CN108619145B - 化合物在***中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了式(I)所示的化合物、其药学上可接受的盐或其前药在预防和/或***中的应用，

式(I)。本发明的式(I)所示的化合物能够显著抑制多种人肿瘤细胞的增殖，其对本实验中的某些特定细胞株都表现出比对照药物姜黄素和先导化合物EF24、EF31更强的抑制作用，尤其是对人胰腺癌细胞PANC‑1，该化合物对它们的增殖抑制作用达到了纳摩尔级别。

Description

化合物在***中的应用

技术领域

本发明涉及医药技术领域，具体涉及一种化合物在***中的应用。

背景技术

胰腺癌，素有“癌症之王”之称，是恶性程度最高的肿瘤之一。胰腺癌预后极差，中位生存期小于6个月且5年生存率仅有6％。手术切除是根治胰腺癌的首选方法。但是，由于早期临床症状不明显，以及高度的转移潜能，大多数胰腺癌病人确诊时已错过手术治疗的最佳时期。据统计，只有不到20％的病人适合采用手术疗法。化疗是治疗晚期胰腺癌、延长患者生存期的另一重要手段。然而，此类传统细胞毒药物对肿瘤细胞和正常细胞缺乏选择性，从而造成严重的不可逆副反应，极大限制了这些药物疗效的发挥。

近数十年来，分子靶向疗法飞速发展。相对传统化疗，靶向疗法在提高癌症病患的生存期、改善预后、克服化疗所带来的严重不良反应等方面，展现出巨大的优势。目前，已经确定的与胰腺癌发生发展密切相关的靶标蛋白有K-Ras、GSK3β、Notch、PI3K/Akt、IKKβ等。IKK是丝氨酸/苏氨酸激酶家族成员之一，包括IKKα、IKKβ、IKKγ和IKKε四个成员，其中，IKKβ对下游NF-κB信号通路起决定性的调控作用。NF-κB是真核细胞中广泛存在的一种转录因子，对细胞的生存、凋亡、迁移等功能有重要的调控作用。在机体生理和病理条件下，NF-κB信号通路调节许多与免疫功能和炎症有关的基因。研究发现，在胰腺癌细胞中，IKKβ介导的NF-κB信号通路异常持续性激活，会明显促进癌细胞的生长和生存。此外，IKKβ的激活可与Notch信号通路发生协同增效的作用，增强胰腺癌细胞的存活能力与转移能力。众多研究结果表明，IKKβ是理想的胰腺癌治疗靶点之一。针对IKKβ开发其选择性抑制剂，近年来逐渐得到了药物研发机构和制药企业的关注和重视。可惜的是，虽然BMS-345541、ML-120B、TPCA-1等IKKβ小分子抑制剂被相继发现，但是，由于安全性问题，它们仍处于临床研究或临床前研究阶段。目前仍无上市的IKKβ抑制剂类药物可供临床使用，使得开发高效低毒的IKKβ选择性抑制剂成为了胰腺癌临床用药方面的一种迫切需求。

姜黄素(curcumin)是从中华传统药用植物姜黄的块根中提取出来的有效抗肿瘤活性成分，其对于包括STAT3、IKKβ、PKC等在内的多个肿瘤治疗靶点有良好的抑制作用，并且在高剂量使用的情况下，表现出较低的毒性。然而，姜黄素的体内外不稳定性及其药代缺陷极大地限制临床应用前景。基于此，通过大量的文献和专利查阅，我们发现姜黄素结构中β-二酮结构的存在，导致了姜黄素的稳定性较弱。另外，在之前的研究中已有报道，姜黄素类似物EF31、EF24是有效的IKKβ抑制剂。

综上所述，传统的抗肿瘤药物稳定性比较差，***效果差，在较低浓度时，就存在细胞毒性，亟待研制一种稳定性高，抑制肿瘤效果好的药物。

发明内容

本发明的目的在于提供一种式(I)所示的化合物，其通过抑制IKKβ的磷酸化来发挥其抗肿瘤活性，用以解决现有抗肿瘤药物存在细胞毒性高、稳定性差，***效果差的缺陷。

为实现上述目的，本发明提供式(I)所示的化合物、其药学上可接受的盐或其前药在预防和/或***中的应用，

优选的，所述肿瘤为胰腺癌，所述胰腺癌为胰腺导管癌。

优选的，所述胰腺癌细胞选自人胰腺癌细胞PANC-1细胞、MiaPaCa-2或BxPC-3细胞。

优选的，所述化合物、其药学上可接受的盐或其前药在制备预防和/或治疗胰腺癌的产品；抑制胰腺癌干细胞活性的产品；以及

抑制原代胰腺癌细胞的活性产品。

上述所述的化合物、其药学上可接受的盐或其前药有效剂量组成的药物组合物，其中含有一个或多个药学上可接受的药物载体。

优选的，所述药物载体包括：稀释剂、赋形剂、粘合剂、湿润剂、吸收促进剂、表面活性剂、润滑剂。

优选的，其中，所述药物组合物的剂型为片剂、胶囊、口服液、注射剂、粉剂、膏剂或外用药液。

本发明中，术语“前药”是指一种作为药物前体的化合物，该化合物在被服用后，在体内通过代谢或化学过程(例如，被置于生理pH条件下或通过酶的活性)发生化学转化，释放活性药物。。本发明的“前药”也可包括本发明化合物的代谢前体，该类前药在对主体给药时可能不具有活性，但可在体内转化为本发明的式(I)化合物或其盐和/或溶剂化物。前药也可以是天然存在或者化学合成的化合物。

术语“药学上可接受的”是指某载体、运载物、稀释剂、辅料，和/或所形成的盐通常在化学上或物理上与构成某药物剂型的其它成分相兼容，并在生理上与受体相兼容。

术语“盐”和“可药用的盐”是指式(I)所示的化合物或其立体异构体，或其前药与无机和/或有机酸和碱形成的酸式和/或碱式盐，也包括两性离子盐(内盐)，还包括季铵盐，例如烷基铵盐。这些盐可以是在化合物的最后分离和纯化中直接得到。也可以是通过将式(I)所示化合物，或其立体异构体，或其前药，与一定数量的酸或碱适当(例如等当量)进行混合而得到。这些盐可能在溶液中形成沉淀而以过滤方法收集，或在溶剂蒸发后回收而得到，或在水介质中反应后冷冻干燥制得。

本发明的化合物所述治疗的肿瘤不是所有肿瘤，而是特定的肿瘤，如通过特定机制而能够凋亡的肿瘤。根据试验结果，式(I)化合物的体外抗肿瘤细胞增殖作用是通过抑制IKKβ所导致的。式(I)化合物(D6)可以直接结合于IKKβ，并抑制其磷酸化下游底物，继而减少所调控基因(Bcl-2)的表达，并激活Caspase家族特异性切割底物PARP，从而显著诱导肿瘤细胞凋亡。在细胞实验中，式(I)化合物对多种特定肿瘤细胞的增殖抑制活性皆能达到单微摩尔级别。

本发明中，所述药学上可接受的载体是指药学领域常规的药物载体，例如：稀释剂、赋形剂如水等，填充剂如淀粉、蔗糖等；粘合剂如纤维素衍生物、藻酸盐、明胶和聚乙烯吡咯烷酮；湿润剂如甘油；崩解剂如琼脂、碳酸钙和碳酸氢钠；吸收促进剂如季铵化合物；表面活性剂如十六烷醇；吸附载体如高岭土和皂粘土；润滑剂如滑石粉、硬脂酸钙/镁、聚乙二醇等。另外还可以在组合物中加入其它辅剂如香味剂、甜味剂等。

本发明药物组合物的形式通过口服，鼻吸入、直肠或者肠胃外给药的方式施用于需要这种治疗的患者。用于口服时，可将其制成常规的固体制剂如片剂、粉剂、粒剂、胶囊等，制成液体制剂如水或油悬浮剂或其它液体制剂如糖浆、酏剂等；用于肠胃外给药时，可将其制成注射用的溶液、水或油性悬浮剂等。

本发明药物组合物的各种剂型可以按照药学领域的常规生产方法制备。例如使活性成分与一种或多种载体混合，然后将其制成所需的剂型。

本发明具有如下优点：

本发明的式(I)所示的化合物能够显著抑制多种人肿瘤细胞的增殖，其对本实验中的某些特定细胞株都表现出比对照药物姜黄素和先导化合物EF24、EF31更强的抑制作用，尤其是对人胰腺癌细胞PANC-1，该化合物对它们的增殖抑制作用达到了纳摩尔级别。

附图说明

图1为本发明的式(I)化合物的化学合成示意图

图2为为本发明的式(I)化合物与IKKβ的相互作用检测示意图。

图3A为本发明采用TNF-α刺激细胞内IKKβ-NF-κB/IκB通路的活化，并在培养液里加入不同处理后(空白对照组只加3uL DMSO，阴性对照组加入3uL DMSO和1ng/ml的TNF-α，实验组分别加入1μM、2.5μM和5μM的化合物D6和TNF-α，阳性对照选用5μM的EF31作为对照)，用Western Blot检测磷酸化IKKβ(pIKKβ)、总IKKβ和总IκB的表达量变化图。

图3B、图3C为本发明分别为pIKKβ/IKKβ和IκB/GAPDH表达量相对值的直方图。

图4A-图4D为本发明的式(I)化合物、EF31诱导人胰腺癌PANC-1细胞凋亡的Hoechst染色图。其中，图4A为只加DMSO的阴性对照组，图4B、4C、4D分别为加入2.5μM和5μM的化合物D6以及5μM的EF31，图中蓝色荧光越多，表示细胞凋亡程度的越严重。

图5A为本发明的加入DMSO、2.5μM和5μM化合物D6以及5μM的EF31对PANC-1细胞的凋亡诱导作用，以凋亡相关蛋白Cleaved-PARP和抗凋亡蛋白Bcl-2的表达量指示细胞的凋亡情况的Western Blot结果图。

图5B为与图5A相同处理后，另一株胰腺癌细胞系BxPC-3的凋亡情况Western Blot结果图。

图5C-5F为本发明的分别为PANC-1和BxPC-3细胞中Cleaved-PARP(5C-5D)、Bcl-2(5E-5F)相对表达量的直方图，以内参蛋白GAPDH进行校正。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。本发明中式(I)化合物和D6均指同一种化合物。

实施例1式(I)化合物(D6)的合成

将10mmol 4-(2-(二甲基氨基)乙氧基)苯甲醛和5mmol 4-哌啶酮盐酸盐一水合物溶于18mL无水乙醇和2mL蒸馏水的混合溶剂中，室温搅拌10-15min至固体完全溶解，溶液呈透明澄清。在冰水浴的条件下(0-4℃)，缓慢滴加40％NaOH溶液0.5mL于反应溶液中，反应在冰浴到室温的条件下缓慢进行，直至出现大量不溶的橙黄色沉淀，用TLC检测反应液，反应的化学方程式如图1所示。待254nm紫外灯下不再出现原料4-(2-(二甲基氨基)乙氧基)苯甲醛的紫色斑点，365nm紫外灯下产物斑点明显，停止反应，将反应液过滤，产物先用20mL水洗，随后用10mL 10％乙醇洗两次，30℃真空干燥过夜后得橙黄色粉末状粗产物，此粗产物经硅胶柱层析法纯化后得目标化合物3,5-二((E)-4-(2-(二甲基氨基)乙氧基)苯亚甲基)哌啶-4-酮(式(I)所示的化合物，简称为D6化合物)，收率44.48％。熔点111.8-113.2℃。¹HNMR(500MHz,CDCl₃)δ:7.758(s,2H,Ar-CH＝C×2),7.346(d,J＝8.0Hz,4H,Ar-H2×2,Ar-H6×2),6.937(d,J＝8.0Hz,4H,Ar-H3×2,Ar-H5×2),4.146(s,4H,N-CH2×2),4.059(t,J＝6.0Hz,4H,-OCH2CH2N-×2),2.463(t,J＝7.0Hz,4H,-OCH2CH2N-×2),2.623(s,12H,-NCH3×4),1.975(t,J＝6.5Hz,1H,-NH)。ESI-MS m/z:450.41(M+H)⁺,calcd for C₂₇H₃₅N₃O₃:449.27.HPLC purity:99.36％。

实施例2式(I)化合物与IKKβ直接相互作用的解离结合常数测定

SPR实验通过ProteOn XPR36Protein Interaction Array system(Bio-RadLaboratories,Hercules,CA,USA)进行测定。首先，将实验所用到的试剂溶于超纯水中，用0.22μM孔径的微孔膜进行过滤。将浓度为1mg/mL的IKKβ-PBST(5mM，pH 7.4)溶液在醋酸钠缓冲液中(pH 4.5)稀释成30μg/mL，再将芯片用EDC/NHS(10μL/min，600s)进行激活。然后，将IKKβ以5μL/min的流速共价固定于芯片上，使将近约8,000RU的IKKβ固定在芯片上。而没有固定上的IKKβ则用PBS溶液(5mM,pH 7.4，with 5％，w/v，DMSO)进行洗脱。将式(I)化合物用PBS溶液(5mM,pH7.4,，with 5％，w/v，DMSO)制备成20-100μM的浓度梯度，并以10μL/min注射进入体系中。最后用ProteOn manager software(Bio-Rad Laboratories)进行数据的采集与分析。

如表1所示，SPR实验的结果式(I)化合物/IKKβ之间的相互作用随着式(I)化合物浓度的提高而逐渐加强，表示式(I)化合物与IKKβ之间存在直接的相互结合。而最终分析所得KD值(解离常数，指引起最大效应一半(50％受体被占位)时的药物浓度)为22.2μM，表明式(I)化合物/IKKβ的结合能力较强，说明式(I)化合物(D6)极可能直接结合于IKKβ上的某一特定结构域，并进而抑制其磷酸化进程。

表1为本发明的式(I)化合物、EF31、EF24、CUR分别对IKKβ激酶和人胰腺癌PANC-1细胞、MiaPaCa-2及BxPC-3细胞的半数抑制浓度(IC₅₀)。

实施例3式(I)化合物的体外IKKβ抑制活性及其抗胰腺癌细胞增殖活性

式(I)化合物、EF31、EF24、姜黄素的激酶抑制活性实验委托于上海睿智化学公司进行测定，检测方法如下概述：

第一步，先将1.25×kinase base buffer(62.5mM HEPES，0.001875％Brij-35，12.5mM MgCl2，2.5mM DTT)以及Stop buffer(100mM HEPES，0.015％Brij-35，0.2％coating reagent No 3，50mM EDTA)配制好。然后将5μL 10％DMSO溶解的待测化合物用10μL的2.5×enzyme solution进行稀释后加入384孔板，与此同时，在空白对照孔内加入10mMEDTA终止后续的磷酸化反应。然后，在各个孔内加入10μL的peptide solution。28℃孵育1h后，向各个孔内加入25μL的stop buffer终止反应。通过Caliper Life Sciences公司的EZreader进行读数。

抑制率计算公式如下：

Inhibition％＝(Max-conversion)/(Max-Min)×100％

“Max”代表DMSO对照组,“Min”代表提前加入EDTA的空白对照组,“conversion”表示EZ reader所读得的三个副孔的平均读数。

通过设定10个从大到小的梯度浓度，化合物浓度-抑制率曲线通过Graphpadprism软件(GraphPad,San Diego，CA，USA)进行拟合，从而计算化合物的半数有效抑制浓度(IC₅₀)。

细胞增殖活性实验使用的细胞株有：人胰腺癌细胞株PANC-1、MiaPaCa-2和BxPC-3，均购自中国科学院上海生命科学研究院细胞中心。

细胞分别接种于96孔培养板中，调整细胞悬液为含10％热灭活新生牛血清，青霉素100U/mL，链霉素100μg/mL的DMEM培养基，每孔加入100μL，使细胞密度为5000个/孔。于37℃含5％CO₂饱和湿度的培养箱中培养。24h后把溶于DMSO的各种浓度化合物加入培养板中，孵育72h。终止培养前3h每孔加入5mg/ml MTT 20μL。孵育完毕，小心吸除孔内液体，每孔加100μL DMSO，置摇床上低速振荡10min，使结晶物充分溶解，在酶联免疫检测仪570nm波长下测定各孔光吸收值。阳性对照物为姜黄素及其单羰基类似物EF31、EF24。根据吸光度计算细胞生长抑制率。细胞生长抑制率＝[OD对照-OD实验]/[OD对照-OD空白]×100％。

以同一药物的不同浓度对肿瘤细胞生长抑制率作图，可得到剂量反应曲线，根据线性回归方程求出该药物对细胞生长抑制率为50％的浓度即为半数抑制浓度IC₅₀。

如图2所示的激酶活性和细胞增殖活性，本发明采用Biorad公司的ProteOnXPR36Protein Interaction Array system仪器进行为式(I)化合物与IKKβ结合、解离常数的测定。从图中可以看出，式(I)化合物对IKKβ的抑制活性达到了800nM的水平，而对人胰腺癌细胞株PANC-1、MiaPaCa-2和BxPC-3等几种细胞株亦明显高于阳性药物姜黄素(CUR)、EF31和EF24。并且，这四个化合物的激酶活性与细胞活性保持一致，表明相应化合物主要通过抑制IKKβ的磷酸化来发挥其抗肿瘤活性。

实施例4式(I)化合物剂量依赖性抑制胰腺癌细胞内磷酸化IKKβ和游离IκB的表达

经典的NF-κB信号通路中，TLR4与膜外配体结合后，通过一系列细胞信号传导，致使胞内IKKβ磷酸化。IKKβ的磷酸化会造成IκB/NF-κB复合物的分离，从而使游离的NF-κB入核，并调节下游一系列的靶基因的转录。同时，游离的IκB则会被快速地泛素化途径降解。因此，本发明通过Western Blot检测了D6以及阳性对照EF31对胰腺癌PANC-1细胞中磷酸化IKKβ(pIKKβ)和IκB的影响。本发明将1×10⁶个细胞用培养液培养于37℃，24h后更新培养液并加入不同浓度的化合物，继续处理相应的时间段后，TNF-α刺激30分钟，收集细胞提取总蛋白，用Western Blot检测pIKKβ、总IKKβ和总IκB含量，GAPDH作为校准蛋白。如图3A-3C所示，为本发明的式(I)化合物对胰腺癌细胞系PANC-1中磷酸化IKKβ蛋白的抑制作用，并显著减少下游IκB的降解，其中，pIKKβ的表达量在不同浓度的D6处理后被有效抑制，其剂量依赖性非常明显，并且式(I)化合物能同时剂量依赖性地抑制IκB的游离降解。由此，进一步证明了式(I)化合物对IKKβ磷酸化存在抑制效果。通过对比发现，相同浓度(5μM)的式(I)化合物和EF31作用后，式(I)化合物的效果要明显优于EF31。

实施例5式(I)化合物显著诱导人胰腺癌PANC-1细胞凋亡

PANC-1细胞接种于6孔培养板中，24h后把溶于DMSO的式(I)化合物和EF31加入培养板中并使最终浓度分别为式(I)化合物(2.5、5μM)、EF31(5μM)，孵育12h。然后根据试剂盒说明书将Hoechst 33342染料(Beyotime Biotech,Nantong,China)加入6孔板中。通过荧光显微镜(Nikon,Tokyo,Japan)记录下细胞整体及其核质、核仁的形态、以及Hoechst 33342特异性蓝色荧光的强度。如图4A-图4D所示，结果显示12h后，式(I)化合物呈现剂量依赖诱导细胞凋亡，PANC-1在式(I)化合物的诱导下，细胞核碎裂明显，核内染色质出现皱缩，并伴有强烈蓝色荧光。同样在5μM的浓度下，式(I)化合物诱导细胞凋亡的效果要显著优于对照化合物EF31。

实施例6式(I)化合物激活Cleaved-PARP并抑制Bcl-2的表达量

PARP是细胞凋亡关键酶-半胱天冬酶(caspase)的切割底物，它在细胞凋亡中发挥着重要作用。在正常生理、病理条件下，PARP会被caspase剪切成为Cleaved-PARP，因此，Cleaved-PARP的表达量提高被认为是细胞凋亡的一个重要指标。此外，Bcl-2蛋白是最为人熟知的抗凋亡蛋白家族中的核心成员，而且，研究证明，Bcl-2基因是NF-κB所调节的众多靶基因之一。因此，检测了式(I)化合物对Cleaved-PARP和Bcl-2表达量的影响。本发明利用1.2×10⁶个PANC-1和BxPC-3细胞用1640培养液培养于37℃，24h后更新培养液，通过加入不同浓度的式(I)化合物和EF31处理细胞24h后收集细胞提取总蛋白，用Western Blot分别检测Cleaved-PARP和Bcl-2的表达量，GAPDH作为内参蛋白。如图5A、5B所示，在式(I)化合物和EF31作用72h后，PANC-1、BxPC-3细胞中的Cleaved-PARP明显增多，而Bcl-2显著减少，说明式(I)化合物和EF31都能较好地诱导胰腺癌细胞发生凋亡。通过柱状统计图如图5C-5F所示，更直观地观察到，式(I)化合物在同样浓度下，诱导胰腺癌细胞凋亡的作用要优于EF31。

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施例对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

Claims (6)

1.式(I)所示的化合物或其药学上可接受的盐在制备预防和/或治疗胰腺癌的产品中的应用，

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，

所述胰腺癌为胰腺导管癌。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，

所述胰腺癌细胞选自人胰腺癌细胞PANC-1细胞、MiaPaCa-2或BxPC-3细胞。

4.根据权利要求1至3任一项所述的应用，其特征在于，

所述产品为药物组合物，所述药物组合物包括所述化合物或其药学上可接受的盐，一个或多个药学上可接受的药物载体。

5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，

其中，所述药物载体包括：稀释剂、粘合剂、湿润剂、吸收促进剂、表面活性剂、润滑剂。

6.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，

其中，所述药物组合物的剂型为片剂、胶囊、口服液、注射剂、粉剂、膏剂或外用药液。

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