CN107828758A - 重组尿嘧啶‑dna糖苷酶及其编码基因、制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于生物工程基因领域，涉及一种重组尿嘧啶‑DNA糖苷酶及其编码基因，以及其表达、纯化及在各种核酸扩增中的应用。本发明重组尿嘧啶‑DNA糖苷酶编码基因在大肠杆菌中能高效可溶表达，通过两步纯化工艺即可获得纯度较高的重组UNG酶，且重组UNG酶具有较好的生物学活性和较大的应用价值。

Description

重组尿嘧啶-DNA糖苷酶及其编码基因、制备方法和应用

技术领域

本发明属于生物工程基因领域，涉及一种重组尿嘧啶-DNA糖苷酶及其编码基因，以及其表达、纯化和在各种核酸扩增中的应用。

背景技术

在PCR操作过程中，最容易出现“污染”问题，原因主要有如下几种情况：1.模板的交叉污染：在样品采集或处理中，气溶胶、加样器取样时的泡沫或其他原因引起样品或模板的交叉污染，造成假阳性，属于正常DNA(由A、T、G、C四种碱基组成)引起的污染；2.扩增产物的污染：在扩增过程中，将碱基T置换成U，使得扩增产物中含有dU-DNA(由A、U、G、C四种碱基组成)，由于产物量特别大，容易溢漏引起污染，造成假阳性；3.核酸酶、蛋白酶的污染造成假阳性；在这三种情况中最为严重是第二种，即称之为：“残留污染”，因为PCR扩增的放大倍数高达千万倍，而且在实际应用中扩增一直在反复进行，造成扩增产物的大量堆积，难于将其控制降解，即使是荧光定量PCR也很难避免扩增产物的污染，为了使得PCR结果更加可靠、准确，有必要在反应管完全封闭后于管内通过酶或其他方法，将操作过程中可能带入的残留污染物破坏，使其不能成为新一轮扩增的模板。

UNG酶，即尿嘧啶-DNA糖苷酶(Uracil-DNA Glycocasylase)。UNG的作用原理是选择性水解断裂含有dU的双链或单链DNA中的尿嘧啶糖苷键，形成有缺失碱基的DNA链，在碱性介质以及高温下会进一步水解断裂，从而被消除。UNG酶是细胞内DNA损伤修复***中一种重要的组分，在自然界广泛存在，包括细菌、真核生物、人细胞中都有UNG酶表达。

目前常用的做法是在PCR反应体系中加入UNG酶，并以dUTP取代dTTP，这样PCR产物都是含有dUTP的DNA链。在PCR开始前增加一步较低温度的孵育步骤，UNG酶即可将反应体系中可能存在的上一轮的含有U-DNA的扩增产物中的尿嘧啶碱基降解，并在随后变性这步的条件下DNA链断裂，消除由于污染DNA产生的扩增，从而保证扩增结果的特异性，准确性。同时UNG酶被灭活,不会再降解新扩增的产物U-DNA，这样就可以有效地防止实验室内扩增产物的污染，避免假阳性的出现，这种技术叫做UNG/dUTP防污染技术。目前市售的UNG酶主要以基因工程技术制备的重组UNG酶为主，但普遍存在着表达量不高或者重组UNG酶活性不高的问题。

发明内容

本发明的目的在于提供一种UNG酶的编码基因，其编码出的UNG酶具有较强的活性，该UNG酶编码基因在大肠杆菌中能高效可溶表达，通过两步纯化工艺即可获得纯度较高的重组UNG酶。

本发明提供了一种重组UNG酶(以下简称为“rUNG”)，其氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示。

本发明提供了编码上述所述rUNG酶的基因，其碱基序列如SEQ ID NO：2所示。该序列是专为大肠杆菌表达***进行密码子优化得到的序列，能够显著提高异源基因在宿主菌中的表达效率。

本发明还提供了包含了上述所述编码rUNG的基因的载体，所述的载体优选为原核表达载体pET21b、pDEST14、pET28a，特别优选为pET28a作为rUNG高效可溶表达的载体。

本发明还提供了包含有上述所述载体的大肠杆菌宿主菌株，优选地，所述宿主菌株选自大肠杆菌BL21(DE3)或BL21(AI)菌株，特别优选为BL21(DE3)作为rUNG高效可溶表达的宿主菌株。

本发明还提供了rUNG在大肠杆菌中高效可溶表达方法，包括如下步骤：

1.挑取一个含有上述所述的重组大肠杆菌单菌落，接入LB培养液，于37℃，220rpm培养过夜；

2.取10mL过夜培养物接入TB或LB培养液中，于37℃震荡培养至对数中期(A₆₀₀＝1.0)；

3.在培养物中加入IPTG至1mmol/L，于25℃过夜诱导表达，4℃以12000rpm离心3min收集含有rUNG酶的大肠杆菌菌体沉淀。

所述TB或LB培养液中均含有卡那霉素25-50μg/mL。

本发明还提供了rUNG酶的纯化方法，包括如下步骤：

1.将收集得到的含有诱导rUNG酶大肠杆菌菌体沉淀，用预冷的结合缓冲液BufferA重悬，并于4℃高速离心处理。

2.吸去上清，每克菌体加入结合缓冲液BufferA 3-10ml，搅动，使菌体悬起。

3.每克菌体加入3-10μL浓度为100mmol/L的PMSF，3-100μL浓度为100mg/mL的溶菌酶，于冰上搅动。

4.破碎菌体，于冰浴中超声，并于4℃以12000rpm高速离心5min收集上清,0.22μm滤膜过滤备用。

5.IMAC亲和层析，合并各收集峰中样品并以0.22μm滤膜过滤备用。

6.进一步以凝胶过滤层析，得到所需目的产物。

优选的，所述IMAC亲和层析，选用的结合缓冲液BufferA：20mM Tris-HCl，20mM咪唑，300mMNaCl，pH＝8.0；洗脱缓冲液BufferB：20mM Tris-HCl，300mM NaCl，300mM咪唑，pH＝8.0；所述凝胶过滤层析，选用的结合以及洗脱缓冲液为BufferC:20mM Tris-HCl，50mMNaCl，pH＝8.0，0.22μm滤膜过滤备用。

附图说明

图1为rUNG酶密码子优化前后核苷酸序列比较图。

其中，奇数行(即“优化前序列”对应的行)为rUNG酶天然基因核苷酸序列，即密码子优化前的序列；偶数行(即“优化后序列”对应的行)为本发明的rUNG酶的基因核苷酸序列，即密码子优化后的序列。

图2-a、图2-b为rUNG酶密码子优化前后在大肠杆菌表达宿主中CAI指数。

其中，图2-a表示rUNG酶天然基因核苷酸序列在大肠杆菌表达宿主中CAI指数经过程序计算为0.53；图2-b表示优化后的本发明的rUNG酶密码子在大肠杆菌表达宿主中CAI指数经过程序计算为0.96。

图3-a、图3-b为rUNG酶密码子优化前后在大肠杆菌表达宿主中最优密码子频率分布区域图。

其中，图3-a表示rUNG酶天然基因核苷酸序列在大肠杆菌表达宿主中最优密码子频率分布区域图，从图中可以看出：rUNG酶天然基因核苷酸序列的低利用率密码子出现百分比为25％；图3-b表示优化后的本发明的rUNG酶密码子在大肠杆菌表达宿主中最优密码子频率分布区域图，优化后的本发明的rUNG酶密码子序列的低利用率密码子出现百分比为0。

图4-a、图4-b为rUNG酶密码子优化前后在大肠杆菌表达宿主中平均GC碱基含量分布区域图。

其中，图4-a表示rUNG酶天然基因核苷酸序列在大肠杆菌表达宿主中平均GC碱基含量为：52.66％；图4-b表示优化后的本发明的rUNG酶密码子在大肠杆菌表达宿主中平均GC碱基含量为：59.54％。

图5为rUNG酶基因PCR产物的琼脂糖凝胶电泳图。

其中，泳道1为1000bp DNA Ladder；泳道2为两端含有NdeI和XhoI酶切位点的rUNG酶基因PCR产物。

图6为rUNG酶构建到表达质粒pET28a过程图；

图7为rUNG酶诱导前后SDS-PAGE凝胶电泳鉴定图。

其中，泳道1为(10-230kDa)宽范围的预染的蛋白上样Marker；泳道2为克隆1未加入IPTG诱导表达的rUNG酶重组大肠杆菌BL21(DE3)裂解液；泳道3为克隆1加入IPTG诱导表达的rUNG酶重组大肠杆菌BL21(DE3)裂解液；泳道4为克隆2未加入IPTG诱导表达的rUNG酶重组大肠杆菌BL21(DE3)裂解液；泳道5为克隆2加入IPTG诱导表达的rUNG酶重组大肠杆菌BL21(DE3)裂解液。

图8为IMAC亲和纯化重组rUNG酶细菌裂解液色谱图。

图9为IMAC亲和纯化亲和纯化重组rUNG酶细菌裂解液的SDS-PAGE凝胶电泳图。

其中，泳道1为(10-230kDa)宽范围的预染的蛋白Marker；泳道2-5为缓冲液BufferB洗脱时收集的不同收集管样品。

图10为Superdex75凝胶过滤纯化rUNG酶色谱图。

图11为Superdex75凝胶过滤纯化rUNG酶的SDS-PAGE凝胶电泳图。

其中，泳道1为(10-230kDa)宽范围的预染的蛋白Marker；泳道2-4为缓冲液BufferC洗脱时收集的不同收集管样品。

图12为rUNG酶纯化样品HPLC纯度检测色谱图。

图13为添加rUNG酶/dUTP或rUNG酶/dTTP后，PCR产物琼脂糖凝胶电泳图。

其中，泳道1为1000bp DNA Ladder；泳道2为添加rUNG酶/dUTP到PCR体系PCR扩增产物；泳道3为添加rUNG酶/dTTP到PCR体系PCR扩增产物。

图14rUNG酶清除含dUTP的PCR产物能力检测，其中14-a表示清除10¹⁰拷贝的含dUTP的PCR产物的能力，14-b清除10⁸拷贝的含dUTP的PCR产物的能力。

图15rUNG酶在荧光定量PCR双重反应中扩增效果。

具体实施方式

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明，应理解，引用实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。

实施例1rUNG酶基因优化设计

发明人根据GenBank已公开的UNG酶的cDNA序列(GenBank登录号：NC_000913.3)，对该基因进行密码子优化后得到本发明的rUNG酶基因，如SEQ ID No：2所示。

下面是对rUNG酶进行密码子优化，优化前后各参数对比如下：

1.密码子适应指数(Codon Adaptation Index，CAI)

由图2-a可知，密码子没有优化前，UNG酶天然基因在大肠杆菌中密码子适应指数(CAI)为0.53。由图2-b可知，通过密码子优化后，使得本发明的rUNG酶基因在大肠杆菌中CAI指数为0.96。通常CAI＝1时被认为该基因在该表达***中是最理想的高效表达状态，CAI指数越低表明该基因在该宿主中表达水平越差，因此可以看出经过了密码子优化后得到的基因序列可以提高rUNG酶基因在大肠杆菌中的表达水平。

2.最优密码子使用频率(Frequency of Optimal Codons，FOP)

由图3-a可知，基于大肠杆菌表达载体，密码子没有优化前，UNG酶天然基因序列的低利用率密码子出现百分比为25％。这条未进行优化的基因含有串联稀有密码子，这些密码子可能降低翻译效率，甚至能够解散翻译装配物。由图3-b可知，通过密码子优化后，本发明的rUNG酶基因在大肠杆菌***中出现低利用率密码子的频率为0。

3.GC碱基含量(GC curve)

GC含量理想分布区域为30％-70％，在这个区域外的出现任何峰都会不同程度地影响转录和翻译效率。由图4-a、图4-b的UNG酶的GC碱基平均含量分布区域图对比可知，由图4-a中显示UNG酶天然基因中在优化前GC碱基平均含量为52.66％，由图4-b中显示出优化后的序列消除了GC含量在30％-70％区域外所有碱基，最终得到优化后rUNG酶的GC碱基平均含量为59.54％。

实施例2UNG酶基因的表达载体构建

将优化后的rUNG酶全基因(如SEQ ID No：2所示)在5’端引入XbaI酶切位点序列，在3’端引入组氨酸标签和XhoI酶切位点序列，并进行全基因合成，将合成的基因片段，构建到pUC57质粒(由南京金斯瑞科技有限公司提供)中，得到一种长期保存质粒，记为pUC57-rUNG质粒。以pUC57-rUNG质粒为模板，进行PCR扩增，所用引物序列如下：

上游引物：

M13F:CGC CAG GGT TTT CCC AGT CAC GAC

下游引物：

M13R:AGC GGA TAA CAA TTT CAC ACA GGA

反应总体积50μL，其中浓度为10μmol/L引物各加2.5μL，浓度为10mmol/L的dNTP加1μL，所用DNA聚合酶为Q5(#M0491L，购自New England Biolabs公司)，2U/μL，加0.5μL。反应条件为98℃30秒预变性，热循环30次(98℃10秒、55℃15秒、72℃30秒)，72℃延伸2分钟，4℃保存，，产物经1.0％琼脂糖凝胶电泳分析，结果显示产物大小与预期大小(750bp)一致(结果如图5所示)。

将得到的基因产物用通用型DNA纯化回收试剂盒(DP214-02，购自北京天根生化科技有限公司)纯化。纯化后，用XbaI(#R0145S，购自New England Biolabs公司)和XhoI(#R0146S，购自New England Biolabs公司)双酶切，用T4连接酶(#M0202S，购自New EnglandBiolabs公司)连接到pET28a质粒(购自Merck公司)载体中，转化到DH5α感受态细胞(CB101-02，购自北京天根生化科技有限公司)中，在含有50μg/mL的卡那霉素(0408，购自Amresco公司)的LB平板中37℃培养过夜。第二天筛选阳性克隆菌测序，比对，与预期序列完全一致，即得到rUNG酶一种形式的表达载体，记为pET28a-rUNG(质粒构建流程如图6所示)。

实施例3rUNG酶在重组大肠杆菌中的表达和鉴定

具体步骤如下：

1).将实施例2中测序比对正确的pET28a-rUNG质粒转化到大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞中(CB105-02，购自北京天根生化科技有限公司)中，37℃卡那霉素平板中过夜培养。

2).第二天挑1-4个含有pET28a-rUNG质粒的重组单菌落，接入含有50μg/mL卡那霉素的LB培养液，37℃培养过夜。

3).取10mL过夜培养物接入500mL含50μg/mL卡那霉素的TB培养液中，37℃振荡培养。

4).接种后每隔1小时测菌液OD600值，待OD600≈1.0时，用1mmol/L的IPTG(0487，购自Amresco公司)进行诱导表达。同时以未加入IPTG的大肠杆菌培养液做阴性对照。

5).25℃过夜诱导表达后收集菌液，取1mL菌液，12000rpm高速离心3min，用预冷的PBS清洗沉淀，加入5×SDS凝胶上样缓冲液，100℃加热5min，12000rpm高速离心1min，取上清。未加入IPTG的大肠杆菌培养液也按此步骤处理。

6).各取5μL未加入IPTG和加入IPTG诱导的培养物悬液，10％SDS-PAGE凝胶电泳分析。

7).8-15V/cm电泳，至溴酚蓝迁移到分离胶底部。

8).考马斯亮蓝染色，观察表达产物条带，见图7。

实施例4rUNG酶纯化

步骤1.重组菌体破碎

1).将实施例3中重组BL21(DE3)菌体，经预冷的结合缓冲液BufferA清洗得到的含有诱导rUNG的大肠杆菌沉淀，用预冷的结合缓冲液BufferA重悬，于4℃以12000rpm离心15min；重复一次。

2).吸去上清，称菌体沉淀重量，每克菌体加入5mL结合缓冲液BufferA，用磨光玻璃棒搅动，使菌体悬起。

3).每克菌体加入5μL 100mmol/L PMSF，5μL 100mg/mL溶菌酶，冰上搅动20min。

4).用探针型超声波仪破碎菌体，样品置于冰上，超声60次，每次4秒间隔3秒，循环三次，每次循环间隔等待5min。12000rpm，4℃高速离心15min。

5).将离心获得的上清液过0.22μm滤膜过滤备用。

步骤2.IMAC亲和纯化细菌裂解液

1).IMAC亲和层析选用的层析柱是HisTrap crude FF 5mL(17-5286-01，购自GEhealthcare)，结合缓冲液BufferA：20mM Tris-HCl，20mM咪唑，300mMNaCl，pH＝7.5，洗脱缓冲液BufferB：20mM Tris-HCl，300mM NaCl，300mM咪唑，pH＝8.0，0.22μm滤膜过滤备用。

2).将HisTrap FF crude 5mL接入AKTA avant150纯化仪中，依次用双蒸水清洗机器和柱子后，再用结合缓冲液BufferA平衡柱子，并用样品泵对步骤1中处理的重组BL21(DE3)细菌裂解液进行上样。上完样品后，先用结合缓冲液BufferA清洗柱子，再用洗脱缓冲液BufferB进行洗脱并收集洗脱峰。(见图8)

3).对IMAC亲和层析收集的各收集管的样品进行SDS-PAGE蛋白凝胶电泳检测，由图9所示，重组菌株BL21(DE3)能够诱导产生较高的可溶表达的rUNG酶。

步骤3.Superdex 75凝胶过滤层析

1).凝胶过滤层析选用的层析柱是HiLoad16/60superdex75pg(17-1068-01，购自GE healthcare)，缓冲液BufferC为20mM Tris-HCl，50mM NaCl，pH＝8.0，0.22μm滤膜过滤备用。

2).将Superdex75凝胶过滤层析柱接入AKTA avant150纯化仪中，依次用双蒸水清洗机器和柱子后，再用缓冲液BufferC平衡柱子，每次上样总体积不超过柱体积的5％。上完样品后，用BufferC洗脱，并收集洗脱峰。(见图10)

3).对Superdex75凝胶过滤层析收集的各收集管样品进行SDS-PAGE凝胶电泳检测(结果如图11所示)。

步骤4.rUNG酶纯度检测

将Superdex75凝胶过滤层析收集的各收集管样品进行合并，通过分子筛色谱法检测rUNG酶蛋白纯度，色谱法条件：HPLC(Waters，e2695HPLC)，Superdex200GL increase(购自GEhealthcare)，流动相为含0.1M Na₂SO₄的PB(pH＝6.5)，流速为0.8mL/min，检测波长为280nm，进样量10μL，检测时间为35min。

分析结果见图12所示。如图可以看出，经过纯化后，rUNG纯度达到99％以上，经过计算，上述1L培养基，在摇瓶中能够制备50～100mg左右的纯度达到99％左右的rUNG酶。

步骤5.rUNG酶保存

将上述纯化合并样品加入DTT、TritonX-100和甘油，最终rUNG酶保存的缓冲液为：20mM Tris-HCl，50mM NaCl，1mM DTT，0.1％(v/v)Triton X-100，50％glycerol，pH＝8.0，并置于-20冰箱长期保存。

实施例5 rUNG酶生物学活性验证

将实施例4制备得到的rUNG酶应用于PCR扩增中。首先用质粒小提试剂盒提取某重组大肠杆菌质粒，再按如下程序和方法制备反应组：25μl反应液中含有2.5μl 10×PCR缓冲液，上下游引物各1μL，4×dNTPs各0.1mmol(dUTP，dATP，dCTP，dGTP)，25ng重组载体，1UTaqDNA聚合酶(详见专利号：201510946096.5)，同时制备对照组：25μl反应液中含有2.5μl10×PCR缓冲液，上下游引物各1μL，4×dNTPs各0.1mmol(dTTP，dATP，dCTP，dGTP)，25ng重组质粒，1U TaqDNA聚合酶，将反应组和对照组分别加入rUNG酶置于37℃反应10min后，在PCR仪(Applied Biosystems，96-Well Thermal Cycler)扩增确定其反应活性，其中PCR反应条件：94℃预变性2min，热循环30次(94℃变性60s，55℃退火60s，70℃延伸1min)，72℃延伸5min，4℃保存。最后通过琼脂糖凝胶电泳检测其活性，结果如图13所示，添加rUNG酶/dUTP反应组PCR扩增产物没有任何条带，而添加rUNG酶/dTTP对照组PCR扩增产物有目的条带，说明反应组具有明显的尿嘧啶-DNA糖苷酶特异活性，可以用于PCR实验室中DNA防污染中。

实施例6 rUNG酶在荧光定量PCR中的防污染能力

PCR体系即Taq 0.5U、rUNG 1U、10×buffer 4μL、25mM MgCl₂ 4μL、10μM dNTP 0.8μL、1μM上下游引物各2μL、1μM突变/内控探针各2μL、DNA10ng，ddH₂O补足至40μL，DNA模板为含dUTP的PCR回收产物，进行梯度稀释，稀释为不同拷贝数：10¹²、10¹⁰、10⁸。PCR反应程序：50℃10min；95℃5min；95℃15sec，60℃1min 40个循环，60℃时收集荧光。图14-a、14-b结果显示：本发明的rUNG能够明显清除10⁸拷贝数的含dUTP的PCR产物。

实施例7rUNG酶对荧光定量PCR扩增效果的影响

PCR体系即Taq 0.5U、rUNG 1U、10×buffer 4μL、25mM MgCl₂ 4μL、10uM dNTP 0.8μL、1μM上下游引物各2μL、1μM突变/内控探针各2μL、DNA10ng，ddH₂O补足至40μL，DNA模板为含有人基因组DNA片段重组载体。PCR反应程序：50℃10min；95℃5min；95℃15sec，60℃1min40个循环，60℃时收集荧光。图15结果显示：本发明rUNG在荧光定量PCR双重反应(同时检测FAM与VIC信号)中，扩增效率高，能特异性扩增目的片段。

以上仅是本发明的优选实施方式，应当指出的是，上述优选实施方式不应视为对本发明的限制，本发明的保护范围应当以权利要求所限定的范围为准。对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明的精神和范围内，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

序列表

<110> 江苏众红生物工程创药研究院有限公司

<120> 重组尿嘧啶-DNA糖苷酶及其编码基因、制备方法和应用

<130> 重组尿嘧啶-DNA糖苷酶及其编码基因、制备方法和应用

<160> 2

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 229

<212> PRT

<213> Escherichia coli

<400> 1

Met Ala Asn Glu Leu Thr Trp His Asp Val Leu Ala Glu Glu Lys Gln

1 5 10 15

Gln Pro Tyr Phe Leu Asn Thr Leu Gln Thr Val Ala Ser Glu Arg Gln

20 25 30

Ser Gly Val Thr Ile Tyr Pro Pro Gln Lys Asp Val Phe Asn Ala Phe

35 40 45

Arg Phe Thr Glu Leu Gly Asp Val Lys Val Val Ile Leu Gly Gln Asp

50 55 60

Pro Tyr His Gly Pro Gly Gln Ala His Gly Leu Ala Phe Ser Val Arg

65 70 75 80

Pro Gly Ile Ala Ile Pro Pro Ser Leu Leu Asn Met Tyr Lys Glu Leu

85 90 95

Glu Asn Thr Ile Pro Gly Phe Thr Arg Pro Asn His Gly Tyr Leu Glu

100 105 110

Ser Trp Ala Arg Gln Gly Val Leu Leu Leu Asn Thr Val Leu Thr Val

115 120 125

Arg Ala Gly Gln Ala His Ser His Ala Ser Leu Gly Trp Glu Thr Phe

130 135 140

Thr Asp Lys Val Ile Ser Leu Ile Asn Gln His Arg Glu Gly Val Val

145 150 155 160

Phe Leu Leu Trp Gly Ser His Ala Gln Lys Lys Gly Ala Ile Ile Asp

165 170 175

Lys Gln Arg His His Val Leu Lys Ala Pro His Pro Ser Pro Leu Ser

180 185 190

Ala His Arg Gly Phe Phe Gly Cys Asn His Phe Val Leu Ala Asn Gln

195 200 205

Trp Leu Glu Gln Arg Gly Glu Thr Pro Ile Asp Trp Met Pro Val Leu

210 215 220

Pro Ala Glu Ser Glu

225

<210> 2

<211> 711

<212> DNA

<213> Escherichia coli

<400> 2

atggcgaacg agctgacctg gcacgacgtg ctggcggagg aaaagcagca accgtacttc 60

ctgaacaccc tgcagaccgt ggcgagcgag cgtcaaagcg gcgttaccat ctatccgccg 120

cagaaggatg tgtttaacgc gttccgtttt accgaactgg gcgacgttaa agtggttatt 180

ctgggtcagg acccgtacca cggtccgggt caagcgcacg gcctggcgtt cagcgttcgt 240

ccgggtatcg cgattccgcc gagcctgctg aacatgtaca aggagctgga aaacaccatc 300

ccgggtttta cccgtccgaa ccacggctat ctggaaagct gggcgcgtca gggtgtgctg 360

ctgctgaaca ccgtgctgac cgttcgtgcg ggccaagcgc acagccacgc gagcctgggt 420

tgggagacct tcaccgacaa agttatcagc ctgattaacc aacaccgtga aggtgtggtt 480

tttctgctgt ggggcagcca cgcgcagaag aaaggtgcga tcattgataa gcaacgtcac 540

cacgtgctga aagcgccgca cccgagcccg ctgagcgcgc accgtggttt ctttggctgc 600

aaccacttcg tgctggcgaa ccagtggctg gagcaacgtg gcgaaacccc gattgactgg 660

atgccggttc tgccagcgga gagcgaacac caccaccacc accactgata a 711

Claims (8)

1.一种重组UNG酶，其氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示。

2.一种编码权利要求1所述重组UNG酶的基因，其碱基序列如SEQ ID NO：2所示。

3.一种包含了权利要求2所述编码重组UNG的基因的载体，所述载体为pET28a。

4.一种包含了权利要求3所述载体的大肠杆菌宿主菌株，所述大肠杆菌宿主菌株为BL21(DE3)。

5.一种重组UNG酶在大肠杆菌中高效可溶表达方法，包括如下步骤：

1).挑取一个含有权利要求4所述的大肠杆菌菌株单菌落，接入LB培养液，于37℃培养过夜；

2).取10mL过夜培养物接入TB或LB培养液中，于37℃震荡培养至对数中期(A₆₀₀＝1.0)；

3).在培养物中加入IPTG至1mmol/L，于25℃震荡过夜诱导表达，4℃以12000rpm离心3min收集含有重组UNG酶的大肠杆菌菌体沉淀。

所述TB或LB培养液中均含有卡那霉素25-50μg/mL。

6.一种重组UNG酶的纯化方法，包括如下步骤：

1).将收集得到的含有诱导重组UNG酶大肠杆菌菌体沉淀，用预冷的结合缓冲液BufferA重悬，并于4℃高速离心处理。

2).吸去上清，每克菌体加入结合缓冲液BufferA 3-10mL，搅动，使菌体悬起。

3).每克菌体加入3-10μL浓度为100mmol/L的PMSF，3-100μL浓度为100mg/mL的溶菌酶，于冰上搅动。

4).破碎菌体，于冰浴中超声，并于4℃以12000rpm高速离心5min收集上清，0.22μm滤膜过滤备用。

5).IMAC亲和层析，合并各收集峰中样品并以0.22μm滤膜过滤备用。

6).进一步以凝胶过滤层析，得到所需目的产物。

7.根据权利要求6所述的纯化方法，所述IMAC亲和层析选用的结合缓冲液为BufferA：20mM Tris-HCl，20mM咪唑，300mMNaCl，pH＝8.0；洗脱缓冲液为BufferB：20mM Tris-HCl，300mM NaCl，300mM咪唑，pH＝8.0；所述凝胶过滤层析，选用的结合以及洗脱缓冲液为BufferC:20mM Tris-HCl，50mM NaCl，pH＝8.0，0.22μm滤膜过滤备用。

8.如权利要求1所述的重组UNG酶在预防非特异性PCR扩增和污染、保证PCR结果准确性中的应用。