CN102358896B

CN102358896B - 一种耐热角质酶-cbd融合酶及其突变体和应用

Info

Publication number: CN102358896B
Application number: CN 201110295384
Authority: CN
Inventors: 吴敬; 陈晟; 张瑶; 吴丹; 陈坚; 夏泽华
Original assignee: Jiangnan University
Current assignee: Jiangnan University
Priority date: 2011-10-08
Filing date: 2011-10-08
Publication date: 2013-01-30
Anticipated expiration: 2031-10-08
Also published as: CN102358896A

Abstract

本发明公开了一种耐热角质酶-CBD融合酶及其突变体和其在涤纶纤维改性中的应用，属于基因工程和酶工程领域。本发明提供了一种嗜热子囊菌（Thermobifida fusca）角质酶-CBD及其突变体的制备方法，突变体包括一个位于嗜热子囊菌（Thermobifida fusca）角质酶-CBD融合酶中CBD上的结合位点的取代。突变体W68L和W68Y对涤纶纤维的吸附效率比角质酶-CBD分别提高14%和17%，而对涤纶纤维的水解能力是角质酶-CBD的1.4倍和1.5倍。这两种角质酶-CBD突变体更适合在涤纶纤维改性中应用。

Description

一种耐热角质酶-CBD融合酶及其突变体和应用

技术领域

本发明涉及一种耐热角质酶-CBD融合酶及其突变体和其在涤纶纤维改性中的应用，属于基因工程和酶工程领域。

背景技术

涤纶作为当今世界的三大合成纤维之一，与天然纤维相比，表现出良好的物理性能（如强度、弹性、韧性、硬度和耐磨性等）、染色性能和耐高温、耐化学品等特性。然而，由于涤纶纤维是疏水性纤维，其结晶度高，吸湿性差，且易起静电，不仅影响穿着舒适性，而且还限制了复合物改性剂、着色剂、阻燃剂等在加工处理过程中的应用。因此，为了达到优良的润湿性和染色效果，必须对涤纶纤维进行改性。目前，国内采用传统的强碱性或酸性剂处理方法不仅需要消耗大量的能源和化学品（粘合剂，偶联剂等），而且对生态环境造成了严重威胁。相比于化学改性，生物酶应用于纤维改性是提高合成纤维质量和加工性能的有效途径，顺应了纤维改性工业可持续发展的要求。

角质酶是一种多功能的水解酶，它不仅水解植物表皮的角质层，也能水解很多酯类结构包括甘油三酯和合成聚酯等。近来，角质酶在涤纶纤维改性中有潜在的应用价值。然而，角质酶处理大分子聚酯类底物（如涤纶）时存在亲和力差、可及度低的问题，大大降低角质酶的作用效果。国外对角质酶的研究主要集中于真菌来源角质酶，但真菌角质酶热稳定性差，也不适合于纺织工业中的应用。

本实验室研究开发的嗜热子囊菌（Thermobifida fusca）可产耐热角质酶，并能有效水解角质、PET等聚酯（陈坚, 吴敬, 陈晟. 一种耐热角质酶及其编码基因和表达. 申请号200710026074.2）。另外，我们采用一种新方法将纤维素结合域（CBD）融合到角质酶上，从而提高角质酶对棉纤维的结合效率及精练效果（吴敬, 陈坚, 张瑶, 陈晟. 一种耐热角质酶-CBD的制备及其在棉纤维精练中的应用. 申请号 200910033667.0）。为了使角质酶-CBD能有效地作用于涤纶纤维，通过对CBM进行结构模拟，结合涤纶纤维结构特点，利用定点突变方法提高角质酶-CBD对涤纶纤维的改性效果。这种提高酶催化效率的结合位点改造策略目前国内外未见报道。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种耐热角质酶-CBD融合酶，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，核苷酸序列如SEQ ID NO.2 所示。

本发明要解决的另一个技术问题是提供一种耐热角质酶-CBD融合酶的突变体，包括一个相应于嗜热子囊菌（Thermobifida fusca）的角质酶-CBD结合位点的氨基酸残基的取代，突变成与涤纶聚酯结构类似的氨基酸，与角质酶-CBD融合酶相比具有更强的涤纶纤维水解效率。

所述角质酶-CBD突变体是在CBD上的第68位色氨酸Trp突变为亮氨酸Leu，命名为W68L；突变为酪氨酸Tyr，命名为W68Y。

本发明所要解决的另一个技术问题是提供上述突变体的制备方法。

为解决上述问题，本发明的技术方案是：其特征是在纤维素结合域模拟结构的基础上确定突变位点；设计定点突变引物，以携带角质酶-CBD基因的pET20b（+）载体为模板构建突变质粒W68L-pET20b和W68Y-pET20b；将突变质粒转化到大肠杆菌BL21(DE3)中，挑选阳性克隆进行发酵培养，30℃培养48 h；发酵上清液经硫酸铵沉淀、亲和色谱纯化角质酶-CBD突变体W68L和W68Y。

所述耐热角质酶-CBD融合酶及其突变体应用于涤纶纤维改性亦为本发明要求保护的范围。

本发明提供了一种耐热角质酶-CBD融合酶及两种具有涤纶纤维高水解效率的耐热角质酶-CBD突变体及其制备方法；突变体W68L和W68Y对涤纶纤维的吸附效率比角质酶-CBD分别提高14%和17%，而对涤纶纤维的水解效率分别是天然角质酶-CBD的1.4倍和1.5倍，非常适宜涤纶纤维改性中应用。

附图说明

图１耐热角质酶-CBD突变体分离纯化SDS-PAGE图谱

1, W68L发酵上清液; 2, W68Y发酵上清液; 3, W68L Ni柱纯化结果; 4, W68Y Ni柱纯化结果

图2耐热角质酶-CBD突变体50℃稳定性研究

图3耐热角质酶-CBD突变体对涤纶水解效率分析。

具体实施方式

实施例1 角质酶-CBD融合酶的制备方法

通过基因全合成的方法获得编码角质酶-CBD的融合基因，序列如SEQ ID NO: 1。角质酶-CBD基因以质粒pET20b(+)为表达载体，以E. coli BL21(DE3)为表达宿主，实现耐热角质酶-CBD基因的高效表达。其发酵和纯化方法同角质酶-CBD突变体。

实施例2 角质酶-CBD融合酶对棉纤维的作用效果

在10 mL反应体系中，分别加入1mL角质酶-CBD（或天然角质酶）的酶液(酶活力100U/mL)，1mL果胶酶液(酶活力100U/mL)，8mL 25mM磷酸钾（pH 8.0），0.5g原棉纤维和50μL渗透剂TX-10。对照与上述条件一致但处理液中不加棉纤维。在室温下反应，定时取样。取出的样品经离心3 min后按照测定酶活的方法测上清液中酶活。被吸附的酶量为对照溶液中的酶活减去上清液中的酶活。结果表明，在与果胶酶互作下，天然角质酶对棉纤维的吸附率为10%，而角质酶-CBD对棉纤维的吸附率为55%。

10mL反应体系包括0.5g原棉纤维、8mL 25 mM 磷酸钾缓冲液(pH 8.0)、1mL角质酶-CBD（或天然角质酶）酶液(酶活力100U/mL)，1mL果胶酶液(酶活力100U/mL) 和50μL渗透剂TX-10，在50℃保温。不同时间取样，用0.02mol/L NaOH溶液滴定生成的脂肪酸。结果显示，天然角质酶15h达到反应平衡，生产脂肪酸为160μmol；角质酶-CBD 6h达到反应平衡时，生成脂肪酸为180μmol。

实施例3 角质酶-CBD突变体突变位点的确定

纤维素结合域与纤维素结合的关键氨基酸是高度保守的色氨酸残基。通过对第二家族CBD多重序列比对，结合涤纶纤维的结构特点，从以上两方面将两个关键点突变成与涤纶聚酯结构类似的氨基酸，以增强酶与底物的疏水作用，从而提高催化效率。具体突变如下：（1）将色氨酸突变成亮氨酸，增强与聚酯结构中烷基链的疏水作用，以提高与底物的亲和力；（2）将色氨酸突变成酪氨酸，提高与聚酯结构中苯环的疏水作用，并且羟基产生氢键作用以增强与底物的结合力。

实施例4 角质酶-CBD突变体的制备方法

利用一步PCR定点突变方法构建W68L-pET20b和W68Y-pET20b突变质粒。

W68L-pET20b和W68Y-pET20b突变质粒是以cutinase-CBM_CenA/pET20b质粒为模板（Yao Zhang, Sheng Chen, Meng Xu, Artur Cavaco-Paulo, Jing Wu, Jian Chen. Characterization of Thermobifida fusca Cutinase-Carbohydrate-Binding Module Fusion Proteins and Their Potential Application in Bioscouring. Applied and Environmental Microbiology, 2010, 76(20): 6870-6876），分别用W68L和W68Y的突变引物通过PCR得到大小为5000bp产物，然后将PCR产物经过Dpn I处理后转化大肠杆菌JM109，再筛选转化子。

测序结果证明除所需位点外，无其他位点突变。因此，突变质粒W68L-pET20b和W68Y-pET20b构建成功。

定点突变互补引物如下所示（突变位点斜体加粗）：

1、W68Y突变

Primer-F: GTCACCAGCCTGCCC TAT AACGGCAGCATCCCG

Primer-R: CGGGATGCTGCCGTT ATA GGGCAGGCTGGTGAC

2、W68L突变

Primer-F: GTCACCAGCCTGCCC TTG AACGGCAGCATCCCG

Primer-R: CGGGATGCTGCCGTT CAA GGGCAGGCTGGTGAC

PCR反应体系（50 μL）如下：

ddH₂O	37
		10×Prime STAR^TMGC Buffer	5
dNTP Mixture （2.5 mM）	4
		Mg²⁺（250 mM）	1
Primer-F	1
		Primer-R	1
质粒	0.5
		Prime STAR^TMHS DNA Polymerase（2.5 U/μL）	0.5

PCR反应程序为：94 oC预变性5 min；95 oC变性30 s，55 oC退火60 s，72 oC延伸6 min；共循环30次；72 oC延伸10 min；4 oC保存。核酸电泳检测目的条带大小。

实施例5 角质酶-CBD突变体的表达及纯化

将突变质粒W68L-pET20b和W68Y-pET20b转化大肠杆菌BL21(DE3)。筛选出正确的阳性克隆，在TB（甘油5 g/L，蛋白胨12 g/L，酵母膏24 g/L，K₂HPO4 12.54 g/L，KH₂PO4 2.31 g/L）发酵液体培养基30℃培养48 h时产酶达40-45 U/mL。

将上述耐热角质酶-CBD突变体发酵液于4 ℃、10000 rpm 离心10 min 除菌体；上清液中加入50 %固体硫酸铵盐析过夜，所得沉淀用缓冲液A (含50 mM 磷酸钠、0.5 M氯化钠、10 mM咪唑，pH 7.4)溶解，并在缓冲液A中透析过夜后，通过0.22 μm膜过滤后制成上样样品；Ni亲和柱用缓冲液A平衡后，将上样样品吸入Ni柱，使之完全吸附后，用缓冲液(含50 mM 磷酸钠、0.5 M氯化钠、0 -500 mM咪唑，pH 7.4) 线性梯度洗脱，流速1 mL/ min，检测波长为280 nm，分部收集含角质酶酶活的洗脱液；活力组分用30000道尔顿膜离心浓缩，得纯化角质酶-CBD突变体制品；纯化后角质酶达到电泳纯，表观分子量45000道尔顿。纯化过程电泳图见图1。

实施例6 角质酶-CBD突变体的热稳定性

以可溶性酯对硝基苯丁酸酯（pNPB）为底物时，角质酶-CBD突变体在50℃下保温24 h，酶活仍可达70%以上（图2）。

实施例7 角质酶-CBD突变体对涤纶纤维的吸附效果测定

将涤纶纤维在60^oC水浴振荡清洗30 min后于室温晾干。在10 ml反应体系中，分别加入1ml角质酶-CBD突变体（或天然角质酶-CBD）的酶液(酶活力100U/ml)，9 ml 25mM磷酸钾（pH 8.0），0.5 g预处理的涤纶纤维。对照与上述条件一致但处理液中不加涤纶纤维。在25^oC，60 rpm下处理1 h后，取出的样品经离心3000 rpm离心2 min，测定上清液中的酶活。被吸附的酶量为对照溶液中的酶活减去上清液中的酶活。结果表明，突变体W68L和W68Y对涤纶纤维的吸附效率分别比角质酶-CBD提高14%和17%。

实施例8 角质酶-CBD突变体对涤纶纤维的改性效果

10ml反应体系包括0.5g预处理的涤纶纤维、9 ml 25 mM 磷酸钾缓冲液(pH 8.0)、1 ml角质酶-CBD突变体（或天然融合酶CBD）的酶液（酶活力100U/ml），在50℃，200 rpm下反应。用紫外分光光度计测试不同处理时间下240 nm处的紫外吸光度值。参比样为相同条件下不加入涤纶纤维的角质酶-CBD处理液。结果显示（图3），随着处理时间的延长，紫外吸光度逐渐上升，当处理时间达到20 h时，紫外吸光度的增加逐渐趋于平缓达到平衡。突变体W68L和W68Y释放的产物量比角质酶-CBD有了较明显的提高，分别提高了1.4倍和1.5倍。

序列表

<110> 江南大学

<120> 一种耐热角质酶-CBD融合酶及其突变体和应用

<160> 6

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 395

<212> PRT

<213> 人工合成序列

<400> 1

Ala Asn Pro Tyr Glu Arg Gly Pro Asn Pro Thr Asp Ala Leu Ser Glu

1 5 10 15

Ala Ser Ser Gly Pro Phe Ser Val Ser Glu Glu Asn Val Ser Arg Leu

20 25 30

Ser Ala Ser Gly Phe Gly Gly Gly Thr Ile Tyr Tyr Pro Arg Glu Asn

35 40 45

Asn Thr Tyr Gly Ala Val Ala Ile Ser Pro Gly Tyr Thr Gly Thr Glu

50 55 60

Ala Ser Ile Ala Trp Leu Gly Glu Arg Ile Ala Ser His Gly Phe Val

65 70 75 80

Val Ile Thr Ile Asp Thr Ile Thr Thr Leu Asp Gln Pro Asp Ser Arg

85 90 95

Ala Glu Gln Leu Asn Ala Ala Leu Asn His Met Ile Asn Arg Ala Ser

100 105 110

Ser Thr Val Arg Ser Arg Ile Asp Ser Ser Arg Leu Ala Val Met Gly

115 120 125

His Ser Met Gly Gly Gly Gly Thr Leu Arg Leu Ala Ser Gln Arg Pro

130 135 140

Asp Leu Lys Ala Ala Ile Pro Leu Thr Pro Trp His Leu Asn Lys Asn

145 150 155 160

Trp Ser Ser Val Thr Val Pro Thr Leu Ile Ile Gly Ala Asp Leu Asp

165 170 175

Thr Ile Ala Pro Val Ala Thr His Ala Lys Pro Phe Tyr Asn Ser Leu

180 185 190

Pro Ser Ser Ile Ser Lys Ala Tyr Leu Glu Leu Asp Gly Ala Thr His

195 200 205

Phe Ala Pro Asn Ile Pro Asn Lys Ile Ile Gly Lys Tyr Ser Val Ala

210 215 220

Trp Leu Lys Arg Phe Val Asp Asn Asp Thr Arg Tyr Thr Gln Phe Leu

225 230 235 240

Cys Pro Gly Pro Arg Asp Gly Leu Phe Gly Glu Val Glu Glu Tyr Arg

245 250 255

Ser Thr Cys Pro Phe Met Ala Ile Ala Ala Gly Gly Thr Asn Pro Asn

260 265 270

Pro Asn Pro Asn Pro Thr Pro Thr Pro Thr Pro Thr Pro Thr Pro Pro

275 280 285

Pro Ala Pro Gly Cys Arg Val Asp Tyr Ala Val Thr Asn Gln Trp Pro

290 295 300

Gly Gly Phe Gly Ala Asn Val Thr Ile Thr Asn Leu Gly Asp Pro Val

305 310 315 320

Ser Ser Trp Lys Leu Asp Trp Thr Tyr Thr Ala Gly Gln Arg Ile Gln

325 330 335

Gln Leu Trp Asn Gly Thr Ala Ser Thr Asn Gly Gly Gln Val Ser Val

340 345 350

Thr Ser Leu Pro Trp Asn Gly Ser Ile Pro Thr Gly Gly Thr Ala Ser

355 360 365

Phe Gly Phe Asn Gly Ser Trp Ala Gly Ser Asn Pro Thr Pro Ala Ser

370 375 380

Phe Ser Leu Asn Gly Thr Thr Cys Thr Gly Thr

385 390 395

<210> 2

<211> 1185

<212> DNA

<213>人工序列

<220>

<223>根据基因序列设计，用于表达。

<400> 2

gccaacccct acgagcgcgg ccccaacccg accgacgccc tgtccgaagc cagcagcggc 60

cccttctccg tcagcgagga gaacgtctcc cggttgagcg ccagcggctt cggcggcggc 120

accatctact acccgcggga gaacaacacc tacggtgcgg tggcgatctc ccccggctac 180

accggcactg aggcttccat cgcctggctg ggcgagcgca tcgcctccca cggcttcgtc 240

gtcatcacca tcgacaccat caccaccctc gaccagccgg acagccgggc agagcagctc 300

aacgccgcgc tgaaccacat gatcaaccgg gcgtcctcca cggtgcgcag ccggatcgac 360

agcagccgac tggcggtcat gggccactca atgggcggcg gcggcaccct gcgtctggcc 420

tcccagcgtc ccgacctgaa ggccgccatc ccgctcaccc cgtggcacct caacaagaac 480

tggagcagcg tcaccgtgcc gacgctgatc atcggggccg acctcgacac gatcgcgccg 540

gtcgccacgc acgcgaaacc gttctacaac agcctgccga gctccatcag caaggcctac 600

ctggagctgg acggcgcaac ccacttcgcc ccgaacatcc ccaacaagat catcggcaag 660

tacagtgtcg cctggctcaa gcggttcgtc gacaacgaca cccgctacac ccagttcctc 720

tgccccggac cgcgcgacgg actcttcggc gaggtcgaag agtaccgctc cacctgcccg 780

ttcatggcga tcgccgcggg cggcaccaac cccaacccga accccaaccc gacgcccacc 840

cccactccga cccccacgcc gcctcccgct cccggctgcc gcgtcgacta cgccgtcacc 900

aaccagtggc ccggcggctt cggcgccaac gtcacgatca ccaacctcgg cgaccccgtc 960

tcgtcgtgga agctcgactg gacctacacc gcaggccagc ggatccagca gctgtggaac 1020

ggcaccgcgt cgaccaacgg cggccaggtc tccgtcacca gcctgccctg gaacggcagc 1080

atcccgaccg gcggcacggc gtcgttcggg ttcaacggct cgtgggccgg gtccaacccg 1140

acgccggcgt cgttctcgct caacggcacc acctgcacgg gcacc 1185

<210> 3

<211> 33

<212> DNA

<213>人工序列

<220>

<223>根据基因序列设计，用于扩增。

<400> 3

gtcaccagcc tgccctataa cggcagcatc ccg 33

<210> 4

<211> 33

<212> DNA

<213>人工序列

<220>

<223>根据基因序列设计，用于扩增。

<400> 4

cgggatgctg ccgttatagg gcaggctggt gac 33

<210> 5

<211> 33

<212> DNA

<213>人工序列

<220>

<223>根据基因序列设计，用于扩增。

<400> 5

gtcaccagcc tgcccttgaa cggcagcatc ccg 33

<210> 6

<211> 33

<212> DNA

<213>人工序列

<220>

<223>根据基因序列设计，用于扩增。

<400> 6

cgggatgctg ccgttcaagg gcaggctggt gac 33

Claims

1.一种耐热角质酶-CBD融合酶的突变体，其特征在于将SEQ ID NO.1所示氨基酸序列的第357位色氨酸突变为亮氨酸或酪氨酸。

2、权利要求1所述的耐热角质酶-CBD突变体应用于涤纶纤维改性。