CN108277210A - 霉烯酮水解酶zen214及编码基因和应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及饲用酶领域，具体涉及赤霉烯酮水解酶ZEN214及编码基因和应用，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，该酶能够水解玉米赤霉烯酮，去除毒素，在动物霉变饲料和饲料原料中的应用具有广阔的发展前景。

Description

霉烯酮水解酶ZEN214及编码基因和应用

技术领域

本发明涉及饲用酶领域，具体涉及霉烯酮水解酶ZEN214及编码基因和应用。

背景技术

玉米赤霉烯酮(Zearalenone,ZEN)是世界上分布最广范的一种由镰刀菌产生的真菌毒素，在亚洲、欧洲和美洲等地的谷物及农副产品中均有发生。ZEN具有类***性质，又称F-2毒素，其化学名为6-(10-羟基-6-氧基-十一碳烯基)β-雷锁酸内酯，分子式为C18H22O5，分子质量为318，熔点为165℃，对热较稳定，120℃加热4h不被降解。ZEN具有很强的生殖毒性，能够与***受体产生竞争性结合继而表现出***活性。***受体与ZEN结合后受体构型发生改变，转移至细胞核中进一步与染色质结合，调节基因转录和蛋白质合成这两大过程，因此使细胞的***和生长受到影响。ZEN主要污染玉米、小麦、大麦等农作物和饲料，能引起猪、鸡等家畜或家禽早熟、生殖周期紊乱，给种养殖业带来巨大损失。ZEN还具有强致癌性，导致乳腺癌、食管癌等发病率增加，成为现今癌症发病率节节上升的原因之一。目前ZEN的检测方法已较为完善，但有关ZEN转化、降解等方面的问题迫在眉睫却仍悬而未决。

ZEN污染范围广泛，危害程度严重，因此，有效控制和解决其对粮食和饲料的污染，对改善动物生产性能和提高人类食品安全有着非常重要的意义。近年来ZEN生物降解方法越来越受到重视。ZEN的生物降解方法主要是指微生物、植物或其代谢时产生的酶与ZEN发生作用并使ZEN分子结构中毒性基团被破坏从而生成无毒代谢产物的过程。由于微生物及其生物酶降解ZEN的方法能够彻底去除毒素，同时，该方法的专一性强、对饲料无污染、不会影响饲料营养价值，因此，该方法在动物霉变饲料和饲料原料中的应用具有广阔的发展前景。

发明内容

本发明的目的是提供一种玉米赤霉烯酮水解酶ZEN214。

本发明的另一目的是提供编码上述玉米赤霉烯酮水解酶ZEN214的基因zen214。

本发明的另一目的是提供包含上述基因的重组载体。

本发明的另一目的是提供包含上述基因的重组菌株。

本发明的另一目的是提供一种制备上述玉米赤霉烯酮水解酶ZEN214的方法。

本发明的另一目的是提供上述玉米赤霉烯酮水解酶ZEN214的应用。

本发明合成了一种新的玉米赤霉烯酮水解酶ZEN214，并构建了能够高效表达此酶的重组大肠杆菌菌株。

本发明提供了一种玉米赤霉烯酮水解酶ZEN214，其氨基酸序列如下：

SEQ ID NO.1：

MVFERLKSTVTTKDGIEWYYEQEGVGPHVVLIPDGLGECQMMDKPMSLIASAGFTVTTFDMPGMSRSSNAPVESYKGVTGHKLATQLDTLMEHLEIAKASFWGCSAGALAVLGLCAHYPSRVRNAMPHEAPLHLMDQLKDLPSLDDETLIASMAAISKASCRDDEAWNSLGPEVHQRLRRNFIRWAHGYISDLTLSPPIETENLRKRPISWTVGADSPMFMFFSNVVTATKADIPIKTLPGSHFPYVSHPEQMSKHIVEATRSHLP

其中，该酶包括266个氨基酸，未预测到信号肽序列，该蛋白理论分子量为29.3kDa。

本发明提供了编码上述玉米赤霉烯酮水解酶ZEN214的基因zen214，其编码基因经密码子优化后序列如下：

SEQ ID NO.2：

atggttttcgaaagattgaagtctactgttactactaaagatggtattgagtggtactatgaacaagagggtgttggtccacatgttgttttgattcctgatggtttgggtgaatgtcaaatgatggataagccaatgtctttgattgcttctgctggttttactgttactactttcgatatgccaggaatgtctagatcttctaacgctcctgttgaatcttacaagggtgttactggtcataaattggctactcaattggatactttgatggaacacttggagattgctaaagcttctttttggggttgttctgctggtgctttggctgttttgggtttgtgtgctcactatccatctagagttagaaatgctatgccacatgaagctcctttgcacttgatggatcaattgaaggatttgccttctttggatgatgagactttgattgcttctatggctgctatttctaaagcttcttgtagagatgatgaagcttggaattctttgggtccagaggttcatcaaagattgagaagaaacttcatcagatgggctcacggttacatttctgatttgactttgtctccacctattgaaactgagaacttgagaaagagaccaatttcttggactgttggtgctgattctcctatgttcatgtttttctctaacgttgttactgctactaaggctgatatcccaattaaaactttgcctggtagtcatttcccatatgtttctcaccctgaacaaatgtctaaacatattgttgaggctactagatctcacttgccttaa

本发明提供了包含上述赤霉烯酮水解酶基因zen214的重组载体，优选为pet30a-zen214。将本发明的赤霉烯酮水解酶基因***到表达载体合适的限制性酶切位点之间，使其核苷酸序列可操作的与表达调控序列相连接。作为本发明的一个最优选的实施方案，优选为将本发明的赤霉烯酮水解酶基因***到质粒pet30a上的Nde I和Not I限制性酶切位点之间，使该核苷酸序列位于T7启动子的下游并受其调控，得到重组大肠杆菌表达质粒pet30a-zen214。

本发明还提供了包含上述赤霉烯酮水解酶基因zen214的重组菌株，优选所述菌株为大肠杆菌BL21/zen214。

本发明还提供了一种制备赤霉烯酮水解酶ZEN214的方法，包括以下步骤：

1)用上述的重组载体转化宿主细胞，得重组菌株；

2)培养重组菌株，诱导重组赤霉烯酮水解酶表达；

3)回收并纯化所表达的赤霉烯酮水解酶ZEN214蛋白。

根据本发明的具体实施方式，在大肠杆菌中表达赤霉烯酮水解酶。为了测定赤霉烯酮水解酶的性质，通过如硫酸铵沉淀，透析、超滤和层析的简单方法纯化赤霉烯酮水解酶。经过简单的净化，赤霉烯酮水解酶的纯度足以研究酶学性质的研究。

本发明还提供了上述赤霉烯酮水解酶ZEN214的应用，包括生物质能源、食品工业和饲料工业等方面的应用。

组表达的赤霉烯酮水解酶ZEN214具有宽泛的pH范围，在pH 5.0-9.0均具有较好的水解能力，其最适温度范围为35-40摄氏度。

附图说明

图1显示赤霉烯酮水解酶的SDS-PAGE分析结果。

图2显示赤霉烯酮水解酶降解玉米赤霉烯酮底物HPLC分析结果。

具体实施方式

试验材料和试剂

1、菌株及载体：本发明的赤霉烯酮水解酶ZEN214的编码基因(SEQ ID NO.2)在金斯瑞公司合成。

2、酶类及其它生化试剂：内切酶购自TaKaRa公司，连接酶购自Invitrogen公司。其它都为国产试剂(均可从普通生化试剂公司购买得到)。

3、大肠杆菌培养基LB(1％蛋白胨、0.5％酵母提取物、1％NaCl,pH自然)。

说明：以下实施例中未作具体说明的分子生物学实验方法，均参照《分子克隆实验指南》(第三版)J.萨姆布鲁克一书中所列的具体方法进行，或者按照试剂盒和产品说明书进行。

实施例1重组赤霉烯酮水解酶ZEN214表达载体的构建

采用overlap-PCR的方法，经两步PCR方法将表达载体pet30a与赤霉烯酮水解酶编码基因zen214连接，获得重组质粒pet30a-zen214并转化大肠杆菌BL21，获得重组大肠杆菌菌株BL21/zen214。

第一步PCR所用引物如下：

214-30a F:5'-TATGCACCATCATCATCATCATATGGTTTTCGAAAGATTG-3'

214-30a R:5'-AGTGGTGGTGGTGGTGGTGTTAAGGCAAGTGAGATCTAGT-3'

30a-214F:5'-GCCTTAACACCACCACCACCACCACTGAGATCCG-3'

30a-214R:5'-TCGAAAACCATATGATGATGATGATGGTGCATAT-3'

其中214-30a F与214-30a R用于扩增zen214的片段，30a-214F与30a-214R用于扩增pet30a的载体片段。

PCR反应体系如下：

PCR反应条件为：95℃5min；94℃30sec，60℃30sec，72℃2.5min,30个循环；72℃,10min；4℃,hold。

扩增结束后，将PCR产物进行核酸电泳检测，条带大小分别为801bp和5500bp，将其分别回收纯化，进行第二轮PCR，该PCR不需要加入引物，第一步PCR两段产物互为引物与模板可扩增出重组的片段，控制加入的基因片段与载体片段的摩尔比为1：1，浓度在50ng/μl。

PCR反应体系如下：

PCR反应条件为：95℃5min；94℃30sec，62℃30sec，72℃3.5min,30个循环；72℃,10min；4℃,hold。

扩增结束后，经核酸电泳验证其PCR产物为6300bp或是呈多聚物形式聚集在点样孔中，即可直接将5μLPCR产物转化大肠杆菌TransⅠ感受态。

待测序正确后，将重组质粒pet30a-zen214转化大肠杆菌感受态BL21进行诱导表达。分别挑取3-5个阳性转化子接种至30ml含有100μg/ml氨苄青霉素的LB液体培养基中，37℃、250rpm培养6小时，此为预培养；将此预培养转接至300ml含有100μg/ml氨苄青霉素的LB液体培养基中，37℃、250rpm培养2-3小时，此OD600约为0.4。将1M IPTG储液加入到此培养物中，使IPTG终浓度达到0.06mM，同时将培养温度降低至25℃，维持摇床的转速不变，继续诱导8小时。4000g离心15分钟，弃上清并收集细菌。用25ml Tris缓冲液(20mM Tris-HCl,150mMNaCl,pH7.5)重选菌体，用超声波破碎细菌菌体，12000g离心15分钟，上清液中含有重组的赤霉烯酮水解酶蛋白。将上清液和1ml Ni-NTA金属螯合层析，洗涤3次含有重组蛋白的Ni-NTA金属螯合层析琼脂，再用含不同浓度(100mM-400mM)咪唑的洗脱缓冲液(20mM Tris-HCl,150mMNaCl,pH7.5)将重组蛋白从琼脂上洗脱下来。SDS-PAGE验证蛋白的纯度，合并最纯部分的蛋白，并将重组蛋白对Tris缓冲液(20mM Tris-HCl,150mMNaCl,pH7.5)透析以更换缓冲液。

实施例2重组赤霉烯酮水解酶的活性分析

经过密码子优化的赤霉烯酮水解酶的ZEN214，其蛋白表达量比未优化前提高了约2.2倍，能够显著降低生产成本，表达及纯化后的蛋白SDS-PAGE分析结果如图1所示，赤霉烯酮水解酶降解玉米赤霉烯酮底物HPLC分析如图2所示，

反应体系为：

800ul的pH6.0的磷酸氢二钠柠檬酸缓冲液，加上100ul溶于DMSO的0.5g/L的赤霉烯酮毒素(购自sigma公司)，然后加入100ul经过适当稀释的酶液，37摄氏度温浴小时，然后加入2倍体积的DMSO终止反应，同时剧烈震荡后，吸取部分样品过微孔滤膜后，上样高效液相分析(HPLC)，对照为适当稀释的酶液在沸水浴中5分钟灭活。

组表达的赤霉烯酮水解酶ZEN214具有宽泛的pH范围，在pH 5.0-9.0均具有较好的水解能力，其最适温度范围为35-40℃。

序列表

<110> 中国农业科学院饲料研究所

<120> 霉烯酮水解酶ZEN214及编码基因和应用

<160> 2

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 266

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

Met Val Phe Glu Arg Leu Lys Ser Thr Val Thr Thr Lys Asp Gly Ile

1 5 10 15

Glu Trp Tyr Tyr Glu Gln Glu Gly Val Gly Pro His Val Val Leu Ile

20 25 30

Pro Asp Gly Leu Gly Glu Cys Gln Met Met Asp Lys Pro Met Ser Leu

35 40 45

Ile Ala Ser Ala Gly Phe Thr Val Thr Thr Phe Asp Met Pro Gly Met

50 55 60

Ser Arg Ser Ser Asn Ala Pro Val Glu Ser Tyr Lys Gly Val Thr Gly

65 70 75 80

His Lys Leu Ala Thr Gln Leu Asp Thr Leu Met Glu His Leu Glu Ile

85 90 95

Ala Lys Ala Ser Phe Trp Gly Cys Ser Ala Gly Ala Leu Ala Val Leu

100 105 110

Gly Leu Cys Ala His Tyr Pro Ser Arg Val Arg Asn Ala Met Pro His

115 120 125

Glu Ala Pro Leu His Leu Met Asp Gln Leu Lys Asp Leu Pro Ser Leu

130 135 140

Asp Asp Glu Thr Leu Ile Ala Ser Met Ala Ala Ile Ser Lys Ala Ser

145 150 155 160

Cys Arg Asp Asp Glu Ala Trp Asn Ser Leu Gly Pro Glu Val His Gln

165 170 175

Arg Leu Arg Arg Asn Phe Ile Arg Trp Ala His Gly Tyr Ile Ser Asp

180 185 190

Leu Thr Leu Ser Pro Pro Ile Glu Thr Glu Asn Leu Arg Lys Arg Pro

195 200 205

Ile Ser Trp Thr Val Gly Ala Asp Ser Pro Met Phe Met Phe Phe Ser

210 215 220

Asn Val Val Thr Ala Thr Lys Ala Asp Ile Pro Ile Lys Thr Leu Pro

225 230 235 240

Gly Ser His Phe Pro Tyr Val Ser His Pro Glu Gln Met Ser Lys His

245 250 255

Ile Val Glu Ala Thr Arg Ser His Leu Pro

260 265

<210> 2

<211> 801

<212> DNA

<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum

<400> 2

atggttttcg aaagattgaa gtctactgtt actactaaag atggtattga gtggtactat 60

gaacaagagg gtgttggtcc acatgttgtt ttgattcctg atggtttggg tgaatgtcaa 120

atgatggata agccaatgtc tttgattgct tctgctggtt ttactgttac tactttcgat 180

atgccaggaa tgtctagatc ttctaacgct cctgttgaat cttacaaggg tgttactggt 240

cataaattgg ctactcaatt ggatactttg atggaacact tggagattgc taaagcttct 300

ttttggggtt gttctgctgg tgctttggct gttttgggtt tgtgtgctca ctatccatct 360

agagttagaa atgctatgcc acatgaagct cctttgcact tgatggatca attgaaggat 420

ttgccttctt tggatgatga gactttgatt gcttctatgg ctgctatttc taaagcttct 480

tgtagagatg atgaagcttg gaattctttg ggtccagagg ttcatcaaag attgagaaga 540

aacttcatca gatgggctca cggttacatt tctgatttga ctttgtctcc acctattgaa 600

actgagaact tgagaaagag accaatttct tggactgttg gtgctgattc tcctatgttc 660

atgtttttct ctaacgttgt tactgctact aaggctgata tcccaattaa aactttgcct 720

ggtagtcatt tcccatatgt ttctcaccct gaacaaatgt ctaaacatat tgttgaggct 780

actagatctc acttgcctta a 801

Claims (9)

1.玉米赤霉烯酮水解酶ZEN214，其特征在于，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

2.玉米赤霉烯酮水解酶基因，其特征在于，编码权利要求1所述的玉米赤霉烯酮水解酶ZEN214。

3.根据权利要求2所述的玉米赤霉烯酮水解酶基因，其特征在于，其核苷酸序列如SEQID NO.2所示。

4.包含权利要求2所述玉米赤霉烯酮水解酶基因的重组载体。

5.包含权利要求2所述玉米赤霉烯酮水解酶基因的重组载体pet30a-zen214。

6.包含权利要求2所述玉米赤霉烯酮水解酶基因的重组细胞。

7.根据权利要求6所述的重组细胞，其特征在于，所述重组细胞为大肠杆菌细胞或酵母细胞。

8.权利要求1所述玉米赤霉烯酮水解酶ZEN214的应用。

9.权利要求2所述玉米赤霉烯酮水解酶基因的应用。