CN113025591B

CN113025591B - 一种法尼基转移酶变体及其制备方法

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Publication number: CN113025591B
Application number: CN201911343531.XA
Authority: CN
Inventors: 文良柱; 赵珊珊; 王雪松; 苗森; 姜皓; 容平芳; 徐晓峰; 支艳艳; 李晓稳
Original assignee: Jiangsu Wanbang Pharmaceutical Technology Co ltd; China Pharmaceutical University
Current assignee: Jiangsu Wanbang Pharmaceutical Technology Co ltd; China Pharmaceutical University
Priority date: 2019-12-24
Filing date: 2019-12-24
Publication date: 2024-02-27
Anticipated expiration: 2039-12-24
Also published as: CN113025591A

Abstract

本发明公开了一种法尼基转移酶变体及其制备方法，本发明筛选出一种法尼基转移酶蛋白序列，将其基因通过密码子优化后，通过大肠杆菌表达体系进行高密度发酵诱导表达，表达量高；进一步提供了无需经过变形性和复性的可溶性表达方法，并且纯化步骤简单方便；通过特异性酶活性检测该制备的法尼基转移酶具有很强的酶活力，为蛋白偶联提供一种可工业化生产的工具酶。

Description

一种法尼基转移酶变体及其制备方法

技术领域

本发明属于生物技术领域，特别涉及一种法尼基转移酶变体及其制备方法。

背景技术

法尼基转移酶(Farnesyl Transferase，FTase)由两个亚基组成：一个48kDa的α亚基和一个46kDa的β亚基，两个亚基主要由α螺旋组成。α亚基由双层平行堆叠的成对α螺旋构成，其围绕β亚基部分包裹，就像毯子一样。β亚基的α螺旋形成一个桶。活性位点由β亚基的中心形成，α亚基的一部分侧接在β亚基的中心(如图5)。

FTase可催化以下化学反应：

法尼基二磷酸盐+蛋白质-半胱氨酸S-法尼基蛋白+二磷酸

该酶具有用于法尼基二磷酸酯(脂质供体分子)的疏水结合口袋，主要向目标蛋白质的羧基末端带有CaaX四个氨基酸序列的部位加法尼基(十五碳类异戊二烯基团)。其中：C是异戊烯基化的半胱氨酸，a是任何脂肪族氨基酸，X是M，S，Q，A或C。目标蛋白质羧基末端半胱氨酸(C)中的-SH与法尼基形成硫醚键，CaaX基序的最后三个氨基酸随后被去除，使翻译后的蛋白质完成法尼基化修饰。

蛋白药物的开发过程中，尤其是药物偶联抗体，往往在其蛋白序列的羧基末端加入CaaX基序。FTase可以识别抗体分子羧基末端的CaaX框，通过硫醚键将具有生物活性的小分子药物连接到抗体分子上，而抗体作为载体将小分子药物运输到靶细胞中。FTase作为定向偶联工具酶，解决了传统偶联技术中所得产品是有不同药物分子数的混合物且无法实现特定位置偶联的缺点。所以越来越多的学者和医药企业将开发FTase作为研发重点。

目前关于法尼基转移酶制备等相关研究的文献或专利非常少；本领域需要提供一种法尼基裂解酶的蛋白序列以及制备方法，可以实现其作为工具酶的应用价值。

发明内容

本发明的目的之一是提供一种法尼基转移酶变体。

本发明的目的之二是提供本发明所述的法尼基转移酶变体的制备方法。

本发明所述的目的通过以下方案实现：

本发明所述的法尼基转移酶变体，包括被修饰的法尼基转移酶α亚基和β亚基。

本发明所述的法尼基转移酶变体的制备方法，是将被修饰的法尼基转移酶α亚基和β亚基基因在大肠杆菌中可溶性表达和纯化，制备得到的法尼基转移酶可以应用于实验研究。

本发明具体的技术方案如下：

一种法尼基转移酶变体，包括被修饰的法尼基转移酶α亚基和β亚基，其中，被修饰的法尼基转移酶α亚基序列结构从N端到C端依次包括A1-A2-A3，A1为His标签，A2为EVDDDDK连接位点，A3为法尼基转移酶α亚基。

在一种实施例中，A1为3～8个His标签，在一种具体实施例中，A1为6个His标签，其核苷酸序列为Seq ID No.3，氨基酸序列为Seq ID No.4。

在一种实施例中，A2为EVDDDDK连接位点，核苷酸序列为Seq ID No.5，氨基酸序列为Seq ID No.6。

在一种实施例中，A3为法尼基转移酶α亚基，核苷酸序列为Seq ID No.7，氨基酸序列为Seq ID No.8。

在一种实施例中，本发明所述的被修饰的法尼基转移酶α亚基核苷酸序列为SeqID No.1，氨基酸序列为Seq ID No.2。

在一种实施例中，法尼基转移酶β亚基，核苷酸序列为Seq ID No.9，氨基酸序列为Seq ID No.10。

在一种实施例中，本发明所述的法尼基转移酶变体，所述变体的核苷酸序列包括Seq ID No.1和Seq ID No.9，氨基酸序列包括Seq ID No.2和Seq ID No.10。

本发明是采用大肠杆菌为宿主，为了增加宿主的表达效率，本发明将法尼基转移酶α亚基和β亚基及两者变体的核苷酸序列进行密码子偏好性优化。在本发明优选的实施方式中，编码所述的法尼基转移酶基因序列分别为Seq ID No.7和Seq ID No.9所示的核苷酸序列。

本发明进一步提供一类表达载体，包含编码所述的含被修饰的法尼基转移酶α亚基和β亚基基因序列。该表达载体属于pETDuet类，含有两个多克隆酶切位点区域，可用于在大肠杆菌中同时表达两个目的基因。

为***pETDuet中，在合成包含被修饰的的法尼基转移酶α亚基时，两端分别添加了NcoI/HindIII限制酶酶切位点。在合成法尼基转移酶β亚基时，两端分别添加了NdeI/XhoI限制酶酶切位点。将其***质粒pETDuet的NcoI/HindIII和NdeI/XhoI酶切位点。

另外，本发明提供所述法尼基转移酶变体的制备方法，该方法是以大肠杆菌作为表达宿主的可溶性表达方法，包括以下步骤：

(1)高密度发酵法尼基转移酶变体；

(2)收集菌体；

(3)破碎菌体；

(4)收集上清；

(5)Ni²⁺-NTA基质纯化上述法尼基转移酶变体；

(6)离子交换纯化法尼基转移酶变体；

(7)浓缩。

在一种实施例中，步骤(1)中高密度发酵所用的工程菌为大肠杆菌BL21(DE3)，本发明的方法对大肠杆菌宿主的种类没有任何限制。优选那些能够直接表达构象正确目的蛋白的宿主。将前述表达载体转化大肠杆菌BL21(DE3)的转化方法在本领域是公知的，例如电穿孔法、CaCL₂转化法等。

在一种实施例中，步骤(1)中的高密度发酵可采用本领域技术人员所公知的诱导宿主表达蛋白的技术。

在本发明优选的实施方式中，步骤(1)中的高密度发酵法尼基转移酶在发酵1.5-5小时OD₆₀₀为50-250进行诱导，诱导温度20-30℃。发明人发现采用该条件，可以使得目的蛋白获得更高效的表达。为了获得更高效的表达，进一步优选发酵3-5小时OD₆₀₀为150-250进行诱导。诱导可以采用本领域常规的方法，在一种实施例中，是采用终浓度为0.lmM至2mM的异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)进行诱导。

本发明步骤(1)中的高密度发酵法尼基转移酶可以采用本领域常用的培养基；为了获得更高效的表达，在一种实施例中，本发明的种子培养基和基础发酵罐培养基均采用葡萄糖或甘油作为碳源，更优选为甘油。

在一种实施例中，本发明提供一种可以提高表达的种子培养基，包含：12～15g/L胰蛋白胨(Typtone)，30～35g/L酵母提取物(Yeast Extraction)和4～6ml/L甘油。

在一种实施例中，本发明提供一种可以提高标的基础发酵罐培养基，包含：12～15g/L胰蛋白胨(Typtone)，30～35g/L酵母提取物(Yeast Extraction)和4～6ml/L甘油。

本发明步骤(2)收集菌体的方法可以为本领域的常规方法。

本发明步骤(3)破碎菌体可以采用本领域的常规方法，包括但不限于高压匀浆、渗透压冲击、冻融、超声波破碎等。

本发明步骤(4)收集上清的方法可以为本领域的常规方法。

在一种实施方式中，本发明步骤(5)中Ni²⁺-NTA基质纯化具体是采用Ni²⁺-NTA基质，通过梯度为20mM至1M的咪唑溶液洗脱法尼基转移酶变体。

在一种实施方式中，本发明步骤(6)离子交换纯化法尼基转移酶变体采用的阴离子基质包括但不限于uniQ30S、UniMSP30s、UniGEL80Q、UniCORE10Q、bestaroseFF、sepaxMC60Q、POROSTM50HQ等。

本发明通过活性测定表明利用大肠杆菌可溶性表达可以制备得到有活性的法尼基转移酶变体。

本发明还提供所述的法尼基转移酶变体、所述的编码基因或所述表达载体在酶联反应中的应用。

本发明所提供的法尼基转移酶变体，以及制备法尼基转移酶变体的方法具有以下优点：

(1)通过引入His标签，使后续纯化工作简单易行。

(2)通过引入连接序列，使法尼基转移酶α链蛋白更容易形成正确的空间结构，保证其活性，也确保了被修饰的法尼基转移酶α亚基和法尼基转移酶β亚基同时表达后可以更准确的利用自身性质进行组装。

(3)通过使用具有两个多克隆位点区域的载体(例如pETduet等)，使被修饰的法尼基转移酶α亚基和法尼基转移酶β亚基可以同时表达，最终使目的基因两个亚基利用自身性质，通过非共价键在宿主体内组装成有活性的法尼基转移酶。

(4)在可溶性表达***中进行诱导表达时，温度控制在20-30℃，表达被修饰的法尼基转移酶α链蛋白和法尼基转移酶β链蛋白，无需经过变性和复性，且产量较高，其存在于菌体中，经采用Ni²⁺-NTA基质粗纯后，再经阴离子基质精纯后即可得到有活性的纯度较高(纯度≥95％)法尼基转移酶，且本发明实施例2和3证明，采用甘油作为碳源时可以提高蛋白表达；实施例2、4-6证明，在OD₆₀₀为150-250进行诱导时可以进一步提高蛋白表达。

附图说明

图1.法尼基转移酶工程菌表达电泳图。

图2.法尼基转移酶蛋白纯化电泳图Ni²⁺-NTA层析纯化洗脱峰电泳图。

图3.法尼基转移酶阴离子纯化电泳图。

图4.浓缩后成品电泳图。

图5法尼基转移酶亚基示意图。

具体实施方式

本发明所述方法，若无特别说明，均为本领域的常规方法。

部分材料：

菌株和质粒：表达菌株BL21(DE3)和质粒Petduet由南京金斯瑞有限公司提供。

酶和试剂：

实施例中涉及分子生物学操作所用的酶均购于购自TakaRa，相应的操作步骤完全按照相关的产品说明书进行。

实施例中所涉及的法尼基转移酶α亚基或被修饰的法尼基转移酶α亚基和β亚基基因合成、和测序工作由南京金斯瑞有限公司完成。

其他未标明来源的原、辅料均为市售产品。

实施例1：法尼基转移酶工程菌的制备

一、法尼基转移酶表达载体和工程菌的构建

1、构建法尼基转移酶核苷酸序列：EVDDDDK酶切位点和法尼基转移酶α亚基的氨基酸序列分别如下(Seq ID No.6和Seq ID No.8，)。按照大肠杆菌密码子偏好性对氨基酸序列的的原始核苷酸进行优化，该优化方法为本领域技术人员所公知的技术，可参见例如内蒙古大学学报：大肠杆菌和酵母密码子使用对比，006,VOI.37,NO.1:34-39；得到最终的核苷酸序列：Seq ID No.5和Seq ID No.7。在初步修饰后的法尼基转移酶α亚基的5’端加入6个His(基因序列为Seq ID No.3)，获得包含6个His标签的修饰的法尼基转移酶α亚基核苷酸序列(Seq ID No.1，1-3bp为甲硫氨酸，4-21bp为6个His基因序列，22-42bp为EVDDDDK连接位点，43-1131bp为法尼基转移酶α亚基基因序列；氨基酸序列如Seq ID No.2，1aa为甲硫氨酸，2-7aa为6个His，8-14aa为EVDDDDK连接位点，15-377aa为法尼基转移酶α亚基氨基酸序列)，在该核苷酸序列两端引入NcoI/HindIII连入载体中。在法尼基转移酶β亚基核苷酸序列(Seq ID No.9，1-3bp为甲硫氨酸编码序列，4-1311bp为法尼基转移酶β亚基基因序列，氨基酸序列如Seq ID No.10，1aa为甲硫氨酸，2-437aa为法尼基转移酶β亚基氨基酸序列)两端引入NdeI/XhoI酶切位点。

2、人工合成上述基因序列。通过Xba I/Hind I酶切位点将α链基因***到质粒pETDuet-1相应酶切位点中，通过Nde I/Xho I酶切位点将β链基因***到质粒pETDuet-1相应酶切位点中，构建成的重组质粒。

3、构建法尼基转移酶工程菌：将上述重组质粒通过CaC1₂转化的方法导入到BL21(DE3)中，构建法尼基转移酶工程菌。如果需要，转化也可用电转的方法进行。经测序，工程菌中的修饰的法尼基转移酶α亚基和β亚基序列与设计一致。经后续发酵纯化测序后获得法尼基转移酶变体，氨基酸序列为Seq ID No.11。

实施例2：工程菌的高密度发酵方法1

1.发酵培养基配制

1.1培养基

种子培养基：称取27Typtone，63g Yeast Extraction，量取甘油10ml放入5L烧杯中，搅拌至完全溶解，用量筒定容至2000ml。分装至2个250ml摇瓶中(每瓶装50ml TB种子培养基)和3个2L(每瓶装500ml TB种子培养基)。

80L基础罐基：称取1080g Typtone，2520g Yeast Extraction，量取甘油400ml放入10L烧杯中，搅拌至完全溶解，在发酵罐中补足水至80L。

2.发酵过程

2.1一级种子培养

向培养基中加入氨苄青霉素使其终浓度为100μg/ml，按照1％的接种量接入TB种子培养基中，37℃培养，转速200±20rpm，培养14～16h。

2.2二级种子培养

按照1％的接种量，将过夜活化的一级种子接入3个2L摇瓶中，向培养基中加入氨苄青霉素使其终浓度为100μg/ml，37℃培养，转速200±20rpm，3～5h。

2.3 100L发酵过程控制

罐基灭菌后降温至37℃后，溶氧校正100％，将通气量设定在0.2m³/h，搅拌设定为500rpm，待溶氧稳定设定溶氧100％，然后将转速设定为200rpm。pH设定为7.0，自动控制，死区设定为0.2，即pH在7.0±0.2的范围内不自动控制，调整pH用30％磷酸和氨水。用50％甘油作为碳源和酵母粉、蛋白胨混合氮源作进行流加补料。

向发酵罐中加入氨苄青霉素使其终浓度为100μg/ml，并接入1500ml种子。随菌体生长溶氧不断下降，不断提高转速和通气量，保证溶氧维持在20％以上。转速每次提高20～30rpm，最高转速500rpm；通气量每次提高0.1m3/h，最大通气量为2.4m³/h，增加通气量时注意罐压，罐压不得大于0.5公斤；转速和通气量交替提高。用50％甘油作为碳源，酵母粉、蛋白胨混合氮源作进行流加补料。发酵1.5h(菌体生长至OD₆₀₀约50)时，降温至25℃，加入IPTG诱导(IPTG终浓度为0.5mM)。诱导15h后结束发酵。

2.4菌体收获

出罐菌液在管式离心机中离心，离心参数：9000rpm，4℃，30minutes。弃去上清，称重菌体沉淀。

2.5菌体破碎

离心收集的菌体按重量体积比1:5加入破碎缓冲液(含150mM Nacl,50mMTris-HCl,pH8.0)，加入1％曲拉通X-100充分搅匀，无块状菌体，悬浮液即可进行高压匀浆破菌，破菌时采用的操作压力为850±50bar，连续破碎两遍。使用离心机将破碎后混悬液离心，离心参数：离心转速为9000rpm，离心60min，离心温度为4℃，离心两遍，收取上清液。

2.6结果

单位发酵液菌体重量(g/L)	菌体总重量(g)	破菌后上清液蛋白浓度(g/L)
			127	698.5	7.77

实施例3：工程菌的高密度发酵方法2

1.发酵培养基配制

1.1TB培养基

种子培养基：称取24Typtone，48g Yeast Extraction，量取葡萄糖16g放入5L烧杯中，搅拌至完全溶解，用量筒定容至2000ml。分装至2个250ml摇瓶中(每瓶装50ml TB种子培养基)和3个2L(每瓶装500ml TB种子培养基)。

80L基础罐基：称取960g Typtone，1920g Yeast Extraction，磷酸二氢钾184g，磷酸氢二钾1312g，秤取葡萄糖640g放入10L烧杯中，搅拌至完全溶解，在发酵罐中补足水至80L。

2.发酵过程

2.1一级种子培养

2.2二级种子培养

2.3 100L发酵过程控制

罐基灭菌后降温至37℃后，溶氧校正100％，将通气量设定在0.2m³/h，搅拌设定为500rpm，待溶氧稳定设定溶氧100％，然后将转速设定为200rpm。pH设定为7.0，自动控制，死区设定为0.2，即pH在7.0±0.2的范围内不自动控制，调整pH用30％磷酸和氨水。用20g/L葡萄糖作为碳源和酵母粉、蛋白胨混合氮源作进行流加补料。

2.4菌体收获

2.5菌体破碎

2.6结果

单位发酵液菌体重量(g/L)	菌体总重量(g)	破菌后上清液蛋白浓度(g/L)
			122	671	6.05

实施例4：工程菌的高密度发酵方法3

1.发酵培养基配制

1.1培养基

2.发酵过程

2.1一级种子培养

2.2二级种子培养

2.3 100L发酵过程控制

向发酵罐中加入氨苄青霉素使其终浓度为100μg/ml，并接入1500ml种子。随菌体生长溶氧不断下降，不断提高转速和通气量，保证溶氧维持在20％以上。转速每次提高20～30rpm，最高转速500rpm；通气量每次提高0.1m3/h，最大通气量为2.4m³/h，增加通气量时注意罐压，罐压不得大于0.5公斤；转速和通气量交替提高。用50％甘油作为碳源，酵母粉、蛋白胨混合氮源作进行流加补料。发酵3h(菌体生长至OD₆₀₀约150)时，降温至30℃，加入IPTG诱导(IPTG终浓度为0.5mM)。诱导15h后结束发酵。

2.4菌体收获

2.5菌体破碎

2.6结果

单位发酵液菌体重量(g/L)	菌体总重量(g)	破菌后上清液蛋白浓度(g/L)
			175	980	13.17

实施例5：工程菌的高密度发酵方法4

1.发酵培养基配制

1.1培养基

2.发酵过程

2.1一级种子培养

2.2二级种子培养

2.3 100L发酵过程控制

向发酵罐中加入氨苄青霉素使其终浓度为100μg/ml，并接入1500ml种子。随菌体生长溶氧不断下降，不断提高转速和通气量，保证溶氧维持在20％以上。转速每次提高20～30rpm，最高转速500rpm；通气量每次提高0.1m3/h，最大通气量为2.4m3/h，增加通气量时注意罐压，罐压不得大于0.5公斤；转速和通气量交替提高。用50％甘油作为碳源，酵母粉、蛋白胨混合氮源作进行流加补料。发酵3h(菌体生长至OD₆₀₀约150)时，降温至25℃，加入IPTG诱导(IPTG终浓度为0.5mM)。诱导15h后结束发酵。

2.4菌体收获

2.5菌体破碎

2.6结果

单位发酵液菌体重量(g/L)	菌体总重量(g)	破菌后上清液蛋白浓度(g/L)
			172	963.2	15.69

实施例6：工程菌的高密度发酵方法5

1.发酵培养基配制

1.1培养基

2.发酵过程

2.1一级种子培养

2.2二级种子培养

2.3 100L发酵过程控制

向发酵罐中加入氨苄青霉素使其终浓度为100μg/ml，并接入1500ml种子。随菌体生长溶氧不断下降，不断提高转速和通气量，保证溶氧维持在20％以上。转速每次提高20～30rpm，最高转速500rpm；通气量每次提高0.1m3/h，最大通气量为2.4m3/h，增加通气量时注意罐压，罐压不得大于0.5公斤；转速和通气量交替提高。用50％甘油作为碳源，酵母粉、蛋白胨混合氮源作进行流加补料。发酵3h(菌体生长至OD₆₀₀约150)时，降温至20℃，加入IPTG诱导(IPTG终浓度为0.5mM)。诱导15h后结束发酵。

2.4菌体收获

2.5菌体破碎

2.6结果

单位发酵液菌体重量(g/L)	菌体总重量(g)	破菌后上清液蛋白浓度(g/L)
			140	963.2	16.55

实施例7：法尼基转移酶Ni²⁺亲和纯化

将破碎离心后上清用0.45μm滤膜过滤，使用AKTA process层析***，装入层析介质为Chelating Bestarose FF的填料。用NiSO₄溶液进行纯化Ni²⁺挂柱再生。用溶液A：50mMTris-HCl+150mM NaCl，pH8.0平衡柱子，上样，在用溶液B：50mM Tris-HCl+150mM NaCl+

1‰TritonX-100，pH8.0液进行等度洗脱以除去杂蛋白，最后用溶液C：50mM Tris-HCl+150mM NaCl+1M咪唑，pH8.0梯度洗脱目的蛋白(法尼基转移酶)，收集组分峰(如图2)，得到含有咪唑的法尼基转移酶溶液。

实施例8：法尼基转移酶离子纯化

使用AKTA process层析***，装入层析介质为sepaxMC60Q的填料。用溶液D：20mMPB，pH 7.5平衡柱子，用溶液E：20mM PB+1M NaCl，pH 7.5梯度洗脱目的蛋白(法尼基转移酶)，收集组分峰(如图3)。

实施例9：法尼基转移酶的浓缩

取主峰纯度≥95％的法尼基转移酶溶液，用装有1KD板膜进行浓缩，同时用25mMHEPES,40mM NaCl,5mM DTT洗涤，浓缩至法尼基转移酶蛋白浓度为2-5mg/ml。分装置于PETG瓶中，放-70℃保存，浓缩后的电泳图如图4所示。

实施例10：法尼基转移酶活性检测

1实验条件

1.1酶联反应：

Caax-body抗体原液终浓度5mg/mL，10×酶联反应buffer，DTT终浓度0.33mmol/L，FTase终浓度0.25μmol/L，小分子溶液终浓度0.5mmol/L，总体积1ml。反应条件：25℃-28℃水浴反应12～15h。

1.2氧化反应

向酶联反应液重加入8mmol/L DHAA(脱氢抗坏血酸)溶液氧化恢复二硫键。加入量为DHAA/抗体摩尔比为30倍。25℃-28℃水浴反应2-3h。

1.3HPLC检测

调整积分事件，确保保留时间在5.0-30.0min之间的色谱峰都得到积分。按5.0-30.0min之间各色谱峰面积比例进行报告。

检测：1ml反应体系中抗体和小分子转化率。

2结果

表明，本发明所述的法尼基转移酶变体具有很好的酶活性。

需要说明的是上述实施例仅仅是本发明的较佳实施例，并没有用来限定本发明的保护范围，在上述基础上做出的等同替换或者替代均属于本发明的保护范围。

序列表

<110> 江苏万邦医药科技有限公司

上海复星医药产业发展有限公司

<120> 一种法尼基转移酶变体及其制备方法

<160> 10

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1173

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

atgcatcacc atcatcacca cgaagtggac gatgacgata agatggcagc taccgaaggt 60

gttggtgaat cagccccggg tggtgaaccg ggtcagccgg aacagccgcc gccgccgccg 120

ccgccgccgc cggctcagca accgcaggaa gaagaaatgg cagcagaagc aggtgaagca 180

gctgcatccc cgatggatga cggttttctg agtctggatt ccccgaccta tgtgctgtac 240

cgtgaccgcg ctgaatgggc ggatattgac ccggttccgc agaacgatgg tccgagcccg 300

gtggttcaaa tcatctactc tgaaaaattc cgcgatgttt atgactactt ccgtgccgtc 360

ctgcagcgtg atgaacgctc ggaacgtgct tttaaactga cccgcgacgc gatcgaactg 420

aacgccgcaa attatacggt ctggcatttc cgtcgcgtgc tgctgcgtag cctgcagaaa 480

gatctgcaag aagaaatgaa ctacatcatc gctatcatcg aagaacagcc gaaaaattac 540

caagtgtggc atcaccgtcg cgtcctggtg gaatggctga aagatccgtc tcaggaactg 600

gaatttattg cagatatcct gaaccaagac gccaaaaatt atcatgcatg gcagcaccgc 660

caatgggtca ttcaggaatt ccgtctgtgg gataacgaac tgcagtacgt tgatcaactg 720

ctgaaagaag acgttcgcaa caattcagtc tggaaccagc gtcattttgt gatctcaaat 780

accacgggtt attcggatcg cgccgtgctg gaacgtgaag ttcagtacac cctggaaatg 840

attaaactgg ttccgcacaa cgaaagtgca tggaattatc tgaaaggcat cctgcaggat 900

cgcggtctgt cccgttaccc gaacctgctg aatcagctgc tggacctgca accgtcacac 960

agctctccgt atctgattgc gttcctggtg gatatctacg aagacatgct ggaaaaccag 1020

tgcgataaca aagaagacat cctgaacaaa gccctggaac tgtgtgaaat tctggcaaaa 1080

gaaaaagata cgatccgcaa agaatattgg cgttacatcg gtcgtagcct gcaaagcaaa 1140

catagtcgtg aatcagacat cccggcaagc gtc 1173

<210> 2

<211> 391

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

Met His His His His His His Glu Asn Leu Tyr Phe Gln Gly Met Ala

1 5 10 15

Ala Thr Glu Gly Val Gly Glu Ser Ala Pro Gly Gly Glu Pro Gly Gln

20 25 30

Pro Glu Gln Pro Pro Pro Pro Pro Pro Pro Pro Pro Ala Gln Gln Pro

35 40 45

Gln Glu Glu Glu Met Ala Ala Glu Ala Gly Glu Ala Ala Ala Ser Pro

50 55 60

Met Asp Asp Gly Phe Leu Ser Leu Asp Ser Pro Thr Tyr Val Leu Tyr

65 70 75 80

Arg Asp Arg Ala Glu Trp Ala Asp Ile Asp Pro Val Pro Gln Asn Asp

85 90 95

Gly Pro Ser Pro Val Val Gln Ile Ile Tyr Ser Glu Lys Phe Arg Asp

100 105 110

Val Tyr Asp Tyr Phe Arg Ala Val Leu Gln Arg Asp Glu Arg Ser Glu

115 120 125

Arg Ala Phe Lys Leu Thr Arg Asp Ala Ile Glu Leu Asn Ala Ala Asn

130 135 140

Tyr Thr Val Trp His Phe Arg Arg Val Leu Leu Arg Ser Leu Gln Lys

145 150 155 160

Asp Leu Gln Glu Glu Met Asn Tyr Ile Ile Ala Ile Ile Glu Glu Gln

165 170 175

Pro Lys Asn Tyr Gln Val Trp His His Arg Arg Val Leu Val Glu Trp

180 185 190

Leu Lys Asp Pro Ser Gln Glu Leu Glu Phe Ile Ala Asp Ile Leu Asn

195 200 205

Gln Asp Ala Lys Asn Tyr His Ala Trp Gln His Arg Gln Trp Val Ile

210 215 220

Gln Glu Phe Arg Leu Trp Asp Asn Glu Leu Gln Tyr Val Asp Gln Leu

225 230 235 240

Leu Lys Glu Asp Val Arg Asn Asn Ser Val Trp Asn Gln Arg His Phe

245 250 255

Val Ile Ser Asn Thr Thr Gly Tyr Ser Asp Arg Ala Val Leu Glu Arg

260 265 270

Glu Val Gln Tyr Thr Leu Glu Met Ile Lys Leu Val Pro His Asn Glu

275 280 285

Ser Ala Trp Asn Tyr Leu Lys Gly Ile Leu Gln Asp Arg Gly Leu Ser

290 295 300

Arg Tyr Pro Asn Leu Leu Asn Gln Leu Leu Asp Leu Gln Pro Ser His

305 310 315 320

Ser Ser Pro Tyr Leu Ile Ala Phe Leu Val Asp Ile Tyr Glu Asp Met

325 330 335

Leu Glu Asn Gln Cys Asp Asn Lys Glu Asp Ile Leu Asn Lys Ala Leu

340 345 350

Glu Leu Cys Glu Ile Leu Ala Lys Glu Lys Asp Thr Ile Arg Lys Glu

355 360 365

Tyr Trp Arg Tyr Ile Gly Arg Ser Leu Gln Ser Lys His Ser Arg Glu

370 375 380

Ser Asp Ile Pro Ala Ser Val

385 390

<210> 3

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

catcaccatc atcaccac 18

<210> 4

<211> 6

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

His His His His His His

1 5

<210> 5

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

gaagtggacg atgacgataa g 21

<210> 6

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

Glu Val Asp Asp Asp Asp Lys

1 5

<210> 7

<211> 1131

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

atggcagcta ccgaaggtgt tggtgaatca gccccgggtg gtgaaccggg tcagccggaa 60

cagccgccgc cgccgccgcc gccgccgccg gctcagcaac cgcaggaaga agaaatggca 120

gcagaagcag gtgaagcagc tgcatccccg atggatgacg gttttctgag tctggattcc 180

ccgacctatg tgctgtaccg tgaccgcgct gaatgggcgg atattgaccc ggttccgcag 240

aacgatggtc cgagcccggt ggttcaaatc atctactctg aaaaattccg cgatgtttat 300

gactacttcc gtgccgtcct gcagcgtgat gaacgctcgg aacgtgcttt taaactgacc 360

cgcgacgcga tcgaactgaa cgccgcaaat tatacggtct ggcatttccg tcgcgtgctg 420

ctgcgtagcc tgcagaaaga tctgcaagaa gaaatgaact acatcatcgc tatcatcgaa 480

gaacagccga aaaattacca agtgtggcat caccgtcgcg tcctggtgga atggctgaaa 540

gatccgtctc aggaactgga atttattgca gatatcctga accaagacgc caaaaattat 600

catgcatggc agcaccgcca atgggtcatt caggaattcc gtctgtggga taacgaactg 660

cagtacgttg atcaactgct gaaagaagac gttcgcaaca attcagtctg gaaccagcgt 720

cattttgtga tctcaaatac cacgggttat tcggatcgcg ccgtgctgga acgtgaagtt 780

cagtacaccc tggaaatgat taaactggtt ccgcacaacg aaagtgcatg gaattatctg 840

aaaggcatcc tgcaggatcg cggtctgtcc cgttacccga acctgctgaa tcagctgctg 900

gacctgcaac cgtcacacag ctctccgtat ctgattgcgt tcctggtgga tatctacgaa 960

gacatgctgg aaaaccagtg cgataacaaa gaagacatcc tgaacaaagc cctggaactg 1020

tgtgaaattc tggcaaaaga aaaagatacg atccgcaaag aatattggcg ttacatcggt 1080

cgtagcctgc aaagcaaaca tagtcgtgaa tcagacatcc cggcaagcgt c 1131

<210> 8

<211> 377

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

Met Ala Ala Thr Glu Gly Val Gly Glu Ser Ala Pro Gly Gly Glu Pro

1 5 10 15

Gly Gln Pro Glu Gln Pro Pro Pro Pro Pro Pro Pro Pro Pro Ala Gln

20 25 30

Gln Pro Gln Glu Glu Glu Met Ala Ala Glu Ala Gly Glu Ala Ala Ala

35 40 45

Ser Pro Met Asp Asp Gly Phe Leu Ser Leu Asp Ser Pro Thr Tyr Val

50 55 60

Leu Tyr Arg Asp Arg Ala Glu Trp Ala Asp Ile Asp Pro Val Pro Gln

65 70 75 80

Asn Asp Gly Pro Ser Pro Val Val Gln Ile Ile Tyr Ser Glu Lys Phe

85 90 95

Arg Asp Val Tyr Asp Tyr Phe Arg Ala Val Leu Gln Arg Asp Glu Arg

100 105 110

Ser Glu Arg Ala Phe Lys Leu Thr Arg Asp Ala Ile Glu Leu Asn Ala

115 120 125

Ala Asn Tyr Thr Val Trp His Phe Arg Arg Val Leu Leu Arg Ser Leu

130 135 140

Gln Lys Asp Leu Gln Glu Glu Met Asn Tyr Ile Ile Ala Ile Ile Glu

145 150 155 160

Glu Gln Pro Lys Asn Tyr Gln Val Trp His His Arg Arg Val Leu Val

165 170 175

Glu Trp Leu Lys Asp Pro Ser Gln Glu Leu Glu Phe Ile Ala Asp Ile

180 185 190

Leu Asn Gln Asp Ala Lys Asn Tyr His Ala Trp Gln His Arg Gln Trp

195 200 205

Val Ile Gln Glu Phe Arg Leu Trp Asp Asn Glu Leu Gln Tyr Val Asp

210 215 220

Gln Leu Leu Lys Glu Asp Val Arg Asn Asn Ser Val Trp Asn Gln Arg

225 230 235 240

His Phe Val Ile Ser Asn Thr Thr Gly Tyr Ser Asp Arg Ala Val Leu

245 250 255

Glu Arg Glu Val Gln Tyr Thr Leu Glu Met Ile Lys Leu Val Pro His

260 265 270

Asn Glu Ser Ala Trp Asn Tyr Leu Lys Gly Ile Leu Gln Asp Arg Gly

275 280 285

Leu Ser Arg Tyr Pro Asn Leu Leu Asn Gln Leu Leu Asp Leu Gln Pro

290 295 300

Ser His Ser Ser Pro Tyr Leu Ile Ala Phe Leu Val Asp Ile Tyr Glu

305 310 315 320

Asp Met Leu Glu Asn Gln Cys Asp Asn Lys Glu Asp Ile Leu Asn Lys

325 330 335

Ala Leu Glu Leu Cys Glu Ile Leu Ala Lys Glu Lys Asp Thr Ile Arg

340 345 350

Lys Glu Tyr Trp Arg Tyr Ile Gly Arg Ser Leu Gln Ser Lys His Ser

355 360 365

Arg Glu Ser Asp Ile Pro Ala Ser Val

370 375

<210> 9

<211> 1311

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

atggcctcat cctcatcctt tacctactac tgcccgccgt catcaagccc ggtctggtcg 60

gaaccgctgt attcgctgcg cccggaacat gcgcgtgaac gcctgcagga tgactcagtt 120

gaaaccgtca cgtcgattga acaggccaaa gtggaagaaa aaatccaaga agtttttagc 180

tcttacaaat tcaaccacct ggtgccgcgt ctggttctgc agcgcgaaaa acatttccac 240

tatctgaaac gtggcctgcg ccaactgacc gatgcatacg aatgcctgga cgctagtcgt 300

ccgtggctgt gttattggat tctgcattcc ctggaactgc tggatgaacc gattccgcag 360

atcgtcgcga cggacgtgtg ccagtttctg gaactgtgtc aaagcccgga tggcggtttc 420

ggcggtggcc cgggccagta tccgcacctg gcaccgacct acgcggcagt taatgccctg 480

tgcattatcg gtacggaaga agcctacaac gtcatcaatc gtgaaaaact gctgcagtat 540

ctgtacagcc tgaaacaacc ggatggctct tttctgatgc atgtgggtgg cgaagtcgac 600

gtgcgtagcg catattgtgc agcttcagtt gcctcgctga ccaacattat cacgccggac 660

ctgtttgaag gtaccgcgga atggattgcc cgttgccaga attgggaagg tggcatcggt 720

ggcgtgccgg gtatggaagc acacggtggc tacacctttt gtggtctggc ggccctggtg 780

attctgaaga aagaacgcag tctgaacctg aaatccctgc tgcagtgggt tacgagccgt 840

caaatgcgct ttgaaggtgg cttccagggt cgttgcaata aactggttga tggctgttac 900

tctttttggc aggcaggtct gctgccgctg ctgcatcgtg cactgcacgc tcaaggtgat 960

ccggcactga gtatgtccca ttggatgttc caccagcaag ctctgcagga atatattctg 1020

atgtgctgtc aatgcccggc gggcggcctg ctggataaac cgggcaaatc acgcgacttt 1080

tatcatacct gctactgtct gagcggtctg tctatcgcac agcatttcgg ttcgggcgct 1140

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tataatattg gtccggacaa agtgatccag gccaccacgc actttctgca aaaaccggtg 1260

ccgggctttg aagaatgtga agacgcagtg acctcggacc cggcgacgga c 1311

<210> 10

<211> 437

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

Met Ala Ser Ser Ser Ser Phe Thr Tyr Tyr Cys Pro Pro Ser Ser Ser

1 5 10 15

Pro Val Trp Ser Glu Pro Leu Tyr Ser Leu Arg Pro Glu His Ala Arg

20 25 30

Glu Arg Leu Gln Asp Asp Ser Val Glu Thr Val Thr Ser Ile Glu Gln

35 40 45

Ala Lys Val Glu Glu Lys Ile Gln Glu Val Phe Ser Ser Tyr Lys Phe

50 55 60

Asn His Leu Val Pro Arg Leu Val Leu Gln Arg Glu Lys His Phe His

65 70 75 80

Tyr Leu Lys Arg Gly Leu Arg Gln Leu Thr Asp Ala Tyr Glu Cys Leu

85 90 95

Asp Ala Ser Arg Pro Trp Leu Cys Tyr Trp Ile Leu His Ser Leu Glu

100 105 110

Leu Leu Asp Glu Pro Ile Pro Gln Ile Val Ala Thr Asp Val Cys Gln

115 120 125

Phe Leu Glu Leu Cys Gln Ser Pro Asp Gly Gly Phe Gly Gly Gly Pro

130 135 140

Gly Gln Tyr Pro His Leu Ala Pro Thr Tyr Ala Ala Val Asn Ala Leu

145 150 155 160

Cys Ile Ile Gly Thr Glu Glu Ala Tyr Asn Val Ile Asn Arg Glu Lys

165 170 175

Leu Leu Gln Tyr Leu Tyr Ser Leu Lys Gln Pro Asp Gly Ser Phe Leu

180 185 190

Met His Val Gly Gly Glu Val Asp Val Arg Ser Ala Tyr Cys Ala Ala

195 200 205

Ser Val Ala Ser Leu Thr Asn Ile Ile Thr Pro Asp Leu Phe Glu Gly

210 215 220

Thr Ala Glu Trp Ile Ala Arg Cys Gln Asn Trp Glu Gly Gly Ile Gly

225 230 235 240

Gly Val Pro Gly Met Glu Ala His Gly Gly Tyr Thr Phe Cys Gly Leu

245 250 255

Ala Ala Leu Val Ile Leu Lys Lys Glu Arg Ser Leu Asn Leu Lys Ser

260 265 270

Leu Leu Gln Trp Val Thr Ser Arg Gln Met Arg Phe Glu Gly Gly Phe

275 280 285

Gln Gly Arg Cys Asn Lys Leu Val Asp Gly Cys Tyr Ser Phe Trp Gln

290 295 300

Ala Gly Leu Leu Pro Leu Leu His Arg Ala Leu His Ala Gln Gly Asp

305 310 315 320

Pro Ala Leu Ser Met Ser His Trp Met Phe His Gln Gln Ala Leu Gln

325 330 335

Glu Tyr Ile Leu Met Cys Cys Gln Cys Pro Ala Gly Gly Leu Leu Asp

340 345 350

Lys Pro Gly Lys Ser Arg Asp Phe Tyr His Thr Cys Tyr Cys Leu Ser

355 360 365

Gly Leu Ser Ile Ala Gln His Phe Gly Ser Gly Ala Met Leu His Asp

370 375 380

Val Val Met Gly Val Pro Glu Asn Val Leu Gln Pro Thr His Pro Val

385 390 395 400

Tyr Asn Ile Gly Pro Asp Lys Val Ile Gln Ala Thr Thr His Phe Leu

405 410 415

Gln Lys Pro Val Pro Gly Phe Glu Glu Cys Glu Asp Ala Val Thr Ser

420 425 430

Asp Pro Ala Thr Asp

435

Claims

1.一种法尼基转移酶变体，其特征在于，由被修饰的法尼基转移酶α亚基和β亚基组成，其中，被修饰的法尼基转移酶α亚基核苷酸序列为Seq ID No.1，氨基酸序列为Seq IDNo.2；法尼基转移酶β亚基，核苷酸序列为Seq ID No.9，氨基酸序列为Seq ID No.10。

2.编码权利要求1所述的法尼基转移酶变体的基因。

3.一种包含权利要求2所述的基因的表达载体。

4.一种权利要求1所述的法尼基转移酶变体的制备方法，其特征在于，大肠杆菌作为表达宿主的可溶性表达方法，包括以下步骤：

(1)高密度发酵法尼基转移酶变体；

(2)收集菌体；

(3)破碎菌体；

(4)收集上清；

(5)Ni²⁺-NTA基质纯化上述法尼基转移酶变体；

(6)离子交换纯化法尼基转移酶变体；

(7)浓缩。

5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，步骤(1)中的高密度发酵法尼基转移酶在发酵1.5-5小时OD₆₀₀为50-250进行诱导，诱导温度20-30℃。

6.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，步骤(1)中的高密度发酵法尼基转移酶在发酵3-5小时OD₆₀₀为150-250进行诱导。

7.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，发酵培养基为种子培养基，包含：12～15g/L胰蛋白胨，30～35g/L酵母提取物和4～6ml/L甘油。

8.权利要求1所述的法尼基转移酶变体、权利要求2所述的基因或权利要求3所述的表达载体在酶联反应中的应用。