominantes, em que pelo menos uma das espigas codominantes compreende um embrião duplo haploide. Certas modalidades proveem uma planta de milho produzida por qualquer um dos métodos descritos neste documento.
BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS
[0018] A Figura 1 mostra espigas classificadas por seu pedigree de população, posição na haste de milho e número de sementes DH1 que produziram.
[0019] A Figura 2 mostra oito espigas de milho codominantes nu meradas que crescem a partir de uma única planta que foi tratada com um regulador de crescimento vegetal.
[0020] A Figura 3 mostra o número total médio de sementes pro duzidas a partir de rebentos provenientes da mesma planta mãe que foi submetida a um tratamento de indução de rebentos.
[0021] A Figura 4 mostra que plantas tratadas com PGR produzi ram mais sementes por planta.
[0022] A Figura 5 mostra que, através de linhagens, plantas trata das com PGR produziram mais sementes por planta.
DESCRIÇÃO DETALHADA
[0023] São providos neste documento métodos para induzir ou promover o desenvolvimento de meristemas axilares ou brotos laterais adicionais ou inflorescências adicionais em uma planta de cultivo. Em certos aspectos, isso é feito com o propósito de melhorar a eficácia da produção de plantas duplo haploides ("DH").
[0024] Deve-se notar que a entidade do termo "um" ou "uma" se refere a uma ou mais dessas entidades; por exemplo, "uma planta" é entendida por representar uma ou mais plantas. Como tal, os termos "um" (ou "uma"), "um ou mais" e "pelo menos um" podem ser usados de forma intercambiável neste documento.
[0025] Além disso, "e/ou", onde usado neste documento, deve ser tomado como a divulgação específica de cada uma das duas características ou componentes especificados com ou sem o outro. Assim, o termo "e/ou" como usado em uma frase tal como "A e/ou B" neste documento se destina a incluir "A e B", "A ou B", "A" (por si só) e "B" (por si só). Da mesma forma, o termo "e/ou" como usado em uma frase tal como "A, B e/ou C" se destina a abranger cada uma das seguintes modalidades: A, B, e C; A, B, ou C; A ou C; A ou B; B ou C; A e C; A e B; B e C; A (por si só); B (por si só); e C (por si só).
[0026] A menos que definido de outra forma, termos técnicos e científicos usados neste documento têm o mesmo significado como comumente compreendido por alguém ordinariamente versado na técnica à qual esta divulgação se relaciona. Unidades, prefixos e símbolos são denotados em sua forma aceita pelo Système International de Unites (Sistema Internacional de Unidades - SI). Faixas numéricas são inclusivas dos números que definem a faixa.
[0027] Os cabeçalhos providos neste documento são unicamente para facilitar a referência e não são limitações dos vários aspectos da divulgação, os quais podem ser obtidos por referência no relatório descritivo como um todo. Consequentemente, os termos definidos imediatamente abaixo são mais completamente definidos por referência ao relatório descritivo em sua totalidade.
Definições
[0028] Como usado neste documento, uma "planta" se refere a uma planta monocotiledônea inteira, qualquer parte da mesma, ou uma cultura de células ou tecidos derivada de uma planta monocotile- dônea, compreendendo qualquer um dentre: plantas inteiras, componentes ou órgãos da planta (por exemplo, folhas, caules, raízes, etc.), tecidos vegetais, sementes, células vegetais e/ou progênies da mesma. Uma célula vegetal é uma célula biológica de uma planta, tirada de uma planta monocotiledônea ou derivada por meio de cultivo de uma célula retirada de uma planta monocotiledônea.
[0029] Como usado neste documento, uma "população de plantas" ou "população vegetal" se refere a um conjunto que compreende qualquer número, incluindo um, de indivíduos, objetos ou dados a partir dos quais amostras são retiradas para avaliação, por exemplo, estimar os efeitos de QTL. Mais comumente, os termos se relacionam a uma população de reprodução de plantas a partir da qual membros são selecionados e cruzados para produzir uma progênie em um programa de reprodução. Uma população de plantas pode incluir a progênie de um único cruzamento de reprodução ou uma pluralidade de cruzamentos de reprodução e pode ser de plantas em si ou de materiais derivados de plantas ou representações in silico das plantas. Os membros da população não precisam ser idênticos aos membros da população selecionados para uso em ciclos subsequentes de análises ou aqueles em última análise selecionados para obter as plantas de progênie final. Muitas vezes, uma população de planta é derivada de um único cruzamento biparental, mas também pode ser derivado de dois ou mais cruzamentos entre os mesmos ou diferentes progenitores. Apesar de que uma população de plantas pode compreender qualquer número de indivíduos, aqueles versados na técnica reconhecerão que criadores de plantas comumente usam tamanhos de populações que variam de cem a duzentos indivíduos a milhares, e que o maior desempenho de 5-20% de uma população é o que comumente é selecionado para ser usado em cruzamentos subsequentes a fim de melhorar o desempenho de gerações subsequentes da população.
[0030] Como usado neste documento, o termo "elemento genéti co" se refere a uma construção de DNA recombinante (vulgarmente referida como "transgene") que foi inserida no genoma do milho, uma sequência nucleotídica ou um locus genético de um genoma vegetal.
[0031] Como usado neste documento, os termos "promover" e "in duzir" são usados de forma intercambiável para significar promover, por exemplo, o desenvolvimento de gomos axilares a partir de gomos pré-existentes e induzir, por exemplo, a formação de gomos axilares de novo.
[0032] Como usado neste documento, o termo substância, compo sição, entidade e/ou qualquer combinação de substâncias, composições ou entidades "de ocorrência não natural", ou quaisquer variantes gramaticais das mesmas, é um termo condicional que exclui explicitamente, mas somente exclui aquelas formas da substância, composição, entidade e/ou qualquer combinação de substâncias, composições ou entidades que são bem compreendidas por pessoas ordinariamente versadas na técnica como sendo "de ocorrência natural", ou que são, ou podem ser, a qualquer momento, determinadas ou interpretadas por um juiz ou um órgão administrativo ou judicial como sendo "de ocorrência natural".
[0033] Como usado neste documento, os termos "flor" e "inflores- cência" são usados de forma intercambiável.
[0034] Como usado neste documento, os termos "milho" e "abati" são usados de forma intercambiável.
[0035] Como usado neste documento, o termo "elite", "planta de elite" e semelhantes descreve um grupo, germoplasma ou população de pelo menos uma planta de cultivo que resultou da reprodução e seleção dirigida por seres humanos para desempenho agronômico superior. Uma "população de elite" é uma variedade de indivíduos ou linhagens de elite que podem ser usados para representar o estado da téc- nica em termos de genótipos agronomicamente superiores de uma dada espécie de cultivo, tal como milho. De forma semelhante, um "germoplasma de elite" ou "estirpe de elite de germoplasma" é um germoplasma agronomicamente superior, tipicamente derivado de e/ou capaz de dar origem a uma planta com desempenho agronômico superior, tal como uma linhagem de elite desenvolvida recentemente ou já existente de milho. Em contraste, uma "planta exótica", "linhagem exótica" ou "germoplasma exótico" é uma planta, linhagem ou germo- plasma derivado de uma planta que não pertence a uma linhagem ou estirpe de elite de germoplasma disponível. No contexto de um cruzamento entre duas plantas ou linhagens de germoplasma, um germo- plasma exótico não está intimamente relacionado por descendência ao germoplasma de elite com o qual é cruzado. Mais comumente, o ger- moplasma exótico não é derivado de nenhuma linhagem de elite conhecida de um cultivo, mas sim selecionado para introduzir elementos genéticos (alelos tipicamente desejados) em um programa de reprodução.
[0036] As plantas de milho tendem a produzir uma única espiga dominante, ou primária, que se desenvolve mais rápido e mais com-pletamente. As espigas adicionais às vezes se formam mais abaixo no caule na espiga dominante (a espiga secundária é a próxima espiga abaixo a partir da espiga primária, a espiga terciária a próxima abaixo, e assim por diante - todas as quais podem ser referidas coletivamente como espigas secundárias), mas seu desenvolvimento tipicamente é atrasado em relação à espiga dominante. Uma vez que o desenvolvimento de espigas adicionais ou não dominantes geralmente é atrasado, a espiga dominante é tipicamente a única que se divide bem.
[0037] Como usado neste documento, o termo "espiga(s) codomi- nante(s)" se refere a espigas em uma planta de milho que amadurecem a uma velocidade/tempo semelhante, de modo que elas produ- zem sedas receptivas à germinação de pólen em um período de de-senvolvimento sobreposto. Uma planta com espigas codominantes terá pelo menos duas espigas codominantes. Espigas codominantes podem ser numeradas pela sua posição no caule, isto é, a espiga codo- minante superior é a primeira espiga codominante, a próxima espiga codominante a partir da primeira é a segunda espiga codominante, a terceira espiga codominante é a próxima abaixo, e assim por diante.
[0038] Como usado neste documento, uma planta controle (por exemplo, planta controle monocotiledônea, planta de milho controle, etc.) é uma planta (ou população de plantas) reconhecida como tendo um fenótipo representativo (por exemplo, número de inflorescências, número de rebentos, número de espigas, número de grãos/sementes, altura, biomassa e semelhantes) de uma planta que não tenha sido tratada com um regulador de crescimento vegetal, mas que seja, em outros aspectos, tais como composição genética e condições de crescimento, comparável com uma planta tratada com um regulador de crescimento vegetal. Por exemplo, alguém versado na técnica entenderia que uma planta controle tem um ou mais dos seguintes atributos: resultados de uma semente derivada do mesmo cruzamento de indução; tem pelo menos um precursor em comum com a planta tratada; compartilha um ancestral em comum com a planta tratada dentro de doze gerações; compartilha herança genética comum suficiente com a planta tratada que alguém ordinariamente versado na técnica de reprodução de plantas reconheceria a planta controle como uma comparação válida para estabelecer uma correlação entre a aplicação de um regulador de crescimento vegetal e o fenótipo resultante; e/ou tem uma espiga dominante e nenhuma espiga codominante (milho). Alguém ordinariamente versado na técnica reconhecerá que uma planta não tratada que por acaso (por exemplo, um ponto estatístico fora da reta), por algum outro tipo de manipulação, ou outra razão, compreen- de um fenótipo que varia de um fenótipo representativo para a planta não tratada não seria uma planta controle apropriada.
Eficácias de duplicação
[0039] Plantas haploides submetidas a um tratamento de duplica ção de cromossomos (ou, em certas modalidades, plantas haploides a serem submetidas a um tratamento de duplicação de cromossomos) denominadas plantas DH0, por contato com o agente de duplicação de cromossomos, podem produzir um óvulo e/ou esperma haploide, e se as plantas DH0 forem autopolinizadas com êxito, o número de cromossomos zigóticos poderá ser recuperado na prole (denominadas sementes, plantas, etc. DH1), restaurando, assim, o vigor e a fertilidade esperados de um esporófito 2n. "Eficácia de Duplicação" (DE) é uma medida global de sucesso de duplicação calculado pela divisão do número de plantas DH0 de uma designação que produz semente DH1 pelo número total de plantas DH0 dessa designação que foram submetidas a um tratamento de duplicação de cromossomos.
[0040] Embora a recuperação de uma única semente DH1 possa tecnicamente ser contada como um evento de duplicação bem- sucedido, os criadores de plantas geralmente requerem uma população de pelo menos várias plantas a fim de gerar a quantia estatística necessária para tirar conclusões confiantes dos testes genéticos e estatísticos desempenhados sobre a população. Por exemplo, um tratamento de duplicação que produza somente uma ou algumas sementes DH1 será de uso limitado em um programa de reprodução competitivo, porque pelo menos uma geração adicional de plantação, crescimento, polinização e colheita será necessária para gerar um tamanho de população suficiente para testes estatísticos precisos, especialmente se forem planejadas comparações em múltiplos ambientes. Em um programa de reprodução relativamente grande, essa etapa de "agrupamento" de sementes pode atrasar testes dessa população uma tempo- rada inteira, o que tipicamente atrasa a liberação de um produto comercial, potencialmente resultando em perda de valiosa parcela de mercado. Uma vez que os métodos descritos neste documento podem aumentar o número de sementes DH1 produzidas por uma planta DH0 em uma única geração, eles também podem reduzir a probabilidade de que uma geração adicional seja necessária para agrupar (aumentar) o número de sementes DH1 de um dado cruzamento a fim de avançar essa população em etapas subsequentes (por exemplo, testes de campo) em um pipeline de reprodução. Assim, um usuário dos métodos descritos neste documento será capaz de desenvolver ger- moplasma melhorado para o mercado mais rápido do que aqueles que utilizam os métodos atuais descritos em outro lugar.
[0041] A fim de quantificar melhor a eficácia do tratamento de du plicação, as restrições de rendimento mínimo podem ser aplicadas durante o processo de cálculo da DE, de forma tal que uma dada planta DH0 deve produzir pelo menos um número mínimo de sementes DH1 antes de ser contada na proporção de eventos de duplicação bem- sucedidos, ou seja, usada no numerador. Subscritos podem ser usados para significar a restrição de rendimento mínimo, de forma tal que DE20 é a eficácia de duplicação calculada quando somente plantas DH0 que tenham produzido pelo menos 20 sementes DH1 são divididas pelo número total de plantas DH0 submetidas ao tratamento de duplicação. DE30 representa a DE quando somente plantas DH0 que tenham produzido pelo menos 30 sementes DH1 são divididas pelo número total de plantas DH0 submetidas ao tratamento de duplicação. Da mesma forma, DE50 representa a DE quando somente plantas DH0 que tenham produzido pelo menos 50 sementes DH1 são divididas pelo número total de plantas DH0 submetidas ao tratamento de duplicação e assim por diante.
Indução e promoção de gomos axilares
[0042] É descrito neste documento que agora é possível aumentar drasticamente a probabilidade de recuperar um número alvo de sementes em uma única geração a partir de uma planta monocotiledô- nea DH0. Os métodos compreendem induzir ou promover a planta mo- nocotiledônea para desenvolver pelo menos uma dentre uma variedade de tipos diferentes de gomos axilares que podem dar origem a inflo- rescências adicionais. São possíveis diferentes modalidades de indução de gomos axilares e/ou de tratamento de plantas em diferentes estágios de crescimento para controlar o tipo de gomo(s) axilar(es) que se desenvolve(m). Exemplos não limitantes incluem multigomos, rebentos e espigas codominantes, os quais são definidos neste documento em detalhes.
[0043] A indução de gomos axilares em monocotiledôneas relaxa a dominância apical que normalmente inibe o desenvolvimento de brotos laterais e/ou flores ou inflorescências secundárias. Em certas modalidades, um usuário faz com que uma planta mãe produza um maior número de inflorescências femininas férteis e óvulos fêmeas férteis do que os métodos atuais de reprodução e cultivo de plantas que se concentram na maximização do desenvolvimento de uma única inflores- cência feminina.
[0044] Embora conhecida por surgir e se desenvolver espontane amente às vezes, a formação ou desenvolvimento de gomos axilares no milho é atualmente um traço indesejável que é eliminado dos programas de reprodução por uma série de razões descritas neste documento. Entre estas, está a ideia de que os hormônios responsáveis pela manutenção do domínio apical reprimirão o desenvolvimento de flores de gomos axilares, por isso é mais eficaz se a planta não desperdiçar recursos desenvolvendo-os ou as estruturas vegetativas que os sustentam. Isso é especialmente evidente nos híbridos de milho modernos, onde os rendimentos são tipicamente maximizados em bons ambientes através do cultivo dos híbridos selecionados para concentrar seus recursos no desenvolvimento de uma espiga única de desempenho excelente que se divida bem e minimize o desenvolvimento de quaisquer gomos axilares ou inflorescências secundárias.
[0045] No entanto, descobriu-se que, ao submeter uma planta mo- nocotiledônea a pelo menos um dentre vários possíveis tratamentos de indução de gomos axilares em um ou mais dos inúmeros possíveis pontos no ciclo de vida da planta, é possível liberar a programação de desenvolvimento para uma maior dominância apical que criadores de plantas selecionaram. Em certas modalidades, um usuário submete uma planta monocotiledônea a um tratamento que promove o desenvolvimento de pelo menos um gomo axilar pré-existente ou primordial de forma tal que ele forme um broto de lado lateral (por exemplo, um rebento) ou uma inflorescência secundária (ou terciária, ou quaternária, etc.) no caule principal de uma planta de milho. Um usuário pode sincronizar o desenvolvimento de pelo menos um gomo axilar em uma planta de milho com o desenvolvimento de outros gomos na planta de milho para efetuar um desenvolvimento simultâneo e coordenado de pelo menos duas espigas na planta que exibam os traços esperados de uma espiga dominante, incluindo ser receptiva à polinização aproximadamente ao mesmo tempo (por exemplo, espigas codominantes). Descrições e exemplos neste documento permitem que um usuário escolha e/ou desenvolva uma combinação apropriada de parâmetros de tratamento de indução a partir de uma ampla gama de opções para atender a necessidades específicas. Certas modalidades incluem submeter uma planta a um tratamento que reconfigura o programa de desenvolvimento de pelo menos uma célula na região nodal da haste principal, de forma tal que dê origem a pelo menos um novo meristema de broto lateral que se desenvolve em um novo ramo lateral capaz de produzir inflorescências férteis (por exemplo, multigomos).
[0046] Assim, em certas modalidades, um usuário pode recuperar com segurança um número alvo de sementes de uma planta monocoti- ledônea DH0 induzindo-a a formar flores adicionais a partir de gomos axilares, polinizando essas flores e então colhendo a semente que se forma a partir dessas flores adicionais até o número alvo de sementes ser obtido. Através da combinação de todas as sementes produzidas por uma planta induzida a formar gomos axilares adicionais, pode-se aumentar as chances de produzir um número desejado de sementes de uma única planta mãe em uma única geração.
Divisão (nick)
[0047] No milho, a formação bem sucedida do grão requer uma sobreposição de períodos de desenvolvimento quando as estruturas femininas necessárias para dar suporte à fertilização estão totalmente funcionais e o período de desenvolvimento quando o pólen está viável e liberado da bandeira. Uma boa divisão descreve as circunstâncias quando a sobreposição desses períodos de desenvolvimento é suficiente para fertilizar a maioria, se não todos, dos ovários disponíveis na espiga. Como o pólen pode ser sensível à dessecação, ao calor e a outros fatores ambientais, o período de desenvolvimento para uma boa divisão é muitas vezes limitado a vários dias ou até mesmo algumas horas. Se o pólen for liberado muito cedo, de forma tal que a maioria ou a totalidade não esteja viável no momento em que as flores femininas estão receptivas à polinização, então a divisão será pobre, levando a muitos óvulos não fertilizados e um mau estabelecimento de sementes. Também se espera que a divisão seja má quando o pólen é liberado tão tarde que as sedas estão mortas ou as flores femininas não são mais receptivas e/ou capazes de suportar a fertilização. Sob condições de crescimento normais, o desenvolvimento de espigas secundárias geralmente é suprimido e atrasado, de forma que a espiga primária seja tipicamente a única cujo desenvolvimento esteja suficien- temente alinhado com aquele da bandeira para que ocorra uma boa divisão.
[0048] A divisão serve como uma conexão tão crucial no ciclo de vida do milho que os produtores comerciais e criadores de milho também gastam recursos consideráveis, ajudando a garanti-la. Não é in- comum que um programa de reprodução competitivo ou industrial descarte linhagens que, de outro modo, exibem excelente desempenho, mas não conseguem se dividir bem e, assim, sua manutenção se torna onerosa. Por exemplo, uma população de plantas DH0 pode exibir uma taxa muito alta de duplicação e conter uma excelente genética, mas ainda pode ser eliminada de um desenvolvimento posterior se ela se dividir tão mal que é um empenho produzir sementes suficientes para se manter e/ou se for necessária mais de uma geração para produzir sementes suficientes para testes de desempenho.
Agentes de tratamento vegetal
[0049] Em certas modalidades providas neste documento, uma planta pode ser contatada com uma ampla variedade de "agentes de tratamento vegetal". Assim, como usado neste documento, um "agente de tratamento vegetal", ou "agente", pode se referir a qualquer composto provido de forma exógena que pode ser introduzido à superfície de uma planta e migrar para um tecido vegetal. Em algumas modalidades, o agente de tratamento vegetal atua extracelularmente no interior do tecido vegetal, tal como interagindo com receptores na superfície celular externa. Em algumas modalidades, o agente de tratamento vegetal entra em células dentro do tecido. Em algumas modalidades, o agente de tratamento vegetal está contido dentro de um líquido. Tais líquidos incluem, mas não estão limitados a, soluções, suspensões, emulsões e dispersões coloidais.
[0050] O contato de uma planta com um agente de tratamento po de ocorrer antes, durante ou após a aplicação de outras substâncias. Em certas modalidades, o contato entre a planta e o agente de tratamento é atingido por imersão, submersão ou outra forma de inserção da planta em um reservatório de líquido compreendendo o agente de tratamento vegetal. Outros métodos de contatar uma planta com um agente de tratamento incluem a pulverização ou nebulização da planta com uma solução compreendendo um agente de tratamento vegetal ou agitação ou rolamento de uma planta em uma solução compreendendo um agente de tratamento vegetal. Em certas modalidades, o contato entre a planta e o agente de tratamento é atingido por uma umidificação do solo, que compreende adicionar um agente de tratamento líquido ao solo ou meio de crescimento próximo às raízes onde a planta crescerá.
[0051] Em certas modalidades, os líquidos são de natureza aquo sa. Em certas modalidades, líquidos aquosos podem compreender componentes solúveis em água. Em certas modalidades, líquidos aquosos podem compreender componentes insolúveis em água, podem compreender um componente insolúvel que se torna solúvel em água por adição de um surfactante, ou pode compreender qualquer combinação de componentes solúveis, componentes insolúveis e sur- factantes.
[0052] A "solução de tratamento vegetal" ou "solução de tratamen to" pode se referir a qualquer solução de líquido que compreende um agente de tratamento vegetal. Em certas modalidades, uma solução de tratamento vegetal compreende um agente de tratamento vegetal e os dois termos podem ser frequentemente usados como sinônimos. Por exemplo, a entrega de uma solução de tratamento vegetal que compreende o agente de tratamento vegetal colchicina a um meriste- ma vegetal é essencialmente sinônimo a entregar um agente de tratamento vegetal compreendendo colchicina a um meristema vegetal.
[0053] Agentes de tratamento vegetal incluem, mas não estão limi- tados a, macromoléculas, incluindo polinucleotídeos, incluindo ácidos nucleicos (por exemplo, DNA e/ou RNA), polipeptídeos, polissacarí- deos, policetídeos, e semelhantes. Os polinucleotídeos podem ser de fita simples ou de fita dupla e podem incluir moléculas antisense e RNAs interferentes. Os polinucleotídeos podem incluir mutações e/ou várias outras modificações, tais como em suas cadeias principais, que são bem conhecidas na técnica. Os polinucleotídeos incluem "elementos genéticos", os quais compreendem construções de DNA recombi- nante (comumente referidas como "transgenes") que tenham sido inse-ridas no genoma de uma planta, ou uma sequência nucleotídica, ou um locus genético do genoma de uma planta. Assim, em certas modalidades, um usuário desta invenção pode entregar uma sequência de DNA ou RNA a um tecido alvo para alterar a expressão ou a herança de um traço da planta, por exemplo, para efetivamente "transformar" uma planta através da inserção de um elemento genético no seu ge- noma.
[0054] Agentes de tratamento vegetal também podem compreen der vários fito-hormônios, agonistas de fito-hormônios, antagonistas de fito-hormônios, ou agentes que estimulam ou inibem a percepção, a sinalização ou a síntese de fito-hormônios. Em certas modalidades, um agente de tratamento vegetal compreende um regulador de crescimento vegetal (PGR). PGRs são uma classe de compostos que afetam os processos celulares, crescimento, desenvolvimento ou comportamento de uma planta ou parte da planta. Em algumas modalidades, um PGR é responsável por acelerar ou retardar a taxa de crescimento ou maturação, ou de outra forma alterar o comportamento de uma planta ou parte da planta. Em algumas modalidades, um PGR é um hormônio vegetal de ocorrência natural. Em algumas modalidades, um PGR é uma substância química que altera a floração, o comprimento internodos, a dominância apical, o amadurecimento, a arquitetura da raiz ou a frutificação, incluindo qualquer substância que afete o crescimento, desenvolvimento, comportamento ou reprodução em uma planta monocotiledônea. Reguladores de crescimento vegetal incluem auxinas (por exemplo, IAA) e inibidores de auxina, citocininas (por exemplo, BAP) e inibidores de citocinina, compostos que podem estimular a produção de etileno (isto é, ACC e semelhantes) e compostos que podem inibir a produção de etileno (AVG e semelhantes), e compostos que inibem a percepção de etileno (prata e semelhantes). Reguladores de crescimento vegetal também compreendem compostos que modulam a percepção, sinalização, e/ou comportamento da planta, tais como giberelinas e seus inibidores (por exemplo, paclobutrazol (PBZ) ou uniconazol), ácido abscísico e seus inibidores, e ácido jas- mônico e seus inibidores. Outros exemplos incluem hormônios peptídi- cos, por exemplo, sistemina, fitossulfocina, fator de alcalinização rápida e semelhantes.
[0055] IAA é o ácido indol-3-acético, e IBA é ácido inodol-3- butírico. Ambos são formas de ocorrência natural de uma classe de hormônios vegetais chamada auxinas. Outras variações de auxina podem ser usadas, incluindo auxinas sintéticas, tais como 2,4-D (ácido 2,4-Diclorofenoxiacético) e α-NAA (ácido α naftaleno acético).
[0056] Como usado neste documento, PBZ é paclobutrazol, (2S,3S)-1-(4-clorofenil)-4,4-dimetil-2-(1,2,4-triazol-1-il)pentan-3-ol, também escrito como C15H10CIN30, um regulador de crescimento vegetal e fungicida de triazol. É um antagonista conhecido dos hormônios vegetais giberelinas que inibe a biossíntese de giberelina, reduzindo o crescimento internodal e aumentando o perímetro do caule. BAP é 6-benzilaminopurina, N-(fenilmetil)-7H-pruin-6-amina, também escrito como C12H11N5. IAA é o ácido indol-3-acético, e IBA é ácido inodol-3-butírico. Ambos são formas de ocorrência natural de uma classe de hormônios vegetais chamada auxinas. Outras variações de auxina podem ser usadas com esta invenção, incluindo auxinas sintéticas, tais como 2,4-D (ácido 2,4-Diclorofenoxiacético) e 1-NAA (ácido 1-naftaleno acético).
[0057] Como usado neste documento, uniconazol é (e)-(+/-)-beta- ((4-clorofenil) metileno)-alfa-(1,1-dimetiletil)-1h-1,2,4-triazol-1-etanol, também escrito como C15H18CIN3O, também conhecido como unico- nazol-P. É um retardador de crescimento vegetal do tipo triazol e conhecido antagonista do hormônio vegetal giberelina que reduz o crescimento internodal e aumenta o perímetro do caule.
[0058] Em geral, agentes de tratamento vegetal usados neste do cumento serão agentes solúveis em água. No entanto, o uso de agentes de tratamento vegetal com solubilidade em água alta, média, baixa ou desprezível pode ser facilitado pelo uso de composições líquidas que também compreendem vários agentes de transferência ou de condicionamento. Agentes de transferência ou de condicionamento podem compreender qualquer agente que facilite a migração de agentes de tratamento vegetal para a planta (por exemplo, células vegetais) e/ou que facilitem a captação de agentes de tratamento vegetal pela planta. Agentes de transferência ou de condicionamento incluem, mas não estão limitados a, (a) agentes surfactantes, (b) um solvente orgânico ou soluções aquosas ou misturas aquosas de solventes orgânicos, (c) agentes oxidantes, (d) ácidos, (e) bases, (f) óleos, (g), enzimas ou combinações dos mesmos. Em certas modalidades, os métodos podem incluir opcionalmente uma etapa de incubação, uma etapa de neutralização (por exemplo, para neutralizar um ácido, base ou agente oxidante, ou para inativar uma enzima), uma etapa de enxágue ou combinações das mesmas, por meio das quais o líquido e o agente de tratamento vegetal contido no mesmo é tratado antes ou depois da entrega à planta. Agentes de condicionamento ou de transferência, as-sim, incluem, mas não estão limitados a, emulsões, emulsões rever- sas, lipossomas e outras composições semelhantes a micelas. Exemplos de adjuvantes úteis incluem surfactantes e moléculas eficazes contidas no mesmo, as quais incluem sais de sódio ou lítio de ácidos graxos (tais como sebo ou aminas de sebo ou fosfolipídios). Agentes de transferência ou de condicionamento podem compreender sais, incluindo, mas não limitados a, sais de sódio, amônio, cálcio, potássio, lítio, magnésio, cloreto, sulfeto e sulfato. Certas modalidades dos métodos providos neste documento usam contra-íons ou outras moléculas que são conhecidas por se associarem com agentes de tratamento vegetal. Para certos agentes de tratamento vegetal com carga negativa, tais como polinucleotídeos, cátions, tais como íons amônio inorgânicos, íons alquilamônio, íons lítio, poliaminas, tais como espermina, espermidina, ou putrescina e semelhantes, podem ser usados. Solventes orgânicos úteis no condicionamento de uma célula vegetal à per- meação com certos agentes de tratamento vegetal, incluindo, mas não limitados a, polinucleotídeos, são solventes, tais como DMSO, DMF, piridina, N-pirrolidina, hexameti-ifosforamida, acetonitrila, dioxano, po- lipropileno glicol, ou outros solventes que são miscíveis com água. Óleos sintéticos ou naturalmente derivados com ou sem surfactantes ou emulsificantes podem ser usados, por exemplo, óleos de origem vegetal, óleos agrícolas (tais como aqueles listados no 9th Compendium of Herbicide Adjuvants, disponível publicamente na rede mundial (internet) em "herbicide.adjuvants.com") podem ser usados. Óleos úteis em certas composições líquidas usadas nos métodos providos neste documento incluem, mas não estão limitados a, óleos parafíni- cos, poliol ésteres de ácidos graxos, ou óleos com moléculas de cadeia curta modificadas com amidas ou poliaminas, tais como polietile- noimina ou N-pirrolidina.
[0059] Em certas modalidades, um agente de tratamento vegetal é um agente de duplicação de cromossomos. Agentes de duplicação de cromossomos são usados para gerar células vegetais duplo haploides e plantas duplo haploides. Agentes de duplicação de cromossomos podem compreender vários inibidores mitóticos que causam a duplicação de cromossomos. Em certas modalidades, o agente de duplicação de cromossomos pode ser um composto tal como colchicina, amipro- fos metil, trifluralina, orizalina, pronamida, ou cloroprofam. Em certas modalidades, o agente de duplicação de cromossomos pode ser um agente de duplicação de cromossomos de baixa toxicidade a mamíferos. Agentes de duplicação de cromossomos de baixa toxicidade a mamíferos que podem ser usados incluem, mas não estão limitados a, compostos tais como: i) 1,2,3-trimetoxi-4-((1S,6R)-6-nitro-ciclohex-3- enil)-benzeno e outros compostos relacionados divulgados na Publicação de Pedido de Patente US 2010/0169999; e ii) compostos divulgados na Patente No. US 5.866.513 para Michelotti et al. A Publicação de Pedido de Patente US 2010/0169999 e a Pat. No. US 5.866.513 são incorporadas neste documento por referência na sua totalidade. Em particular, os 76 compostos divulgados na Tabela I e 1a nas colunas 3-4, 5-6, e 7-8 da Patente No. US 5.866.513 são, cada um, incorporados neste documento por referência. Em certas modalidades, o agente de duplicação de cromossomos é um polinucleotídeo.
[0060] Em certas modalidades, uma ampla gama de concentra ções de substâncias químicas e cronogramas de dosagem pode ser usada em conjunto com esses métodos e alguém ordinariamente versado na técnica pode otimizar a dose administrada a um dado genóti- po a fim de maximizar a formação de espiga codominante e/ou maximizar a divisão e/ou fertilização entre espigas codominantes.
Tipos de plantas
[0061] A menos que especificado de outra forma, esta divulgação não é limitada a qualquer tipo particular de planta monocotiledônea. Por exemplo, em certas modalidades, a planta monocotiledônea é um membro da família Poaceae, planta de trigo, planta de milho, planta de milho doce, planta de arroz, planta de arroz selvagem, planta de cevada, centeio, planta de painço, planta de sorgo, planta de cana-de- açúcar, planta de relva (turfgrass), planta de bambu, planta de aveia, planta do gênero Bromus, planta do gênero Miscanthus, planta de cortadeira selloana, planta do gênero Panicum e planta do gênero Teosin- tos ou é um membro da família Alliaceae, planta de cebola, planta de alho-poró, planta de alho.
[0062] A menos que especificado de outra forma, como usado neste documento, uma planta pode ser qualquer planta monocotiledô- nea inteira, ou parte de uma planta monocotiledônea, ou cultura de tecido derivado de uma planta monocotiledônea, ou semente da planta monocotiledônea; com um tecido ao qual um agente de tratamento vegetal pode ser entregue. Uma planta pode ser de vários conteúdos cromossômicos, tais como haploide, diploide, triploide, tetraploide, etc. Poliploidia se refere geralmente a uma condição de ter um nível de ploidia superior a triploide. Em certas modalidades, é feita uma distinção entre os tecidos vegetais cultivados em cultura de tecidos e plantas de cultivo não tecido.
[0063] A menos que especificado de outra forma, como usado neste documento, a superfície de uma planta se refere à superfície que está geralmente exposta ao ambiente externo em torno da planta, sem puxar, cortar, etc. a planta para expor áreas adicionais. Por exemplo, se uma planta estiver completamente submersa em uma solução, a superfície da planta é geralmente a porção da planta que iria entrar em contato com a solução.
[0064] Um tecido vegetal pode ser qualquer tecido vegetal. Em certas modalidades, um tecido vegetal pode incluir um meristema funcional ou agrupamento de células capazes de formar um meristema funcional. Um meristema funcional é definido como um centro de célu- las pluripotentes que tem a capacidade de dar origem a novos tecidos ou órgãos da planta. Em certas modalidades, o tecido vegetal é um tecido de meristema, tal como um meristema apical de raiz ou um me- ristema apical de broto.
[0065] Em certas modalidades, um agente de tratamento vegetal é entregue a um tecido vegetal alvo ou selecionado. Um tecido vegetal pode ser almejado ou selecionado com base na resposta do tecido ao agente de tratamento vegetal e/ou na influência sobre o crescimento, características, genética, rendimento, etc. da planta que se deseja atingir. Por exemplo, o meristema apical de broto, particularmente de uma planta DH0 , pode ser selecionado para a entrega de um agente de duplicação de cromossomos. O tecido selecionado pode estar localizado na superfície da planta e/ou pode estar localizado abaixo da superfície da planta ou abaixo de uma porção da superfície da planta. Assim, em certas modalidades, em que até mesmo toda a superfície de uma planta é contatada com uma solução compreendendo um agente de tratamento vegetal, tal como submergindo completamente a planta, pelo menos uma porção do tecido selecionado pode não ser contatada pela solução.
[0066] Em certas modalidades, antes da germinação, a planta ou um propágulo da planta é contatado com um agente de tratamento vegetal a fim de entregar o agente de tratamento a pelo menos um tecido selecionado da planta. Em certas modalidades, técnicas de resgate de embriões conhecidas na técnica são usadas para excisar um embrião da semente antes da germinação da semente, a fim de melhor contatar o embrião com o agente de tratamento. Após a excisão, o embrião pode ser cultivado in vitro ou cultivado de outra forma em condições que promovam a sua sobrevivência e desenvolvimento em uma muda. Assim, a entrega de um agente de tratamento vegetal a tecidos selecionados de uma planta antes da germinação pode ser melhorada usando uma variedade de técnicas atualmente conhecidas na técnica, incluindo técnicas de resgate de embriões, permitindo, desse modo, que o embrião seja contatado pelo agente de tratamento vegetal. Em certas modalidades, esses métodos são usados para entregar um agente de duplicação a um meristema de um embrião haploide a fim de criar pelo menos um tecido reprodutivo duplo haploide capaz de produzir gametas funcionais haploides.
[0067] Uma planta monocotiledônea para uso nos métodos descri tos neste documento pode estar em qualquer um dentre vários estágios de desenvolvimento. Por exemplo, plantas de milho podem ser descritas pelos seus estágios de crescimento vegetativo e reprodução ,e como usado neste documento, os estágios de desenvolvimento de grãos de milho (método Leaf Collar: V1-Vn, Vt, R1-R6, etc.) são tal como descrito em Abendroth, L.J., R.W. Elmore, M.J. Boyer, e S.K. Marlay, 2011, Corn Growth and Development, PMR 1009, Iowa State University Extension, Ames, Iowa.
[0068] Em certas modalidades, a planta monocotiledônea é uma planta de milho. Em certas modalidades, a planta monocotiledônea é uma planta de milho e o tecido vegetal é um meristema. Em certas modalidades, a planta monocotiledônea é uma planta de milho e o tecido vegetal é um meristema apical de broto (SAM). Em certas modalidades, a planta monocotiledônea é uma planta de milho, o tecido vegetal compreende um meristema apical de broto e a planta de milho está dentro da semente ou germinando ou entre os estágios VE, V1, V2, V3, V4, V5, V6, V7, V8, V9, V10, V11 ou V12 de crescimento ve- getativo. Em certas modalidades, a planta monocotiledônea é uma planta de milho haploide, o tecido vegetal compreende um meristema apical de broto, a planta de milho está dentro da semente ou germinando ou em ou entre os estágios E, V1, V2, V3, V4, V5, V6, V7, V8, V9, V10, V11 ou V12 de crescimento vegetativo.
[0069] Métodos descritos neste documento não são restritos a cer tos estágios do desenvolvimento de uma planta. Prevê-se que técnicas de prolongamento ou modificação de outra forma da duração dos estádios de crescimento possam ser usadas em conjunto com esta invenção para expandir as opções de um usuário sobre quando aplicar um PGR para induzir o desenvolvimento de meristemas adicionais e/ou brotos axilares e/ou espigas codominantes.
Métodos para Produzir Plantas Duplo Haploides
[0070] Certas modalidades descritas neste documento proveem soluções para um problema que aqueles versados na técnica têm lutado para resolver por décadas. Esse problema é como garantir que substancialmente qualquer planta DH0 duplicada produzirá um número desejado de sementes DH1 em uma única geração. Em certas modalidades, a probabilidade de recuperar pelo menos um número mínimo de sementes DH1 de uma planta DH0 (por exemplo, pelo menos uma semente DH1, pelo menos quatro sementes DH1, pelo menos vinte sementes DH1, etc.) pode ser melhorada através da indução ou promoção do desenvolvimento, em uma planta DH0, de pelo menos um gomo axilar adicional. Esse processo pode ser repetido com outros gomos axiais, simultaneamente e/ou sequencialmente, até que um número alvo de sementes seja gerado. Ao combinar as sementes produzidas por pelo menos um gomo axilar com as sementes produzidas por pelo menos um outro gomo axilar, e/ou a semente produzida pelo gomo primário de uma planta DH0 mãe, esses métodos podem melhorar a probabilidade de recuperar dezenas, centenas ou até mesmo milhares de sementes DH1 de uma única planta DH0.
[0071] Protocolos de duplicação de cromossomos à base de col- chicina geralmente sugerem exposições de vários minutos a várias horas e confiam na esperança de que, durante esse tempo, não só a colchicina contate especificamente as células do meristema apical do broto, que dará origem a órgãos reprodutivos, mas também que o contato ocorra durante os períodos específicos do ciclo celular necessários para que a duplicação de cromossomos ocorra. As incertezas disso se traduzem nos problemas de baixa previsibilidade e eficácia de duplicação de milho que os criadores de plantas têm lutado para resolver por muitos anos.
[0072] Em certas modalidades, a imprevisibilidade dos métodos de DH atuais pode ser diminuída através do aumento do número de chances que cada planta de milho DH0 mãe individual tem de satisfazer as condições necessárias para produzir uma inflorescência duplo haploide. Verificou-se que uma única planta de milho haploide agora pode ser induzida a produzir um número alvo de descendentes DH1 com maior frequência e confiabilidade. Plantas haploides podem ser induzidas a formar múltiplos meristemas axilares em estruturas férteis portadoras de frutos para produzir maiores números de sementes DH1 em comparação com plantas controle que não foram induzidas de tal maneira.
[0073] Plantas monocotiledôneas haploides que são usadas para obter plantas, sementes e/ou células duplo haploides podem ser adquiridas por qualquer método. Em certas modalidades, plantas de milho haploides ou as espigas haploides derivadas delas podem ser obtidas através do cruzamento de uma linhagem indutora (macho) com uma linhagem desejada (como fêmea) para induzir a formação de células vegetais haploides na linhagem fêmea. Exemplos de linhagens para milho incluem, mas não estão limitados a, Stock 6, RWS, KEMS, Indutor Haploide Krasnodar (KHI), KMS ou ZMS, linhagens que compreendem uma mutação de gametófito indeterminado (ig) e derivadas das mesmas. Em outras modalidades, grandes cruzamentos de hibri- dização podem ser usados para produzir haploides. Exemplos de descrições de grandes cruzamentos de hibridização podem ser encontra- dos em Kasha e Kao, 1970, Nature 225:874-876. Qualquer outro método de indução haploide também pode ser usado com esses métodos, incluindo abordagens moleculares ou à base de transgênicos, por exemplo, aquelas envolvendo alterações CENH3 ou outros métodos à base de degradação do genoma.
[0074] Certas modalidades proveem métodos de obtenção de uma célula vegetal de milho duplo haploide, o método compreendendo contatar uma planta de milho com uma solução que compreende um agente de tratamento vegetal, em que o agente de tratamento vegetal é um agente de duplicação de cromossomos, e permitir que o agente de duplicação cause a formação de pelo menos uma célula vegetal duplo haploide. Também são providos neste documento métodos de obtenção de uma célula vegetal de milho duplo haploide, o método compreendendo colher uma célula vegetal duplo haploide de uma semente que compreende uma célula vegetal duplo haploide. Em certas modalidades, a semente está na espiga do milho uma vez que a célula vegetal é colhida da semente.
[0075] Certas modalidades também proveem métodos para a ob tenção de uma planta de milho de duplo haploide, o método compre-endendo: obter um embrião de milho duplo haploide derivado de qualquer um dos métodos providos neste documento e fornecer nutrientes suficientes ao embrião para permitir o desenvolvimento do embrião na semente da planta de milho duplo haploide. Um embrião de milho duplo haploide pode ser formado por métodos compreendendo realizar qualquer um dos métodos de fornecimento de uma solução mencionados acima compreendendo um agente de tratamento vegetal no meris- tema apical do broto, em que o agente de tratamento vegetal é um agente de duplicação de cromossomos, e permitir que o agente de duplicação induza a duplicação de cromossomos.
[0076] Em certas modalidades desses métodos, a célula vegetal de milho duplo haploide é obtida de uma terceira parte. Em outras palavras, a parte que causou a formação da célula vegetal de milho duplo haploide não é necessariamente a parte que fornece os nutrientes para permitir o desenvolvimento da célula vegetal na planta de milho duplo haploide.
[0077] Também são providos neste documento métodos de obten ção de uma semente que compreende uma célula vegetal de milho duplo haploide, o método compreendendo colher uma semente compreendendo uma célula vegetal duplo haploide obtida pelos métodos de obtenção de uma célula vegetal de milho duplo haploide. Uma célula vegetal de milho duplo haploide pode ser obtida por métodos compreendendo desempenhar qualquer um dos métodos mencionados acima para entregar uma solução compreendendo um agente de tratamento vegetal na planta, em que o agente de tratamento vegetal é um agente de duplicação de cromossomos, e permitir que o agente de duplicação induz a formação de pelo menos uma célula vegetal duplo haploide em pelo menos uma das sementes. Em certas modalidades, a semente colhida é uma semente fisiologicamente madura.
[0078] Também são providos neste documento métodos de obten ção de uma planta de milho duplo haploide, o método compreendendo semear uma semente compreendendo uma célula vegetal de milho duplo haploide obtida pelos métodos de obtenção de uma semente compreendendo uma célula vegetal de milho duplo haploide, e permitir que a semente semeada se desenvolva na planta de milho duplo ha- ploide. Em certas modalidades, a semente que compreende a célula vegetal de milho duplo haploide é obtida a partir de uma terceira parte. Em outras palavras, a parte que colheu a semente não é necessariamente a parte que semeou a semente compreendendo a célula vegetal duplo haploide e permitiu que a semente semeada se desenvolvesse na planta de milho duplo haploide.
[0079] Em certas modalidades, células vegetais duplo haploides podem ser obtidas através da colheita de sementes DH1 de uma espiga de milho DH que se forma em uma planta DH0 tratada com um agente de duplicação de cromossomos pelos métodos providos neste documento. Sementes DH1 fisiologicamente maduras derivadas da espiga DH na planta DH0 mãe podem ser colhidas para obter uma célula vegetal duplo haploide que está contida na semente. Sementes DH1 fisiologicamente maduras da espiga DH tratada da planta DH0 também podem ser semeadas e germinadas para obter uma planta de milho duplo haploide.
[0080] Em certas modalidades, uma célula vegetal haploide pode ser recuperada a partir de uma espiga de milho tratada com um agente de duplicação de cromossomos através do resgate de uma célula vegetal de um grão na espiga. O resgate de células vegetais pode ser desempenhado através da remoção de uma célula vegetal tratada de uma espiga, colocação da célula vegetal em meio que proveja o desenvolvimento de células vegetais e/ou da planta, e permissão que o desenvolvimento de células vegetais e/ou plantas ocorra. Em certas modalidades, um meio que provê o desenvolvimento de células vegetais e/ou plantas pode incluir um ou mais fito-hormônios, sais e/ou açúcares. Vários meios e técnicas para o resgate de células vegetais são descritos em Matthys-Rochon, et al., Journal of Experimental Botany, Vol. 49, No. 322, pp. 839-845, 1998.
[0081] Esses métodos podem ser ajustados para uma ampla gama de parâmetros a fim de maximizar a divisão entre as espigas codomi- nantes de substancialmente qualquer genótipo de plantas. Alguém ordinariamente versado na técnica pode ajustar esses métodos para qualquer número de variáveis conhecidas por afetar o desenvolvimento da planta em conjunto com esses métodos, incluindo a alteração da densidade da plantação, dosagem, métodos de tratamento químico ou tempo para melhorar a divisão e/ou fertilização e/ou produção de sementes em uma gama diversificada de genótipos ou germoplasmas de plantas. Em certas modalidades, as plantas podem ser plantadas em diferentes densidades para afetar a formação de espigas codominan- tes. Em certas modalidades, as plantas podem ser tratadas com pelo menos um dos muitos agentes químicos possíveis (por exemplo, agentes que afetam a formação de espiga, como inibidores de GA), usando pelo menos um dos muitos níveis de dosagem possíveis para otimizar a formação e divisão entre pelo menos duas espigas codominantes em substancialmente qualquer genótipo ou conjunto de genótipos. Em algumas modalidades, algum outro tratamento conhecido na técnica por afetar o desenvolvimento da planta pode ser provido a fim de otimizar a formação de espiga codominante. Em algumas modalidades, uma combinação dos anteriores pode ser usada para otimizar a formação de espigas codominantes. Em algumas modalidades, diferentes tratamentos podem ser usados em diferentes genótipos, a fim de otimizar a formação global de espigas codominantes.
Reprodução de plantas
[0082] Os métodos providos neste documento podem ser usados para aumentar a eficácia da reprodução de plantas em monocotiledô- neas através do aumento do número de descendentes recombinantes que uma dada planta mãe produz em uma única geração. Essa realização tem aplicações dramáticas e amplas para a reprodução de plantas, uma vez que ela aumenta a probabilidade de que uma única planta monocotiledônea produzirá uma prole que contenha uma combinação estatisticamente improvável, porém, superior de elementos genéticos. Um criador de plantas que empregue esses métodos para integrar certas sequências de DNA, genótipos e/ou traços fenotípicos em um germoplasma e/ou genoma alvo será capaz de criar um gameta contendo uma sequência de DNA compreendendo um conjunto específico de elementos genéticos usando menos plantas mãe e usando menos recursos do que um criador que use os métodos atuais conhecidos na técnica. Isso se deve, em parte, ao fato de que os métodos descritos neste documento efetivamente possibilitam que um usuário induza plantas mãe a produzir mais sementes por planta, o que equivale a mais meioses por planta, o que equivale a mais oportunidades por planta de que uma recombinação genética desejada ocorra. Mais oportunidades de recombinação por planta, portanto, se traduz em menos plantas (e menos recursos) necessárias para alcançar um tamanho de população eficaz necessário para atingir uma alta probabilidade de recuperar pelo menos uma planta com uma combinação desejada de elementos genéticos.
[0083] Por exemplo, quando criadores de plantas usam seleção recorrente para introgressar um elemento genético desejado em um germoplasma alvo, eles dependem que a recombinação genética ocorra entre os cromossomos homólogos do germoplasma alvo e o ger- moplasma doador in loci dos genomas que flanqueiam o locus genético desejado. Um usuário desses métodos terá uma maior probabilidade de gerar uma planta mãe com um genoma que compreenda o ger- moplasma alvo modificado somente pela(s) sequência(s) do genoma doador necessárias para conferir o elemento genético desejado, pois esses métodos geram mais eventos de recombinação por planta mãe e, assim, um usuário terá maior probabilidade de criar uma planta contendo o arranjo desejado de elementos genéticos incorporados em seu genoma do que um usuário de outros métodos de integração de traços.
[0084] Os benefícios disso se tornam ainda mais evidentes ao ten tar introgressar múltiplos elementos genéticos em um germoplasma alvo, pois o número de eventos de recombinação genética necessários para introgressar elementos genéticos adicionais em um germoplasma alvo aumenta rapidamente com o número de elementos genéticos adicionais que se desejam introgressar. Um usuário desses métodos descobrirá que eles necessitam de muito menos plantas mãe para atingir uma alta probabilidade de recuperar o(s) evento(s) de introgres- são desejado(s) e, assim, podem aumentar drasticamente a eficácia de criar um arranjo desejado de elementos genéticos em um gameta em comparação com alguém que usa métodos atuais na técnica que ignoram gomos axilares e/ou não induzem deliberadamente os gomos axilares a produzir frutos.
[0085] Essa realização é especialmente útil em espécies monoco- tiledôneas inflorescentes, por exemplo, milho, porque cada vez que uma inflorescência adicional é induzida a formar uma espiga inteira de óvulos em potencial (em média 500 grãos ou mais para a maioria dos híbridos de alto rendimento), cada uma representando uma oportunidade para que as recombinações genéticas necessárias ocorram durante a meiose. Assim, um criador ordinariamente versado na técnica pode usar esses métodos para aumentar dramaticamente a eficácia de criar um arranjo desejado de elementos genéticos em um gameta em comparação com alguém que usa métodos atuais na técnica que ignoram gomos axilares ou não os induza deliberadamente a formar e produzir frutas.
[0086] Esses métodos podem ser combinados com qualquer mé todo de prolongamento de divisão, prolongamento do espalhamento de pólen ou prolongamento do período durante o qual as espigas estão receptivas à polinização e fertilização que são conhecidos na técnica. Por exemplo, uma bandeira pode ser submetida a um tratamento que prolonga o período durante o qual a bandeira espalha pólen. O pólen T que é espalhado pode ser preservado a fim de ampliar o período de tempo que ele é capaz de polinização bem-sucedida e subsequente fertilização. Outros métodos conhecidos por melhorar ou es- tender a divisão também podem ser empregados.
[0087] Em certas modalidades, os tratamentos de indução de go mos axilares podem ser aplicados nos estágios de crescimento VE, V1, V2, V3, V4, V5, V6, V7, V8, V9, V10, V11 ou V12, ou qualquer combinação dos mesmos.
Multigomos
[0088] Um tipo de gomo axilar induzido é um "multigomos", que é derivado através da indução de uma planta a formar um gomo axilar de novo a partir de células diferenciadas. Este método reprograma efetivamente uma ou mais células de uma planta para produzir um meris- tema, broto ou gomo axilar de novo.
[0089] Em certas modalidades, uma muda monocotiledônea ou um embrião de planta monocotiledônea pode ser submetida à indução de gomos axilares enquanto ainda está fixada à semente (abordagem de semente direta) ou a muda/embrião pode ser dissecada da semente antes da germinação (método de embrião dissecado) ou a mu- da/embrião pode ser separada da semente após a germinação (método do eixo embrionário).
[0090] É divulgada neste documento a constatação de vários no vos usos para multigomos em monocotiledôneas, incluindo a melhora da eficácia de duplicação ("DH"), garantindo-se que um número alvo de sementes seja gerado a partir de um cruzamento ou autopoliniza- ção. Em certas modalidades, um usuário que deseje garantir que pelo menos um número mínimo de sementes seja gerado em uma única geração por uma planta DH0 induz a planta DH0 a formar pelo menos um multigomos duplo haploide. Em certas modalidades, pelo menos um desses multigomos é cultivado em uma planta haploide madura que é autopolinizada para produzir uma semente DH1. Esse processo pode ser repetido, simultaneamente e/ou sequencialmente, até que o número alvo de sementes seja gerado.
[0091] Em certas modalidades, esses métodos podem primeira mente aumentar o número de sementes duplo haploides recuperadas através da indução de uma planta precursora diploide para produzir pelo menos dois multigomos diploides que são então cultivados em plantas diploides maduras. Essas plantas precursoras derivadas de multigomos podem então ser polinizadas com um indutor para formar pelo menos uma semente haploide, a qual pode ser subsequentemente cultivada em mudas e submetida a técnicas de duplicação de cromossomos conhecidas na técnica para converter os haploides em uma população de plantas DH0. As plantas DH0 podem, então, ser cultivadas até produzir flores, e então polinizadas para produzir sementes DH1.
[0092] Em certas modalidades, uma única planta diploide pode ser submetida a um tratamento de indução multigomos para gerar vários multigomos diploides. Esses multigomos podem ser separados da planta mãe e cultivados até produzir flores, momento em que eles podem ser polinizados por um indutor. Mesmo se algumas espigas derivadas de multigomos produzirem muito poucas ou nenhuma semente, espera-se que esse método possa ser repetido, sequencialmente ou simultaneamente, até que um número alvo de sementes seja gerado quando todas as sementes de espigas derivadas de multigomos forem combinadas. Tantas dessas plantas haploides quanto necessário podem ser submetidas à duplicação de cromossomos para produzir um número desejado de plantas DH.
[0093] As sementes haploides recuperadas e reunidas de pelo menos uma espiga induzida por multigomos podem ser submetidas a quaisquer tipos de análises que o usuário considere apropriado a fim de determinar quais sementes contêm traços específicos. Essas análises podem incluir a triagem das sementes (incluindo os embriões e todos os outros tecidos da semente) para identificar e separar as se- mentes diploides, incluindo os métodos de triagem haploide descritos no pedido de patente US 14/206.238 que foi publicado como US20140266196A1 e que é incorporado por referência neste documento em sua totalidade. As análises também podem incluir a genoti- pagem de tecidos usando métodos conhecidos na técnica. Independentemente de como as sementes haploides são analisadas, um subconjunto da população pode ser selecionado com base em qualquer critério a fim de limitar o número de plantas que são submetidas a etapas de duplicação subsequentes. Assim, esses métodos podem reduzir a quantidade de recursos gastos duplicando plantas que não satisfazem um limite de seleção alvo.
[0094] Ao contrário de métodos atuais de produção de plantas DH, um usuário desses métodos não depende somente de uma única chance de dobrar as células necessárias para produzir uma espiga contendo pelo menos o número alvo de óvulos haploides. Ao invés disso, o usuário é capaz de produzir múltiplas espigas a partir de uma única planta DH0 e, assim, combina múltiplas oportunidades de duplicação para atingir um número alvo de óvulos haploides.
Rebentos
[0095] Rebentos são um tipo de gomo axilar. A indução de reben tos em monocotiledôneas relaxa a supressão, inibindo o desenvolvimento de um gomo axilar, de forma que o gomo axilar seja capaz de formar um broto lateral alongado que, em última análise, produz uma bandeira e pelo menos uma flor feminina conhecida como uma espiga. Embora conhecidos por se formarem espontaneamente, a formação de rebentos é um traço indesejável que é eliminado de programas de reprodução de milho por inúmeros motivos, incluindo o fato de que eles tornam a preservação da identidade de plantas vizinhas mais difícil e aumentam a probabilidade de sementes contaminantes de forma cruzada de diferentes tratamentos experimentais. Eles também ten- dem a sobrecarregar a área normalmente reservada para uma planta individual, o que prejudica os cronogramas de plantio, torna o acesso humano e de máquinas mais difícil e prejudica a manutenção eficaz do campo, o cultivo e a colheita. Além disso, rebentos competem com a planta mãe (isto é, o caule principal a partir do qual os rebentos foram derivados) por recursos próximos, reduzindo a precisão das avaliações fenotípicas e o rendimento global por unidade de acre. Por essas e outras razões, os rebentos são geralmente eliminados tanto de gráficos de pesquisa quanto de operações comerciais.
[0096] Constatou-se, no entanto, que, ao submeter uma planta de milho a um tratamento de indução de gomos axilares em momentos específicos no ciclo de vida da planta, é possível gerar vários brotos de rebentos de uma única planta mãe que produzem espigas que se dividem bem com as bandeiras do mesmo broto e produzem um excelente conjunto de sementes quando polinizadas. Assim, esses métodos podem aumentar a chance de recuperar um número alvo de sementes produzidas por uma única planta de milho, induzindo-a a formar rebentos, permitindo que esses rebentos produzam suas próprias espigas e então colhendo as sementes de pelo menos uma das espigas produzidas por pelo menos um dos rebentos. Ao combinar as sementes produzidas por pelo menos um rebento com as sementes produzidas por pelo menos um outro rebento e/ou a semente produzida pela planta mãe, esses métodos podem aumentar a chance de recuperar dezenas, centenas ou até mesmo milhares de sementes de uma única planta.
[0097] Em certas modalidades, um método compreende induzir uma planta DH0 para formar pelo menos um rebento duplo haploide. Pelo menos um desses rebentos é cultivado em uma planta haploide madura que é autopolinizada para produzir sementes DH1. Esse processo pode ser repetido, simultaneamente e/ou sequencialmente, até que um número alvo de sementes seja gerado. Ao combinar as sementes produzidas por pelo menos um rebento com as sementes produzidas por pelo menos um outro rebento e/ou a semente produzida pela planta mãe DH0, esses métodos podem aumentar a chance de recuperar dezenas, centenas ou até mesmo milhares de sementes de uma única planta DH0.
[0098] Ao contrário de métodos atuais de produção de plantas DH, esses métodos não são limitados a uma única chance de dobrar as células necessárias para produzir uma espiga ou bandeira contendo pelo menos o número alvo de óvulos ou pólen haploide. Ao invés disso, eles produzem múltiplas espigas e bandeiras a partir de uma única planta DH0, combinando, assim, múltiplas oportunidades de duplicação para produzir uma espiga contendo pelo menos o número alvo de óvulos e pólen haploide e, subsequentemente à polinização e fertilização, o número alvo de sementes DH1.
Espigas codominantes
[0099] Certas modalidades proveem a produção de espigas co- dominantes. Em certas modalidades, o desenvolvimento de espigas codominantes é coordenado de forma tal que pelo menos duas espigas codominantes sejam receptivas à polinização em um momento que se sobrepõe com pólen espalhado a partir de bandeiras da mesma planta. Em certas modalidades, o desenvolvimento de espigas co- dominantes é coordenado de forma tal que pelo menos duas espigas codominantes sejam receptivas à polinização em um momento que se sobrepõe com pólen espalhado a partir de outro germoplasma desejado.
[00100] Certas modalidades compreendem submeter uma planta a um tratamento de indução de gomo axilar em momentos específicos no ciclo de vida de uma planta. É possível gerar pelo menos duas espigas codominantes em uma única planta cujo desenvolvimento é co- ordenado de forma tal que as espigas se dividem bem e produzem um excelente conjunto de sementes quando polinizadas. Esses métodos podem aumentar a recuperação de um número alvo de sementes da prole de uma única planta precursora através da indução da planta primária para formar múltiplas espigas codominantes que são todas receptivas à polinização em períodos de desenvolvimento sobrepostos.
[00101] Em certas modalidades, as sementes são geradas em uma única geração por uma planta DH0 através de indução da planta DH0 para formar pelo menos duas espigas codominantes depois do tratamento de duplicação. Ao contrário de métodos convencionais de produção de plantas DH, esses métodos não dependem somente de uma única chance de duplicar as células necessárias para produzir uma espiga contendo pelo menos o número alvo de óvulos haploides. Ao invés disso, várias espigas são produzidas a partir de uma única planta DH0, combinando, assim múltiplas oportunidades de duplicação para produzir pelo menos o número alvo de gametas haploides, e subsequentemente à polinização e fertilização, por exemplo, para produzir o número alvo de sementes DH1.
[00102] Uma observação inesperada tem um impacto considerável na produção de DH. Uma vez que uma planta DH0 é tratada com um agente de indução, não é inteiramente previsível qual espiga da planta DH0 produzirá o maior número de sementes DH1. Em alguns casos, a segunda e/ou terceira espiga teve um melhor conjunto de sementes do que a primeira espiga. Em alguns casos, a primeira espiga produziu poucas sementes ou nenhuma semente, enquanto a segunda e/ou a terceira espiga produziu sementes abundantes.
[00103] Além disso, resultados representativos descritos neste documento revelam que é estocástico qual espiga tem o maior potencial de duplicação. Demonstrou-se que não é previsível quais meristemas axilares ao longo do broto são mais prováveis de serem duplicados por um tratamento de duplicação de cromossomos, até mesmo entre os membros estreitamente relacionados de uma linhagem consanguínea.
[00104] Em casos onde tantas espigas codominantes se formaram na planta mãe que não existem recursos suficientes para suportar completamente o seu desenvolvimento, as espigas poderão ser cultivadas separadamente, por exemplo, in vitro, em vasos separados, ou de qualquer outra forma conhecida na técnica.
[00105] Em certas modalidades, o tratamento de indução de espiga codominante compreende aplicar um agente de tratamento vegetal a uma planta. Em certas modalidades, o agente de tratamento vegetal é um hormônio vegetal ou combinação de hormônios vegetais. Em certas modalidades, o tratamento de indução de espiga codominante compreende aplicar um inibidor de ácido giberélico, tal como PBZ, uni- conazol, clormequat-CL, mepiquat-CL, AMO-1618, clorfônio-Cl, tetcila- cis, ancimidol, flurprimidol, paclobutrazol, uniconazol-P, inabenfido, pro-hexadiona-CA, trinexapac-etila, daminozida, exo-16,17- ou di- hidro-GA5-13-acetato ou uma combinação de quaisquer agentes de tratamento vegetal, por exemplo, uma combinação de inibidor de GA com citocinina.
[00106] Em certas modalidades, as espigas codominantes são formadas em diferentes brotos. Por exemplo, um usuário pode tratar um caule principal (ou seja, a planta mãe) com um agente de tratamento vegetal para fazer com que o caule principal forme pelo menos um rebento. O usuário organiza o tratamento para coordenar o desenvolvimento de uma espiga no rebento (isto é, uma espiga de rebento) e uma espiga na planta mãe, de forma tal que ambas as espigas produzam sedas e sejam receptivas à polinização em um período de desenvolvimento substancialmente sobreposto. Em certas modalidades, o usuário trata uma planta mãe para formar pelo menos dois rebentos e organiza os tratamentos a fim de coordenar o desenvolvimento de pelo menos duas espigas de rebentos que crescem a partir de diferentes rebentos, de forma que as pelo menos duas espigas de rebento produzam sedas receptivas à polinização durante um período de desenvolvimento substancialmente sobreposto. Assim, os métodos que envolvem rebentos e métodos que envolvem espigas codominantes não são mutuamente exclusivos; é possível incorporar ambos os tipos de métodos de formação de gomos axilares para atingir resultados melhorados em certas situações.
[00107] Entende-se que, para quaisquer dos métodos descritos neste documento, o método pode incluir adicionalmente a seleção de plantas, por exemplo, com base em atributos desejados, tais como número de rebentos, número de espigas codominantes, eficácia de duplicação, etc.
Exemplos
[00108] Os exemplos a seguir são incluídos para demonstrar certas modalidades da invenção. Deve-se apreciar por aqueles versados na técnica que as técnicas divulgadas nos exemplos a seguir representam técnicas verificadas pelos inventores por funcionar bem na prática da invenção. No entanto, aqueles versados na técnica devem, à luz da presente divulgação, apreciar que muitas mudanças podem ser feitas nas modalidades específicas que são divulgadas e ainda obter um resultado igual ou semelhante, sem se afastar do espírito e do escopo da invenção.
[00109] Nos exemplos a seguir, sementes de milho haploides foram obtidas pela polinização de fêmeas F1 ou F2 contendo a genética desejada com pólen de uma linhagem de indutor haploide. Espigas foram colhidas quando as sementes estavam maduras, as espigas foram então descascadas, e então as sementes foram separadas em haploides vs. diploides. Plantas de milho haploides usadas neste documento fo- ram obtidas por polinização de plantas de milho F1 ou F2 com pólen de uma linhagem indutora haploide para formar populações de indução haploide derivadas de híbridos F1. Espigas foram colhidas quando as sementes estavam maduras, descascadas e as sementes haploi- des recuperadas por métodos convencionais da técnica.
[00110] Exemplos não limitantes de linhagens de indutores haploi- des que podem ser usadas para repetir os experimentos abaixo incluem Stock 6 (Coe 1959), RWS (Rober et al. 1005), KEMS (Deimling et al. 1997), KMS ou ZMS (Chalyk et al. 3994; Chalyk e Chebotar 1000), ou outras linhagens de indutores derivadas das mesmas. A linhagem de indutor também pode possuir pelo menos um traço marcante para facilitar a identificação da prole haploide. A pureza do pool haploide pode ser de 95% ou mais e pode ser verificada usando uma variedade de métodos conhecidos na técnica.
Exemplo 1. A fecundidade da espiga de milho pode ser manipulada para produzir múltiplas espigas por planta ao longo de diversos germoplasmas.
[00111] Mudas V1-V3 de duas linhagens de milho haploides derivadas de híbridos F1 únicos, derivadas de: grupo heterótico feminino (Germoplasma A) ou grupo heterótico masculino (Germoplasma B), foram submetidas a um tratamento de duplicação de cromossomos à base de colchicina em grupo através da remoção das mudas do solo ou do meio de crescimento no estágio de crescimento V1-V3 e alinhamento de seus caules e envolvendo-os em conjunto juntamente com várias hastes de madeira em um feixe unido por uma tira de papel alumínio (as dimensões aproximadas da tira de papel alumínio eram de 6 pol. x 18 pol.). As plantas reunidas em feixe foram submersas em uma solução de tratamento vegetal compreendendo 1250 ppm de col- chicina em um recipiente de centrífuga, e então toda a amostra foi centrifugada a 50 g por 3 min enquanto os meristemas apicais de broto (SAM) permaneceram submersos na solução do agente de tratamento vegetal.
[00112] Após a primeira centrifugação, a solução de tratamento vegetal foi decantada e as mudas submetidas a uma centrifugação adicional a 335 g por 3 min. Durante a segunda centrifugação, o feixe embrulhado por hastes apoiou as mudas e impediu que os SAMs contatassem com o agente de tratamento reserva que não foi absorvido pela planta durante a aplicação da força centrífuga.
[00113] Após a segunda centrifugação, as plantas foram removidas do recipiente de centrifugação e o feixe embrulhado com haste enxaguado com água para remover qualquer solução restante de colchici- na, e então recuperado e colocado em uma estufa clara, úmida e com temperatura controlada por vários dias antes de ser transplantado para um viveiro. Esses métodos de tratamento à base de centrifugação são descritos em mais detalhes no pedido internacional número PCT/US2015/028955, que é incorporado por referência neste documento na sua totalidade; no entanto, tratamentos de duplicação padrão também podem ser aplicados a qualquer uma das etapas de duplicação de haploides referidas neste documento.
[00114] Após o tratamento de duplicação com colchicina, foram plantadas 15-20 plantas de cada germoplasma em vasos em duas densidades diferentes; como plantas individuais por vaso (individuais), ou como duas plantas por vaso (pares).
[00115] Em seguida, cada planta recebeu uma dentre duas doses diferentes de PBZ, 50 mL (dose baixa) ou 60 mL (dose alta) de uma solução de PBZ a 2,5% (v/v; 0,4% de ingrediente ativo) em água. Essas duas doses diferentes foram aplicadas por umedecimento do solo no estágio de crescimento V7 ou V8, que ocorreu em um total de 23 ou 26 dias após as mudas terem sido submetidas ao tratamento de duplicação de cromossomos, respectivamente. Um grupo de controle de plantas não recebeu nenhuma solução de tratamento, mas foi tratado, de outra forma, exatamente como os grupos experimentais plantados como individuais. Quando o espalhamento de pólen começou nas bandeiras, o número médio de espigas produtoras de seda (isto é, espigas codominantes) foi contado para cada dosagem, germoplasma e tempo de tratamento e os resultados estão resumidos na Tabela 1. Tabela 1. O número de espigas codominantes formadas por planta em dois germoplasmas haploides induzidos únicos (A e B) após tratamentos em uma dentre duas doses diferentes de PBZ em um dentre dois estágios de desenvolvimento diferentes após o tratamento de duplicação de cromossomos.
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tV7 ocorreu 23 dias após o tratamento de duplicação de cromossomos; V8 ocorreu 26 dias após o tratamento de duplicação de cromossomos.
[00116] As plantas controle para o Germoplasma A e o Germo- plasma B produziram 1,4 EP e 1,1 EP, respectivamente.
[00117] Esses resultados revelam que esses métodos permanecem úteis entre diferentes densidades de plantação. Ambos os germoplas- mas formaram mais espigas codominantes quando indivíduos foram plantados individualmente em vasos, independentemente do tempo de tratamento. Todas as plantas do Germoplasma B pareadas produziram menos espigas do que qualquer uma das plantas do Germoplasma B individualizadas, independentemente da dosagem ou tempo de tratamento, e a população do Germoplasma B V8 com dose alta produziu mais de duas vezes suas contrapartidas duplicadas. Essa variância no efeito que a densidade de plantação tem sobre germoplasmas diferentes provê a um usuário a compreensão de que a faixa ótima de densi- dades de plantação que se pode empregar em conjunto com esses métodos pode variar de germoplasma para germoplasma. Espera-se que um usuário possa ajustar o tempo de tratamento e outras condições de crescimento ou tratamento para otimizar o uso desses métodos com germoplasmas diferentes.
[00118] Esses resultados revelam que, em todas as variáveis de dosagem, densidade e germoplasma, os tratamentos aplicados tanto em V7 quanto em V8 produzem consistentemente mais espigas co- dominantes para ambos os germoplasmas do que os controles. Assim, estes métodos não são limitados à aplicação do tratamento de indução de espiga codominante durante um ponto em particular de desenvolvimento da planta. Em uma modalidade, o tratamento de indução de espiga codominante ocorre em uma gama de tempos selecionados pelo usuário que melhora o número de sementes produzidas por uma planta haploide tratada com um agente de duplicação de cromossomos.
[00119] Os resultados revelam que esses métodos não se limitam a uso com germoplasmas ou genótipos vegetais específicos. Além disso, ambos os germoplasmas apresentaram melhoras variáveis dependendo de outras variáveis, tais como densidade de plantação, crono- gramas de tratamento, dosagens e outras variáveis. O número de espigas codominantes foi melhorado para dois genótipos drasticamente divergentes em uma gama de diferentes cronogramas de tratamento. Prevê-se que usuários usarão esses métodos com uma ampla gama de outros germoplasmas e serão capazes de ajustar parâmetros tais como a densidade de plantação, o momento do(s) tratamento(s) de indução da espiga, a dosagem de substâncias químicas usadas durante o(s) tratamento(s) de indução de espiga, e outras variáveis que afetam o desenvolvimento da espiga para maximizar a divisão entre as espigas codominantes e melhorar o número de sementes produzidas em uma dada geração.
[00120] Esses resultados revelam que o uso desses métodos não se limita a dosagens específicas de substâncias químicas que induzem a formação de espigas. Uma variedade de diferentes melhorias da espiga por planta (EP) parece correlacionar-se com a dosagem. Por um lado, a EP média de todas as plantas tratadas com a dosagem alta foi 0,31 maior do que a EP de todas as plantas tratadas com a dosagem baixa. Essa relação é ainda mais pronunciada quando somente os individuais foram considerados (a média de EP de dose alta foi 0,55 maior do que a dose baixa). Além disso, os individuais submetidos à dose baixa ainda produziram um aumento mínimo de 1,2 EP em relação às plantas controle, sugerindo que há efeitos de dosagem até mesmo fora da faixa testada neste documento que poderiam ser usados em conjunto com esses métodos.
Exemplo 2. Colher e agrupar as sementes de espigas codominan- tes melhora a recuperação de sementes DH1 em uma única geração.
[00121] Uma população de indução haploide derivada de híbrido F1 derivada de Germoplasma A de planta de milho consanguínea fêmea foi germinada no solo e colocada em condições padrão de cultivo de milho em estufa por aproximadamente sete dias. As mudas foram então submetidas a um tratamento de duplicação de cromossomos à base de colchicina em grupo como descrito acima. Após o tratamento, as mudas foram transplantadas para vasos e colocadas em uma estufa em condições padrão de cultivo de milho em estufa para se recuperarem.
[00122] Vinte e nove dias após o tratamento de duplicação com col- chicina, 77 das mudas DH0 foram submetidas a um tratamento de indução de espiga codominante compreendendo a adição de 60 mL de PBZ a 2,5% (v/v) em água, a qual foi vertida no solo ao redor das raí- zes de cada planta. As mudas foram então colocadas em condições padrão de cultivo de milho em estufa até florescerem, momento em que cada planta que produzia pólen foi autopolinizada. Após aproximadamente 3-4 semanas, as espigas foram colhidas e os grãos (sementes DH1) que se formaram nas plantas DH0 tratadas foram contados para determinar as eficácias de duplicação.
[00123] As eficácias de duplicação (DE) foram calculadas sob quatro restrições diferentes, dependendo do número mínimo de grãos que uma espiga teve que produzir a fim de até mesmo ser incluída no cálculo. DE04 representa a porção de todas as plantas DH0 duplicadas que produziram um total de pelo menos quatro sementes quando todas as espigas foram consideradas. DE20 representa a porção de todas as plantas DH0 duplicadas que produziram um total de pelo menos 20 grãos quando todas as espigas foram consideradas. De forma semelhante, DE30 representa a porção de plantas DH0 duplicadas que produziram um total de pelo menos 30 grãos quando todas as espigas foram consideradas, e DE50 representa a porção de plantas DH0 duplicadas que produziram um total de pelo menos 50 grãos quando todas as espigas foram consideradas.
[00124] Além disso, as eficácias de duplicação acima foram calculadas uma vez considerando-se somente os grãos que se formaram na espiga primária de cada planta (Espiga1), uma vez considerando-se somente os grãos que se formaram nas espigas primária e secundária de cada planta (Espiga2), uma vez considerando-se somente os grãos que se formaram nas espigas primária, secundária e terciária de cada planta (Espiga3) e, finalmente, considerando-se todos os grãos que se formaram em todas as espigas de cada planta (Espigatodas). Tabela 2. Comparação das eficácias de duplicação produzidas pela indução de espiga codominante em vários limites mínimos grãos/planta. Os subscritos representam o número mínimo de grãos que uma planta teve que produzir a fim de ser considerada no cálculo de DE.
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[00125] Esses resultados revelam que maiores eficácias de duplicação foram obtidas sempre que os grãos de espigas codominantes foram incluídos. Essa relação se torna ainda mais evidente quando as restrições de rendimento mínimo para uma espiga foram incluídas. Para DE20, DE30, e DE50, incluindo os grãos produzidos por todas as espigas em cada planta, a DE aproximadamente dobrou em relação à DE da ESPIGA1 em cada caso. Isso demonstra a utilidade desses métodos em uma ampla gama de restrições de rendimento mínimo.
[00126] Esses resultados revelam que um usuário desses métodos deve experimentar uma DE mais consistente entre uma variedade de restrições de rendimento mínimo diferentes em comparação com métodos atualmente conhecidos na técnica. Enquanto a DE da Espiga1 caiu quase metade entre a DE04 e a DE20 (de 71% para 37%), a inclusão somente de uma espiga adicional (Espiga2) resultou em somente uma redução de 22% da DE entre a DE04 e a DE20 (de 76% para 59%). Essa redução entre DE04 e DE20 foi ainda menor para a Espiga3 e a Espigatodas.
[00127] Uma vez que DE é um fator do número de espigas com um certo número de sementes recuperadas de uma planta individual em uma dada geração, um usuário desses métodos pode esperar recuperar números maiores de sementes de uma dada planta e, assim, será mais propenso a recuperar pelo menos um número mínimo de semen- tes de qualquer cruzamento em particular do que alguém que usa métodos que são atualmente conhecidos na técnica. Assim, os usuários desses métodos serão mais bem sucedidos na recuperação do número mínimo de sementes de um cruzamento em uma única geração que é necessária para testar de forma eficaz essa população para tomar decisões de avanço precisas em um programa de reprodução e colocar os produtos no mercado mais rapidamente. Um usuário desses métodos também será mais capaz de prever a DE ao longo de diferentes limites de rendimento mínimo e, assim, ser mais capaz de prever a alocação de recursos entre as populações derivadas de pelo menos um cruzamento de indução.
Exemplo 3. A indução de espigas codominantes melhora a DE de diversos germoplasmas.
[00128] Foram testadas duas populações haploides derivadas de híbridos F1 (um macho e uma fêmea) (referidas aqui como H1 e H2) e duas linhagens haploides derivadas de consanguíneos (Germoplasma macho B e Germoplasma fêmea A). Sete dias após o plantio, várias dúzias de mudas de cada grupo foram removidas do solo e submetidas a um tratamento de duplicação de cromossomos à base de colchi- cina em grupo como descrito acima. Após o tratamento de duplicação de cromossomos, as mudas foram transplantadas para o solo e colocadas em uma estufa em condições padrão de cultivo de milho. Quando as mudas alcançaram aproximadamente o estágio V7 ou V8 (aproximadamente 29 dias após a duplicação nas condições de cultivo usadas), as mudas foram submetidas a um tratamento de indução de espiga codominante compreendendo 60 mL de PBZ a 2,5% adicionado ao solo ao redor da base de cada caule.
[00129] As mudas foram então colocadas em condições padrão de cultivo de milho em estufa até florescerem, momento em que cada planta que produzia pólen foi autopolinizada e então deixada inaltera- da para aguardar a fertilização e a produção de grãos. Após aproxi-madamente 2-3 semanas, as espigas foram colhidas e os grãos que se formaram sobre eles (DH1) foram contados para determinar eficácias de duplicação.
[00130] As eficácias de duplicação (DE) foram calculadas sob as diferentes restrições descritas no exemplo anterior para gerar valores para DE04, DE20, DE30, e DE50 para cada um dos quatro genótipos. Além disso, as eficácias de duplicação acima foram calculadas uma vez considerando-se somente os grãos que se formaram na espiga primária de cada planta (Espiga1), uma vez considerando-se somente os grãos que se formaram nas espigas primária e secundária de cada planta (Espiga2), uma vez considerando-se somente os grãos que se formaram nas espigas primária, secundária e terciária de cada planta (Espiga3) e, finalmente, considerando-se todos os grãos que se formaram em todas as espigas de cada planta (Espigatodas). Tabela 3. Eficácias de duplicação de quatro germoplasmas dependendo somente de a espiga primária ter sido colhida (Espiga1) ou todas as espigas terem sido colhidas (Espigatodas).
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[00131] Tabela 3 revela que esses métod os podem ser usados com uma ampla diversidade de germoplasmas, incluindo entre linhagens consanguíneas de diferentes grupos heteróticos e entre híbridos derivados de consanguíneos de diferentes grupos heteróticos. Ela também revela que, em todos os germoplasmas e limites de rendimento mínimo, a Espigatodas ultrapassou os resultados da Espiga1, demonstrando que um usuário desses métodos pode esperar melhorar a DE através da inclusão dos grãos produzidos por todas as espigas codominantes adicionais. Esses resultados sugerem que esses métodos podem ser adaptados para uso com substancialmente qualquer genótipo ou ger- moplasma de milho.
Exemplo 4. A indução de espiga codominante combina as probabilidades de duplicação de múltiplos meristemas axilares para melhorar a DE e o estabelecimento de sementes.
[00132] Quando as espigas DH1 foram colhidas no experimento descrito no Exemplo 3, quatro plantas DH0 selecionadas aleatoriamente de cada germoplasma foram submetidas a um exame adicional, compreendendo o registro do número aproximado de sementes produzidas a partir das primeiras 3 espigas codominantes para cada planta. A Figura 1 mostra as primeiras três espigas que foram colhidas de cada uma dessas quatro plantas e essa figura também está representada na Tabela 4 abaixo. Na Tabela 4, as espigas são atribuídas a uma dentre 4 categorias, dependendo do número aproximado de sementes que elas tenham produzido: espigas Classe A produziram aproximadamente 50 sementes, espigas Classe B produziram aproximadamente 20-49 sementes, espigas Classe C produziram aproximadamente 120 sementes e espigas Classe 0 produziram zero sementes. Duas plantas falharam em produzir uma terceira espiga. Tabela 4. Espigas classificadas pelo número de sementes DH1 que produziram. "-" representa uma situação em que uma terceira espiga não foi formada pela planta. A espiga de maior rendimento para cada combinação planta-germoplasma está em negrito para facilitar as comparações.
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[00133] Esses resultados revelam a constatação de que diferentes espigas codominantes têm diferentes potenciais de duplicação. Eles também revelam o resultado de que as espigas de maior rendimento podem não ser a primeira espiga, ou nem mesmo a primeira ou a se- gunda espiga. Por exemplo, a segunda espiga rendeu a maioria das sementes na Planta 1 a partir dos germoplasmas Controle A, Germo- plasma A e Germoplasma B. Para a Planta 1 do Controle B e a Planta 3 do Germoplasma A, a terceira espiga exibiu o maior potencial de duplicação.
[00134] Esse experimento também revela o resultado de que as plantas haploides submetidas a um tratamento de indução de espiga codominante irão investir mais recursos em desenvolver espigas que tenham sido duplicadas com sucesso e que sejam capazes de produzir descendentes diploides viáveis, independentemente da posição relativa da espiga no caule. O desenvolvimento de espigas haploides que não são duplicadas e, portanto, é improvável que produzam sementes, parece ser interrompido. Por exemplo, as espigas que não produzem nenhuma semente, ou muito poucas sementes (1-4), na planta #2 e na planta #3 do germoplasma H2 parecem ter sido interrompidas enquanto a planta continuava claramente a investir recursos no desenvolvimento das espigas que realmente produziam sementes. Isso sugere que, quando o desenvolvimento de uma espiga codomi- nante induzida crescendo em uma planta DH0 é interrompido, isso se dá porque a espiga não foi duplicada e não devido à posição da espiga no caule. Assim, uma espiga induzida codominante e duplicada com sucesso que cresce a partir de um nó inferior é mais propensa a seguir o cronograma de desenvolvimento esperado de uma espiga codomi- nante do que uma espiga que cresce mais acima no caule que não seja duplicada com sucesso.
Exemplo 5. A indução da espiga codominante aumenta drasticamente a produção de sementes em diploides.
[00135] Sementes de linhagens consanguíneas de milho Germo- plasma A e LH244 foram plantadas no solo, germinadas e então transplantadas para vasos de 10 polegadas após aproximadamente uma semana, uma muda por vaso. As plantas foram submetidas a um tratamento de indução de espiga codominante no estágio V8, compreendendo umedecer o solo ao redor das raízes de cada planta com 50 mL de uma solução de PBZ a 2,5% (v/v, 0,4% de ingrediente ativo). As plantas foram colocadas em uma estufa até a maturidade sexual, então elas foram autopolinizadas. Quando o conjunto de sementes foi concluído, o número de espigas codominantes e o número total de grãos produzidos por cada planta foram contados. Plantas controle para cada germoplasma foram processadas da mesma forma que os grupos tratados, exceto que as plantas controle não foram submetidas ao tratamento de indução de espiga codominante. Tabela 5. Número médio de espigas por planta e grãos to- tais médios por planta recuperados de dois genótipos submetidos a um tratamento de indução de espiga codominante vs. um tratamento controle.
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[00136] A Tabela 5 revela o resultado de que é possível aumentar drasticamente o total médio de grãos por planta produzidos a partir de duas linhagens consanguíneas diferentes, submetendo-se as plantas a um tratamento de indução de espiga codominante. Ambos os germo- plasmas, muito diversos um do outro, responderam ao tratamento de indução de espiga codominante mais do que duplicando o total médio de grãos por planta e as espigas médias por planta. Além disso, todas as espigas registradas a partir dos grupos tratados na Tabela 5 eram codominantes.
[00137] Um exemplo representativo de uma planta de Germoplas- ma A que produziu 8 espigas após o tratamento com esses métodos é mostrado na Figura 2.
[00138] Embora as plantas controle tenham produzido múltiplas espigas, elas não produziram nenhuma espiga codominante; somente as espigas primárias nas plantas controle se dividiram bem o suficiente para produzir qualquer semente.
Exemplo 6. A indução de rebentos aumenta drasticamente a produção de sementes em diploides.
[00139] Plantas de milho diploides de uma linhagem consanguínea comum foram submetidas a um tratamento de indução de rebentos compreendendo umedecer o solo ao redor das raízes com 100 mL de uma solução de PBZ a 2,5% (v/v; 0,4% de ingrediente ativo) aproximadamente uma semana após a germinação, e então se permitiu que crescessem até a maturidade sexual em vasos de 10 polegadas em uma estufa. Um grupo controle de plantas foi cultivado em circunstâncias idênticas, exceto que elas não foram submetidas ao tratamento de indução de rebentos.
[00140] O inibidor de GA resultou em que as plantas mãe expressassem internodos encurtados e induziu as plantas mãe a produzir rebentos. Três grupos de tratamento foram então formados a partir dos rebentos: permitiu-se que rebentos do tratamento "Co-hab" continuassem crescendo no mesmo vaso com a planta mãe; aqueles do trata- mento "-Mãe" também permaneceram no mesmo vaso, mas a planta mãe foi removida do vaso; e aqueles do grupo de tratamento "Transplantado" foram transplantados do vaso contendo a planta mãe em vasos separados de 10 polegadas, uma planta por vaso. Permitiu-se que todos os rebentos de ocorrência natural produzidos pelo grupo controle crescessem no mesmo vaso que a planta mãe, de forma semelhante ao tratamento co-hab. Permitiu-se que todas as plantas crescessem até a maturidade sexual e foram autopolinizadas quando se formaram as sedas e bandeiras. Quando o conjunto de sementes estava completo, o número total médio de sementes produzidas por todas as plantas derivadas da mesma semente da planta mãe foi contado e plotado na Figura 3.
[00141] Esses resultados revelam que é possível aumentar drasticamente o total médio de sementes por planta, submetendo-se as plantas a um tratamento de indução de rebentos, evidenciado pelo grupo de tratamento transplantado que produz mais do que o dobro do número de sementes em relação ao grupo controle. Eles também revelam que a melhor recuperação de sementes ocorreu quando os rebentos foram transplantados para longe da planta mãe.
Exemplo 7. O método de indução de rebentos e duplicação de plantas haploides.
[00142] Uma planta mãe haploide será submetida a tratamento de duplicação e depois é plantada em um vaso, o solo ao redor das raízes é umedecido com 100 mL de 2,5% de paclobutrazol, e então colocada em condições padrão de cultivo de milho em estufa por vários dias. O inibidor de GA resultará em a planta mãe expressar internodos encurtados e em aumento da produção de rebentos. Uma das plantas de rebento filha resultante pode ser separada da planta mãe, transplantada para um vaso separado e cultivada através de procedimentos padrão de gerenciamento de estufa para eventualmente recuperar uma planta filha com morfologia haploide normal. Essa planta filha produzirá pólen abundante e uma espiga robusta que se divide bem e produz várias dúzias de sementes DH1 quando autopolinizada.
[00143] Prevê-se que esses métodos de indução de rebentos podem ser usados em conjunto com métodos de DH para aumentar drasticamente a probabilidade de recuperação de sementes DH1 de uma dada planta mãe DH0. Prevê-se que um usuário possa induzir uma planta DH0 a formar rebentos duplo haploides, cada um gerando espigas que se dividem bem com suas respectivas bandeiras para produzir dezenas de sementes duplo haploides. Espera-se que se possa usar esses métodos para gerar tantos rebentos quanto necessário para se obter uma quantidade de sementes DH1 desejada pelo usuário.
Exemplo 8. Indução de multigomos pode ser usada em conjunto com métodos DH para gerar rapidamente plantas homo- zigóticas para múltiplos traços.
[00144] Sementes de uma planta de milho diploide foram esterilizadas na superfície compreendendo imersão usando métodos padrão da técnica e então germinadas in vitro em meios de cultivo. Uma das mudas resultantes foi dissecada da sua semente dois dias após a germinação (método do eixo embrionário). O eixo dissecado foi então submetido a um tratamento de indução de multigomos, compreendendo a transferência para um meio de indução de multigomos fresco contendo citocinina na forma de BAP a 10 mg/L. Após sete dias no meio de indução de gomos multigomos, as mudas tratadas foram transferidas de volta para um meio de regeneração sem hormônios.
[00145] Após cerca de vinte dias, os multigomos induzidos podem ser vistos crescendo a partir das regiões nodais do caule. Esses multi- gomos foram dissecados da planta mãe e transferidos para meio de enraizamento compreendendo IBA e IAA. Após aproximadamente uma semana, as plantas derivadas de multigomos foram transplantadas para vasos de 10 polegadas e cultivadas em uma estufa até que estivesse claro que cada broto derivado dos multigomos estivesse crescendo de forma autônoma tivesse formado espigas e bandeiras que se dividiram. Cada espiga foi então polinizada a partir da bandeira que estava crescendo no mesmo vaso, e então se permitiu que todas as plantas crescessem em condições de estufa até que as sementes se estabelecessem. Em cada caso, as plantas derivadas de multigomos produziram espigas que carregavam dezenas de sementes cada uma.
[00146] Este exemplo revela que multigomos induzidos a partir de uma única planta mãe podem ser cultivados para produzir espigas e bandeiras férteis que se dividem bem e produzem um excelente conjunto de sementes. Assim, prevê-se que um usuário desses métodos possa usar multigomos para aumentar a probabilidade de recuperar pelo menos uma semente de uma dada planta.
[00147] Em uma modalidade, o usuário induz uma planta mãe ha- ploide submetida a duplicação de cromossomos a um tratamento de indução de multigomos para produzir múltiplos gomos duplo haploides. Esses multigomos podem ser cultivados para produzir sementes DH.
[00148] Em outra modalidade, o usuário submete uma planta diploi- de contendo pelo menos um traço desejado em um estado heterozigó- tico a um tratamento de indução de multigomos para produzir vários multigomos diploides. Esses multigomos são separados da planta mãe e cultivados para produzir bandeiras e espigas. Em seguida, o usuário poliniza as plantas diploides derivadas de multigomos com um indutor haploide materno para gerar prole haploide, pelo menos uma das quais contém o alelo desejado do traço. A prole haploide pode então ser submetida a um tratamento de duplicação com colchicina para produzir uma planta duplo haploide contendo o traço desejado na condição homozigótica. Esse método tem o potencial de aumentar drasticamente a eficácia de criar uma planta que seja homozigota para mais de um traço, uma vez que o usuário pode induzir a formação de muitas novas inflorescências a partir de uma única planta mãe, aumentando, desse modo, a probabilidade de produzir um ovo contendo os traços desejados em um estado homozigótico de uma planta mãe. Uma vez que uma planta haploide contendo os traços desejados na condição homozigótica é gerada, o usuário pode submeter a planta a um tratamento de duplicação de cromossomos para recuperar um diploide ho- mozigótico.
Exemplo 9. Manipulação de grãos por planta em populações duplo haploides usando o regulador de crescimento vegetal paclobutrazol.
[00149] Mudas duplo haploides foram plantadas no solo um dia após terem sido tratadas com o agente de duplicação de haploides colchicina e um total de sete dias após a germinação. As plantas de quatro germoplasmas diferentes foram tratadas com Paczol (2,5% em 60 mL equivalentes a 0,4% de ingrediente ativo Paclobutrazol) aproximadamente 37 dias após a imbibição da semente (aproximadamente estágio V11) para formar múltiplas espigas codominantes. Todas as plantas foram polinizadas manualmente por dois dias consecutivos. Plantas com espigas codominantes foram polinizadas manualmente em duas espigas separadas em cada planta (tanto espigas primárias quanto secundárias estavam no caule principal). Na conclusão do experimento, o número total de grãos foi determinado por planta. A Tabela 6 abaixo ilustra os resultados das plantas tratadas e não tratadas em cada população de germoplasma. Tabela 6. Tratamento com Paczol de populações de germoplasma di-haploide.
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[00150] O número de grãos por planta foi quase duplicado após o tratamento com Paczol. Vide as Figuras 4 e 5.
[00151] Tendo ilustrado e descrito os princípios desses métodos, deve ser evidente para pessoas versadas na técnica que os métodos podem ser modificados em arranjos e detalhes, sem se afastar de tais princípios. Uma vez que várias modificações poderiam ser feitas nas construções descritas e ilustradas neste documento sem se afastar do escopo da invenção, pretende-se que toda a matéria contida na descrição acima ou mostrada nas figuras em anexo deva ser interpretada como ilustrativa ao invés de limitante.
[00152] Embora os materiais e métodos divulgados neste documento tenham sido descritos em termos de várias modalidades e exemplos ilustrativos, será evidente para aqueles versados na técnica que variações podem ser aplicadas aos materiais e métodos descritos neste documento sem se afastar do conceito, espírito e escopo da invenção. Todos os substitutos e modificações semelhantes evidentes para aqueles versados na técnica são considerados como estando dentro do espírito, escopo e conceito da invenção como definido pelas reivindicações anexas.
[00153] A abrangência e o escopo da presente divulgação não devem ser limitados por qualquer um dos exemplos de modalidades descritos acima, mas devem ser definidos somente em conformidade com as reivindicações a seguir e seus equivalentes.

Claims (16)

1. Método de produção de espigas codominantes em uma planta jovem de milho haploide, o método caracterizado pelo fato de que compreende contatar a planta jovem de milho haploide com um regulador de crescimento vegetal que é um inibidor do ácido giberéli- co, em que a planta jovem de milho haploide produz espigas codomi- nantes que são receptivas à polinização durante a liberação de pólen da planta haploide de milho, em que a planta é posta em contato com o regulador de crescimento de plantas por encharcamento do solo, em que o inibidor de ácido giberélico é paclobutrazol (PBZ).
2. Método de melhoramento do número de sementes DH1 colhidas de uma planta de milho DH0, o método caracterizado pelo fato de que compreende contatar a planta de milho DH0 com um regulador de crescimento vegetal que é um inibidor do ácido giberélico no estágio de desenvolvimento V2, V3, V4, V5, V6, V7, V8, V9, V10, V11, V12* e contatar a planta de milho DH0 com um agente de duplicação de cromossomos em qualquer estágio do seu ciclo de vida para produzir uma planta de milho DH0 que produz pelo menos uma semente de milho DH1 e pelo menos duas espigas codominantes que são re-ceptivas à polinização durante a liberação de pólen da planta de milho haploide, em que a planta é posta em contato com o regulador de crescimento de plantas por encharcamento do solo, em que o inibidor de ácido giberélico é paclobutrazol (PBZ).
3. Método, de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo fato de que o número total de sementes de milho DH1 produzidas pela planta de milho DH0 com pelo menos duas espigas codominantes é maior do que o número de sementes de milho DH1 produzidas por plantas de milho DH0 controle que exibem uma espiga dominante.
4. Método, de acordo com a reivindicação 2 ou 3, caracte-rizado pelo fato de que a planta de milho DH0 produz uma primeira espiga codominante e uma segunda espiga codominante, e a segunda espiga codominante produz mais sementes de milho DH1 do que a primeira espiga codominante.
5. Método, de acordo com a reivindicação 2 ou 3, caracte-rizado pelo fato de que a planta de milho DH0 produz uma primeira espiga codominante, uma segunda espiga codominante e uma terceira espiga codominante, e a terceira espiga codominante produz mais sementes de milho DH1 do que a primeira espiga codominante.
6. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 2 a 5, caracterizado pelo fato de que compreende adicionalmente a genotipagem da planta de milho DH0 antes de contatar a planta de mi-lho DH0 com o regulador de crescimento vegetal ou o agente de dupli-cação de cromossomos.
7. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 2 a 6, caracterizado pelo fato de que compreende adicionalmente a obtenção de sementes de milho DH1 da planta de milho DH0.
8. Método, de acordo com a reivindicação 7, caracterizado pelo fato de que compreende adicionalmente a genotipagem das se-mentes de milho DH1 obtidas da planta de milho DH0 ou a genotipa- gem de uma planta cultivada a partir das sementes de milho DH1.
9. Método, de acordo com a reivindicação 8, caracterizado pelo fato de que compreende adicionalmente o cultivo de uma semente de milho DH1 selecionada com base na genotipagem.
10. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 2 a 9, caracterizado pelo fato de que a planta de milho DH0 é contatada com o agente de duplicação de cromossomos antes de ser contatada com o regulador de crescimento vegetal.
11. Método, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 2 a 9, caracterizado pelo fato de que a planta de milho DH0 é contatada com o agente de duplicação de cromossomos depois que ele é contatado com o regulador de crescimento vegetal.
12. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 2 a 11, caracterizado pelo fato de que a planta de milho DH0 é contatada com o agente de duplicação de cromossomos dentro de 1 minuto, 5 minutos, 15 minutos, 30 minutos, 1 hora, 2 horas, 3 horas, 6 horas, 12 horas ou 24 horas antes ou depois do contato com o regulador de crescimento vegetal.
13. Método, de acordo com a reivindicação 12, caracterizado pelo fato de que o agente de duplicação de cromossomos e o regulador de crescimento vegetal são contatados com a planta de milho DH0 ao mesmo tempo.
14. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 13, caracterizado pelo fato de que a planta de milho é contatada com o regulador de crescimento vegetal no estágio de desenvolvimento V4, V5 ou V6.
15. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 13, caracterizado pelo fato de que a planta de milho é contatada com o regulador de crescimento vegetal no estágio de desenvolvimento V6, V7, V8, V9 ou V10.
16. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 2 a 15, caracterizado pelo fato de que três ou mais, quatro ou mais, ou cinco ou mais espigas codominantes são produzidas.
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Families Citing this family (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN115918545A (zh) 2015-07-16 2023-04-07 孟山都技术公司 形成加倍单倍体植物的方法
BR112020015481A2 (pt) 2018-02-15 2020-12-08 Monsanto Technology Llc Controle aprimorado de milho através de sistemas de porte semianão
MX2020008563A (es) 2018-02-15 2021-01-08 Monsanto Technology Llc Métodos mejorados para la producción de semillas de maíz híbridas.
WO2019178680A1 (en) * 2018-03-21 2019-09-26 Canopy Growth Corporation Methods for inducing polyploidy in cannabis
MX2020011296A (es) * 2018-04-27 2020-11-18 Monsanto Technology Llc Metodos para el genotipado de embriones haploides.
CN109122293B (zh) * 2018-08-29 2022-04-05 广西壮族自治区农业科学院玉米研究所 一种利用除草剂加倍玉米单倍体的方法
CN115067208B (zh) * 2022-07-21 2023-05-16 北京市农林科学院 一种利用赤霉素提高玉米单倍体加倍效率的方法
CN116671436B (zh) * 2023-07-14 2024-03-12 邯郸市农业科学院 一种单倍体玉米加倍的组合物和单倍体玉米加倍的方法

Family Cites Families (23)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
IE45765B1 (en) 1976-08-19 1982-11-17 Ici Ltd Triazoles and imidazoles useful as plant fungicides and growth regulating agents
AU544099B2 (en) 1980-12-15 1985-05-16 Sumitomo Chemical Company, Limited Triazolylpentenols
CN1040278C (zh) * 1992-04-25 1998-10-21 慈利县科学技术委员会 水稻控蘖增粒高产栽培方法
FR2736509B1 (fr) * 1995-07-12 1997-09-19 Federation Nationale De La Pro Composition et procede pour reduire la sterilite et stimuler la floraison des plantes de cereales
CA2187257A1 (en) 1995-10-12 1997-04-13 Enrique Luis Michelotti Aryl-substituted cycloalkanes and cycloalkenes and herbicidal use thereof
CN1195476A (zh) * 1997-12-28 1998-10-14 中国科学院黑龙江农业现代化研究所 春小麦分蘖促进液
MXPA04006392A (es) 2001-12-28 2004-11-10 Monsanto Technology Llc Plantas de maiz con caracteristicas de grano de calidad mejorada.
CN1555686A (zh) * 2003-12-31 2004-12-22 徐德芳 禾本科农作物高产栽培技术
US8859846B2 (en) * 2005-09-21 2014-10-14 E. I. Du Pont De Nemours And Company Doubling of chromosomes in haploid embryos
CN100423630C (zh) 2006-05-15 2008-10-08 西北农林科技大学 一种玉米人工套袋自交授粉方法
US7902437B1 (en) * 2008-04-15 2011-03-08 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Maize variety PHWMK
JP2011528911A (ja) 2008-07-24 2011-12-01 ザ・テキサス・エイ・アンド・エム・ユニバーシティ・システム モロコシ属およびサトウキビ属の属間雑種植物およびその生産方法
US8558061B2 (en) 2008-12-29 2013-10-15 Agrigenetics, Inc. Induced chromosome doubling in plants
RU2623176C2 (ru) 2009-11-23 2017-06-22 Монсанто Текнолоджи Ллс Трансгенное событие mon 87427 маиса и относительная шкала развития
GB0920893D0 (en) * 2009-11-27 2010-01-13 Syngenta Participations Ag Plant growth regulation
US20140310832A1 (en) * 2011-03-28 2014-10-16 Commonwealth Scientific And Industrial Research Organisation Stress tolerant wheat plants
US8742237B1 (en) * 2011-04-07 2014-06-03 Agrigenetics, Inc. Haploid-inducer corn line designated AX6012
CN102273460B (zh) * 2011-06-20 2014-08-20 中国农业大学 一种植物生长调节剂及其应用
WO2014037947A1 (en) * 2012-09-09 2014-03-13 Y.E. Vigor.Corn Production of maize plant with increased yield and additional leaves above the ear archtecture by using non dominant genetic factor
US9658176B2 (en) 2013-03-15 2017-05-23 Monsanto Technology Llc High-throughput sorting of small objects via oil and/or moisture content using low-field nuclear magnetic resonance
CN103461108A (zh) * 2013-09-17 2013-12-25 山东省农业科学院玉米研究所 一种玉米育种简易授粉方法
WO2015168659A1 (en) 2014-05-01 2015-11-05 Monsanto Technology Llc Aided delivery of plant treatment agents
CN115918545A (zh) 2015-07-16 2023-04-07 孟山都技术公司 形成加倍单倍体植物的方法

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