CN111041013B

CN111041013B - 一种褐藻胶裂解酶或果胶酶及其在协同降解褐藻方面的应用

Info

Publication number: CN111041013B
Application number: CN201911422366.7A
Authority: CN
Inventors: 李福利; 公衍军; 苏航
Original assignee: Weifang Macaaji Biotechnology Co ltd
Current assignee: Weifang Macaaji Biotechnology Co ltd
Priority date: 2019-12-31
Filing date: 2019-12-31
Publication date: 2020-11-17
Anticipated expiration: 2039-12-31
Also published as: CN111041013A

Abstract

本发明涉及基因工程技术领域，具体的说是一种降解褐藻的褐藻胶裂解酶、果胶酶及其在协同降解褐藻方面的应用。褐藻胶裂解酶AL1059的编码基因碱基序列依次为SEQ ID NO.2。果胶酶pG1466的编码基因碱基序列依次为SEQ ID NO.5。本发明可以利用枯草芽孢杆菌表达***快速表达来源于海洋嗜热菌Defluviitalea phaphyphila sp.Alg1的褐藻胶裂解酶以及嗜热菌Caldicellulosiruptor sp.strain F32来源的果胶酶pG1466，本发明所述的褐藻胶裂解酶和果胶酶具有安全性好、酶活高的优点，具备良好的工业应用前景。

Description

一种褐藻胶裂解酶或果胶酶及其在协同降解褐藻方面的应用

技术领域

本发明涉及基因工程技术领域，具体的说是一种降解褐藻的褐藻胶裂解酶、果胶酶及其在协同降解褐藻方面的应用。

背景技术

大型海藻是新型可再生生物质能源的代表。以褐藻为例，褐藻细胞壁中褐藻胶是最主要的多糖成分，其降解产物褐藻寡糖在降血糖、降血脂、抗肿瘤、提高免疫力、提高农作品质等很多用途上均表现出十分优异的生物学活性。目前以褐藻寡糖为原料的药物、保健品、化妆品、肥料、饲料添加剂都被广泛地应用。目前褐藻寡糖生产主要有三种工艺：

(1)化学提取法，采用有机溶剂浸提、化学水解(强酸、强碱)等方法。该方法成本低廉，反应快速。但工艺中使用的强酸、强碱、有机溶剂等化工原料会对褐藻寡糖的生物活性造成严重破坏，活性较差；

(2)物理提取法，采用渗透休克、高压匀浆、冷冻粉碎、低温***等方法。使用该方法对设备要求高、能耗大、生产成本高，最终提取出来的褐藻胶仍是以大分子形态为主，不利于机体的吸收利用；

(3)生物酶解法，该方法在最大程度的保留了褐藻寡糖主要活性成分的同时，并将褐藻胶中的大分子转化为能被机体直接吸收的小分子，是环保、高效的加工工艺。然而目前已知的褐藻胶裂解酶大多为中低温酶，热稳定性差，反应温度低，不适应于规模化生产。

另外一个方面，目前能够表达褐藻胶裂解酶的野生菌种类很多，但总的问题是分泌效率低，纯度低，规模化培养困难，而且遗传操作手段复杂，不利于进行遗传改造。因此目前更多的人是采用大肠杆菌作为工程菌对褐藻胶裂解酶进行异源表达，但同样面临表达量低，后续分离纯化难度大等多方面不利因素。这些问题都阻碍了褐藻胶裂解酶的产业化进程，也严重阻碍了褐藻寡糖的广泛应用。

为此现阶段采用分泌效率高，易于规模化培养，产物纯化方便的毕赤酵母作为宿主菌株，对海洋嗜热细菌来源热稳定性强的褐藻胶裂解酶进行了异源高效表达，提高了其表达效率和酶活。但是，毕赤酵母表达***也有一些不足之处，例如：发酵周期长，通常需要120-144h的发酵周期；此外甲醇诱导过程中会有部分甲醇残余，这也会限制其在食品行业的应用。

发明内容

本发明目的在于提供一种降解褐藻的褐藻胶裂解酶、果胶酶及其在协同降解褐藻方面的应用。

为实现上述目的，本发明采用技术方案为：

一种褐藻胶裂解酶，褐藻胶裂解酶AL1059的编码基因碱基序列依次为SEQ IDNO.2。

所述褐藻胶裂解酶为与SEQ ID NO.2所示碱基序列具有至少95％同源性，且具有活性的编码基因。

所述褐藻胶裂解酶所编码的氨基酸序列为SEQ ID NO.3。

一种果胶酶，pG1466的编码基因碱基序列依次为SEQ ID NO.5。

所述果胶酶为与SEQ ID NO.5所示碱基序列具有至少95％同源性，且具有活性的编码基因。

所述果胶酶所编码的氨基酸序列为SEQ ID NO.6。

一种质粒，包含所述的褐藻胶裂解酶。

一种质粒，包含所述的果胶酶。

所述质粒载体为pHT43、pUB110、pE194、pUCX05-bgaB、pWB980、pHP13、pBE2、pHP13、pHP13-43、pHT01、pHT304、pMK3、pHCMC05、pMA5、pHY300PLK、pMUTIN4或pBesT502。

一种菌株，包含所述的褐藻胶裂解酶。

一种菌株，包含所述的果胶酶。

所述宿主菌株枯草芽孢杆菌。

一种褐藻胶裂解酶的应用，所述褐藻胶裂解酶和所述的果胶酶在降解海带中的应用。

优选，所述褐藻胶裂解酶、所述果胶酶和蛋白酶在降解海带中的应用。

各自酶的加入量为海带粉内依次加入其质量的1％褐藻胶、0.5％的果胶酶和0.5％的蛋白酶。其中，蛋白酶为酸性蛋白酶是一种蛋白水解酶类，能够在酸性条件下水解动植物蛋白质，通过内切和外切作用将蛋白质水解为小肽和氨基酸(购自宁夏夏盛实业集团有限公司，酶活60000u/g)。

一种果胶酶的应用，所述褐藻胶裂解酶和所述的果胶酶在降解海带中的应用。

本发明所具有的优点：本发明可以利用枯草芽孢杆菌表达***快速表达来源于海洋嗜热菌Defluviitalea phaphyphila sp.Alg1的褐藻胶裂解酶以及嗜热菌Caldicellulosiruptor sp.strain F32来源的果胶酶pG1466，本发明所述的褐藻胶裂解酶和果胶酶具有安全性好、酶活高的优点，具备良好的工业应用前景。

附图说明

图1为本发明实施例提供的褐藻胶裂解酶AL1059和果胶酶pG1466的基因功能预测示意图；

图2为本发明实施例提供的pHT43表达载体和褐藻胶裂解酶AL1059、果胶酶pG1466琼脂糖凝胶电泳图；其中，1为pHT43表达载体，2为褐藻胶裂解酶AL1059，3为果胶酶pG1466的琼脂糖凝胶电泳图

图3为本发明实施例提供的重组质粒pHT43-AL1059和pHT43-pG1466质粒图谱；

图4为本发明实施例提供的菌落PCR验证琼脂糖凝胶电泳图；其中A为AL1059A；B为pG1466。

图5为本发明实施例提供的褐藻胶裂解酶AL1059和果胶酶pG1466的最适温度、最适pH；其中A是褐藻胶裂解酶AL1059的最适温度，B是褐藻胶裂解酶AL1059的最适温度pH，C是果胶酶pG1466的最适温度，D是果胶酶pG1466的最适pH

图6为本发明实施例提供的3L发酵罐对AL1059和pG1466发酵过程的酶活和OD600nm随时间变化图；其中A是AL1059发酵过程的酶活和OD600nm随时间变化图，B是pG1466发酵过程的酶活和OD600nm随时间变化图。

图7为本发明实施例提供的SDS-PAGE分析3L发酵罐中AL1059和pG1466不同取样时间点的胞外蛋白表达情况；其中A是AL1059不同取样时间点的胞外蛋白表达情况B是pG1466不同取样时间点的胞外蛋白表达情况。

图8为本发明实施例提供的海带酶解过程最适缓冲液种类及最适pH测定；

图9为本发明实施例提供的海带酶解过程的最适温度测定；

图10为本发明实施例提供的海带酶解过程不同酶解时间后海带酶解液中的还原糖含量测定；

图11为本发明实施例提供的BCA法测定蛋白含量标准曲线；

图12为本发明实施例提供的HPLC法测定甘露醇含量标准曲线；

图13为本发明实施例提供的DNS法测定葡萄糖醛酸标曲，测定褐藻胶裂解酶酶活；

图14为本发明实施例提供的HPLC检测甘露醇含量出峰时间；

图15为本发明实施例提供的DNS法测定葡萄糖含量标曲。

具体实施方式

下面结合附图和实施例对本发明作进一步的解释说明。

本发明利用基因工程的方法，将褐藻胶裂解酶和果胶酶的基因克隆到是公认安全菌株枯草芽孢杆菌母中。在3L发酵罐中，褐藻胶裂解酶AL1059发酵42h后，发酵36h后OD达到了最高为56.6，发酵42h酶活达到了最高为26194.2U/mL。果胶酶pG1466的发酵结果如图6B所示，发酵42h后OD达到了最高为68.3，发酵48h酶活达到了最高为6.08U/mL。获得可制备褐藻胶酶和果胶酶的枯草芽孢杆菌菌株。所产生的重组褐藻胶裂解酶和果胶酶可以和蛋白酶一起配合使用进行褐藻降解，进过复合酶降解12h后，酶解液中总蛋白含量为20.6mg/L，海藻酸含量为5.16％，甘露醇含量为12g/L，还原糖含量为20g/L。该降解过程温和、高效，具有良好的工业化应用潜质

实施例1、

根据海洋嗜热菌D.phaphyphila sp.Alg1菌株基因组DNA中AL1059基因序列，以及以及嗜热菌Caldicellulosiruptor sp.strain F32来源的果胶酶pG1466，进行密码子优化和基因合成。用NCBI(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)网站的Basic Local AlignmentSearch Tool(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)，对Al1059和Pg1466进行保守结构域的预测和分析。

Al1059由orf1059编码，基因全长1935bp，其具有两个预测结构域，即AlgLyasesuperfamily(氨基酸顺序19-329)和Heper_II_III superfamily(氨基酸顺序346-585)。选择只有AlgLyase superfamily(氨基酸顺序19-329)的截短蛋白进行表达，将该基因表达的酶命名为AL1059，碱基序列如SEQ ID NO.1所示(结构预测示意图结果如图1所示)。

Pg1466由orf1466编码，基因全长1341bp，将该基因表达的酶命名为pG1466为多聚半乳糖醛酸酶Polygalacturonase，具有Pgu1superfamily结构域(结构预测示意图结果如图1所示)。由于宿主菌株有其自身的密码子偏好性，使用密码子在线优化软件Codon-Adaptation(http://www.jcat.de/Start.jsp)，以Bacillus subtilis为目标菌株对AL1059原始序列进行优化；发送相应序列给华大基因公司进行基因合成，褐藻胶裂解酶AL1059密码子优化后的基因序列如SEQ ID NO.2所示；果胶酶pG1466的密码子优化后的基因序列如SEQ ID NO.5所示。

本发明所述的褐藻胶裂解酶AL1059的原始基因序列如SEQ ID NO.1所示。

SEQ ID NO.1：

TTATTAAATCATTATAGGAAAGTTCTCCCTTACAGAACTAGAGGATATCATCAAGATGAAATAGGACCAATTATACCTGAAGACACTTCAGAAAAAGCAAATAAATTTTTAAATAGAGAATTTGATTTAGCAGGATATACTGTAAATATGAAAGATAAATTAAATTGGTATGCTACACCTACTGGAGATTTAGAATGGAATGGTGGTTTAGTAAGACATGGTCATTTTGTTGTTATGGCCAATGAATATATAAGAACATCTGATGAAAGATTTGCAAAAGAAATTATTGACCAAATGCTTGATTATATTGAAAATGTTCCTGTATATGACCCAACAGACAAACCATATCTTGAATATAAAAAATCAACTTGGAGGCCTTTTGAAGCAGCAGCTAGAATGGGAGAAACATGGCCTGAAGCTTTAGGGAAAATAATTAATTCAAAATCAATGACAGCAGAAGCTTTTGCAAAAATATTATTATCTACTTATGAACATGCAAAATTTATTAGAAAATACCATTGGAAAACTGGAAATCATGCAGTAGGAGAAGTTGCATCATTAGGGATAACATCTATATTTTACAGTGAATTTAAAGAAGCAGATACTTGGCGTCAATATGCAGTAGATTTTTTAATGAATATGTGGGATAAACTATTTAATAAAGATTATTATACAAATGAGATGTCAGGTGGTTATCACTGGGTTGCTATGAGAAGTTTTTTTGCATTTTATGAAGTAGCAAAGAAAAATGCTCTTGAACATATATTTCCTAATATATATACCGAAAGATTAATTAATGCCTCTTATGCTGAATTATATCAAGAAAAACCAGACTATTCTATTCCAGTTACTAATGATTCAAGTAGCAAAACAAATAGAAAGAAACAATTAGAAAGAATTTATAATCTTTTTAAATTAGAAGAAATTAAATAT

(a)序列特征：

·长度：933

·类型：基因序列

·链型：单链

·拓扑结构：线性

(b)分子类型：DNA

(c)假设：否

(d)反义：否

(e)最初来源：Defluviitalea phaphyphila sp.Alg1

本发明所述的褐藻胶裂解酶AL1059的密码子优化后的基因序列如SEQ ID NO.2所示。

SEQ ID NO.2：

CTTCTTAACCATTACCGTAAAGTTCTTCCTTACCGTACACGTGGCTACCATCAAGATGAAATCGGCCCTATCATCCCTGAAGATACATCTGAAAAAGCTAACAAATTCCTTAACCGTGAATTCGATCTTGCTGGCTACACAGTTAACATGAAAGATAAACTTAACTGGTACGCTACACCTACAGGCGATCTTGAATGGAACGGCGGCCTTGTTCGTCATGGCCATTTCGTTGTTATGGCTAACGAATACATCCGTACATCTGATGAACGTTTCGCTAAAGAAATCATCGATCAAATGCTTGATTACATCGAAAACGTTCCTGTTTACGATCCTACAGATAAACCTTACCTTGAATACAAAAAATCTACATGGCGTCCTTTCGAAGCTGCTGCTCGTATGGGCGAAACATGGCCTGAAGCTCTTGGCAAAATCATCAACTCTAAATCTATGACAGCTGAAGCTTTCGCTAAAATCCTTCTTTCTACATACGAACATGCTAAATTCATCCGTAAATACCATTGGAAAACAGGCAACCATGCTGTTGGCGAAGTTGCTTCTCTTGGCATCACATCTATCTTCTACTCTGAATTCAAAGAAGCTGATACATGGCGTCAATACGCTGTTGATTTCCTTATGAACATGTGGGATAAACTTTTCAACAAAGATTACTACACAAACGAAATGTCTGGCGGCTACCATTGGGTTGCTATGCGTTCTTTCTTCGCTTTCTACGAAGTTGCTAAAAAAAACGCTCTTGAACATATCTTCCCTAACATCTACACAGAACGTCTTATCAACGCTTCTTACGCTGAACTTTACCAAGAAAAACCTGATTACTCTATCCCTGTTACAAACGATTCTTCTTCTAAAACAAACCGTAAAAAACAACTTGAACGTATCTACAACCTTTTCAAACTTGAAGAAATCAAATAC

(a)序列特征：

·长度：933

·类型：基因序列

·链型：单链

·拓扑结构：线性

(b)分子类型：DNA

(c)假设：否

(d)反义：否

(e)最初来源：Defluviitalea phaphyphila sp.Alg1

优化前后序列比对结果如下

本发明所述的褐藻胶裂解酶AL1059的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示。

SEQ ID NO.3：

LLNHYRKVLPYRTRGYHQDEIGPIIPEDTSEKANKFLNREFDLAGYTVNMKDKLNWYATPTGDLEWNGGLVRHGHFVVMANEYIRTSDERFAKEIIDQMLDYIENVPVYDPTDKPYLEYKKSTWRPFEAAARMGETWPEALGKIINSKSMTAEAFAKILLSTYEHAKFIRKYHWKTGNHAVGEVASLGITSIFYSEFKEADTWRQYAVDFLMNMWDKLFNKDYYTNEMSGGYHWVAMRSFFAFYEVAKKNALEHIFPNIYTERLINASYAELYQEKPDYSIPVTNDSSSKTNRKKQLERIYNLFKLEEIKY

(a)序列特征：

·长度：311

·类型：氨基酸序列

·链型：单链

·拓扑结构：线性

(b)分子类型：蛋白质

(c)假设：否

(d)反义：否

(e)最初来源：Defluviitalea phaphyphila sp.Alg1

本发明所述的果胶酶pG1466的原始基因序列如SEQ ID NO.4所示。

SEQ ID NO.4：

ATGTTTTTAAATGTTCGTGATTTTGGAGCGGTGGGAAATGGGCAGGTAAAAGATACAGAAGCATTCAAAAAGGCGATTGAAGCAAGTTGGGAGCAAGGTGGTGGGACGGTTTATGTACCTGCTGGAGTTTATCTAACCGGTCCCATTCATCTGAAGAGCAATATAACCCTCTATATAGAAAGTGGGGCTACATTGAAATTTTCCAACGACCTGGATGATTTTCCTTTAGTTTATACAAGATGGGAAGGAGAAGAACAAGAAGCATACTCTCCACTAATTTATGCCGAAAATGCAGAAAACATTGCAGTTGTTGGATTTGGCACAATAGATGGGCAGGGTGAAATGTGGTGGAAACTTCACAGAAATAAAGAACTAAAATATCCAAGACCAAGGACAGTTTGCTTTTACAGGTGCAAAAATGTGACTATTGAAGGAATAAAGATTGTCAATTCACCAAGCTGGACGGTAAACCCAATCGAATGTGAGAATGTCACAGTTCACAATGTCAAGATTCAAAACCCTTATGATTCTCCTAACACAGATGGGATAAATCCTGAGTCTTGCGAAGGTGTTAGAATCTCAAACTGCTACATAGATGTTGGCGATGACTGTGTAACTTTAAAATCCGGAACAGAAGATTGCAAGGTGAGGATTCCTTGTGAGAATATAGCAATTACAAACTGCATAATGGCACATGGTCATGGTGGAATTGTCATTGGCAGTGAAATGAGCGGTGGTGTTAGAAATGTTGTCATTTCAAACTGCATTTTTGAGGGTACAGACAGGGGAATAAGAATAAAAACCCGCCGTGGAAGAGGTGGGATTGTTGAAGATATAAGAGTTTCAAACATTGTGATGAAGAATGTAATCTGTCCATTTGCGTTTTATATGTACTATCACTGTGGCAAAGGCGGAAAAGAAAAGAGAGTTTGGGACAAGTCTCCTTATCCTGTAGACAGTACAACTCCAATTGTAAGAAGAATTTATATAAGCGATGTGATTGTAAGGCAGGCGCGAGCAGCAGCTGGATTTTTGTATGGTCTTACAGAGATGCCAATTGAAGATGTTGTATTTTCGAATGTCACAGTTGAGATGGCACAAAACCCTGAGCCTGAACTTCCTGCTATGATGAGCTATTTAGAACCGATGGCAAAAAGAGGGTTTGTCATAAATACTGTGAGGAATATAAGATTTATGAATGTTACTGTGCTGGAACAGGAAGGTGTTGCTTTTGAACTTAACAATTGTGAAAATGTAGAGTTTTACAGATGCAGGGCAAAAGATACAGCAGATTATTCTAAGATTTTGAGTCTGAATAATACAATGAATCTGATTGCCGAG

(a)序列特征：

·长度：1341

·类型：基因序列

·链型：单链

·拓扑结构：线性

(b)分子类型：DNA

(c)假设：否

(d)反义：否

(e)最初来源：Caldicellulosiruptor sp.strain F32

本发明所述的果胶酶pG1466的密码子优化后的基因序列如SEQ ID NO.5所示。

SEQ ID NO.5：

ATGTTCCTTAACGTTCGTGATTTCGGCGCTGTTGGCAACGGCCAAGTTAAAGATACAGAAGCTTTCAAAAAAGCTATCGAAGCTTCTTGGGAACAAGGCGGCGGCACAGTTTACGTTCCTGCTGGCGTTTACCTTACAGGCCCTATCCATCTTAAATCTAACATCACACTTTACATCGAATCTGGCGCTACACTTAAATTCTCTAACGATCTTGATGATTTCCCTCTTGTTTACACACGTTGGGAAGGCGAAGAACAAGAAGCTTACTCTCCTCTTATCTACGCTGAAAACGCTGAAAACATCGCTGTTGTTGGCTTCGGCACAATCGATGGCCAAGGCGAAATGTGGTGGAAACTTCATCGTAACAAAGAACTTAAATACCCTCGTCCTCGTACAGTTTGCTTCTACCGTTGCAAAAACGTTACAATCGAAGGCATCAAAATCGTTAACTCTCCTTCTTGGACAGTTAACCCTATCGAATGCGAAAACGTTACAGTTCATAACGTTAAAATCCAAAACCCTTACGATTCTCCTAACACAGATGGCATCAACCCTGAATCTTGCGAAGGCGTTCGTATCTCTAACTGCTACATCGATGTTGGCGATGATTGCGTTACACTTAAATCTGGCACAGAAGATTGCAAAGTTCGTATCCCTTGCGAAAACATCGCTATCACAAACTGCATCATGGCTCATGGCCATGGCGGCATCGTTATCGGCTCTGAAATGTCTGGCGGCGTTCGTAACGTTGTTATCTCTAACTGCATCTTCGAAGGCACAGATCGTGGCATCCGTATCAAAACACGTCGTGGCCGTGGCGGCATCGTTGAAGATATCCGTGTTTCTAACATCGTTATGAAAAACGTTATCTGCCCTTTCGCTTTCTACATGTACTACCATTGCGGCAAAGGCGGCAAAGAAAAACGTGTTTGGGATAAATCTCCTTACCCTGTTGATTCTACAACACCTATCGTTCGTCGTATCTACATCTCTGATGTTATCGTTCGTCAAGCTCGTGCTGCTGCTGGCTTCCTTTACGGCCTTACAGAAATGCCTATCGAAGATGTTGTTTTCTCTAACGTTACAGTTGAAATGGCTCAAAACCCTGAACCTGAACTTCCTGCTATGATGTCTTACCTTGAACCTATGGCTAAACGTGGCTTCGTTATCAACACAGTTCGTAACATCCGTTTCATGAACGTTACAGTTCTTGAACAAGAAGGCGTTGCTTTCGAACTTAACAACTGCGAAAACGTTGAATTCTACCGTTGCCGTGCTAAAGATACAGCTGATTACTCTAAAATCCTTTCTCTTAACAACACAATGAACCTTATCGCTGAA

(a)序列特征：

·长度：1341

·类型：基因序列

·链型：单链

·拓扑结构：线性

(b)分子类型：DNA

(c)假设：否

(d)反义：否

(e)最初来源：Caldicellulosiruptor sp.strain F32

本发明所述的果胶酶pG1466的氨基酸序列如SEQ ID NO.6所示。

SEQ ID NO.6：

MFLNVRDFGAVGNGQVKDTEAFKKAIEASWEQGGGTVYVPAGVYLTGPIHLKSNITLYIESGATLKFSNDLDDFPLVYTRWEGEEQEAYSPLIYAENAENIAVVGFGTIDGQGEMWWKLHRNKELKYPRPRTVCFYRCKNVTIEGIKIVNSPSWTVNPIECENVTVHNVKIQNPYDSPNTDGINPESCEGVRISNCYIDVGDDCVTLKSGTEDCKVRIPCENIAITNCIMAHGHGGIVIGSEMSGGVRNVVISNCIFEGTDRGIRIKTRRGRGGIVEDIRVSNIVMKNVICPFAFYMYYHCGKGGKEKRVWDKSPYPVDSTTPIVRRIYISDVIVRQARAAAGFLYGLTEMPIEDVVFSNVTVEMAQNPEPELPAMMSYLEPMAKRGFVINTVRNIRFMNVTVLEQEGVAFELNNCENVEFYRCRAKDTADYSKILSLNNTMNLIAE

(a)序列特征：

·长度：447

·类型：氨基酸序列

·链型：单链

·拓扑结构：线性

(b)分子类型：蛋白质

(c)假设：否

(d)反义：否

(e)最初来源：Caldicellulosiruptor sp.strain F32

实施例2、

枯草芽孢杆菌表达载体pHT43-AL1059和pHT43-pG1466构建。

根据上述AL1059和pG1466密码子优化后的基因序列和大肠杆菌-枯草芽孢杆菌穿梭质粒pHT43的多克隆位点；pHT43表达载体是大肠杆菌-枯草芽孢杆菌穿梭质粒，作为诱导型载体，pHT43的强启动子Pgrac是将groESL这个启动子融合在乳糖操纵子的下游得到，在以后的应用中可以用乳糖替代物IPTG进行诱导表达，实现产业化应用。并选择BamH I和SmaI作为酶切位点，设计相应引物，去掉自身84bp的信号肽，两端分别加上酶切位点。设计引物如下：

AL1059：

正向引物F：5’-CGGGATTCCTTCTTAACCATTACCGTAAAGTTCTTCC-3’(BamH I)；

反向引物R：5’-TCCCCCGGGGTATTTGATTTCTTCAAGTTTGAAAAGG-3’(Sma I)；

pG1466：

正向引物F：5’-CGGGATTCATGTTCCTTAACGTTCGTGATTTCGGCGCTG-3’(BamH I)；

反向引物R：5’-TCCCCCGGGTTCAGCGATAAGGTTCATTGTGTTGTTAAG-3’(Sma I)；

正向引物中下划线标注的是限制性内切酶BamH I位点，反向引物下划线标注的是限制性内切酶Sma I位点，加粗显示的是保护碱基；

1)以Defluviitalea phaphyphila sp.Alg1基因组DNA为模板进行AL1059的基因PCR扩增，以Caldicellulosiruptor sp.strain F32基因组DNA为模板进行pG1466的基因PCR扩增PCR反应体系如下：

正向引物(10pM)	1μL
		反向引物(10pM)	1μL
模板DNA	1μL
		2×TransStart FastPfu PCR SuperMix	50μL
H<sub>2</sub>O	43μL

PCR扩增条件如下：预变性，变性，退火，延伸，循环33次，延伸。PCR完成后进行琼脂糖凝胶电泳验证AL1059和pG1466的分子量大小为933bp和1341bp左右，表明扩增成功，见图2B所示，2为pG1466，1为AL1059。

2)使用TransGen Biotech质粒小提试剂盒提取质粒，并进行双酶切。将扩增好的目的基因片段和载体进行双酶切。37℃过夜处理2h。

酶切体系如下：

PCR产物/质粒	50μL
		BamH I	1μg/μL
Sma I	1μg/μL
		10×酶切反应buffer	10μL
H<sub>2</sub>O	补齐至100μL

酶切后的载体首先进行琼脂糖凝胶电泳确定分子量大小为8000bp左右，见图2A，表明酶切成功。

3)连接：使用Omega PCR纯化试剂盒进行PCR产物纯化，测定浓度，按照大片段：小片段的摩尔比为1：3的比例使用T4DNA连接酶进行连接，16℃连接12h，连接体系如下：

目的片段AL1059	2μL
		pHT43	5μL
T<sub>4</sub>DNA连接酶	1μL
		10×连接反应buffer	1μL
H<sub>2</sub>O	补齐至10μL

4)转化Trans1-E1感受态细胞(TransGen Biotech)：将连接产物加入到50μLTrans1-T1感受态细胞中(在感受态细胞刚刚解冻时加入连接产物)，轻弹混匀，冰浴30min。冰浴结束后42℃热激30秒，然后立即置于冰上2分钟。加0.6ml LB无抗培养基，200转，37℃孵育1小时。菌液6000rpm离心1min后，取50-100μL全部用来涂添加了氨苄的LB平板，培养过夜。

5)PCR方法分析阳性重组子

(1)挑选克隆至500μL LB液体培养基中，37℃培养5-6h。

(2)25μL反应体系中取1μL菌液液用作PCR反应的模板，用AL1059和pG1466正向引物和反向引物鉴定重组子。

PCR反应条件，循环数33个：

94℃	10min
		94℃	30sec
67℃	30sec
		72℃	60sec
72℃	10min

结果得到大小为933bp和1341bp左右的的扩增条带，如图4所示。初步验证正确后，再挑选正确的质粒，送样到青岛擎科梓熙公司进行测序，进一步证明构建的重组质粒pHT43-AL1059，pHT43-pG1466正确。质粒图谱如图3所示。

实施例3、枯草芽孢杆菌重组工程菌的构建

将实施例2中所得的正确质粒，过夜扩大培养，扩大培养后经质粒小提试剂盒(TransGen Biotech)分别提取质粒pHT43-AL1059和pHT43-pG1466，将提取的质粒分别转化枯草芽孢杆菌表达菌株WB800。转化方法如下：

1)枯草芽孢杆菌表达菌株WB800接种5μL至5mL LB培养基中，220rpm，37℃过夜培养菌株；

2)取过夜培养的种子0.2ml接种至20ml RHAF培养基，37℃，250rpm摇床培养；

3)检测培养物的OD600nm达到0.4(枯草芽孢杆菌WB800一般生长3-3.5h)，而后6000rpm离心10min收集菌体，重悬于2ml RHAF培养基；

4)向重悬液中加入终浓度为0.6mg/ml的溶菌酶，37℃孵育25-30min(镜检可见细胞均成圆球形)；

5)孵育结束后，1000g离心5min收集原生质体，用2ml RHAF培养基清洗一遍，再用2ml RHAF培养基重悬；

6)取0.2ml重悬液转入新离心管，分别加入上述构建好的质粒pHT43-AL1059和pHT43-pG1466质粒和0.2ml 35％PEG 8000，在37℃孵育3min，立即加入3ml RHAF培养基，1000g离心5min收集原生质体，重悬沉淀于1ml RHAF培养基；

7)上述重悬液37℃孵育90min，涂布于无抗性的RHAF培养基平板，30℃过夜培养(培养时间不宜过长，16h左右即可，否则菌浓度太高，不利于后面涂平板)；

8)用LB培养基洗脱菌落(镜检可见细胞恢复正常的形态)，涂布于含5μg/μL的氯霉素抗性LB平板；12-24h后可见克隆长出菌落；

菌落PCR验证阳性克隆，PCR反应条件如下，33个循环

94℃	10min
		94℃	30sec
67℃	30sec
		72℃	60sec
72℃	10min

结果得到大小为933bp和1341bp左右的的扩增条带。

该过程中所使用的培养基配方为：

LB培养基：酵母粉5g/L，蛋白胨10g/L，NaCl 10g/L；

RHAF培养基：NH₄Cl 1g/L，Tris base 12g/L，KCl 0.035g/L，NaCl 0.058g/L，Na₂SO₄·10H₂O,0.30g/L，KH₂PO₄ 0.14g/L，MgCl₂.5H₂O 4.26g/L(调pH后加入)，酵母粉5g/L，蛋白胨5g/L，蔗糖68.46g/L葡萄糖溶液2g/L。调整pH为7.5。

实施例4、AL1059和pG1466在枯草芽孢杆菌重组工程菌中的表达

4.1枯草芽孢杆菌重组工程菌在摇瓶中进行蛋白诱导表达

1)将上述实施例获得含有重组质粒pHT43-AL1059和pHT43-pG1466的重组枯草芽孢杆菌从保种管中取出，分别按照1wt‰的接种量接种于含有5mg/L氯霉素的LB液体培养基中，于37℃、220rpm培养过夜，作为一级种子；

2)分别将pHT43-AL1059和pHT43-pG1466的一级种子以10wt％的接种量接种至装有100mL LB培养基的500mL三角瓶中，检测菌体浓度达到OD600nm为0.8至1.0时，加入终浓度为1mM的诱导剂IPTG开始诱导。在温度37℃、转速220rpm条件下诱导培养24-30小时后，8000rpm，4℃离心10min，分别所得上清液即为含褐藻胶裂解酶的粗酶液和含有果胶酶pG1466粗酶液。

3)褐藻胶裂解酶的酶活测定方法为3，5-二硝基水杨酸法。标准曲线如图13所示，取上述实施例获得粗酶液与1mL1％褐藻酸钠溶液(pH 5.8的100mM的HAC-NaAC缓冲液)于EP管中混匀，同时以相同体积的蒸馏水替代酶液做空白对照试验。70℃，反应5min，冷却，取出100μL加入3，5二硝基水杨酸显色剂125μL，再沸水浴5min显色，冷却，加入蒸馏水200μL，混匀，在550nm下测定吸光度(用空白调零)，将每分钟催化海藻酸钠水解生成1μg葡糖醛酸定义为一个海藻酸裂解酶活力单位(U)。经测定酶活性为336.5U/mL。

4)褐藻胶裂解酶AL1059的最适反应温度和pH的测定：

分别以0.2％的海藻酸钠为底物测定褐藻胶裂解酶AL1059在pH7.0值条件下测其在不同温度范围(30、40、50、60、65、70、75、80、85、90℃)的酶活，确定其最适反应温度，结果如图5A所示。在70℃测定蛋白在不同pH范围(pH4、5、5.2、5.6、5.8为200mM的乙酸-乙酸钠缓冲液；pH6、6.4、7、7.4、8为磷酸盐缓冲液的酶活；pH7.1、7.5、8。1、8.5的Tris-HCl)最适反应pH值。结果如图5B所示。

5)果胶酶的酶活测定方法为OD235nm法，以0.2％的聚半乳糖醛酸(polygalacturonic acid)为底物测定蛋白酶活时使用分光光度法在OD235nm测定不饱和褐藻寡糖生成量。在有水浴锅循环加热的紫外分光光度计下测定其OD235nm的变化值。1分钟裂解聚半乳糖醛酸产生1μmol不饱和聚半乳糖醛酸定义为一个酶活单位。

6)果胶酶酶的最适反应温度分别：以0.2％的聚半乳糖醛酸(polygalacturonicacid)在在其pH7.0值条件下测其在不同温度范围(30、40、50、60、65、70、75、80、85、90℃)的酶活，确定其最适反应温度，结果如图5C所示。在70℃测定蛋白在不同pH范围(pH4、5、5.2、5.6、5.8为200mM的乙酸-乙酸钠缓冲液；pH6、6.4、7、7.4、8为磷酸盐缓冲液的酶活；pH7.1、7.5、8。1、8.5的Tris-HCl)最适反应pH值。结果如图5D所示。

4.2枯草芽孢杆菌重组工程菌在3L发酵罐中进行蛋白诱导表达

1)将含有重组质粒pHT43-AL1059和pHT43-pG1466的重组枯草芽孢杆菌从保种管中取出，按照1wt‰的接种量分别接种于含有5mg/L氯霉素的LB液体培养基中，于37℃、220rpm培养过夜，作为一级种子；

2)从上述获得一级种子中取出130μL分别加入装有130mL LB培养基的500mL锥形瓶中，37℃、220rpm培养12h，作为二级种子；

3)使用3-L发酵罐(BioFlo115,New Brunswick Scientific Co.,Edison,NJ),初始装发酵培养基的量为1.2L，分别接种上述分别获得的二级种子，接种量10wt％。

发酵培养基如下：酵母粉20g/L,Na₂SO₃ 2g/L,玉米浆粉30g/L,葡萄糖10g/L,MgSO₄·7H₂O 1g/L,(NH₄)₂–H-citrate 1g/L,(NH₄)₂SO₄2.68g/L,NaH₂PO₄·H₂O 4g/L,K₂HPO₄14.6g/L,and 3ml/L微量元素。

其中微量元素包含如下：CaCl₂ 0.5g/L,ZnSO₄·7H₂O 0.18g/L,MnSO₄·H₂O 0.1g/L,Na₂-EDTA 10.05g/L,FeCl₃ 8.35g/L,CuSO₄·5H₂O 0.16g/L,CoCl₂·6H₂O 0.18g/L。

补料培养基为：上述微量元素40mL/L,葡萄糖500g/L,(NH₄)₂HPO₄ 63.36g/L,MgSO₄·7H₂O 7.89g/L。

4)过程控制参数如下，初始温度维持在37℃，接种之后溶氧逐渐下降，待其下降至30％时，手动调整通气量(0.5-5L/min)，采用转速与溶氧关联的方式(转速在200-800rpm之间)，控制DO在20-30％。6h之后，OD600nm为5-6之间时，加入终浓度为1mM的IPTG，同时把发酵温度降低到35℃，开始诱导。待初始培养基中的葡萄糖耗尽后，开始补料，使体系内维持葡萄糖浓度为1-5g/L，DO维持在20-30％之间。pH用氨水和20％(v/v)的H₃PO₄维持在7.0，发酵周期48h，每隔6h取样一次测定OD和酶活。

AL1059的发酵结果如图6A所示，发酵42h后OD达到了最高为56.6，发酵42h酶活达到了最高为26194.2U/mL。胞外蛋白跑SDS-PAGE结果如图7A所示，1、2、3、4分别代表了12h、24h、36h和48h的胞外蛋白表达情况。

pG1466的发酵结果如图6B所示，发酵42h后OD达到了最高为68.3，发酵48h酶活达到了最高为6.08U/mL。胞外蛋白跑SDS-PAGE结果如图7B所示，1、2、3、4分别代表了12h、24h、36h和48h的胞外蛋白表达情况。

实施例5、协同降解海带

海带细胞壁的成分40％左右的是褐藻胶，其余主要成分为蛋白质、海带多糖、岩藻多糖等物质，这些物质相互缠绕形成致密的结构。目前的方法主要是使用某一种酶来对海带进行处理，使得单一酶法无法很好的发挥作用。

下述降解海带体系为：

(1)以15wt％的海带粉作为底物，向底物中将放置于50℃恒温摇床、200rpm溶胀2h，待底物变为胶状固体，无团状干海带粉，表明溶胀完全。

(2)而后向上述溶胀后海带粉内依次加入其质量的1％的褐藻胶裂解酶、0.5％的果胶酶和0.5％的蛋白酶，体系pH为7.0的0.2M的Tris-HCl缓冲液。继续放入50℃、恒温摇床、200rpm开始酶解。

1)采用褐藻胶裂解酶AL1059与果胶酶pG1466协同降解海带：

以15wt％的海带粉作为底物时，当只加底物质量1％的褐藻胶裂解酶、底物质量0.5％的果胶酶(体系pH为7.0的0.2M的Tris-HCl缓冲液)时海带粉降解率为88.3％。

2)褐藻胶裂解酶AL1059与果胶酶pG1466、蛋白酶协同降解海带

以15wt％的海带粉作为底物时，加入底物质量1％的褐藻胶裂解酶、底物质量0.5％的果胶酶和底物质量0.5％的蛋白酶，体系pH为7.0的0.2M的Tris-HCl缓冲液，海带粉降解率能达到92.3％。

上述三种酶协同降解优化条件为：

(1)为了获得最优酶解条件，以海带酶解液中的还原糖为指标，进一步测定了复合酶的酶解过程的最适反应缓冲液及最适pH(pH缓冲液种类及其梯度为：0.2M的下列各缓冲液KAC-HAC pH4.5、KAC-HAC pH5、KAC-HAC pH5.5、NaAC-HAC pH4.5、NaAC-HAC pH5、NaAC-HAC pH5.5、Na₂CO₃pH4.5、Na₂CO₃pH5、Na₂CO₃pH5.5)、最适温度(40℃、50℃、60℃)和酶解反应所需的时间(参见图8和图9)。结果如图8所示，表明酶解最适缓冲液为醋酸-醋酸钠缓冲液、最适pH为5.5、最适温度结果如图9所示，为50℃。酶解反应12h之后所释放的还原糖含量为15.96g/L，酶解24h后还原糖含量最高为17.11g/L。酶解12h已经达到了最高含量的94.5％，综合考虑，酶解12h为宜。

(2)对酶解后海带酶解液中其余营养成分的含量，按照上述获得最适条件，对海带进行复合酶解，酶解12h后，对酶解液中的海藻酸、总蛋白、甘露醇进行了测定。

海藻酸含量测定采用硫酸-卡唑法，标准曲线使用海藻酸钠进行测定、蛋白含量采用BCA法进行检测、甘露醇含量使用HPLC法进行检测，使用Agilent 1260HPLC***，色谱柱型号为Hi-Plex H300×7.7mm，使用示差折光检测器，流动相为5mM的硫酸，流速0.7mL/min，保留时间30min，柱温控制55℃。经测定甘露醇的出峰时间为10.552min(参见图14)。蛋白含量标曲如图11所示，甘露醇含量标曲如图12所示，还原糖含量标曲如图15所示。经检测酶解液中总蛋白含量为20.6mg/L，海藻酸含量为5.16％，甘露醇含量为12g/L，还原糖含量为20g/L。

序列表

<110> 潍坊麦卡阿吉生物科技有限公司

<120> 一种褐藻胶裂解酶或果胶酶及其在协同降解褐藻方面的应用

<160> 6

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 933

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

ttattaaatc attataggaa agttctccct tacagaacta gaggatatca tcaagatgaa 60

ataggaccaa ttatacctga agacacttca gaaaaagcaa ataaattttt aaatagagaa 120

tttgatttag caggatatac tgtaaatatg aaagataaat taaattggta tgctacacct 180

actggagatt tagaatggaa tggtggttta gtaagacatg gtcattttgt tgttatggcc 240

aatgaatata taagaacatc tgatgaaaga tttgcaaaag aaattattga ccaaatgctt 300

gattatattg aaaatgttcc tgtatatgac ccaacagaca aaccatatct tgaatataaa 360

aaatcaactt ggaggccttt tgaagcagca gctagaatgg gagaaacatg gcctgaagct 420

ttagggaaaa taattaattc aaaatcaatg acagcagaag cttttgcaaa aatattatta 480

tctacttatg aacatgcaaa atttattaga aaataccatt ggaaaactgg aaatcatgca 540

gtaggagaag ttgcatcatt agggataaca tctatatttt acagtgaatt taaagaagca 600

gatacttggc gtcaatatgc agtagatttt ttaatgaata tgtgggataa actatttaat 660

aaagattatt atacaaatga gatgtcaggt ggttatcact gggttgctat gagaagtttt 720

tttgcatttt atgaagtagc aaagaaaaat gctcttgaac atatatttcc taatatatat 780

accgaaagat taattaatgc ctcttatgct gaattatatc aagaaaaacc agactattct 840

attccagtta ctaatgattc aagtagcaaa acaaatagaa agaaacaatt agaaagaatt 900

tataatcttt ttaaattaga agaaattaaa tat 933

<210> 2

<211> 933

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

cttcttaacc attaccgtaa agttcttcct taccgtacac gtggctacca tcaagatgaa 60

atcggcccta tcatccctga agatacatct gaaaaagcta acaaattcct taaccgtgaa 120

ttcgatcttg ctggctacac agttaacatg aaagataaac ttaactggta cgctacacct 180

acaggcgatc ttgaatggaa cggcggcctt gttcgtcatg gccatttcgt tgttatggct 240

aacgaataca tccgtacatc tgatgaacgt ttcgctaaag aaatcatcga tcaaatgctt 300

gattacatcg aaaacgttcc tgtttacgat cctacagata aaccttacct tgaatacaaa 360

aaatctacat ggcgtccttt cgaagctgct gctcgtatgg gcgaaacatg gcctgaagct 420

cttggcaaaa tcatcaactc taaatctatg acagctgaag ctttcgctaa aatccttctt 480

tctacatacg aacatgctaa attcatccgt aaataccatt ggaaaacagg caaccatgct 540

gttggcgaag ttgcttctct tggcatcaca tctatcttct actctgaatt caaagaagct 600

gatacatggc gtcaatacgc tgttgatttc cttatgaaca tgtgggataa acttttcaac 660

aaagattact acacaaacga aatgtctggc ggctaccatt gggttgctat gcgttctttc 720

ttcgctttct acgaagttgc taaaaaaaac gctcttgaac atatcttccc taacatctac 780

acagaacgtc ttatcaacgc ttcttacgct gaactttacc aagaaaaacc tgattactct 840

atccctgtta caaacgattc ttcttctaaa acaaaccgta aaaaacaact tgaacgtatc 900

tacaaccttt tcaaacttga agaaatcaaa tac 933

<210> 3

<211> 311

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

Leu Leu Asn His Tyr Arg Lys Val Leu Pro Tyr Arg Thr Arg Gly Tyr

1 5 10 15

His Gln Asp Glu Ile Gly Pro Ile Ile Pro Glu Asp Thr Ser Glu Lys

20 25 30

Ala Asn Lys Phe Leu Asn Arg Glu Phe Asp Leu Ala Gly Tyr Thr Val

35 40 45

Asn Met Lys Asp Lys Leu Asn Trp Tyr Ala Thr Pro Thr Gly Asp Leu

50 55 60

Glu Trp Asn Gly Gly Leu Val Arg His Gly His Phe Val Val Met Ala

65 70 75 80

Asn Glu Tyr Ile Arg Thr Ser Asp Glu Arg Phe Ala Lys Glu Ile Ile

85 90 95

Asp Gln Met Leu Asp Tyr Ile Glu Asn Val Pro Val Tyr Asp Pro Thr

100 105 110

Asp Lys Pro Tyr Leu Glu Tyr Lys Lys Ser Thr Trp Arg Pro Phe Glu

115 120 125

Ala Ala Ala Arg Met Gly Glu Thr Trp Pro Glu Ala Leu Gly Lys Ile

130 135 140

Ile Asn Ser Lys Ser Met Thr Ala Glu Ala Phe Ala Lys Ile Leu Leu

145 150 155 160

Ser Thr Tyr Glu His Ala Lys Phe Ile Arg Lys Tyr His Trp Lys Thr

165 170 175

Gly Asn His Ala Val Gly Glu Val Ala Ser Leu Gly Ile Thr Ser Ile

180 185 190

Phe Tyr Ser Glu Phe Lys Glu Ala Asp Thr Trp Arg Gln Tyr Ala Val

195 200 205

Asp Phe Leu Met Asn Met Trp Asp Lys Leu Phe Asn Lys Asp Tyr Tyr

210 215 220

Thr Asn Glu Met Ser Gly Gly Tyr His Trp Val Ala Met Arg Ser Phe

225 230 235 240

Phe Ala Phe Tyr Glu Val Ala Lys Lys Asn Ala Leu Glu His Ile Phe

245 250 255

Pro Asn Ile Tyr Thr Glu Arg Leu Ile Asn Ala Ser Tyr Ala Glu Leu

260 265 270

Tyr Gln Glu Lys Pro Asp Tyr Ser Ile Pro Val Thr Asn Asp Ser Ser

275 280 285

Ser Lys Thr Asn Arg Lys Lys Gln Leu Glu Arg Ile Tyr Asn Leu Phe

290 295 300

Lys Leu Glu Glu Ile Lys Tyr

305 310

<210> 4

<211> 1341

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

atgtttttaa atgttcgtga ttttggagcg gtgggaaatg ggcaggtaaa agatacagaa 60

gcattcaaaa aggcgattga agcaagttgg gagcaaggtg gtgggacggt ttatgtacct 120

gctggagttt atctaaccgg tcccattcat ctgaagagca atataaccct ctatatagaa 180

agtggggcta cattgaaatt ttccaacgac ctggatgatt ttcctttagt ttatacaaga 240

tgggaaggag aagaacaaga agcatactct ccactaattt atgccgaaaa tgcagaaaac 300

attgcagttg ttggatttgg cacaatagat gggcagggtg aaatgtggtg gaaacttcac 360

agaaataaag aactaaaata tccaagacca aggacagttt gcttttacag gtgcaaaaat 420

gtgactattg aaggaataaa gattgtcaat tcaccaagct ggacggtaaa cccaatcgaa 480

tgtgagaatg tcacagttca caatgtcaag attcaaaacc cttatgattc tcctaacaca 540

gatgggataa atcctgagtc ttgcgaaggt gttagaatct caaactgcta catagatgtt 600

ggcgatgact gtgtaacttt aaaatccgga acagaagatt gcaaggtgag gattccttgt 660

gagaatatag caattacaaa ctgcataatg gcacatggtc atggtggaat tgtcattggc 720

agtgaaatga gcggtggtgt tagaaatgtt gtcatttcaa actgcatttt tgagggtaca 780

gacaggggaa taagaataaa aacccgccgt ggaagaggtg ggattgttga agatataaga 840

gtttcaaaca ttgtgatgaa gaatgtaatc tgtccatttg cgttttatat gtactatcac 900

tgtggcaaag gcggaaaaga aaagagagtt tgggacaagt ctccttatcc tgtagacagt 960

acaactccaa ttgtaagaag aatttatata agcgatgtga ttgtaaggca ggcgcgagca 1020

gcagctggat ttttgtatgg tcttacagag atgccaattg aagatgttgt attttcgaat 1080

gtcacagttg agatggcaca aaaccctgag cctgaacttc ctgctatgat gagctattta 1140

gaaccgatgg caaaaagagg gtttgtcata aatactgtga ggaatataag atttatgaat 1200

gttactgtgc tggaacagga aggtgttgct tttgaactta acaattgtga aaatgtagag 1260

ttttacagat gcagggcaaa agatacagca gattattcta agattttgag tctgaataat 1320

acaatgaatc tgattgccga g 1341

<210> 5

<211> 1341

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

atgttcctta acgttcgtga tttcggcgct gttggcaacg gccaagttaa agatacagaa 60

gctttcaaaa aagctatcga agcttcttgg gaacaaggcg gcggcacagt ttacgttcct 120

gctggcgttt accttacagg ccctatccat cttaaatcta acatcacact ttacatcgaa 180

tctggcgcta cacttaaatt ctctaacgat cttgatgatt tccctcttgt ttacacacgt 240

tgggaaggcg aagaacaaga agcttactct cctcttatct acgctgaaaa cgctgaaaac 300

atcgctgttg ttggcttcgg cacaatcgat ggccaaggcg aaatgtggtg gaaacttcat 360

cgtaacaaag aacttaaata ccctcgtcct cgtacagttt gcttctaccg ttgcaaaaac 420

gttacaatcg aaggcatcaa aatcgttaac tctccttctt ggacagttaa ccctatcgaa 480

tgcgaaaacg ttacagttca taacgttaaa atccaaaacc cttacgattc tcctaacaca 540

gatggcatca accctgaatc ttgcgaaggc gttcgtatct ctaactgcta catcgatgtt 600

ggcgatgatt gcgttacact taaatctggc acagaagatt gcaaagttcg tatcccttgc 660

gaaaacatcg ctatcacaaa ctgcatcatg gctcatggcc atggcggcat cgttatcggc 720

tctgaaatgt ctggcggcgt tcgtaacgtt gttatctcta actgcatctt cgaaggcaca 780

gatcgtggca tccgtatcaa aacacgtcgt ggccgtggcg gcatcgttga agatatccgt 840

gtttctaaca tcgttatgaa aaacgttatc tgccctttcg ctttctacat gtactaccat 900

tgcggcaaag gcggcaaaga aaaacgtgtt tgggataaat ctccttaccc tgttgattct 960

acaacaccta tcgttcgtcg tatctacatc tctgatgtta tcgttcgtca agctcgtgct 1020

gctgctggct tcctttacgg ccttacagaa atgcctatcg aagatgttgt tttctctaac 1080

gttacagttg aaatggctca aaaccctgaa cctgaacttc ctgctatgat gtcttacctt 1140

gaacctatgg ctaaacgtgg cttcgttatc aacacagttc gtaacatccg tttcatgaac 1200

gttacagttc ttgaacaaga aggcgttgct ttcgaactta acaactgcga aaacgttgaa 1260

ttctaccgtt gccgtgctaa agatacagct gattactcta aaatcctttc tcttaacaac 1320

acaatgaacc ttatcgctga a 1341

<210> 6

<211> 447

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

Met Phe Leu Asn Val Arg Asp Phe Gly Ala Val Gly Asn Gly Gln Val

1 5 10 15

Lys Asp Thr Glu Ala Phe Lys Lys Ala Ile Glu Ala Ser Trp Glu Gln

20 25 30

Gly Gly Gly Thr Val Tyr Val Pro Ala Gly Val Tyr Leu Thr Gly Pro

35 40 45

Ile His Leu Lys Ser Asn Ile Thr Leu Tyr Ile Glu Ser Gly Ala Thr

50 55 60

Leu Lys Phe Ser Asn Asp Leu Asp Asp Phe Pro Leu Val Tyr Thr Arg

65 70 75 80

Trp Glu Gly Glu Glu Gln Glu Ala Tyr Ser Pro Leu Ile Tyr Ala Glu

85 90 95

Asn Ala Glu Asn Ile Ala Val Val Gly Phe Gly Thr Ile Asp Gly Gln

100 105 110

Gly Glu Met Trp Trp Lys Leu His Arg Asn Lys Glu Leu Lys Tyr Pro

115 120 125

Arg Pro Arg Thr Val Cys Phe Tyr Arg Cys Lys Asn Val Thr Ile Glu

130 135 140

Gly Ile Lys Ile Val Asn Ser Pro Ser Trp Thr Val Asn Pro Ile Glu

145 150 155 160

Cys Glu Asn Val Thr Val His Asn Val Lys Ile Gln Asn Pro Tyr Asp

165 170 175

Ser Pro Asn Thr Asp Gly Ile Asn Pro Glu Ser Cys Glu Gly Val Arg

180 185 190

Ile Ser Asn Cys Tyr Ile Asp Val Gly Asp Asp Cys Val Thr Leu Lys

195 200 205

Ser Gly Thr Glu Asp Cys Lys Val Arg Ile Pro Cys Glu Asn Ile Ala

210 215 220

Ile Thr Asn Cys Ile Met Ala His Gly His Gly Gly Ile Val Ile Gly

225 230 235 240

Ser Glu Met Ser Gly Gly Val Arg Asn Val Val Ile Ser Asn Cys Ile

245 250 255

Phe Glu Gly Thr Asp Arg Gly Ile Arg Ile Lys Thr Arg Arg Gly Arg

260 265 270

Gly Gly Ile Val Glu Asp Ile Arg Val Ser Asn Ile Val Met Lys Asn

275 280 285

Val Ile Cys Pro Phe Ala Phe Tyr Met Tyr Tyr His Cys Gly Lys Gly

290 295 300

Gly Lys Glu Lys Arg Val Trp Asp Lys Ser Pro Tyr Pro Val Asp Ser

305 310 315 320

Thr Thr Pro Ile Val Arg Arg Ile Tyr Ile Ser Asp Val Ile Val Arg

325 330 335

Gln Ala Arg Ala Ala Ala Gly Phe Leu Tyr Gly Leu Thr Glu Met Pro

340 345 350

Ile Glu Asp Val Val Phe Ser Asn Val Thr Val Glu Met Ala Gln Asn

355 360 365

Pro Glu Pro Glu Leu Pro Ala Met Met Ser Tyr Leu Glu Pro Met Ala

370 375 380

Lys Arg Gly Phe Val Ile Asn Thr Val Arg Asn Ile Arg Phe Met Asn

385 390 395 400

Val Thr Val Leu Glu Gln Glu Gly Val Ala Phe Glu Leu Asn Asn Cys

405 410 415

Glu Asn Val Glu Phe Tyr Arg Cys Arg Ala Lys Asp Thr Ala Asp Tyr

420 425 430

Ser Lys Ile Leu Ser Leu Asn Asn Thr Met Asn Leu Ile Ala Glu

435 440 445

Claims

1.褐藻胶裂解酶和果胶酶在降解海带中的应用，其特征在于：褐藻胶裂解酶的碱基序列为SEQ ID NO.2；果胶酶的碱基序列为SEQ ID NO.5。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：褐藻胶裂解酶、果胶酶和蛋白酶在降解海带中的应用。