CN107828697A - 一种多粘类芽孢杆菌af01及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明属于微生物应用技术领域，尤其涉及一种多粘类芽孢杆菌AF01及其应用。一种多粘类芽孢杆菌AF01，其分类命名为Paenibacillus polymyxa AF01，保藏编号GDMCC No.60281，保藏日为2017年11月20日，保藏单位为广东省微生物菌种保藏中心。本发明提供的多粘类芽孢杆菌AF01菌剂可有效减少火龙果采后病害的发生，并且对火龙果无药害，对环境无污染，具有良好的生物农药开发前景。
Description
技术领域
本发明属于微生物应用技术领域，尤其涉及一种多粘类芽孢杆菌AF01及其应用。
背景技术
火龙果Hylocereus undatus，又名红龙果(台湾)、仙蜜果、芝麻果等，属于仙人掌科量天尺属植物，原产于热带中美洲地区，20世纪90年代初引入台湾试种，经过驯化改良后在我国广东、海南、福建、广西等省区陆续栽培推广，目前广西已成为全国最大的火龙果产区。火龙果果形独特，产业化前景良好，除鲜食外、还可酿酒、制罐头、果酱等，果实中含有丰富的蛋白质、氨基酸、矿质元素、维生素及脂肪酸等营养成分，同时还含有类黄酮、膳食纤维、植物多糖、植物甾醇和苷类化合物等多种功能性物质，具有良好的保健功效，深受广大消费者的青睐。
在火龙果的贮存和调运过程中，一方面由于火龙果自然衰老，果实褐变萎蔫，另一方面则是微生物侵染，包括真菌病害、细菌病害，导致采后病害发生比较严重，其中又以真菌病害危害最为普遍。引起采后病害的病原菌多数从火龙果伤口侵入，因果实采收代谢活动减弱，抗性下降，病原菌从寄主组织中获得角质酶、纤维素酶、半纤维素酶、果胶酶、多酚氧化酶以及部分蛋白酶等生理代谢所需物质，从潜伏状态转变为致病状态而引起果实发病腐烂。朱迎迎等统计了在我国引起火龙果釆后病害的真菌有8个属至少9个种，李敏等记录海南火龙果采后真菌7种，常见的贮藏病害病原菌有炭疽菌 (Collectotrichumgloeosporioides、Collectotrichum capsici)、镰刀菌(Fusarium Dimerum，Fusariumoxysporum)、新暗色柱节孢(Neoscytalidium dimidiatum)、仙人掌平脐蠕孢(Bipolariscactivora)等。
目前，火龙果釆后病害主要采用化学药剂来防治，但长期使用化学农药会使病原菌产生抗药性，并带来污染环境和农药残留的安全问题，因此，开发和利用自然界存在的生防菌具有重要的实践意义。
公开于该背景技术部分的信息仅仅旨在增加对本发明的总体背景的理解，而不应当被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已为本领域一般技术人员所公知的现有技术。
发明内容
本发明的目的是提供一株可用于防治火龙果采后病害的多粘类芽孢杆菌、菌剂及其用途。
本发明提供的技术方案如下：
一种多粘类芽孢杆菌AF01，该菌株已保藏于广东省微生物菌种保藏中心 (简称CDMCC，地址：广州市先烈中路100号大院59号楼5楼广东省微生物研究所，邮政编码：510075)，保藏号为CDMCC No.60281，保藏时间为： 2017年11月20日，分类命名为Paenibacillus polymyxa。
本发明还提供了一种含有多粘类芽孢杆菌AF01的菌剂，该菌剂的活菌数为1-8×109cfu/mL。
作为优选，所述的含有多粘类芽孢杆菌AF01的菌剂，该菌剂的活菌数为 5×109cfu/mL。
本发明还提供了所述的含有多粘类芽孢杆菌AF01的菌剂的制备方法，包括如下步骤：
(1)菌株活化：将多粘类芽孢杆菌AF01接种于固体培养基上，于25-28℃下培养1-2d；
(2)发酵种子培养：将上述活化菌株接种于液体培养基中，于25-28℃下振荡培养12-24h，制得种子液；
(3)菌剂发酵：将上述种子液接种到菌剂发酵培养液中，25-28℃下振荡培养48-72h，制得多粘类芽孢杆菌AF01的菌剂。
作为优选，步骤(1)中固体培养基配方为：马铃薯(去皮)200g、葡萄糖 20g、琼脂15-20g、蒸馏水1000mL，pH 7.0-7.2。
作为优选，步骤(2)中液体培养基配方为：马铃薯(去皮)200g、葡萄糖 20g、蒸馏水1000mL，pH 7.0-7.2。
作为优选，步骤(3)中发酵培养基配方为：马铃薯(去皮)200g、葡萄糖 20g、蒸馏水1000mL，pH 7.0-7.2。
作为优选，步骤(3)中种子液的接种量的体积百分比为0.05-0.1％。
本发明提供的多粘类芽孢杆菌AF01的菌剂可用于火龙果采后病害的防治。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
本发明提供的多粘类芽孢杆菌AF01及其菌剂对新暗色柱节孢，镰刀菌、灰葡萄孢，链格孢，仙人掌平脐蠕孢菌丝有抑制生长作用，可有效减少火龙果采后病害的发生，并且对火龙果无药害，对环境无污染，具有良好的生物农药开发前景。
附图说明
图1为多粘类芽孢杆菌AF01在PDA平板上的菌落形态；
图2为多粘类芽孢杆菌AF01对新暗色柱节孢丝生长的抑制作用；
图3为多粘类芽孢杆菌AF01对镰刀菌菌丝生长的抑制作用；
图4为多粘类芽孢杆菌AF01对链格孢菌丝生长的抑制作用；
图5为多粘类芽孢杆菌AF01对灰葡萄孢菌丝生长的抑制作用；
图6为多粘类芽孢杆菌AF01对仙人掌平脐蠕孢菌丝生长的抑制作用；
图7为多粘类芽孢杆菌AF01对新暗色柱节孢引起的火龙果溃疡病引起的火龙果软腐病的防治效果；
图8为多粘类芽孢杆菌AF01对链格孢引起的火龙果黑斑病的防治效果；
图9为多粘类芽孢杆菌AF01对仙人掌平脐蠕孢引起的火龙果黑斑病的防治效果。
保藏信息说明
Paenibacillus polymyxa AF01，其保藏编号为GDMCC No.60281，保藏日期为2017年11月20日，保藏单位为广东省微生物菌种保藏中心(简称GDMCC，地址：广州市先烈中路100号大院59号楼5楼广东省微生物研究所，邮政编码：510075)。
具体实施方式
以下实施例以便更好的理解本发明，并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的实验材料，如无特殊说明，均为常规生化试剂商店购买得到的。下述实施例中的定量实验，均设置三次重复实验，结果取平均值。
实施例1：菌株的筛选
(1)平板培养基初筛：准确称取5g火龙果园土样，加入50ml无菌水，置入摇床室温震荡30-60min，震荡速率200rpm。静置30min后取上清进行梯度稀释。将梯度稀释液分别涂布于平板筛选培养基，28-37℃倒置培养2-4天，定期观察，对外观形态颜色明显差异的细菌菌落进行纯化，保存备用。
(2)采用平板对峙生长法，以一株火龙果溃疡病菌新暗色柱节孢作为指示菌接种在PDA平板上，对从步骤(1)中分离纯化得到的各细菌菌株进行拮抗筛选，将具有拮抗作用的菌株保存备用。筛选对新暗色柱节孢抑菌能力较强的菌株，接入发酵培养基进行三角瓶发酵，28-37℃，180rpm震荡培养 4-7后检测抑菌活力。
最终得到一株对火龙果溃疡病病原新暗色柱节孢具有抑菌显著活性的菌株AF01。
实施例2：菌株的鉴定
(1)菌株的形态学分析
如图1所示，AF01革兰氏染色为阳性菌，杆状，芽孢卵圆形，细胞直径大于1μm。
如图2所示，菌株AF01在PDA培养基上菌落粘稠、***呈凸状、边缘光滑，圆形、乳白色或透明。
该菌株能利用葡萄糖、木糖、L-***糖、甘露醇和乳糖，能利用柠檬酸盐，还原硝酸盐，能水解淀粉并分解酪素，接触酶起反应。在50℃和pH5.7 条件下均不生长，在7％NaCl溶液下也不生长，发生甲基红反应。
结合形态特征、培养特征和生理生化特性的测试结果，初步判定菌株AF01 为类芽孢杆菌(Paenibacillus sp)。
(2)菌株的分子鉴定
提取菌株AF01的总DNA作为模板，应用通用引物27F： 5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'和1492R： 5'-GGTTACCTTGTTACGACTT-3'，PCR扩增得到其16S-rDNA，经测序获得一条1428bp的核苷酸序列，其序列为SEQ ID NO.1所示。
经同源性比对分析表明：其与多粘类芽孢杆菌(Paenibacillus polymyxa) 菌株的同源性最高，达99％。
根据形态学及分子鉴定结果，将AF01鉴定为多粘类芽孢杆菌 (Paenibacilluspolymyxa)。
实施例3：多粘类芽孢杆菌AF01对火龙果采后病害病原菌菌丝生长的抑制作用
将培养3-6d的火龙果采后病害病原菌新暗色柱节孢，镰刀菌、灰葡萄孢，链格孢，仙人掌平脐蠕孢用5mm打孔器取下置于PDA平板中央，在距菌饼 2.5cm处用移液枪点1μL浓度为109cfu/mL的AF01培养液，于28℃培养箱中培养，观察抑菌圈或抑菌带。
如图2-6所示，多粘类芽孢杆菌AF01培养液可抑制新暗色柱节孢，镰刀菌、灰葡萄孢，链格孢，仙人掌平脐蠕孢菌丝生长，抑制率见表1。
表1 AF01悬液对病原菌的抑制率
由表1可知，在培养3-7d后，AF01菌剂对火龙果采后病害病原菌新暗色柱节孢，镰刀菌、灰葡萄孢，链格孢，仙人掌平脐蠕孢具有显著的抑菌效果，抑菌率均大于38.00％。
实施例4：多粘类芽孢杆菌AF01菌剂对火龙果采后病害的防治
将新暗色柱节孢，镰刀菌、链格孢接种至PDA固体培养基上，28℃条件下培养3-7d。供接种的火龙果先用75％的酒精对果实表面消毒处理，再用无菌水洗净晾干后备用。在每个果实的中部各刺一个3mm×5mm的伤口，先接种1.0×109cfu/mL的AF01菌悬液30μL，2h后接种供试病原菌1.0×109cfu/mL的孢子悬浮液30μL在伤口上，置于温度28℃，湿度80％下培养，以无菌水为对照。每处理5个火龙果，3次重复，定期观察致病性及病害症状表现。
由图7-9可知，AF01菌剂对火龙果采后病害显示出良好的防治效果。接种链格孢(A)、新暗色柱节孢(B)，镰刀菌(C)后，无菌水处理对照组病情指数分别为33.33，18.5和31.85，AF01菌剂处理组的病情指数为11.85、 5.1和10.37，其防治效果分别为64.44％、72.43％和67.44％
前述对本发明的具体示例性实施方案的描述是为了说明和例证的目的。这些描述并非想将本发明限定为所公开的精确形式，并且很显然，根据上述教导，可以进行很多改变和变化。对示例性实施例进行选择和描述的目的在于解释本发明的特定原理及其实际应用，从而使得本领域的技术人员能够实现并利用本发明的各种不同的示例性实施方案以及各种不同的选择和改变。本发明的范围意在由权利要求书及其等同形式所限定。
序列表
<110> 广西壮族自治区农业科学院植物保护研究所
<120> 一种多粘类芽孢杆菌AF01及其应用
<130> ZYWS
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1428
<212> DNA
<213> 一种多粘类芽孢杆菌AF01及其应用(Paenibacillus polymyxa)
<400> 1
atacatgcaa gtcgagcggg gttaattaga agcttgcttc taactaacct agcggcggac 60
gggtgagtaa cacgtaggca acctgcccac aagacaggga taactaccgg aaacggtagc 120
taatacccga tacatccttt tcctgcatgg gagaaggagg aaaggcggag caatctgtca 180
cttgtggatg ggcctgcggc gcattagcta gttggtgggg taaaggccta ccaaggcgac 240
gatgcgtagc cgacctgaga gggtgatcgg ccacactggg actgagacac ggcccagact 300
cctacgggag gcagcagtag ggaatcttcc gcaatgggcg aaagcctgac ggagcaacgc 360
cgcgtgagtg atgaaggttt tcggatcgta aagctctgtt gccagggaag aacgtcttgt 420
agagtaactg ctcttggagt gacggtacct gagaagaaag ccccggctaa ctacgtgcca 480
gcagccgcgg taatacgtag ggggcaagcg ttgtccggaa ttattgggcg taaagcgcgc 540
gcaggcggct ctttaagtct ggtgtttaat cccgaggctc aacttcgggt cgcactggaa 600
actggggagc ttgagtgcag aagaggagag tggaattcca cgtgtagcgg tgaaatgcgt 660
agagatgtgg aggaacacca gtggcgaagg cgactctctg ggctgtaact gacgctgagg 720
cgcgaaagcg tggggagcaa acaggattag ataccctggt agtccacgcc gtaaacgatg 780
aatgctaggt gttaggggtt tcgataccct tggtgccgaa gttaacacat taagcattcc 840
gcctggggag tacggtcgca agactgaaac tcaaaggaat tgacggggac ccgcacaagc 900
agtggagtat gtggtttaat tcgaagcaac gcgaagaacc ttaccaggtc ttgacatccc 960
tttgaccggt ctagagatag acctttcctt cgggacagag gagacaggtg gtgcatggtt 1020
gtcgtcagct cgtgtcgtga gatgttgggt taagtcccgc aacgagcgca acccttatgc 1080
ttagttgcca gcaggtcaag ctgggcactc taagcagact gccggtgaca aaccggagga 1140
aggtggggat gacgtcaaat catcatgccc cttatgacct gggctacaca cgtactacaa 1200
tggccggtac aacgggaagc gaaggagcga tctggagcca atcctagaaa agccggtctc 1260
agttcggatt gtaggctgca actcgcctac atgaagtcgg aattgctagt aatcgcggat 1320
cagcatgccg cggtgaatac gttcccgggt cttgtacaca ccgcccgtca caccacgaga 1380
gtttacaaca cccgaagtcg gtgaggtaac cgcaaggagc cagccgcc 1428
Claims (9)
1.一种多粘类芽孢杆菌AF01，其特征在于，其分类命名为Paenibacillus polymyxaAF01，保藏编号GDMCC No.60281，保藏日为2017年11月20日，保藏单位为广东省微生物菌种保藏中心。
2.一种含有权利要求1所述的多粘类芽孢杆菌AF01的菌剂，其特征在于，该菌剂的活菌数为1-8×109cfu/mL。
3.根据权利要求2所述的多粘类芽孢杆菌AF01的菌剂，其特征在于，该菌剂的活菌数为5×109cfu/mL。
4.根据权利要求2或3所述的含有多粘类芽孢杆菌AF01的菌剂的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)菌株活化：将多粘类芽孢杆菌AF01接种于固体培养基上，于25-28℃下培养1-2d；
(2)发酵种子培养：将上述活化菌株接种于液体培养基中，于25-28℃下振荡培养12-24h，制得种子液；
(3)菌剂发酵：将上述种子液接种到菌剂发酵培养液中，25-28℃下振荡培养48-72h，制得多粘类芽孢杆菌AF01的菌剂。
5.根据权利要求4所述的含有多粘类芽孢杆菌AF01的菌剂的制备方法，其特征在于，步骤(1)中固体培养基配方为：马铃薯200g、葡萄糖20g、琼脂15-20g和蒸馏水1000mL，pH 7.0-7.2。
6.根据权利要求4所述的含有多粘类芽孢杆菌AF01的菌剂的制备方法，其特征在于，步骤(2)中液体培养基配方为：马铃薯200g、葡萄糖20g和蒸馏水1000mL，pH 7.0-7.2。
7.根据权利要求4所述的含有多粘类芽孢杆菌AF01的菌剂的制备方法，其特征在于，步骤(3)中发酵培养基配方为：马铃薯200g、葡萄糖20g和蒸馏水1000mL，pH 7.0-7.2。
8.根据权利要求4所述的含有多粘类芽孢杆菌AF01的菌剂的制备方法，其特征在于，步骤(3)中种子液的接种量的体积百分比为0.05-0.1％。
9.根据权利要求2或3所述的多粘类芽孢杆菌AF01的菌剂在防治火龙果采后病害中的用途。
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