CN107779464A

CN107779464A - 一种人源铜锌超氧化物歧化酶的制备方法

Info

Publication number: CN107779464A
Application number: CN201710756221.5A
Authority: CN
Inventors: 朱斌辉; 朱艳娟; 许仁杰; 韩蓉
Original assignee: SUZHOU DONGQUAN BIOTECHNOLOGY CORP Ltd
Current assignee: SUZHOU DONGQUAN BIOTECHNOLOGY CORP Ltd
Priority date: 2017-08-29
Filing date: 2017-08-29
Publication date: 2018-03-09

Abstract

本发明公开了一种人源铜锌超氧化物歧化酶的制备方法，将SEQ ID NO.2所示的序列***原始载体，构建重组载体，扩大培养后提取表达产物，N‑His‑TEV‑hSOD1酶解，纯化得到无标签的hSOD1。本发明提供的方法，目的基因根据密码子偏爱性设计目的基因序列，并且在N末端添加His‑TEV标签，既避免了表达异源性，又避免了动物或人来源的安全性风险；方法中序列设计添加了His纯化标签和标签切除TEV识别位点，既有利于纯化，也便于切除His标签以达到药用蛋白的要求。本发明提供的方法表达菌株表达出的hSOD1为可溶性表达，并且添加Cu²⁺&Zn²⁺诱导时，表达量明显增加，满足规模化生产的要求。

Description

一种人源铜锌超氧化物歧化酶的制备方法

技术领域

本发明属于超氧化物歧化酶制备技术领域，具体涉及一种人源铜锌超氧化物歧化酶的制备方法。

背景技术

超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，简称SOD)，是一类广泛存在于生物体内的金属酶，能够催化超氧阴离子自由基发生歧化反应，平衡机体内的氧自由基。SOD在防辐射、抗衰老、消炎、抑制肿瘤和癌症、自身免疫治疗等方面显示出独特的功能，在医学、食品、化妆品等领域得到越来越多的应用。

到目前为止，已从细菌、原生动物、藻类、霉菌、植物、昆虫、鸟、鱼类和哺乳动物等生物体内分离得到SOD。根据其活性中心结合的金属离子的不同，SOD主要分为三类：铜锌超氧化物歧化酶(Cu/Zn-SOD)、铁超氧化物歧化酶(Fe-SOD)和锰超氧化物歧化酶 (Mn-SOD)。其中，Fe-SOD主要存在于原核细胞和真核细胞的基质中，Mn-SOD主要存在于原核细胞和少数植物细胞中，而Cu/Zn-SOD则主要存在于包括人类在内的真核生物细胞的细胞质中。因此，最适合人体使用的SOD为Cu/Zn-SOD。

国内Cu/Zn-SOD的研究主要侧重于动植物的提取和纯化。其中动物来源的，由于存在原材料有限及卫生安全性等问题，导致制品产量有限，且血液制品的安全性风险大；而植物来源的与人自身的有一定差异，存在免疫原性等问题。因此，利用基因工程生产人源铜锌超氧化物歧化酶是解决原料来源、获得无免疫原性、高活性Cu/Zn-SOD的有效途径。目前已有通过基因工程技术生产人源铜锌超氧化物歧化酶(hSOD1)的先例，但仍存在许多问题，主要包括：(1)目的蛋白表达量不高，由于异源表达***影响目的蛋白表达量；(2) 纯化过程复杂，不带纯化标签的需要经过离子交换、分子排阻和/或等一系列的层析手段进行纯化，而带纯化标签的以包涵体形式存在，又需要经过变性、复性等繁琐的工艺获得活性形式。

发明内容

本发明的目的在于为了解决以上现有技术的不足而提供一种人源铜锌超氧化物歧化酶的制备方法，提高目的蛋白的表达量，提高酶的比活力，简化制备过程。

本发明的技术方案如下：

一种用于构建人源铜锌超氧化物歧化酶重组载体的核苷酸序列，该序列包括在人源铜锌超氧化物歧化酶N末端添加的His-TEV标签，该序列如SEQ ID NO.2所示。

一种人源铜锌超氧化物歧化酶的制备方法，将SEQ ID NO.2所示的序列***原始载体，构建重组载体，扩大培养后提取表达产物，N-His-TEV-hSOD1酶解，纯化得到无标签的 hSOD1。

进一步地，所述的人源铜锌超氧化物歧化酶的制备方法，所述原始载体可以为真核表达载体或原核表达载体。

进一步地，所述的人源铜锌超氧化物歧化酶的制备方法，所述原始载体可以为pET28a。

进一步地，所述的人源铜锌超氧化物歧化酶的制备方法，N-His-TEV-hSOD1酶解采用 TEV蛋白酶。

进一步地，所述的人源铜锌超氧化物歧化酶的制备方法，包括以下步骤：

(1)将SEQ ID NO.2的序列以人工合成的方式***原始载体中，以构建重组载体；

(2)将重组载体导入表达菌株，得到重组菌株；

(3)将重组菌株扩大培养；

(4)将菌体破碎，离心得到上清液；

(5)将上清液纯化，得到纯化后带标签的N-His-TEV-hSOD1；

(6)将N-His-TEV-hSOD1酶解，得到切除标签的酶液；

(7)将切除标签的酶液纯化，得到纯化后的无标签的hSOD1。

进一步地，所述的人源铜锌超氧化物歧化酶的制备方法，步骤(2)中表达菌株为大肠杆菌，优选大肠杆菌Codonplus。

进一步地，所述的人源铜锌超氧化物歧化酶的制备方法，步骤(3)中重组菌株扩大培养过程为将重组菌株在25～37℃、含10～50μg/mL卡那霉素和10～50μg/mL氯霉素的LB培养基中培养至OD₆₀₀达0.4～1.0，加入终浓度为0.1-1.0mM的IPTG，在15～42℃下诱导 4～16小时，离心收集菌体；更进一步地，培养至OD₆₀₀达0.4～1.0，加入终浓度为0.1-1.0mM 的IPTG，同时分别加入500μM以内的Cu²⁺和Zn²⁺，诱导温度为15～42℃，诱导时间为4～16 小时。

进一步地，所述的人源铜锌超氧化物歧化酶的制备方法，步骤(3)中重组菌株扩大培养中还加入了铜离子和锌离子。

本发明提供了一种人源铜锌超氧化物歧化酶的制备方法，所述方法目的基因根据密码子偏爱性设计目的基因序列，并且在N末端添加His-TEV标签，得到目的基因序列SEQID NO.2，既避免了表达异源性，又避免了动物或人来源的安全性风险；所述方法质粒构建通过人工合成的方式将目的基因合成到质粒载体上，省去酶切、连接、胶回收等步骤，使得操作更容易且可以选择性的去除载体多克隆位点中各酶切位点基因序列、操纵子与目的基因之间的可表达的基因序列；所述方法目的蛋白表达的起始点即目的基因的起始密码子，使得目的氨基酸序列不会包含设计外的氨基酸序列，以避免其对蛋白结构的影响；所述方法中序列设计添加了His纯化标签和标签切除TEV识别位点，既有利于纯化，也便于切除His标签以达到药用蛋白的要求。所述方法表达菌株表达出的hSOD1为可溶性表达，并且添加Cu²⁺&Zn²⁺诱导时，表达量明显增加，满足规模化生产的要求。

本发明使用人工合成的方式连接目的基因，合成时优化去除了pET-28a载体多克隆位点中各酶切位点基因序列、操纵子与目的基因之间的可表达的基因序列等。

本发明使用氯化钙转化法将重组载体pET-28a-N-His-TEV-hSOD1导入表达菌株中。

本发明制备方法中，纯化带标签的N-His-TEV-hSOD1的方法包括亲和层析和脱盐，亲和层析优选使用Ni Sepharose层析柱，脱盐优选使用Sephadex G25层析柱。纯化的步骤包括：

(1)粗提目的蛋白，用破碎缓冲液(50mM Tris，500mM NaCl，5％甘油，pH8.0)重悬菌体，之后用高压均质机破碎菌体，离心收集上清液；

(2)亲和层析，先用缓冲液A(50mM Tris，500mM NaCl，5％甘油，pH8.0)平衡的 NiSepharose层析柱；之后用4％～60％缓冲液B(50mM Tris，500mM NaCl，5％甘油，500mM 咪唑，pH 8.0)进行洗脱，收集洗脱液；

(3)脱盐，将亲和洗脱液进行脱盐处理，先用4％～60％缓冲液B(50mM Tris，500mMNaCl，5％甘油，500mM咪唑，pH 8.0)平衡Desalting层析柱；之后用脱盐缓冲液(50mM Tris，500mM NaCl，5％甘油，pH8.0)进行洗脱，收集洗脱液，得纯的带标签的蛋白溶液。

本发明纯化不带标签的hSOD1的方法包括酶解、亲和层析去标签纯化和凝胶过滤浓缩，亲和层析优选使用Ni Sepharose层析柱，浓缩优选使用Superdex 75层析柱。纯化的步骤包括：

(1)酶解，将纯化的带标签的N-His-TEV-hSOD1的蛋白溶液，添加TEV蛋白酶，2～8℃ 下酶解过夜；

(2)亲和层析去标签纯化，先用Buffer A平衡Ni Sepharose层析柱，然后上样酶解液，并用Buffer A淋洗，收集流传液，之后用4％～60％Buffer B冲洗亲和在层析柱上的His标签，恢复层析柱亲和能力；

(3)浓缩，将亲和流穿液进行浓缩处理，先用凝胶过滤缓冲液(50mM Tris,pH8.0,500mM NaCl)平衡Superdex 75层析柱，然后上样亲和流穿液，并用凝胶过滤缓冲液淋洗，收集目的蛋白峰溶液，得纯的带标签的蛋白溶液。

本发明方法中经密码子偏爱性优化的目的基因序列，可以在大肠杆菌表达菌株中表达，且表达菌株表达出的目的蛋白绝大部分存在于菌体破碎后的上清液中。同时，本发明通过在重组菌培养过程中同时加入铜离子和锌离子诱导，表达量明显提高。再者，目的基因设计时在N末端添加His-TEV标签，使得纯化和His标签切除简便、高效。此外，本发明方法中重组载体通过人工合成的方式构建，选择性的去除了对目的蛋白有影响的基因序列，并且构建方法十分简单，适用于工业化。本发明的方法适用于在工业上大规模地制备具有高比活力的hSOD1。

附图说明

图1为实施例1中所述重组载体pET-28a-N-His-TEV-hSOD1的物理图谱；

图2为实施例2中重组大肠杆菌生产hSOD1筛选的电泳图。其中，M为蛋白质分子量标准；泳道1为全细胞；泳道2为破碎的全细胞；泳道3为破碎上清；泳道4为被Ni Sepharose纯化后样品；A、B、C、D为挑选的4个重组单菌落

图3为实施例3中诱导生产hSOD1的电泳图，其中(a)为IPTG诱导生产hSOD1的电泳图；

(a)中，M为蛋白质分子量标准；泳道1为全细胞；泳道；2为破碎的全细胞；泳道 3为破碎上清；泳道4为被Ni Sepharose纯化后样品；

(b)为IPTG和Cu²⁺&Zn²⁺诱导生产hSOD1的电泳图，(b)中，M为蛋白质分子量标准；泳道1为全细胞；泳道2为破碎上清；泳道3为被Ni Sepharose纯化后样品；

图4为实施例5中诱导和纯化过程中的电泳图，其中，M为蛋白质分子量标准；泳道1为对比空载体；泳道2为未诱导载体；泳道3为诱导载体沉淀；泳道4为诱导载体上清；泳道5为富集纯化后pET-28a-N-His-TEV-hSOD1；泳道6为TEV酶切后hSOD1；

图5为实施例5中pET-28a-N-His-TEV-hSOD1和hSOD1的质谱图。

具体实施方式：

实施例1

本发明所述实施例中所用的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。

本发明所述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

本发明所用包含hSOD1基因编码序列的核苷酸片段可以通过PCR扩增、人工合成等方法获得。对于人工合成目的基因，本领域技术人员知晓通过Emboss等软件分析密码子偏爱性，设计目的基因序列等技术。不同生物体对编码同一氨基酸的密码子有一定的偏爱性，通过密码子使用偏好性的分析，针对这些最优密码子设计可以提高目的基因的表达量。本发明优选通过密码子偏爱性设计人工合成包含hSOD1基因编码序列的核苷酸片段。

本发明所用的原始载体可为原核表达载体和真核表达载体。原核表达***具有遗传背景清楚、表达量高、表达产物分离纯化相对简单以及适于工业化生产的优点。优选地，所述原始载体为原核表达载体，如pET系列载体、pQE系列载体、pGEX系列载体、pMAL 系列载体等。在原核表达载体中，本发明优选pET系列载体，特别是pET-28a。

本发明采用在培养过程中添加铜、锌离子来提高hSOD1的表达量。因Cu²⁺&Zn²⁺是hSOD1活性中心结构的重要组成部分，并且与hSOD1是否形成正确的折叠结构密切相关，而不能正确折叠肽链的特异性错误积累是导致包涵体形成的主要原因。因此除了降低诱导表达时的培养温度，在培养基中添加Cu²⁺&Zn²⁺达到使hSOD1可溶性表达的目的，以提高表达量。

本发明所述实施例中超氧化物歧化酶酶活检测的方法如下：

超氧化物歧化酶酶活定义为，25℃时抑制邻苯三酚自氧化速率50％时所需的酶量为一个酶活力单位(U)。

配制如下试剂：

A液：pH 8.20 0.1mol/L三羟甲基氨基甲烷(Tris)-盐酸缓冲溶液(内含1mmol/LED TA·2Na)。称取1.2114g Tris和37.2mg EDTA·2Na溶于62.4mL 0.1mol/L盐酸溶液中，用蒸馏水定容至100mL。

B液：4.5mmol/L邻苯三酚盐酸溶液。称取邻苯三酚(A.R)56.7mg溶于少量10mmol/L盐酸溶液，并定容至100mL。

邻苯三酚自氧化速率测定在25℃时，于10mL比色管中依次加入A液2.35mL，蒸馏水2.00mL，B液0.15mL。加入B液立即混合并倾入比色皿中，分别测定在325nm波长条件下初始时和1min后吸光值，二者之差即邻苯三酚自氧化速率ΔA₃₂₅(min^-1)。

SOD酶液抑制邻苯三酚自氧化速率测定按上述步骤加入一定量酶液使抑制邻苯三酚自氧化速率约为1/2ΔA₃₂₅(min^-1)。

按照如下公式计算待测溶液中超氧化物歧化酶的活力(U/mL)：

上述公式中，ΔA₃₂₅为邻苯三酚自氧化速率；ΔA’₃₂₅为待测酶液抑制邻苯三酚自氧化速率；V为待测酶液体积，单位为mL；4.5为反应体系总体积，单位为mL；D为稀释倍数。实施例1：重组表达载体pET28a-N-His-TEV-hSOD1的构建

1)目的基因的获得，以hSOD1的氨基酸序列(SEQ ID NO.1)为模板，根据大肠杆菌密码子偏爱性(如表1所示)，将表达氨基酸序列SEQ ID NO.1对应的密码子转化为大肠杆菌使用频率高的密码子，并调整基因序列GC的百分比，完成基因序列的设计，并且在N 末端添加His-TEV标签，得到目的基因序列SEQ ID NO.2。

表1密码子偏好性

注：密码子后面括弧中的数字表示每1000个密码子中出现对应密码子的频率

2)重组表达载体的构建，通过人工合成的方式，将步骤1)的DNA片段直接合成在原始载体pET28a的多克隆位点处，将pET28a固定在载体上，经过脱保护、偶联、加帽、氧化等一系列化学合成过程直接把目的基因按序列顺序一个一个地连接在pET28a载体的多克隆位点处，构建重组载体pET28a-N-His-TEV-hSOD1，其物理图谱如图1所示。经测序证实，原始载体pET28a多克隆位点处连入SEQ ID NO.2所示的序列。

实施例2：重组大肠杆菌的构建

1)大肠杆菌感受态细胞的制备

用CaCl₂化学法制备大肠杆菌感受态细胞，步骤包括：取1ml已活化的大肠杆菌菌液接种至100ml LB培养基中；37℃振荡培养至OD₆₀₀＝0.35-0.5时；在4℃下以4000g离心收集菌体；加入40ml预冷的0.1MCaCl₂重悬细胞，冰浴10分钟；在4℃下以4000g离心收集菌体；加入2ml预冷的0.1M CaCl₂重悬细胞；加入终浓度15％～20％的甘油；分装成每管50μL；且4℃保存24小时后转到-80℃冰箱中冻存。

2)重组载体pET28a-N-His-TEV-hSOD1转化大肠杆菌感受态细胞

将重组载体pET28a-N-His-TEV-hSOD1 2μL(含量不超过50ng)与大肠杆菌感受态细胞 200μL混合；冰浴30分钟，42℃热激90秒，随后冰浴3～5分钟；每管加入1mL LB培养基，37℃培养45-60分钟(≤220rpm)，使细菌恢复正常生长状态；然后将上述菌液摇匀涂布于含抗生素(卡那霉素和氯霉素)的LB平板，37℃倒置培养过夜。

3)重组hSOD1的表达筛选

从平板上挑取单菌落接种到5mL含抗生素的LB液体培养基中，37℃培养4.5h作为种子液。取0.9ml种子转接到2ml含抗生素的LB液体培养基中，并添加0.3mM IPTG，37℃ 诱导2小时。离心收集菌体进行SDS-PAGE检测，分析hSOD1的表达情况。将剩余种子液加入终浓度15％～20％的甘油分装，4℃保存24小时后转到-80℃冰箱中冻存。

图2为重组大肠杆菌生产hSOD1的筛选。如图所示，M为蛋白质分子量标准；泳道1为全细胞；泳道2为破碎的全细胞；泳道3为破碎上清；泳道4为被Ni Sepharose纯化后样品；A、B、C、D为挑选的4个重组单菌落。可见hSOD1在重组菌株均有表达，且为可溶性表达。

实施例3：重组菌株生产hSOD1

1)重组菌株经IPTG诱导生产hSOD1

取实施例2中甘油保存管中菌液20μL接种到200ml含抗生素的LB液体培养基中，37℃，140rpm培养至OD₆₀₀达0.4～0.6。按2.5％接种量转接到1000ml含抗生素的LB液体培养基中。当37℃振荡培养至OD₆₀₀达0.4～1.0时，添加IPTG至终浓度为0.3mM，30℃ 诱导4小时。离心收集菌体。进行SDS-PAGE检测，分析hSOD1的表达情况及酶活性情况。

图3中(a)为IPTG诱导生产hSOD1。如图所示，M为蛋白质分子量标准；泳道1为全细胞；泳道；2为破碎的全细胞；泳道3为破碎上清；泳道4为被Ni Sepharose纯化后样品。

2)重组菌株经IPTG和Cu²⁺&Zn²⁺诱导生产hSOD1

取实施例2中甘油保存管中菌液20μL接种到200ml含抗生素的LB液体培养基中，37℃，140rpm培养至OD₆₀₀达0.4～0.6。按2.5％接种量转接到1000ml含抗生素的LB液体培养基中。当37℃振荡培养至OD₆₀₀达0.4～1.0时，添加IPTG至终浓度为0.3mM，同时添加0～500μM Cu²⁺&Zn²⁺，30℃诱导4小时。离心收集菌体。进行SDS-PAGE检测，分析hSOD1的表达情况及酶活性情况。

图3中(b)为IPTG和Cu²⁺&Zn²⁺诱导生产hSOD1。如图所示，M为蛋白质分子量标准；泳道1为全细胞；泳道2为破碎上清；泳道3为被Ni Sepharose纯化后样品。

如图3所示，同时添加Cu²⁺&Zn²⁺诱导hSOD1的表达量明显优于比单独用IPTG诱导的。

实施例3方法的酶活性对比情况，结果如表2所示。

表2

Cu²⁺&Zn²⁺浓度(μM)	比活力(U/mg)
		0	7371
50	11075
		150	18912
200	26775
		300	35463
500	23902

实施例4：带标签N-His-TEV-hSOD1的纯化

(3)脱盐，将亲和洗脱液进行脱盐处理，先用4％～60％缓冲液B(50mM Tris，500mMNaCl，5％甘油，500mM咪唑，pH 8.0)平衡Desalting层析柱；之后用脱盐缓冲液(50mM Tris，500mM NaCl，5％甘油，pH8.0)进行洗脱，收集洗脱液，得纯的带标签的蛋白溶液。实施例5：不带标签hSOD1的纯化

(1)酶解，将纯化的带标签的N-His-TEV-hSOD1的蛋白溶液，添加TEV蛋白酶，4℃下酶解过夜；

如图4所示，根据SDS-PAGE电泳显示pET28a-N-His-TEV-SOD1在大肠杆菌表达株中有明显可溶性表达，能被Ni亲和柱很好富集。TEV酶切实验显示pET28a-N-His-TEV-SOD1可被切除标签形成hSOD1。如图5所示，根据LC-MS数据显示大肠杆菌表达的人源重组SOD1蛋白分子量与理论分子量相符合，是目的蛋白。

序列表

<110> 苏州东泉生物科技有限公司

<120> 一种人源铜锌超氧化物歧化酶的制备方法

<130> 1

<160> 2

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 154

<212> PRT

<213> 氨基酸序列(hSOD1)

<400> 1

Met Ala Thr Lys Ala Val Cys Val Leu Lys Gly Asp Gly Pro Val Gln

1 5 10 15

Gly Ile Ile Asn Phe Glu Gln Lys Glu Ser Asn Gly Pro Val Lys Val

20 25 30

Trp Gly Ser Ile Lys Gly Leu Thr Glu Gly Leu His Gly Phe His Val

35 40 45

His Glu Phe Gly Asp Asn Thr Ala Gly Cys Thr Ser Ala Gly Pro His

50 55 60

Phe Asn Pro Leu Ser Arg Lys His Gly Gly Pro Lys Asp Glu Glu Arg

65 70 75 80

His Val Gly Asp Leu Gly Asn Val Thr Ala Asp Lys Asp Gly Val Ala

85 90 95

Asp Val Ser Ile Glu Asp Ser Val Ile Ser Leu Ser Gly Asp His Cys

100 105 110

Ile Ile Gly Arg Thr Leu Val Val His Glu Lys Ala Asp Asp Leu Gly

115 120 125

Lys Gly Gly Asn Glu Glu Ser Thr Lys Thr Gly Asn Ala Gly Ser Arg

130 135 140

Leu Ala Cys Gly Val Ile Gly Ile Ala Gln

145 150

<210> 2

<211> 515

<212> DNA

<213> 人工序列(N-His-TEV-hSOD1)

<400> 2

ccatgcatca tcatcatcat cacgaaaact tgtatttcca gggcatggca accaaagcag 60

tttgtgttct gaaaggtgat ggtccggttc agggtattat taattttgaa cagaaggaaa 120

gcaacggtcc tggggtagca ggttaaagtt ttaaaggtct gaccgaaggt ctgcatggtt 180

ttcatgttca tgaatttggt cagcgcaggt gataataccg caggttgtac ccgcatttta 240

atccgctgag ccgtaaacat ggtggtccga aagatgaaga acgtcatgtt ggtgatctgg 300

gtaatgttac cgcagataaa gatggtgttg cagatgttag cattgaagat agcgttatta 360

gcctgagcgg tgatcattgt attattggtc gtaccctggt ccaaaaccgg aaagcagatg 420

atctgggtaa aggtggtaat gaagaaagca tgttcatgaa taatgcaggt agccgtctgg 480

catgtggtgt tattggtatt gcacagtaac tcgag 515

Claims

1. 一种用于构建人源铜锌超氧化物歧化酶重组载体的核苷酸序列，其特征在于，该序列包括在人源铜锌超氧化物歧化酶N末端添加His-TEV标签，该序列如SEQ ID NO.2所示。

2. 一种人源铜锌超氧化物歧化酶的制备方法，其特征在于，将SEQ ID NO.2所示的序列通过人工合成的方式***原始载体，构建重组载体，扩大培养后提取表达产物，N-His-TEV-hSOD1酶解，纯化得到无标签的hSOD1。

3.根据权利要求2所述的人源铜锌超氧化物歧化酶的制备方法，其特征在于，所述原始载体为真核表达载体或原核表达载体。

4.根据权利要求3所述的人源铜锌超氧化物歧化酶的制备方法，其特征在于，所述原始载体为pET28a。

5.根据权利要求2所述的人源铜锌超氧化物歧化酶的制备方法，其特征在于，N-His-TEV-hSOD1酶解采用TEV蛋白酶。

6.根据权利要求2所述的人源铜锌超氧化物歧化酶的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

（1）将SEQ ID NO.2的序列以人工合成的方式***原始载体中，以构建重组载体；

（2）将重组载体导入表达菌株，得到重组菌株；

（3）将重组菌株扩大培养；

（4）将菌体破碎，离心得到上清液；

（5）将上清液纯化，得到纯化后带标签的N-His-TEV-hSOD1；

（6）将N-His-TEV-hSOD1酶解，得到切除标签的酶液；

（7）将切除标签的酶液纯化，得到纯化后的无标签的hSOD1。

7.根据权利要求6所述的人源铜锌超氧化物歧化酶的制备方法，其特征在于，步骤（2）中表达菌株为大肠杆菌，优选大肠杆菌Codonplus。

8.根据权利要求6所述的人源铜锌超氧化物歧化酶的制备方法，其特征在于，步骤（3）中重组菌株扩大培养中还加入了铜离子和锌离子。

9. 根据权利要求6所述的人源铜锌超氧化物歧化酶的制备方法，其特征在于，步骤（3）中重组菌株扩大培养过程为将重组菌株在25~37℃、含10~50μg/mL卡那霉素和10~50μg/mL氯霉素的LB培养基中培养至 OD₆₀₀达0.4~1.0，加入终浓度为 0.1-1.0mM 的 IPTG，在 15~42℃下诱导 4~16 小时，离心收集菌体。

10. 根据权利要求9所述的人源铜锌超氧化物歧化酶的制备方法，其特征在于，培养至OD₆₀₀达0.4~1.0，加入终浓度为 0.1-1.0mM 的 IPTG，同时分别加入500μM以内的 Cu²⁺和Zn² ⁺，诱导温度为15~42℃，诱导时间为4~16小时。