CN113930371A - 一种使用多粘类芽孢杆菌af01促进蔬菜生长和抗病的方法 - Google Patents

一种使用多粘类芽孢杆菌af01促进蔬菜生长和抗病的方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及生物技术领域，特别涉及一种使用多粘类芽孢杆菌AF01促进蔬菜生长和抗病的方法；本申请涉及该菌株的新应用，经实验验证菌株AF01对多种蔬菜病害病原菌例如番茄黑斑病菌、番茄炭疽病菌、黄瓜靶斑病菌和黄瓜枯萎病菌都具有抑制作用；同时，该菌株能很好的促进黄瓜根系生长、增加黄瓜产量，显著提高黄瓜的维生素C、蛋白质、可溶性固形物、总酚等营养物质含量并提升黄瓜风味和口感；同时，本申请的菌株AF01对苦瓜白粉病还具有一定的防效，是一株难得的具有抑菌、促进黄瓜生长、提高黄瓜品质、抑制苦瓜白粉病发生的优良生防菌株，在黄瓜种植上有良好的经济效果。

Description

一种使用多粘类芽孢杆菌AF01促进蔬菜生长和抗病的方法
【技术领域】
本发明涉及生物技术领域，特别涉及一种使用多粘类芽孢杆菌AF01促进蔬菜生长和抗病的方法。
【背景技术】
番茄等茄果类蔬菜和黄瓜苦瓜等瓜类蔬菜具有产量高，生长和供应的季节长，经济利用范围广的优点，是我国广泛种植的蔬菜品种，但生产实际中存在炭疽病，白粉病和枯萎病等病害普遍发生和农药化肥滥用等问题阻碍番茄和瓜类蔬菜生产健康、绿色发展。包括多粘类芽孢杆菌在内的根际促生菌(plant growth promoting rhizobacteria)是生活在土壤或者根际，植物体内对植物生长具有促进或者对病原菌具有抑制作用的有益菌的统称，大部分部分多粘类芽孢杆菌可以通过协助宿主植物固氮、解隣、溶铁以及分泌植物激素直接促进植物生长的促生机制，也能够产生抗菌脂肽、分泌嗜铁素、诱导植物产生***抗性从而提高植物抗病性和抗逆性，缓解胁迫压力，间接促进植物的生长。生物防治和生防菌剂在不同蔬菜、不同地区适用性广泛，既能有效控制病害，又有利于农业的可持续发展，可以为持续推进化肥农药减量增效，努力维持农业环境的友好，走集“高产、优质、高效、生态”于一体的农业发展道路提供有力保障。
申请人课题组长期致力于生防菌的研究，在2017年11月30日申请了题为《一种多粘类芽孢杆菌生防菌株AF01及其应用》申请号为201711244499.0的专利申请，该申请公布了申请人自行筛选的多粘类芽孢杆菌AF01及其应用，证明了菌株AF01可抑制多种病原菌，但是该文并没有对该菌株进行种植的深入研究，在申请人对该菌株的不断深入研究后发现：除了专利201711244499.0公开的抑菌效果外，其还具有良好的抑制其它病菌和促作物生长效果，由于生防菌对不同蔬菜作物有不同的效果，对某些病原菌有抑制作用，对某些病原菌并不一定有抑制作用，对某些植物有促生长作用对另一些植物并不一定有促生长作用，而且这些效果是不可预期的，需要研究者经过实验不断验证，为此，对菌株的新应用，还需要不断研究。
【发明内容】
鉴于上述内容，为了研究并扩展生防菌的应用，本申请经过不断实验，拓展菌株AF01在促进植物生长、抑菌和抗病上的应用。
多粘类芽孢杆菌Paenibacillus polymyxa AF01在促进蔬菜生长、改善蔬菜品质、提高蔬菜的抗病能力和/或抑制病原菌生长上的应用，所述菌株AF01的保藏编号为GDMCCNo.60281，保藏于广东省微生物菌种保藏中心，地址：广州市先烈中路100号大院59号楼5楼广东省微生物研究所；保藏时间为2017年11月20日。
进一步的，所述促进蔬菜生长的蔬菜为黄瓜。
进一步的，所述改善蔬菜品质的蔬菜为黄瓜。
进一步的，所述提高蔬菜的抗病能力所抵抗的疾病为苦瓜白粉病。
进一步的，所述抑制病原菌的病原菌为：番茄黑斑病菌(Alternaria alternata)、番茄炭疽病菌(Colletotrichum gloeosporioides)、黄瓜靶斑病菌(Corynesporacassiicola)和/或黄瓜枯萎病菌(Fusarium oxysporum)。
本发明还包括一种应用所述多粘类芽孢杆菌Paenibacillus polymyxa AF01种植黄瓜的方法，所述方法为：在黄瓜播种时、移栽时和生长期使用菌株AF01发酵液灌根于蔬菜根部周围，间隔10-14天，连续使用2-3次。
本发明还包括一种应用所述多粘类芽孢杆菌Paenibacillus polymyxa AF01种植苦瓜的方法，所述方法为：在苦瓜病害发生前使用菌株AF01发酵液进行喷雾，间隔7-10天，连续使用3-4次。
进一步的，所述AF01发酵液的活菌含量为1×107-1×108cfu/mL。
进一步的，所述AF01发酵液的制备方法为：将AF01菌粉按照6％的接种量，接种在发酵培养基中在31℃条件下培养，发酵时间48h-72h即得；所述发酵培养基中各成分的质量百分数如下：木糖1.4％、NH4H2PO4 1.0％，CaCl2 0.6％；余量为水；发酵培养基的初始pH值为5。
本发明具有以下有益效果：
本申请的菌株Paenibacillus polymyxa AF01是多粘类芽孢杆菌，其保藏编号为GDMCC No.60281；已公开在申请号为ZL 20171124499.0的专利文献中，该文献中验证了该菌株可减少火龙果病害的发生；经过申请人后期的种植实验发现，菌株AF01对多种蔬菜病害病原菌例如番茄黑斑病菌、番茄炭疽病菌、黄瓜靶斑病菌和黄瓜枯萎病菌都具有抑制作用；同时，该菌株能很好的促进黄瓜生长、增加黄瓜产量、提升黄瓜品质，特别是提高黄瓜的蛋白质含量，且施加了菌株种植的黄瓜其可滴定酸含量与总糖含量的比值较低，黄瓜的风味更浓郁，口感更佳；同时，本申请的菌株AF01对苦瓜白粉病还具有良好的防效，是一株难得的具有抑菌、促进黄瓜生长、提高黄瓜品质，抑制苦瓜白粉病发生的优良生防菌株，在黄瓜种植上有良好的经济效果。
【附图说明】
图1为本发明多粘类芽孢杆菌对番茄黑斑病菌的抑制作用平板图；
图2为本发明多粘类芽孢杆菌株对番茄炭疽病菌的抑制作用平板图；
图3为本发明多粘类芽孢杆菌株对黄瓜靶斑病菌的抑制作用平板图；
图4为本发明多粘类芽孢杆菌株对黄瓜枯萎病菌的抑制作用平板图；
图5为多粘类芽孢杆菌AF01促进黄瓜根系生长的效果图；其中，图①为浇灌稀释10倍多粘类芽孢杆菌AF01黄瓜根系生长效果图；图②为浇灌稀释20倍多粘类芽孢杆菌AF01黄瓜根系生长效果图；图③为不使用多粘类芽孢杆菌AF01的黄瓜根系生长效果图；
图6为多粘类芽孢杆菌AF01对黄瓜果实外观的改善效果图；其中，图①为浇灌了多粘类芽孢杆菌的黄瓜果实生长效果图；图②为浇灌了市售生防菌株的黄瓜果实生长效果图；图③为不使用多粘类芽孢杆菌AF01的黄瓜果实生长效果图。
【具体实施方式】
下面结合附图和实施例和试验对本发明作进一步说明。
本申请实验用的番茄黑斑病菌(Alternaria alternata)、番茄炭疽病菌(Colletotrichum gloeosporioides)、黄瓜靶斑病菌(Corynespora cassiicola)、黄瓜枯萎病菌(Fusarium oxysporum)均从病株分离、纯化和鉴定后由本实验室保存。
下面结合具体的实施例对本发明的技术方案做进一步的说明，但不应理解为对本发明的限制：
本申请的多粘类芽孢杆菌AF01，其菌种保藏号为GDMCC No.60281。该菌种已保藏于广东省微生物菌种保藏中心，地址：广州市先烈中路100号大院59号楼5楼广东省微生物研究所；保藏时间为2017年11月20日；该菌株已在申请号为ZL 20171124499.0的专利文献中公开。
实施例1：
本实施例研究的是多粘类芽孢杆菌AF01对不同蔬菜病原菌的抑制效果，具体方法如下：
采用对峙生长法测定本发明拮抗菌株AF01对不同病原菌的抑制效果：用打孔器打取5mm不同病原菌(病原菌为：番茄黑斑病菌(Alternaria alternata)、番茄炭疽病菌(Colletotrichum gloeosporioides)、黄瓜靶斑病菌(Corynespora cassiicola)、黄瓜枯萎病菌(Fusarium oxysporum))菌饼放置于PDA平板中心；
在距菌饼2.5cm处用移液枪点1μL浓度为109cfu/mL的AF01培养液，于28℃培养箱中培养，观察抑菌圈或抑菌带。
实验结果如表1和图1-4
其中，由表1中的结果可以看出，多粘类芽孢杆菌培养液对多种蔬菜病害病原菌具有抑制效果，可抑制番茄黑斑病菌(Alternaria alternata)、番茄炭疽病菌(Colletotrichum gloeosporioides)、黄瓜靶斑病菌(Corynespora cassiicola)、黄瓜枯萎病菌(Fusarium oxysporum)菌丝生长，具体结果见1。
表1多粘类芽孢杆菌AF01抑菌效果表
测试项 番茄黑斑病菌 番茄炭疽病菌 黄瓜靶斑病菌 黄瓜枯萎病菌
抑菌带宽度(mm) 48 40 38 66
由表1可见，多粘类芽孢杆菌AF01对黄瓜枯萎病菌的抑菌带最大，达66mm，其次是番茄黑斑病菌、番茄炭疽病菌和黄瓜靶斑菌抑菌带。
图1-4分别为：多粘类芽孢杆菌AF01对番茄黑斑病菌、番茄炭疽病菌、黄瓜靶斑病菌、黄瓜枯萎病菌抑制作用的平板图；从图中可见菌株AF01对上述的几种病原菌均具有良好的抑制作用。
实施例2：
本实施例研究的是多粘类芽孢杆菌AF01对黄瓜的促生作用：
将多粘类芽孢杆菌AF01接种至木糖1.4％，NH4H2PO4 1.0％，CaCl2 0.6％。初始pH值为5的液体培养基中，培养48h，将发酵液稀释10倍和20倍，即分别含活菌数为1.2×108和6×107cfu/mL。将黄瓜播种至含有育苗基质的育苗盘中，每穴播种1粒，在播种时和7天后分别用菌液均匀淋在穴盘中，每穴20ml。每个处理30穴，空白对照为淋无菌培养基。20天后观察植株根系生长情况，促生效果见图5。
图5中的图①为发酵液稀释10倍的实验结果图，图②为稀释20倍的实验结果图，图③为空白对照结果图，从图中明显可见：使用多粘类芽孢杆菌AF01的黄瓜植株根系与对照相比须根较多，根系发达，健壮，达到良好的促生效果，且稀释倍数越低，活菌数含量越高，对黄瓜的促生效果越好。
实施例3：
本实施例研究的是多粘类芽孢杆菌AF01在黄瓜种植中的应用：
本实施例的试验地点：在南宁市武鸣区林渌村；
黄瓜品种：桂青1号；
种植应用方法如下：
处理一：使用PDA培养基制备种子液，按6％的接种量将种子液接种含木糖1.4％，NH4H2PO4 1.0％，CaCl2 0.6％。初始pH值为5的液体培养基中，振荡培养48-72h获得AF01的发酵液。使用时将发酵液稀释20倍，即活菌数2-6×107cfu/mL。在黄瓜移栽时先穴施有机肥0.5kg，移栽后用稀释的发酵液灌根，每株200ml。间隔10-14天稀释40倍，即活菌数1-3×107cfu/mL，再次灌根，每株500ml；
处理二：市售多粘类芽孢杆菌生防菌剂(武汉科诺生物科技股份有限公司产品)，按说明书使用。
上述两个处理各施用3次，处理每个小区15㎡，三个重复。
空白对照为仅施用有机肥；
上述处理一、处理二和空白对照小区管理一致。在黄瓜成熟期测量黄瓜株高，茎粗，每隔2天收获一批，对其中6批瓜进行测产，具体结果见表2；观察黄瓜的外观，检测黄瓜的维生素C，可溶性固形物，可滴定酸，蛋白质，总糖和总酚的含量，具体结果见表2、表3和图6。
表2黄瓜性状和产量调查表
处理 株高(cm) 茎粗(mm) 结瓜总数(个) 产量(kg)
AF01 152.8 8.61 96 33.73
市售生防菌 138.6 8.66 80 29.16
CK 122.4 8.24 73 24.33
由表2可知，菌株AF01对黄瓜生长有明显促进作用，株高相对于市售多粘类芽孢杆菌生防菌剂提高10.25％,结瓜数增加20.00％，产量增加15.67％；株高相对于空白组提高24.84％；结瓜数增加31.51％，产量提高38.64％，茎粗增加4.50％。
表3处理区与对照区黄瓜品质指标检测表
Figure BDA0003368732720000061
由表3可知，菌株AF01对黄瓜品质有良好的提升作用，与市售生防菌和空白组相比，维生素C、可溶性固形物、蛋白质、总酚的含量显著提高。其中，蛋白质、可溶性固形物、总酚较市售生防菌分别提高44.92％、35.71％和23.83％；蛋白质、可溶性固形物、总酚较空白组分别提高66.74％、86.27％和35.35％。对于鲜食品种，一般来讲在合理的范围内糖酸比较高的产品风味浓，品质优，本次试验AF01处理区总糖含量与可滴定酸含量的比值高于市售生防菌组和空白组，口感测评显示AF01处理区黄瓜的无酸涩感，风味浓郁，口感更佳。
上述种植实验种植得到的黄瓜果实如图6所示，从图中可见：菌株AF01对黄瓜外形有显著的提升作用，施加了菌株AF01的处理一(图6的图①)其黄瓜比施加了市售生防菌的处理二(图6的图②)和未施加任何菌株的空白组(图6的图③)的黄瓜果实外形更匀称，瓜形更美观。
上述试验结果显示AF01在黄瓜增产和提高品质上有显著的促进作用。
实施例4：
本实施例研究的是多粘类芽孢杆菌AF01在提高蔬菜抗病能力的应用：
试验地点：广西农业科学院试验地；
苦瓜品种：大肉苦瓜二号。
处理组：使用PDA培养基制备种子液，按6％的接种量将种子液接种含木糖1.4％、NH4H2PO4 1.0％，CaCl2 0.6％。初始pH值为5的液体培养基中，振荡培养48-72h获得AF01的发酵液。使用时将发酵液稀释10倍，即活菌数1-6×108cfu/mL。在苦瓜始花期白粉病尚未发生前进行第一次喷雾，以叶片充分湿润为宜，每亩发酵液用量60L，连续使用3次，间隔10天。处理每个小区15㎡，三个重复；
空白对照：所有小区管理一致。第三次喷雾后15天调查并计算苦瓜白粉病防效。
调查和防效计算方法如下：
每小区随机调查8条苦瓜蔓的全部叶片，每片叶按叶面积的百分率分级记录。分级方法如下。
0级:无病斑；
1级:病斑面积占叶片面积的5％以下；
3级:病斑面积占时片面积的6％-10％；
5级:病斑面积占叶片面积的11％-20％；
7级:病斑面积占叶片面积的21％-40％；
9级:病斑面积占叶片面积的40％以上。
药效计算方法如下：
Figure BDA0003368732720000071
Figure BDA0003368732720000072
式中：CK1：空白对照区施药后病情指数；PT1：药剂处理区施药后病情指数。
本实施例的具体实验结果如表4所示：
表4使用多粘类芽孢杆菌AF01防治苦瓜白粉病的效果
处理 病指 防效
AF01 11.59 57.23％
CK 27.11 -
从表4可知，使用多粘类芽孢杆菌AF01喷雾苦瓜，白粉病的平均病情指数为11.59，明显低于对照组的平均病情指数27.11，防治效果为57.23％；由此可见，多粘类芽孢杆菌对苦瓜白粉病有一定防治效果。
综上所述，本申请的Paenibacillus polymyxa多粘类芽孢杆菌AF01对蔬菜病害病原菌有良好的抑制效果，对黄瓜有明显的促生长、提高产量、改善黄瓜口感、改善黄瓜品质和黄瓜外形的作用；对苦瓜白粉病有良好的防效。
上述说明是针对本发明较佳可行实施例的详细说明，但实施例并非用以限定本发明的专利申请范围，凡本发明所提示的技术精神下所完成的同等变化或修饰变更，均应属于本发明所涵盖专利范围。

Claims (9)

1.多粘类芽孢杆菌Paenibacillus polymyxa AF01在促进蔬菜生长、改善蔬菜品质、提高蔬菜的抗病能力和/或抑制病原菌生长上的应用，其特征在于，所述菌株AF01的保藏编号为GDMCC No.60281。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述促进蔬菜生长的蔬菜为黄瓜。
3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述改善蔬菜品质的蔬菜为黄瓜。
4.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述提高蔬菜的抗病能力所抵抗的疾病为苦瓜白粉病。
5.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述抑制病原菌的病原菌为：番茄黑斑病菌、番茄炭疽病菌、黄瓜靶斑病菌和/或黄瓜枯萎病菌。
6.一种如权利要求1所述多粘类芽孢杆菌Paenibacillus polymyxa AF01用于黄瓜种植的方法，其特征在于，所述方法为：在黄瓜播种时、移栽时和生长期使用菌株AF01发酵液灌根于蔬菜根部周围，间隔10-14天，连续使用2-3次。
7.一种如权利要求1所述多粘类芽孢杆菌Paenibacillus polymyxa AF01用于苦瓜种植的方法，其特征在于，所述方法为：在苦瓜病害发生前使用菌株AF01发酵液进行喷雾，间隔7-10天，连续使用3-4次。
8.根据权利要求6所述种植黄瓜的方法或权利要求7所述种植苦瓜的方法，其特征在于，所述AF01发酵液的活菌含量为1×107-1×108cfu/mL。
9.根据权利要求6所述种植黄瓜的方法或权利要求7所述种植苦瓜的方法，其特征在于，所述AF01发酵液的制备方法为：将AF01菌粉按照6％的接种量，接种在发酵培养基中在31℃，发酵时间48h-72h即得；所述发酵培养基中各成分的质量百分数如下：木糖1.4％、NH4H2PO4 1.0％，CaCl2 0.6％；余量为水；发酵培养基的初始pH值为5。
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WO2023144829A1 (en) * 2022-01-31 2023-08-03 Yissum Research Development Company Of The Hebrew University Of Jerusalem Ltd. Bacterial composition for improving plant-related parameters and methods of using the same

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