KR20090105149A

KR20090105149A - 식물 병원균에 대하여 항균 활성을 가지는 신규패니바실러스 폴리믹사 ｎｂ1 및 이를 포함하는 조성물

Info

Publication number: KR20090105149A
Application number: KR1020080030431A
Authority: KR
Inventors: 박순한
Original assignee: 주식회사 남보
Priority date: 2008-04-01
Filing date: 2008-04-01
Publication date: 2009-10-07

Abstract

본 발명은 식물 병원균에 대하여 항균활성을 가지는 신규한 패니바실러스 폴리믹사(Paenibacillus polymyxa ) NB1 균주, 이를 포함하는 조성물 및 상기 조성물을 식물 또는 토양에 처리하여 식물 병원균을 방제하는 방법에 관한 것이다. 본 발명인 패니바실러스 폴리믹사 NB1 균주는 다양한 종류의 식물 병원균에 대하여 광범위한 항균 활성을 가지며, 식물 병원균에 의해 유발되는 식물의 병해를 환경 친화적으로 방제할 수 있다.

패니바실러스 폴리믹사(Paenibacillus polymyxa), 식물병 방제균

Description

식물 병원균에 대하여 항균 활성을 가지는 신규 패니바실러스 폴리믹사 ＮＢ1 및 이를 포함하는 조성물{Novel Paenibacillus polymyxa NB1 Having Anti-plant pathogens Activity and Composition Comprising the Same}

본 발명은 식물 병원균에 대하여 항균활성을 가지는 신규한 패니바실러스 폴리믹사 NB1 균주, 이를 포함하는 조성물 및 상기 조성물을 처리하여 식물 병원균을 방제하는 방법에 관한 것이다.

식물 병원균은 농작물 및 화훼류 등의 식물에 감염하여 식물의 수확량을 감소시키고 품질의 저하를 초래하여 상품가치를 떨어뜨리는 등 농업경제에 막대한 손실을 초래한다.

식물병원진균에 의한 작물의 병은 해충, 잡초와 더불어 작물의 안정적 생산에 매우 큰 제한요인이 되고 있다. 여러 종류의 식물병원진균 중에서도 보트리티스 시네리아(B. cinerea) , 리족토니아 솔라니(R. solani)와 같이 균핵을 형성하는 병균은 대부분이 토양전염성으로 여러 종류의 작물에 광범위하게 병을 일으켜 많은 피해를 가져온다. 이들 병원균들은 균핵상태로 월동하여 다음해에 균핵이 1차 감염원이 되는데 균핵은 병든조직이나 토양 중에 있으면서 좋지않은 환경조건에서도 생 존이 가능하고 포자나 균사형태보다 이웃 길항미생물에 의한 분해 및 포자나 억제에도 강하기 때문에 효과적인 방제가 더욱 어렵다. 잎곰팡이병균 크라도스포리움 풀붐(Cladosporium fulvum), 겹둥근무늬병균 알터나리아 솔라니(Alternaria solani)도 여러 채소작물에 병을 일으켜 많은 피해를 유발한다. 특히 이들 병원진균들의 방제를 위해 현재 여러 종류의 살균제가 사용되고 있지만, 살균제의 오용과 남용으로 약제 내성으로 인하여 방제효과가 감소함에 따라 안전하고 효과적인 방제방법의 개발이 절실히 요구되고 있다.

이런 식물 병원균을 방제하기 위한, 병원 진균의 방제 방법으로서는 재배환경을 개선해 주는 물리적 방법, 살균제를 이용한 화학적 방법 및 미생물을 이용한 미생물학적 방법 등이 있다.

그러나 물리적 방제만으로는 큰 효과를 기대할 수 없으며, 화학적 방제는 최근 약제 저항성병원균의 출현으로 포장에서의 방제효과가 크게 저하되었을 뿐만 아니라, 화학농약의 다량 살포에 의한 심각한 환경오염으로 이어지고 있다. 또한, 화학합성 농약에 의한 방제는 사람과 동물에 대한 독성 문제, 토양 및 작물체 내의 잔류 독성 문제, 포장 용기에 의한 환경오염 문제 등으로 인하여 점차 그 사용이 규제되고 있으며, 이미 선진 각국에서는 이들 화학합성 농약에 대한 구체적인 규제 강화 등으로 사용이 크게 제한되고 있다. 따라서 최근에는 이의 대체 방안으로 미생물학적 방제에 관한 연구가 최근 활발하게 진행되어 오고 있으며, 환경 친화적 농업을 위한 효과적인 방제방법의 개발이 절실히 요구되고 있다.

환경적으로 안전하고 효과적인 방제 방법으로는 미생물 제제를 이용한 생물 학적 방제가 1970년대 초반 이후로 국내외에서 이에 관한 연구가 여러 연구자에 의해 많이 수행되고 있다. 최근 세계적으로 10종 이상의 미생물 제제가 상품화되었고 환경적으로 안전한 지속농업을 지향하는 사회적 인식변화로 미생물 제제 개발에 대한 연구가 급격히 증가하고 있다. 현재 외국에서 개발되어 상품화된 대표적인 미생물 제제는 트리코데르마 하지아눔(Trichoderma harzianum)과 트리코데르마 폴리스포룸(T. polysporum)으로 만들어져 목재 부후균을 억제하는 BINAB T(1988, E.R. ButtsInternational), 글리오클라디움 비렌스(Gliocladium virens)를 이용한 온실 화훼작물 유묘의 병 방제제인 GlioGard(1990, W. R. Grace Co.), 트리코데르마 하르지아눔을 이용한 Fstop(1991, Kodak), Trichodex(1997년, 이스라엘에서개발)과 길항세균 바실러스 섭틸리스를 이용한 종자처리제인 KODIAK(1990, Gustafson), 슈도모나스 플루오레슨스(Pseudomonas fluorescens)를 이용하여 목화의 리족토니아나 피티움(Pythium sp.) 모 잘록병을 방제하는 DAGGER(1990, Ecogen Inc.), 슈도모나스 세파시아(P. cepacia)를 이용한 여러 작물의 종자 처리제인 BLUE CIRCLE(1990,Stine Microbial Products), 그리고 길항 방선균 스트렙토마이세스 그리세오비리디스(Streptomyces griseoviridis)를 이용한 푸사리움(Fusarium) 시들음병, 모 잘록병 방제제인 MYCOSTOP(1985, Kemira Oy Biocontrol of Finland)등이 있다.

국내에서는 1970년대 초반부터 인삼 뿌리 썩음병의 생물학적 방제연구를 시작으로 고추역병, 오이 딸기 시들음병, 참깨 모 잘록병과 잿빛 곰팡이병의 생물학적 방제에 관한 연구가 계속 수행되어 왔으나 결과는 미미한 실정이다. 이외에도 미생물 농약으로 특허 받은 살균제용 미생물로 세균류에는 바실러스 속(Bacillus sp. BS555, KCTC 8821P), 바실러스 폴리목사(Bacillus polymoxa B36, FERM BP-6068), 슈도모나스 오레오파시엔스(Pseudomonas aureofaciens B5,FERMBP-6067), 엔테로박터 클로아제(Enterobacter cloacae B51, FERM BP-6069) 및 항진균 물질을 분비하는 방선균인 스트렙토마이세스 속의 Bom1(KFCC 제10992호), Bom2(KFCC 제10993호) 등이 있다. 또한, 병원성 진균에 대한 길항능력을 갖는 미생물으로 바실러스 서브틸리스 바 아밀오리크파시엔스(Bacillus subtilis var. amyloliquefaciens KL114, KCTC 8913P), 바실러스 아밀로리쿼페이션스(Bacillus amyloliquefaciens KTGB0202 KCTC 10564BP), 알칼리진스 파에칼리스(Alcaligenes faecalis KL1179, KCTC 8914P), 슈도모나스 아에루기노사(Pseudomonas aeruginosaKL1121, KCTC 8915P), 슈도모나스 아우란티아카(Pseudomonas aurantiaca KL1326, KCTC 8916P), 바실러스 서브틸리스 및 슈도모나스 플루오레슨스 등이 있으며, 방선균 스트렙토마이세스 속에 대한길항능력을 갖는 균으로는 슈도모나스 플루오레슨스 바이오바 1(Biovar 1)이 있고, 곰팡이류는 트리코델마 하지아늄, 페니실리움 속( Penicillium sp.), 아스퍼질러스 속(Aspergillus sp.), 중복기생 곰팡이균인 아크레모니움 스트릭튬 BCP(Acremonium strictum, KCTC0639BP) 등이 연구 중이다.

길항 미생물에 의한 생물학적 방제의 원리는 이들이 생산하는 항생물질에 의한 항생작용, 세포벽 분해효소에 의한 기생 또는 포식 작용, 그리고 영양물 경쟁이나 거점(niche) 경쟁 등을 통한 병원균의 밀도 감소 또는 발병능력 감소 및 비병원성 균주 또는 약병원성 균주를 이용하는 교차보호(cross protection)와 기주 저항 성 유도 등에 주된 작용기작을 두고 있다. 예를 들어, 트리코데르마 속과 글리오클라디움 속이 분비하는 항생물질 또는 휘발성 물질, 독소, 특수한 저해물질에 의한 진균병의 억제작용이 공지되어 있다. 한편, 기생 또는 포식 작용에 의한 길항작용은 최근 들어 활발하게 연구되고 있는데 길항 세균들이 분비하는 진균의 세포벽 분해효소인 키티나제(chitinase), 글루카나제(glucanase), 셀룰라제(cellulase)등에 의한 병원균의 용해작용이 주된 작용기작으로 알려져 있다.

유기합성 농약을 대체하기 위하여, 식물 병원균에 효율적으로 작용할 수 있는 새로운 미생물을 동정하고자 한다.

이에 본 발명자는, 식물 병원균에 대하여 항균 활성을 가지는 균주를 선별하였고, 선별된 균주는 패니바실러스 폴리믹사에 속하는 신규 균주임을 동정하였으며, 상기 균주는 다양한 종류의 식물 병원균에 대하여 항균 활성을 가진다는 것을 재확인하였다.

이하, 본 발명을 자세히 설명한다.

하나의 양태로서, 본 발명은 기탁번호 KFCC 11413P로 기탁된, 식물 병원균에 대하여 항균활성을 가지는 신규한 패니바실러스 폴리믹사 NB1 균주에 관한 것이다.

본 발명의 “패니바실러스 폴리믹사 NB1”는 경남 하동 지역에서 채집한 각종 식물의 뿌리에서 분리한 균주로, 형태학적, 생리학적 및 생화학적 특성 분석 및, 16s 리보솜 rDNA 서열 분석을 통해 패니바실러스 폴리믹사인 것으로 동정된 균주이다. 본 발명의 균주는 탄저병균, 피티엄 울티멈, 역병균, 라이족토니아 솔라니 AG4, 잿빛곰팡이병균, 푸사리움 옥시스포룸 등의 다양한 종류의 식물 병원균에 대하여 광범위하면서도 우수한 생육저지 활성, 즉 길항 작용을 나타내는 것을 특징으로 한다.

상기 패니바실러스 폴리믹사 NB1 균주는 2008년 3월 10일자로 서울 서대문구 홍제동 유림빌딩2층에 소재한 한국종균협회(Korean Federation of Culture Colleftions, KFCC)에 수탁번호 KFCC 11413P로 기탁하였다.

또 다른 양태로서, 본 발명은 상기 패니바실러스 폴리믹사 NB1 균주, 상기 배양여액, 또는 이들의 혼합물을 포함하는 식물 병원균 억제 조성물에 관한 것이다.

배양여액은 상기 패니바실러스 폴리믹사 NB1 균주를 배양하고 희석시켜 제조한 배양액에서 균체를 제거한 상청액으로, 원심분리 또는 여과를 통해 얻을 수 있다.

본 발명의 패니바실러스 폴리믹사 NB1 균주, 배양여액, 또는 이들의 혼합물은 식물 병원균 억제 조성물로 유용하게 사용될 수 있다. 이때, 본 발명의 조성물에는 당 기술 분야에서 통상적으로 사용되는 계면활성제, 식물 영양제, 방부제, 생물보충제, 계면활성제, 무기염류, 보조제, 결합제 및 증량제 등을 포함할 수 있다. 또한, 본 발명의 조성물은 저장성을 개선할 수 있는 물질, 예를 들어 피트 모스(peat moss), 지올라이트 (zeolite), 탈크(talc) 및 카올리나이트(kaolinite), 점토 등을 포함할 수 있다.

상기 본 발명의 조성물은 분말, 펠렛, 과립, 및 용액 등의 다양한 제제로 제형화될 수 있다.

본 발명의 식물 병원균 억제 조성물은 탄저병균, 피티엄 울티멈, 역병균, 라 이족토니아 솔라니 AG4, 잿빛곰팡이병균, 푸사리움 옥시스포룸 등의 식물 병원균에 의해 유발되는 식물의 다양한 병해를 효과적으로 방제하면서도, 생태계 파괴, 지하수 오염, 농작물의 잔류독성 등의 문제를 유발하지 않아 친환경적이라는 장점을 가진다.

또 다른 양태로서, 본 발명은 패니바실러스 폴리믹사 NB1 균주, 배양액, 또는 이들의 혼합물을 포함하는 식물 병원균 억제 조성물을 처리하여 식물 병원균의 생육을 억제시키는 방법에 관한 것이다.

본 발명의 조성물은 패니바실러스 폴리믹사 NB1 균주가 길항작용을 하는 병원균의 감염에 의해 병해가 유발되었거나 유발될 수 있는 모든 식물에 적용될 수 있다. 본 발명의 조성물을 식물의 종자, 줄기, 잎 등의 다양한 부위에 직접 살포하거나, 또는 식물이 생장하고 있는 토양 등에 처리함으로써 식물 병원균을 효과적으로 방제할 수 있다. 또한, 본 발명의 조성물은 재배중인 식물뿐만 아니라, 수확 후에 저장 및 유통되는 단계의 채소, 과일, 화훼 등의 식물에 처리하여 병원균을 방제할 수도 있다.

본 발명의 패니바실러스 폴리믹사 NB1는 탄저병균(Colletotrichum acutatum), 피티엄 울티멈(Pythum ultimum), 역병균(Phytophthora capsici), 라이족토니아 솔라니 AG4(Rhizoctonia solani AG4), 잿빛곰팡이병균(Botrytis cineriea) 및 푸사리움 옥시스포룸(Fusarium oxysporum) 등의 다양한 종류의 식물 병원균에 대하여 우수한 항균 활성을 나타낸다.

이하, 본 발명을 실시예에 의거하여 보다 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 목적일 뿐 본 발명의 권리 범위는 하기 실시예에만 한정되는 것은 아니다.

실시예 1: NB1 균주분리

경남 하동 지역에서 채집한 각종 식물 뿌리를 각각 물로 세척한 후, 뿌리들을 막자 사발을 이용하여 분쇄한 다음, 멸균수로 희석하여 10% 티에스에이(TSA, Triptic Soy Agar) 배지에 분주 및 도말하여 28℃에서 4일간 배양하였다. 배양된 배지에서 단일 콜로니(single colony)를 선발하여 티에스에이(TSA) 배지에서 재 배양한 후, 배양된 균주를 보관균주로 만들어 사용하였다.

실시예 2: 균주 특성 분석

NB1균주의 형태적 특성을 조사하기 위하여 전자현미경 이용하여 NB1균주의 세포형태, 크기, 포자 및 편모를 조사하였고, TSA 배지에서 생장하는 colony를 조사하였다.

또한 생리적 특성을 알아보기 위하여 Gram 염색반응, 생육온도, 생육pH, 산 소요구성을 각각 조사하였다. Gram 염색반응은 Crystal violet stain solution을 이용하여 조사하였고(Dhingra amp;Sinclair, 1985. Basic Plant Pathology Method. Page 264, CRC Press), 생육온도범위및 최적생육조건은 TSB(Tryptic Soy Broth)배지를 이용하여, 15~40℃의 범위에서 200rpm, pH 7 조건하에서 5℃간격으로 배양하여 진탕배양하여 그 밀도를 흡광도를 이용하여 조사하였다. 생육pH 및 최적생육pH는 TSB 배지의 산도를 3~10pH로 조절하여 27℃, 200rpm 조건하에서 진탕배양시켜 NB1균주의 밀도를 흡광도를 측정하여 조사하여 결정하였다. 산소요구성은 TSA배지에 NB1 균주를 접종한 후, 밀폐용기에 질소를 주입한 무산소 조건과 일반적인 호기적인 조건에서 생육여부를 비교하여 결정하였다. 아래 표1과 같이 NB1균주는 단간균 형태(Rod shape)로서 내생포자를 형성하며, 복수편모를 가지고 있다. 또한, 그람양성균으로서 15~40℃에서 생육이 가능하며, 최적생육온도는 25~30℃이다. 생육이 가능한 pH 범위는 4.0~9.0pH이고 최적 생육 pH는 6.0~7.0이다. 산소요구성 측정결과는 호기성(Aerobic)임을 알 수 있다.

패니바실러스 폴리믹사 NB1 균주의 특성

구분	특성
세포 형태(Cell)	단간균
크기(Size; ㎛)	1.2~2.3(두께), 2.3~4.2(길이)
포자	내생포자 형성
편모	복수편모 있음
그람염색(Gram stain)	양성
생육온도범위(℃)	15~40
최적생육온도(℃)	25~30
생육 pH 범위	4.0~9.0
최적생육 pH	6.0~7.0
산소요구성	호기성

실시예 3: 균체 지방산 분석 결과

균주의 동정은 미디(MIDI)의 미생물동정방법(MIDI Inc., USA)을 이용하여, 지방산메틸에스테르를 사용설명서(Operating manual. Version 6. MIDI Inc., USA)에 따라 TSA배지에서 NB1균주를 27℃, 24시간 배양한 후에 단일 colony를 취하여 용균, 혼성화반응, 메틸화 반응을 거쳐 추출하여 기체크로마토그래피를 이용하여 분석을 실시하고, 그 결과(세포지방산 구성비)를 데이터 베이스와 비교 분석하여 유사성(Sim Index)이 0.785인 Paenibacillus polymyxa으로 NB1을 동정하였다(표2)

Paenibacillus polymyxa NB1의 세포 지방산 분석 결과

Peak Name	Percent
C₁₄ _:0 ISO	2.87
C₁₄ _:0	3.05
C₁₅ _:0 ISO	6.99
C₁₅ _:0 ANTEISO	57.42
C₁₅ _:0	1.22
C₁₆ _:1 w7c alcohol	0.63
C₁₆ _:0 ISO	8.06
C₁₆ _:1 w11c	3.54
C₁₆ _:0	7.39
C₁₇ _:1ISO w10c	0.43
C₁₇ _:0 ISO	2.65
C₁₇ _:0 ANTEISO	5.76

실시예 4: 분자 생물학적 특성 분석

16s 리보솜 DNA의 염기서열을 분석하기 위하여 순수분리된 NB1 균주를 Nutrient broth Agar(Difco) 배지에 접종하고, 28℃에서 3일간 배양한 후에 Benzyl chloride법을 이용하여 DNA를 추출하였다. 16s rDNA의 PCR증폭을 위하여 27F(5`-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3`), 1492R(5`-GGTTACCTTGTTACGACTT-3`)인 2개의 올리고 뉴클레오티드 프라이머를 이용하여 94℃에서 변성(Denaturation), 58℃에서 어닐리(Annealing), 72℃에서 합성(Extension)의 조건으로 추출한 DNA를 증폭하였다.

PCR증제 산물은 Cenetic analyzer 310A(Applied Biosystems)를 사용하여 염기서열을 분석하였다. 염기서열은 DDBJ/NCBI/Genebank의 database와 상동성 검색을 수행하였다.

분석결과 NB1은 Paenibacillus속의 종을 포함하는 계통학적 그룹에 속하는 균주로서, Paenibacillus polymyxa DSM 36t(X57308)와 99%의 유연관계를 나타내는 것으로 확인 되었다. 따라서 NB1은 Paenibacillus polymxa로 동정되었다. 이에 본 발병자들은 이 균주를 Paenibacillus polymxa NB1으로 명명하고, 한국 미생물보존협회에 기탁하여 수탁번호 KFCC 11413P를 부여받았다.

실시예 5: NB1 의 병원균 제어 효과

NB1 균주( Paenibacillus polymyxa NB1)의 식물병원 미생물에 생육저지 효과를 알아보기 위해서 토양전염성병식물병원균인 Rhizoctonia solani AG4, Pythum ultimum, Phytopthora capcisi 및 Fusarium oxysporum과 공기전염성병균인 잿빛곰팡이병균(Botrytis cineriea), 탄저병균(Colletotrichum acutatum) 대치 배양하여 식물병원균에 대한 생육저지 효과를 조사하였다. 조사는 식물병원균과 NB1가 모두 잘 자라는 감자한천배지(PDA, Potato Dextrose Agar)에서 수행하였다. 병원균을 plate의 중앙에 접종 후 24시간 경과 후에 TSB 배지에서 36시간 동안 NB1를 배양하여 충분히 자란 배양액에 페이퍼디스크(직경 8mm)를 10분간 침지 후에 무균상태에서 1분간 건조한 다음 병원균 균총에서 3cm 떨어진 곳에 대치하였다. 이를 각각 표3과 같이 28℃에서 5~7일간 배양하면서 조사하였다. 생육저지 효과의 병원균과 NB1사이에 형성되는 저지원(Inhibition zone)의 간격을 임의로 no, +, ++,+++,++++의 5단계로 나누어 분석한 결과 아래 표3과 같은 결과를 얻었다. 표3에 보이는 바와 같이 NB1은 실험에 사용된 모든 식물병원균에 생육저지 효과를 가지며 특히, Botrytis cineriea , Phytophthora capsici , Colletotrichum acutatum에서 대해서 가장 강력한 생육저지효과를 나타냈다.

Paenibacillus polymyxa NB1의 식물 병원균에 대한 생육저지 효과

식물병원균	항진균 효과	배양온도(℃)	조사일
Rhizoctonia solani AG4	+++	28	5
Botrytis cineriea	++++	28	5
Pythum ultimum	++	28	5
Phytophthora capsici	+++	28	7
Fusarium oxysporum	++	28	7
Colletotrichum acutatum	++++	28	7

본 발명의 Paenibacillus polymyxa NB1균주는 다양한 식물 병원균에 광범위한 항균 활성을 가지는 균주로, 농업 생태계 보전과 식물 병원균에 의한 병해에 대한 우수한 방제 효과를 모두 얻을 수 있으므로 농업 분야에서의 다양한 응용을 기 대할 수 있다.

도 1는 패니바실러스 폴리믹사 NB1의 식물 병원균에 대한 길항효과를 보여주는 결과로서, (A)는 탄저병균 (Colletotrichum acutatum), (B)는 피티엄 울티멈 (Pythum ultimum) (C)는 역병균 (Phytophthora capsici), (D)는 라이족토니아 솔라니 AG4 (Rhizoctonia solani AG4), (E)는 잿빛곰팡이병균 (Botrytis cineriea) 및 (F)는 푸사리움 옥시스포룸 (Fusarium oxysporum)에 대한 길항효과를 나타낸다.

<110> NAMBO CO LTD <120> Novel Paenibacillus polymyxa NB1 Having Anti-plant pathogens Activity and Composition Comprising the Same <160> 2 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 27F primer <400> 1 agagtttgat cctggctcag 20 <210> 2 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 1492R primer <400> 2 ggttaccttg ttacgactt 19

Claims

식물 병원균 길항 균주 패니바실러스 폴리믹사 NB1(Paenibacillus polymyxa; 기탁번호 KFCC 11413P).
제1항에 있어서, 식물 병원균이 탄저병균 (Colletotrichum acutatum), 피티엄 울티멈 (Pythum ultimum ), 역병균 (Phytopthora capcisi ), 라이족토니아 솔라니 AG4 (Rhizoctonia solani AG4), 잿빛곰팡이병균(Botrytis cineriea) 및 푸사리움 옥시스포룸(Fusarium oxysporum)으로 이루어진 그룹 중에서 선택된 1종 이상인 것을 특징으로 하는 균주.
제1항의 패니바실러스 폴리믹사 NB1 균주, 배양여액, 또는 이들의 혼합물을 포함하는 식물 병원균 방제용 조성물.
제3항의 조성물을 식물 또는 토양에 처리하여 식물 병원균의 생육을 억제시키는 방법.
제4항에 있어서, 식물 병원균이 탄저병균, 피티엄 울티멈, 역병균, 라이족토니아 솔라니 AG4, 잿빛곰팡이병균 및 푸사리움 옥시스포룸으로 이루어진 그룹 중에서 선택된 1종 이상인 것을 특징으로 하는 방법.