CN114920842B - 特异性结合pv-1蛋白的抗体或其抗原结合片段及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了特异性结合PV‑1蛋白的抗体或其抗原结合片段及其应用。该抗体或其抗原结合片段包含重链可变区和轻链可变区，重链可变区和轻链可变区的决定簇互补区均由CDR1、CDR2和CDR3组成；重链可变区的CDR1的氨基酸序列如SEQ ID NO：03等的第26‑35位所示；重链可变区的CDR2的氨基酸序列如SEQ ID NO：03等的第50‑66位所示；重链可变区的CDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO：03等的第97‑101位所示；轻链可变区的CDR1的氨基酸序列如SEQ ID NO：04等的第24‑34位所示；轻链可变区的CDR2的氨基酸序列如SEQ ID NO：04等的第50‑56位所示；轻链可变区的CDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO：04等的第89‑97位所示。该抗体或其抗原结合片段亲和力比原始抗体提高1‑2个数量级，理论可降低用药剂量，加速PV‑1新靶点的临床药物开发。

Description

特异性结合PV-1蛋白的抗体或其抗原结合片段及其应用
技术领域
本发明属于生物技术的单克隆抗体领域，具体涉及特异性结合PV-1蛋白的抗体或其抗原结合片段及其应用。
背景技术
生物机体物质交换是由呼吸***吸进的氧和消化***吸收的营养物质先进入血液，再通过组织液进入体内细胞；同时，体内细胞新陈代谢产生的废物和二氧化碳，进入组织液，然后再进入血液而被运送到泌尿***和呼吸***排出体外的过程。
血管-组织间的物质交换是生物体物质交换的重要的组成部分，主要通过血管内皮细胞空隙或带有隔膜的微孔(或凹洞)两种途径。质膜膜泡关联蛋白(Plasmalemmavesicle-associated protein，即PLVAP，简称PV-1)分子量约55-60kD，II型跨膜糖蛋白，是目前已知唯一的内皮血管微孔隔膜或质膜凹洞隔膜蛋白。PV-1除在内分泌腺体如脑垂体、肾上腺及肺组织中表达较高之外，其他组织中表达水平都较低或无表达。肿瘤、缺氧、外伤及炎症等异常状态并伴有血管新生的病理变化时，PV-1的表达则有显著上调。
生物体内存在诸多血管-组织屏障，在维持生物机体正常生理状态中具有重要意义，如血管-脑组织屏障(blood-brain barrier)和血管-视网膜屏障(blood-retinalbarrier)。血管-组织屏障中内皮血管管壁上无质膜微孔或凹洞，也无PV-1蛋白表达，但病理状态下，如缺血性脑中风、脑部原发性或转移性肿瘤、糖尿病视网膜病变等情况下，血管-组织屏障结构遭到破坏，内皮血管管壁出现有微孔并伴有PV-1抗原表达。
综上所述，PV-1蛋白有望成为治疗年龄相关性黄斑变性(Age-related MacularDegeneration，AMD)、糖尿病黄斑水肿(Diabetic Macular Edema，DME)和成年患者视网膜静脉阻塞引起的黄斑水肿等疾病的新靶点。数据库检索可知，市场上治疗此类疾病的靶点有血管内皮生长因子(VEGF)，血管紧张素II(AngII)等，暂无企业布局PV-1靶点相关产品。
发明内容
本发明的目的之一在于提供特异性结合PV-1蛋白的抗体或其抗原结合片段。
本发明提供了特异性结合PV-1蛋白的抗体或其抗原结合片段，所述抗体或其抗原结合片段包含重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区和所述轻链可变区均由决定簇互补区和框架区组成；所述重链可变区和所述轻链可变区的决定簇互补区均由CDR1、CDR2和CDR3组成；
所述重链可变区的CDR1的氨基酸序列如SEQ ID NO：03、SEQ ID NO：05、SEQ IDNO：06、SEQ ID NO：07、SEQ ID NO：08、SEQ ID NO：09、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：11、SEQ IDNO：12、SEQ ID NO：13或SEQ ID NO：14的第26-35位所示；
所述重链可变区的cDR2的氨基酸序列如SEQ ID NO：03、SEQ ID NO：05、SEQ IDNO：06、SEQ ID NO：07、SEQ ID NO：08、SEQ ID NO：09、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：11、SEQ IDNO：12、SEQ ID NO：13或SEQ ID NO：14的第50-66位所示；
所述重链可变区的CDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO：03、SEQ ID NO：05、SEQ IDNO：06、SEQ ID NO：07、SEQ ID NO：08、SEQ ID NO：09、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：11、SEQ IDNO：12、SEQ ID NO：13或SEQ ID NO：14的第97-101位所示；
所述轻链可变区的CDR1的氨基酸序列如SEQ ID NO：04、SEQ ID NO：15、SEQ IDNO：16、SEQ ID NO：17、SEQ ID NO：18、SEQ ID NO：19、SEQ ID NO：20、SEQ ID NO：21、SEQ IDNO：22、SEQ ID NO：23、SEQ ID NO：24或SEQ ID NO：25的第24-34位所示；
所述轻链可变区的CDR2的氨基酸序列如SEQ ID NO：04、SEQ ID NO：15、SEQ IDNO：16、SEQ ID NO：17、SEQ ID NO：18、SEQ ID NO：19、SEQ ID NO：20、SEQ ID NO：21、SEQ IDNO：22、SEQ ID NO：23、SEQ ID NO：24或SEQ ID NO：25的第50-56位所示；
所述轻链可变区的CDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO：04、SEQ ID NO：15、SEQ IDNO：16、SEQ ID NO：17、SEQ ID NO：18、SEQ ID NO：19、SEQ ID NO：20、SEQ ID NO：21、SEQ IDNO：22、SEQ ID NO：23、SEQ ID NO：24或SEQ ID NO：25的第89-97位所示。
上述抗体可为全长抗体，上述抗原结合片段可为Fab片段、Fv片段、Fab′片段、F(ab′)2片段、单链抗体(ScFv)、纳米抗体(单域抗体)、双特异性抗体或最小识别单位(MRU)。
可选地，根据上述的抗体或其抗原结合片段，所述重链可变区的氨基酸序列如SEQID NO：03、SEQ ID NO：05、SEQ ID NO：06、SEQ ID NO：07、SEQ ID NO：08、SEQ ID NO：09、SEQID NO：10、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：13或SEQ ID NO：14所示。
可选地，根据上述的抗体或其抗原结合片段，所述轻链可变区的氨基酸序列如SEQID NO：04、SEQ ID NO：15、SEQ ID NO：16、SEQ ID NO：17、SEQ ID NO：18、SEQ ID NO：19、SEQID NO：20、SEQ ID NO：21、SEQ ID NO：22、SEQ ID NO：23、SEQ ID NO：24或SEQ ID NO：25所示。
可选地，上述抗体或其抗原结合片段为如下任一种：
名称为HLPV-P01的抗体，所述HLPV-P01重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO：03所示，轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO：04所示；
名称为HLPV-P02的抗体，所述HLPV-P02重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO：05所示，轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO：15所示；
名称为HLPV-P03的抗体，所述抗体HLPV-P03重链可变区的氨基酸序列如SEQ IDNO：06所示，轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO：16所示；
名称为HLPV-P04的抗体，所述HLPV-P04重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO：07所示，轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO：17所示；
名称为HLPV-P05的抗体，所述HLPV-P05重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO：08所示，轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO：18所示；
名称为HLPV-P06的抗体，所述HLPV-P06重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO：09所示，轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO：16所示；
名称为HLPV-P07的抗体，所述HLPV-P07重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO：10所示，轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO：19所示；
名称为HLPV-P08的抗体，所述HLPV-P08重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO：11所示，轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO：20所示；
名称为HLPV-P09的抗体，所述HLPV-P09重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO：11所示，轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO：21所示；
名称为HLPV-P10的抗体，所述HLPV-P10重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO：08所示，轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO：22所示；
名称为HLPV-P11的抗体，所述HLPV-P11重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO：11所示，轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO：23所示；
名称为HLPV-P12的抗体，所述HLPV-P12重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO：12所示，轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO：24所示；
名称为HLPV-P13的抗体，所述HLPV-P13重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO：13所示，轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO：25所示；
名称为HLPV-P14的抗体，所述HLPV-P14重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO：14所示，轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO：25所示。
上述抗体亚型可为人源抗体，如IgA，IgD，IgE，IgG1，IgG2，IgG3，IgG4，IgM型抗体等；上述抗体亚型又如为去除ADCC效应的IgG1(N297A)和IgG4(S228P)。
可选地，根据上述的抗体或其抗原结合片段，所述抗体或其抗原结合片段还包括重链恒定区和轻链恒定区。所述重链恒定区为IgG1的重链恒定区、IgG1变体的重链恒定区、IgG4的重链恒定区或IgG4变体的重链恒定区。所述轻链恒定区为Kappa或其变体的轻链恒定区。所述抗体具体可为重链可变区碳端(C端)融合重链恒定区，轻链可变区碳端(C端)融合轻链恒定区。
IgG1的重链恒定区的氨基酸序列如UniProtKB数据库序列号P01857.1(2022.02.23最新更新)所示，IgG1变体的重链恒定区的氨基酸序列为IgG1的重链恒定区引入N297A突变(EU编号)获得。IgG4变体的重链恒定区的氨基酸序列如UniProtKB数据库序列号为P01861.1(2022.02.23最新更新)的IgG4引入S228P(EU编号)氨基酸突变获得。Kappa的轻链恒定区的氨基酸序列如UniProtKB数据库序列号P01834.2(2022.02.23最新更新)所示。
编码重链恒定区的基因核苷酸序列可为SEQ ID No.28第409-1398或SEQ IDNo.29的第409-1389位所示。编码轻链恒定区的基因核苷酸序列可为SEQ ID No.30的第394-714位所示。
本发明还提供了上述抗体或其抗原结合片段的相关生物材料，所述相关生物材料为如下任一种：
B1)编码上述抗体或其抗原结合片段的核酸分子；
B2)编码上述抗体或其抗原结合片段的重链和/或轻链的核酸分子；
B3)编码上述抗体或其抗原结合片段的重链可变区和/或轻链可变区的核酸分子；
B4)含有B1)-B3)任一所述核酸分子的表达盒；
B5)含有B1)-B3)任一所述核酸分子的重组载体、或含有B4)所述表达盒的重组载体；
B6)含有B1)-B3)任一所述核酸分子的重组微生物、或含有B4)所述表达盒的重组微生物、或含有B5)所述重组载体的重组微生物；
B7)含有B1)-B3)任一所述核酸分子的细胞系、或含有B4)所述表达盒的细胞系、或含有B5)所述重组载体的细胞系。
可选地，根据上述的相关生物材料，
B2)编码上述抗体或其抗原结合片段的重链的核酸分子为核苷酸序列如SEQ IDNo.28或SEQ ID No.29所示的核酸分子；
B2)编码上述抗体或其抗原结合片段的轻链的核酸分子为核苷酸序列如SEQ IDNo.30所示的核酸分子；
B3)编码上述抗体或其抗原结合片段的重链可变区的核酸分子为核苷酸序列如SEQ ID No.26所示的核酸分子，其中CDR1，CDR2和CDR3分别为对应的76-105位，148-198位，289-303位碱基；
B3)编码上述抗体或其抗原结合片段的轻链可变区的核酸分子为核苷酸序列如SEQ ID No.27所示的核酸分子，其中，CDR1，CDR2和CDR3分别为对应的70-102位，148-168位和278-291位碱基。
本文所述载体是本领域技术人员公知的，包括但不限于：质粒、噬菌体(如λ噬菌体或M13丝状噬菌体等)、黏粒(即柯斯质粒)、病毒载体(如杆状病毒载体、逆转录病毒(包括慢病毒)、腺病毒、腺相关病毒或疱疹病毒(如单纯疱疹病毒)等)。在本发明的一个实施例中，载体具体可为pUC57或pCGS3。具体可为下述实施例制备的pCGS3-HLPV-P00至P14重组表达质粒、pCGS3-HLPV-P03(S228P)、pCGS3-HLPV-P05(S228P)、pCGS3-HLPV-P08(S228P)、pCGS3-HLPV-P09(S228P)、pCGS3-HLPV-P10(S228P)、pCGS3-HLPV-P11(S228P)、pCGS3-HLPV-P14(S228P)、pCGS3-HLPV-P03(N297A)、pCGS3-HLPV-P05(N297A)、pCGS3-HLPV-P08(N297A)、pCGS3-HLPV-P09(N297A)、pCGS3-HLPV-P10(N297A)、pCGS3-HLPV-P11(N297A)或pCGS3-HLPV-P14(N297A)。
本文所述微生物可为酵母、细菌或真菌。其中，细菌可来自埃希氏菌属(Escherichia)、欧文氏菌(Erwinia)、根癌农杆菌属(Agrobacterium)、黄杆菌属(Flavobacterium)、产碱菌属(Alcaligenes)、假单胞菌属(Pseudomonas)、芽胞杆菌属(Bacillus)等；酵母可为毕赤酵母(P.pastoris)。
所述细胞系(宿主细胞)是指可用于导入载体的细胞，其包括但不限于：真核细胞(如酵母细胞、曲霉菌)、动物细胞(如哺乳动物细胞、昆虫细胞)或原核细胞。在本发明的一个实施例中，所述细胞系具体可为ExpiCHO-S细胞。
术语“细胞”和“细胞系”可互换使用，并且所有这类名称都包括其后代。
本发明还提供了上述抗体或其抗原结合片段的制备方法，所述方法具体包括：将上述抗体或其抗原结合片段的编码基因通过含有所述编码基因的重组表达载体导入宿主细胞中，得重组细胞，培养所述重组细胞上清，通过亲和层析纯化获得目的蛋白。
上述方法中，所述宿主细胞可为真核细胞，如CHO细胞，HEK293细胞，酵母细胞或昆虫细胞等。在本发明的一个实施例中，所述动物细胞为CHO细胞。
本发明还提供了改善、预防或治疗PV-1过表达相关疾病的药物组合物，所述药物组合物包含上述抗体或其抗原结合片段，以及一种或多种药学上可接受的载体。
所述药学上可接受的载体可为稀释剂、赋形剂、填充剂、粘合剂、湿润剂、崩解剂、吸收促进剂、吸附载体、表面活性剂或润滑剂但不限于此。
本发明还提供了用于检测PV-1的试剂或试剂盒，所述试剂或试剂盒含有上述任一所述的抗体或其抗原结合片段。
本发明还提供了缀合物(coniugate)，所述缀合物包含本发明所述的抗体或其抗原结合片段，以及与所述抗体或其抗原结合片段连接的可检测的标记；具体地，所述可检测的标记可选自酶(例如辣根过氧化物酶或碱性磷酸酶)、化学发光试剂(例如吖啶酯类化合物、鲁米诺及其衍生物、或钌衍生物)、荧光染料(例如荧光素或荧光蛋白)、放射性核素或生物素。
上述抗体或其抗原结合片段，和/或，上述的生物材料的下述任一种应用也属于本发明的保护范围之内：
D1)在制备用于改善、预防或治疗PV-1过表达相关疾病的药物中的应用；
D2)在制备用于诊断或筛查PV-1过表达相关疾病的产品中的应用；
D3)在检测PV-1中的应用；
D4)在制备用于检测PV-1的产品中的应用；
D5)在制备用于结合PV-1蛋白的产品中的应用。
所述PV-1过表达相关疾病可包括年龄相关性黄斑变性、糖尿病黄斑水肿、成年患者视网膜静脉阻塞引起的黄斑水肿、肝癌、缺血性脑中风和/或脑水肿。
所述用于检测PV-1的产品包括利用酶联免疫吸附法、免疫荧光检测法、放射免疫法、发光免疫测定法、胶体金免疫层析法、凝集法或免疫比浊法等检测抗原抗体结合的产品。
进一步地，所述产品可为试剂、试剂盒或芯片。
本发明所述药物、试剂、试剂盒或芯片含有本文任一所述抗体或其抗原结合片段或其组合。所述试剂盒可为化学发光免疫试剂盒、酶联免疫检测试剂盒、胶体金免疫试剂盒、或荧光免疫试剂盒，但不限于此。
术语“抗原结合片段”是指抗体的抗原结合片段及抗体类似物，其通常包括至少部分母体抗体(parental antibody)的抗原结合区或可变区(例如一个或多个CDR)。所述抗原结合片段保留母体抗体的至少某些结合特异性。通常，当基于摩尔来表示活性时，所述抗原结合片段保留至少10％的母体结合活性。具体地，所述抗原结合片段保留至少20％、50％、70％、80％、90％、95％或100％或更多的母体抗体对靶标的结合亲和力。
术语“Fab片段”是由重链Fd和完整轻链通过二硫键结合而成的异二聚体，仅含一个抗原结合位点。将重链Fd和完整轻链的编码基因连接，融合细菌蛋白信号肽基因后可在大肠杆菌内分泌表达Fab抗体(Fab片段)，并有完整的立体折叠和链内、链间二硫键。所述重链Fd指Fab中约1/2的H链部分(约含225个氨基酸残基，包括VH、CH1和部分铰链区)。
术语“Fv片段”是指可分别构建含有VH和VL基因的载体，共转染细胞，使之分别表达，再组装成功能性Fv抗体；也可在载体中的VH和VL之间设置终止密码，分别表达两个小分子蛋白片段，再通过非共价键结合而形成Fv抗体(Fv片段)。
术语“Fab′片段”含有一条轻链和包含VH结构域和CH1结构域以及CH1和CH2结构域之间区域的一条重链的部分，由此可在两个Fab′片段的两条重链之间形成链间二硫键以形成F(ab′)2分子。
术语“F(ab′)2片段”含有两条轻链和两条包含CH1和CH2结构域之间的恒定区的部分的重链，由此在两条重链间形成链间二硫键。因此，F(ab′)2片段由通过两条重链间的二硫键保持在一起的两个Fab′片段组成。
术语“单链抗体(ScFv)”是指用适当的寡核苷酸接头(1inker)连接轻链和重链可变区基因，使之表达单一的多肽链，称为单链抗体(ScFv)。多肽链能自发折叠成天然构象，保持Fv的特异性和亲和力。
术语“纳米抗体(单域抗体)”是指将抗体重链V区通过基因工程方法表达，获得仅含VH片段的抗体。单域抗体与抗原结合的能力及其稳定性，与完全抗体基本一致。
术语“双特异性抗体”是指将两套轻链、重链基因导入骨髓瘤细胞中，选择合适的抗体恒定区及Ig类型，可获得产量大、均一性和纯度高的双特异性抗体。另外，以化学交联技术或杂交-杂交瘤技术也可获得双特异性抗体。
术语“最小识别单位(MRU)”是指仅含可变区中单一CDR结构，分子质量仅为完整抗体的1％左右，可结合相应抗原。
本发明的抗体可以本领域已知的各种方法来制备，例如通过基因工程重组技术来获得。例如，通过化学合成或PCR扩增获得编码本发明抗体的重链和轻链基因的DNA分子。将所得DNA分子***表达载体内，然后转染宿主细胞，在特定条件下培养转染后的宿主细胞，并表达本发明的抗体。本领域技术人员可根据需要选择本领域常规的宿主细胞、表达载体、将表达载体导入宿主细胞的方法以及抗体的分离纯化方法。
本领域技术人员熟知，所述抗原结合片段可以通过重组DNA技术或通过完整抗体的酶促或化学断裂产生抗体的抗原结合片段。
本发明实施例通过两次噬菌体筛选实验，获得了一组特异结合人质膜膜泡关联蛋白PV-1亲和力成熟抗体，亲和力比原始抗体提高1-2个数量级，理论可降低用药剂量，治疗年龄相关性黄斑变性(AMD)和糖尿病性黄斑水肿(DME)等PV-1过表达相关疾病，加速PV-1新靶点的临床药物开发。
附图说明
图1噬菌体展示序列IgG1全抗组装表达质粒构建核酸电泳鉴定图；上图为IgG1全抗组装表达质粒轻链构建核酸电泳鉴定图，采用HindIII和XhoI双酶切，酶切后理论获得载体片段9535bp和轻链723bp，其中泳道A为pCGS3-HLPV-P00L，B为pCGS3-HLPV-P01L，C为pCGS3-HLPV-P02L，D为pCGS3-HLPV-P03/06L和，E为pCGS3-HLPV-P04L，F为pCGS3-HLPV-P05L，G为pCGS3-HLPV-P07L，H为pCGS3-HLPV-P08L，I为pCGS3-HLPV-P09L，J为pCGS3-HLPV-P10L，K为pCGS3-HLPV-P11L，L为pCGS3-HLPV-P12L，M为pCGS3-HLPV-P13/14L；下图为IgG1全抗组装表达质粒重链构建酸电泳鉴定图，采用BstBI和PacI双酶切，酶切后理论获得载体片段10200bp和轻链1409bp，其中泳道编号依次对应抗体标号，即泳道00为pCGS3-HLPV-P00，泳道01为pCGS3-HLPV-P00，泳道02为pCGS3-HLPV-P02...，泳道14为pCGS3-HLPV-P14表达质粒。
图2噬菌体展示序列IgG1组装全抗蛋白SDS-PAGE蛋白电泳图；野生型IgG1组装全抗蛋白纯化后SDS-PAGE鉴定(非还原为非还原SDS-PAGE，还原为还原SDS-PAGE)，其中泳道编号依次对应抗体标号，即泳道00为HLPV-P00，泳道01为HLPV-P01，泳道02-HLPV-P02...泳道14为HLPV-P14抗体。
图3去除ADCC效应全抗组装表达质粒构建核酸电泳鉴定图；构建仅仅改变重链碱基序列，采用BstBI和PacI双酶切，第1至7泳道酶切后理论获得载体片段10200bp和轻链1409bp，第8至14泳道酶切后理论获得载体片段10200bp和轻链1400bp。其中，1为pCGS3-HLPV-P03(N297A)，2为pCGS3-HLPV-P05(N297A)，3为pCGS3-HLPV-P08(N297A)，4为pCGS3-HLPV-P09(N297A)，5为pCGS3-HLPV-P10(N297A)，6为pCGS3-HLPV-P11(N297A)，7为pCGS3-HLPV-P14(N297A)，8为pCGS3-HLPV-P03(S228P)，9为pCGS3-HLPV-P05(S228P)，10为pCGS3-HLPV-P08(S228P)，11为pCGS3-HLPV-P09(S228P)，12为pCGS3-HLPV-P10(S228P)，13为pCGS3-HLPV-P11(S228P)，14为pCGS3-HLPV-P14(S228P)重组表达质粒。
图4去除ADCC效应组装全抗纯化SDS-PAGE蛋白电泳图；上图为IgG1(N297)型去除ADCC效应抗体，下图为IgG4(S228P)型去除ADCC效应抗体SDS-PAGE蛋白电泳图，其中AN表示纯化废液非还原SDS-PAGE，BN表示纯化蛋白非还原SDS-PAGE，AR表示纯化废液还原SDS-PAGE，BR表示纯化蛋白还原SDS-PAGE。其中泳道编号依次对应抗体标号，即泳道03为HLPV-P03，泳道05为HLPV-P05，泳道08为HLPV-P08，泳道09为HLPV-P09，泳道10为HLPV-P10，泳道11为HLPV-P11，泳道14为HLPV-P14抗体。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。以下提供的实施例可作为本技术领域普通技术人员进行进一步改进的指南，并不以任何方式构成对本发明的限制。
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
下述实施例中的主要试剂及其厂家信息如下：
ExpiCHO-STM Cells：Thermo公司；
ExpiCHOTM Expression Medium：Thermo公司；
ExpiFectamineTM CHO Transfection Kit：Thermo公司；
pCGS3表达载体：Merck公司；
重组人PLVAP/PV-1蛋白：Abcam公司；
Protein A预装色谱柱：生工生物工程(上海)股份有限公司；
Centrifugal Filters
Figure BDA0003633779020000091
-10K：Millipore公司；
Centrifugal Filters 0.5ml 10K
Figure BDA0003633779020000092
-10K：Millipore公司；
PBS pH7.4(1×)：Thermo公司；
Sure PAGETM，Bis-Tris，10x8，4-12％，12wells：南京金斯瑞生物科技有限公司。
下述实施例中的关键仪器及其厂家信息如下：
凝胶成像***：Protein Simple公司；
eStainTML1蛋白染色仪：南京金斯瑞生物科技有限公司；
Biacore T200分子间相互作用分析***：GE公司。
实施例1、亲和力成熟实验
本实施例在原始抗体(该原始抗体命名为HLPV-P00，重链可变区如SEQ ID NO：01所示，轻链可变区如SEQ ID NO：02所示)基础上，通过噬菌体展示进行亲和力成熟筛选。噬菌体展示突变采用四个组合方式，进行单点或双点饱和突变，设计突变文库。理论库容大小的计算方式为CDR1(氨基酸个数)×20(每个位点有20种可能性)×CDR2(氨基酸个数)×20×CDR3(氨基酸个数)×20。以01号库容为例，库容为9×20×11×20×9×20＝3.96×106(表1)。
表1：抗体亲和力成熟实验库容统计表
库编号 组合方式 突变方式 理论库容
01 LCDR1+LCDR3+HCDR3 单点组合突变 3.96×1006
02 LCDR2+HCDR1+HCDR2 单点组合突变 5.60×1006
03 LCDR3 双点突变 3.20×1006
04 LCDR3+HCDR3 双点组合突变 5.12×1006
第一次噬菌体筛选实验失败，抗体亲和力提高不足一个数量级。第一轮噬菌体筛选实验组装11个全长抗体，其中5个抗体的亲和力提高了2倍以上，亲和力最高的抗体提高4.8倍，亲和力最高的抗体命名为HLPV-P01，重链可变区如SEQ ID NO：03所示，轻链可变区如SEQ ID NO：04所示。
第二次噬菌体筛选实验在第一次实验获得的最佳抗体HLPV-P01基础上，再次通过表1所示设计的抗体文库，进行亲和力成熟筛选，获得亲和力成熟抗体名称依次为HLPV-P02至14，所述编码抗体可变区序列如表2。
表2：亲和力成熟筛选抗体序列统计表
抗体 重链可变区 轻链可变区 备注
HLPV-P00 SEQ ID NO：01 SEQ ID NO：02 原始抗体
HLPV-P01 SEQ ID NO：03 SEQ ID NO：04 中间抗体
HLPV-P02 SEQ ID NO：05 SEQ ID NO：15
HLPV-P03 SEQ ID NO：06 SEQ ID NO：16
HLPV-P04 SEQ ID NO：07 SEQ ID NO：17
HLPV-P05 SEQ ID NO：08 SEQ ID NO：18
HLPV-P06 SEQ ID NO：09 SEQ ID NO：16
HLPV-P07 SEQ ID NO：10 SEQ ID NO：19
HLPV-P08 SEQ ID NO：11 SEQ ID NO：20
HLPV-P09 SEQ ID NO：11 SEQ ID NO：21
HLPV-P10 SEQ ID NO：08 SEQ ID NO：22
HLPV-P11 SEQ ID NO：11 SEQ ID NO：23
HLPV-P12 SEQ ID NO：12 SEQ ID NO：24
HLPV-P13 SEQ ID NO：13 SEQ ID NO：25
HLPV-P14 SEQ ID NO：14 SEQ ID NO：25
实施例2、组装全抗分子验证亲和力实验
1重组表达质粒构建实验
根据实施例1表2亲和力成熟单抗重轻和轻链可变区序列，分别融合IgG1-Fc和κ链恒定区序列(重链可变区碳端融合IgG1-Fc，轻链可变区碳端融合κ恒定区)，密码子优化并委托生工生物合成，重链基因序列连接至pUC57克隆载体的限制性核酸内切酶SmaI单酶切位点之后，轻链基因序列连接至pUC57克隆载体的限制性核酸内切酶SmaI和HindIII的酶切位点之间，对应合成质粒名称如表3。
表3：全抗表达组合重、轻链质粒统计表
抗体 重链可变区 重链质粒 轻链可变区 轻链质粒
HLPV-P00 SEQ ID NO：01 pUC57-00-H SEQ ID NO：02 pUC57-00-L
HLPV-P01 SEQ ID NO：03 pUC57-01-H SEQ ID NO：04 pUC57-01-L
HLPV-P02 SEQ ID NO：05 pUC57-02-H SEQ ID NO：15 pUC57-02-L
HLPV-P03 SEQ ID NO：06 pUC57-03-H SEQ ID NO：16 pUC57-03/06-L
HLPV-P04 SEQ ID NO：07 pUC57-04-H SEQ ID NO：17 pUC57-04-L
HLPV-P05 SEQ ID NO：08 pUC57-05/10-H SEQ ID NO：18 pUC57-05-L
HLPV-P06 SEQ ID NO：09 pUC57-06-H SEQ ID NO：16 pUC57-03/06-L
HLPV-P07 SEQ ID NO：10 pUC57-07-H SEQ ID NO：19 pUC57-07-L
HLPV-P08 SEQ ID NO：11 pUC57-08/09/11-H SEQ ID NO：20 pUC57-08-L
HLPV-P09 SEQ ID NO：11 pUC57-08/09/11-H SEQ ID NO：21 pUC57-09-L
HLPV-P10 SEQ ID NO：08 pUC57-05/10-H SEQ ID NO：22 pUC57-10-L
HLPV-P11 SEQ ID NO：11 pUC57-08/09/11-H SEQ ID NO：23 pUC57-11-L
HLPV-P12 SEQ ID NO：12 pUC57-12-H SEQ ID NO：24 pUC57-12-L
HLPV-P13 SEQ ID NO：13 pUC57-13-H SEQ ID NO：25 pUC57-13/14-L
HLPV-P14 SEQ ID NO：14 pUC57-14-H SEQ ID NO：25 pUC57-13/14-L
其中pUC57-00-L，pUC57-01-L，pUC57-02-L，pUC57-03/06-L，pUC57-04-L，pUC57-05-L，pUC57-07-L，pUC57-08-L，pUC57-09-L，pUC57-10-L，pUC57-11-L，pUC57-12-L和pUC57-13/14-L为轻链质粒，其含有完整的轻链基因，该轻链基因是分别将轻链可变区基因(序列如SEQ ID NO：02、SEQ ID NO：04、SEQ ID NO：15、SEQ ID NO：16、SEQ ID NO：17、SEQID NO：18、SEQ ID NO：19、SEQ ID NO：20、SEQ ID NO：21、SEQ ID NO：22、SEQ ID NO：23、SEQID NO：24和SEQ ID NO：25所示轻链的编码基因)的3’端与人Kappa恒定区(κ恒定区)轻链基因连接得到的融合基因。其中人Kappa恒定区(κ恒定区)轻链基因的核苷酸序列为SEQ IDNo.30的第394-714位所示，人Kappa恒定区(κ恒定区)轻链基因表达氨基酸序列如UniProtKB数据库序列号P01834.2(2022.02.23最新更新)所示的人Kappa恒定区。
其中pUC57-00-H，pUC57-01-H，pUC57-02-H，pUC57-03-H，pUC57-04-H，pUC57-05/10-H，pUC57-06-H，pUC57-07-H，pUC57-08/09/11-H，pUC57-12-H，pUC57-13-H和pUC57-14-H为重链质粒，其含有完整的重链基因，该重链基因是分别将重链可变区基因(SEQ ID NO：01、SEQ ID NO：03、SEQ ID NO：05、SEQ ID NO：06、SEQ ID NO：07、SEQ ID NO：08、SEQ IDNO：09、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：13和SEQ ID NO：14的编码基因)的3’端与人IgG1恒定区重链基因(IgG1-Fc)连接得到的融合基因。其中人IgG1恒定区重链基因的核苷酸序列为SEQ ID No.28的第409-1398位所示，人IgG1恒定区重链基因表达氨基酸序列如UniProtKB数据库序列号P01857.1(2022.02.23最新更新)所示的人IgG1恒定区。
上述重组表达质粒的构建方案采用为先构建轻链，轻链构建完成后，在此基础上按照表3不同组合方式构建重链，最后形成双表达框重组表达质粒，共计构建13个轻链中间质粒和15个全抗分子，具体步骤如下：
第一步构建全抗分子轻链，操作步骤为：采用HindIII(NEB)和XhoI(NEB)双酶切pCGS3(Merck)载体，pUC57-00-L，pUC57-01-L，pUC57-02-L，pUC57-03/06-L，pUC57-04-L，pUC57-05-L，pUC57-07-L，pUC57-08-L，pUC57-09-L，pUC57-10-L，pUC57-11-L，pUC57-12-L和pUC57-13/14-L轻链质粒，获得9535bp载体片段和13条723bp轻链片段。利用T4连接酶(TAKARA)连接，转化，涂板，提取质粒，HindIII和XhoI双酶切鉴定，酶切条带符合预期。测序正确质粒分别命名为pCGS3-HLPV-P00L，pCGS3-HLPV-P01L，pCGS3-HLPV-P02L，pCGS3-HLPV-P03/06L，pCGS3-HLPV-P04L，pCGS3-HLPV-P05L，pCGS3-HLPV-P07L，pCGS3-HLPV-P08L，pCGS3-HLPV-P09L，pCGS3-HLPV-P10L，pCGS3-HLPV-P11L，pCGS3-HLPV-P12L，pCGS3-HLPV-P13/14L中间质粒(图1上)。图中，泳道A-M依次为pCGS3-HLPV-P00L，pCGS3-HLPV-P01L，pCGS3-HLPV-P02L，pCGS3-HLPV-P03/06L，pCGS3-HLPV-P04L，pCGS3-HLPV-P05L，pCGS3-HLPV-P07L，pCGS3-HLPV-P08L，pCGS3-HLPV-P09L，pCGS3-HLPV-P10L，pCGS3-HLPV-P11L，pCGS3-HLPV-P12L，pCGS3-HLPV-P13/14L中间质粒酶切产物电泳结果。
第二步为构建全抗分子重链以及按照表3不同组合方式构建全抗分子：采用BstBI(NEB)和PacI(NEB)双酶切上述构建完成的13个中间质粒和pUC57-00-H，pUC57-01-H，pUC57-02-H，pUC57-03-H，pUC57-04-H，pUC57-05/10-H，pUC57-06-H，pUC57-07-H，pUC57-08/09/11-H，pUC57-12-H，pUC57-13-H和pUC57-14-H重链质粒，获得13条10200bp载体片段和12条1409bp重链片段，采用T4连接酶(TAKARA)连接，转化，涂板，提取质粒，BstBI和PacI双酶切鉴定，酶切条带符合预期(图1下)。测序正确的质粒分别命名为pCGS3-HLPV-P00至P14。图中泳道01-14分别为pCGS3-HLPV-P00至P14酶切产物电泳结果。
pCGS3-HLPV-P00至P14重组表达质粒中每一个重组表达质粒均含有1409bp重链基因片段和723bp轻链基因片段，重链基因片段和轻链基因片段核苷酸序列中，只有编码重链可变区和轻链可变区的核苷酸序列不同，其它核苷酸序列均相同。相应的重链可变区和轻链可变区的氨基酸序列如表3所示。其中，本发明亲和力成熟的序列HLPV-P02至P14的重链可变区的编码序列如SEQ ID No.26所示(表4)，轻链可变区的编码序列如SEQ ID No.27所示(表5)，其中，R为A或G，Y为C或T，M为A或C，K为G或T，S为G或C，W为A或T，H为A或T或C，B为G或T或C，V为G或A或C，D为G或A或T，N为A或T或G或C。
表4 SEQ ID No.26序列简并碱基统计表
Figure BDA0003633779020000131
表5 SEQ ID No.27序列简并碱基统计表
Figure BDA0003633779020000132
Figure BDA0003633779020000141
上述重链基因片段如SEQ ID NO：28所示，第1-6位为BstBI酶切位点，第7-15位为Kozak序列，第16-72位为信号肽基因，第73-1398位为重链基因序列，第1399-1401位为终止密码子，第1402-1409位为PacI酶切位点，其中第73-408位核苷酸序列为重链可变区的编码序列，第409-1398位为恒定区序列。
上述轻链基因片段如SEQ ID NO：30所示，第1-6位为HindIII酶切位点，第7-15位为Kozak序列，第16-72位为信号肽，第73-714位轻链基因序列，第715-717位为终止密码子，第718-723位为XhoI酶切位点，其中第73-393位核苷酸为轻链可变区的编码序列，第394-714位为恒定区序列。
2重组表达质粒瞬转表达实验
按照每mL细胞培养物转染0.8μg质粒的量及质粒原始浓度，计算转染50mL细胞所需原始质粒的体积。将15个上述重组表达质粒与转染试剂ExpiFectamineTM CHOTransfection Kit(Thermo公司)复合物缓慢滴入含有ExpiCHO-S(Thermo公司)细胞的细胞培养基ExpiCHOTM Expression Medium(Thermo公司)中培养以表达15个抗体分子，边加边摇晃细胞培养物，使DNA与转染试剂复合物分散均匀。按照最大滴度在转染后18至22h添加补料和增强剂，同时将培养条件37℃降至32℃、CO2浓度由8％降至5％；转染后第5天再次添加补料。当活率降至65％-75％时终止培养得到培养物。所得培养物依次命名为CHO-S/pCGS3-HLPV-00至14共计15个培养物。
3组装全抗蛋白纯化实验
将上述培养物于6000g离心30min，收集上清，采用超滤管Centrifugal FiltersU1
Figure BDA0003633779020000142
-10K(Millipore公司)进行超滤浓缩，上清和结合/洗涤缓冲液(生工生物Protein A预装色谱柱的试剂盒成分)按照体积比1∶1混匀，静置20min充分孵育，得到超滤浓缩上清和结合/洗涤缓冲液混匀液。五倍柱体积的结合/洗涤缓冲液平衡柱子(生工生物Protein A预装色谱柱的试剂盒成分)，将超滤浓缩上清和结合/洗涤缓冲液混匀液加入柱子依靠重力流穿预装柱。用10-15倍柱体积的结合/洗涤缓冲液清洗柱子并收集流穿液。使用一个新的收集管重复该步骤，直到流穿液的吸光度280nm接近基线；用5-10倍柱体积的洗脱缓冲液洗脱柱上的重组蛋白，Centrifugal Filters 0.5ml 10K/>
Figure BDA0003633779020000151
-10K(Millipore公司)超滤浓缩置换到PBS(pH7.4)缓冲液。使用还原SD S-PAGE鉴定纯化单克隆抗体，检测结果显示单克隆抗体条带符合预期(图2)。全抗样品HLPV-P00至P14抗体分别来自CHO-S/HLPV-00至14培养物。
4全抗分子亲和力检测
采用表面等离子共振技术检测亲和力成熟获得的HLPV-P00至P14共计15个抗体与PV-1蛋白结合亲和力。将偶联物重组人PLVAP/PV-1蛋白(Abcam公司)偶联到Series SSensor Chip CM5芯片(GE公司)上，Biacore T200分子间相互作用分析***(GE公司)上机，将分析物亲和力成熟获得的抗体流过芯片表面(温度25℃，流速度30μl/min，结合时间120s，解离时间180s)，若偶联物与分析物有结合活性，则会引起金膜表面折射率变化，最终导致SPR角变化。通过检测SPR角度变化，Biacore T200 Evaluation Software程序软件输出原始数据，并进行1∶1结合模式进行动力学拟合分析，亲和力成熟抗体与PV-1蛋白的亲和力常数如表6所示。
表6亲和力成熟全抗分子亲和力统计表
抗体 抗体类型 亲和力常数 倍数 备注
HLPV-P00 IgG1-Fc 3.002×10-8 1.00 原始抗体
HLPV-P01 IgG1-Fc 4.107×10-9 7.31 中间抗体
HLPV-P02 IgG1-Fc 2.477×10-9 6.29
HLPV-P03 IgG1-Fc 2.239×10-9 13.41
HLPV-P04 IgG1-Fc 2.141×10-9 14.02
HLPV-P05 IgG1-Fc 1.163×10-9 25.81
HLPV-P06 IgG1-Fc 3.353×10-9 8.95
HLPV-P07 IgG1-Fc 2.636×10-9 11.39
HLPV-P08 IgG1-Fc 7.823×10-10 38.37
HLPV-P09 IgG1-Fc 8.149×10-10 36.84
HLPV-P10 IgG1-Fc 1.284×10-9 23.38
HLPV-P11 IgG1-Fc 7.414×10-10 40.49
HLPV-P12 IgG1-Fc 7.317×10-9 4.10
HLPV-P13 IgG1-Fc 3.230×10-9 9.29
HLPV-P14 IgG1-Fc 3.499×10-9 8.58
由表6可知，经过两次噬菌体展示实验和全抗分子亲和力实验验证，共计获得14个亲和力成熟抗体分子，亲和力比原始抗体显著提高，最高抗体HLPV-P11的亲和力提高倍数为40.49倍(表6)。
实施例3、去除ADCC效应亚型抗体亲和力研究
1重组表达质粒构建实验
靶点PV-1临床应用不需要抗体的ADCC效应，因此任选择七个亲和力成熟抗体，构建弱化ADCC效应的IgG1(N297A)和IgG4(S228P)两个亚型抗体重组表达质粒(表7)，用于验证不同去除ADCC效应亚型抗体对亲和力的影响。
表7去除ADCC效应亚型抗体构建所需统计表
Figure BDA0003633779020000161
IgG1(N297A)质粒和IgG4(S228P)质粒是将重链基因序列连接至pUC57克隆载体的限制性核酸内切酶SmaI单酶切位点之后获得的。
其中pUC57-03-H(N297A)，pUC57-05/10-H(N297A)，pUC57-08/09/11-H(N297A)，pUC57-14-H(N297A)含有完整的重链基因，该重链基因是分别将重链可变区基因(SEQ IDNO：06、SEQ ID NO：08、SEQ ID NO：11和SEQ ID NO：14的编码基因)的3’端与人IgG1(N297A)基因连接得到的融合基因。其中IgG1(N297A)基因的核苷酸序列为SEQ ID NO：28所示，IgG1(N297A)基因表达的IgG1(N297A)与人IgG1恒定区的不同之处仅在于第297位天冬氨酸突变为丙氨酸。
其中pUC57-03-H(S228P)，pUC57-05/10-H(S228P)，pUC57-08/09/11-H(S228P)和pUC57-14-H(S228P)含有完整的重链基因，该重链基因是分别将重链可变区基因(SEQ IDNO：06、SEQ ID NO：08、SEQ ID NO：11和SEQ ID NO：14的编码基因)的3’端与人IgG4(S228P)基因连接得到的融合基因。其中IgG4(S228P)基因的核苷酸序列为SEQ ID No.29的第409-1389位所示，IgG4(S228P)基因表达氨基酸序列如UniProtKB数据库序列号为P01861.1(2022.02.23最新更新)的IgG4并引入S228P(EU编号)氨基酸突变所示的IgG4(S228P)恒定区，即IgG4(S228P)基因表达的IgG4(S228P)与人IgG4恒定区的不同之处仅在于第228位丝氨酸突变为脯氨酸。
按照表7构建质粒：采用BstBI(NEB)和PacI(NEB)双酶切上述构建完成的表7中7个中间质粒，pUC57-03-H(N297A)，pUC57-05/10-H(N297A)，pUC57-08/09/11-H(N297A)，pUC57-14-H(N297A)，pUC57-03-H(S228P)，pUC57-05/10-H(S228P)，pUC57-08/09/11-H(S228P)和pUC57-14-H(S228P)质粒，获得10200bp载体片段和1409bp的IgG1(N297A)或1400bp的IgG4(S228P)重链片段，采用T4连接酶(TAKARA)连接，转化，涂版，提取质粒，BstBI和PacI双酶切鉴定，酶切条带符合预期(图3)。质粒命名为pCGS3-HLPV-P03(N297A)，pCGS3-HLPV-P05(N297A)，pCGS3-HLPV-P08(N297A)，pCGS3-HLPV-P09(N297A)，pCGS3-HLPV-P10(N297A)，pCGS3-HLPV-P11(N297A)，pCGS3-HLPV-P14(N297A)，pCGS3-HLPV-P03(S228P)，pCGS3-HLPV-P05(S228P)，pCGS3-HLPV-P08(S228P)，pCGS3-HLPV-P09(S228P)，pCGS3-HLPV-P10(S228P)，pCGS3-HLPV-P11(S228P)，pCGS3-HLPV-P14(S228P)。
pCGS3-HLPV-P03(N297A)，pCGS3-HLPV-P05(N297A)，pCGS3-HLPV-P08(N297A)，pCGS3-HLPV-P09(N297A)，pCGS3-HLPV-P10(N297A)，pCGS3-HLPV-P11(N297A)和pCGS3-HLPV-P14(N297A)这7个去除ADCC效应IgG1(N297A)亚型抗体重组表达质粒均含有1409bp的IgG1(N297A)重链片段和723bp轻链基因片段，IgG1(N297A)重链片段和轻链基因片段核苷酸序列中，只有编码重链可变区和轻链可变区的核苷酸序列不同，其它核苷酸序列均相同。IgG1(N297A)重链片段如SEQ ID NO：28所示，第1-6位为BstBI酶切位点，第7-15位为Kozak序列，第16-72位为信号肽基因，第73-1398位为重链基因序列，第1399-1401位为终止密码子，第1402-1409位为PacI酶切位点，其中第73-408位核苷酸序列为重链可变区的编码序列，第409-1398位为恒定区序列。该轻链基因片段如SEQ ID NO：30所示，第1-6位为HindIII酶切位点，第7-15位为Kozak序列，第16-72位为信号肽，第73-714位轻链基因序列，第715-717位为终止密码子，第718-723位为XhoI酶切位点，其中第73-393位核苷酸为轻链可变区的编码序列，394-714为恒定区序列。
pCGS3-HLPV-P03(S228P)，pCGS3-HLPV-P05(S228P)，pCGS3-HLPV-P08(S228P)，pCGS3-HLPV-P09(S228P)，pCGS3-HLPV-P10(S228P)，pCGS3-HLPV-P11(S228P)和pCGS3-HLPV-P14(S228P)这7个去除ADCC效应IgG4(SP28P)亚型抗体重组表达质粒均含有1400bp的IgG4(S228P)重链片段和723bp轻链基因片段，IgG4(S228P)重链片段和723bp轻链基因片段核苷酸序列中，只有编码重链可变区和轻链可变区的核苷酸序列不同，其它核苷酸序列均相同。IgG4(S228P)重链片段如SEQ ID NO：29所示，第1-6位为BstBI酶切位点，第7-15位为Kozak序列，第16-72位为信号肽基因，第73-1389位为重链基因序列，第1390-1392位为终止密码子，第1393-1400位为PacI酶切位点，其中第73-408位核苷酸序列为重链可变区的编码序列，第409-1389位为恒定区序列。该轻链基因片段如SEQ ID NO：30所示，第1-6位为HindIII酶切位点，第7-15位为Kozak序列，第16-72位为信号肽，第73-714位轻链基因序列，第715-717位为终止密码子，第718-723位为XhoI酶切位点，其中第73-393位核苷酸为轻链可变区的编码序列，394-714为恒定区序列。
2去除ADCC效应亚型抗体亲和力检测
按照实施例2中重组表达质粒瞬转表达方法对去除ADCC效应IgG1(N297A)和IgG4(SP28P)亚型抗体重组表达质粒进行表达获得培养物，按照实施例2中抗体蛋白纯化对获得的培养物进行纯化并对纯化后培养物进行SDS-PAGE鉴定纯化单克隆抗体，检测结果显示单克隆抗体条带符合预期(图4)，表明前述培养物分别含有抗体亚型为IgG1(N297A)的抗体HLPV-P03、HLPV-P05、HLPV-P08、HLPV-P09、HLPV-P10、HLPV-P11和HLPV-P14以及抗体亚型为IgG4(S228P)的抗体HLPV-P03、HLPV-P05、HLPV-P08、HLPV-P09、HLPV-P10、HLPV-P11和HLPV-P14。
按照实施例2中亲和力检测方法对前述制备的抗体以及实施例2制备的HLPV-P00进行检测，检测去除ADCC效应亚型抗体与PV-1蛋白的亲和力常数，实验结果如表8所示。
表8去除ADCC效应亚型抗体亲和力统计表
Figure BDA0003633779020000181
Figure BDA0003633779020000191
表8可知，IgG1(N297A)和IgG4(S228P)两种去除ADCC效应的抗体亲和力均比原始抗体(HLPV-P00)提高1-2个数量级，亲和力成熟实验符合预期，可用于下一步药物开发实验。
综上所述，本发明通过两次噬菌体筛选实验，获得亲和力提高1-2个数量级的14个亲和力成熟抗体序列HLPV-P00至14。更进一步的，PV-1靶点抗体不需抗体依赖的细胞介导的细胞毒性效应(ADCC)，本发明采用IgG1(N297A)和IgG4(S228P)两种去除ADCC效应的抗体亚型验证，亲和力依然提高1-2个数量级。本发明所述亲和力成熟抗体预期降低给药剂量，用于治疗年龄相关性黄斑变性(AMD)、糖尿病黄斑水肿(DME)和成年患者视网膜静脉阻塞引起的黄斑、肝癌等疾病。
以上对本发明进行了详述。对于本领域技术人员来说，在不脱离本发明的宗旨和范围，以及无需进行不必要的实验情况下，可在等同参数、浓度和条件下，在较宽范围内实施本发明。虽然本发明给出了特殊的实施例，应该理解为，可以对本发明作进一步的改进。总之，按本发明的原理，本申请欲包括任何变更、用途或对本发明的改进，包括脱离了本申请中已公开范围，而用本领域已知的常规技术进行的改变。按以下附带的权利要求的范围，可以进行一些基本特征的应用。
序列表
<110> 华兰基因工程有限公司
<120> 特异性结合PV-1蛋白的抗体或其抗原结合片段及其应用
<130> 221127
<160> 30
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 112
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
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Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr
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Tyr Met Tyr Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
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Gly Glu Ile Asn Pro Thr Gln Gly Asp Val Asn Phe Asn Glu Met Phe
50 55 60
Lys Ser Arg Val Thr Met Thr Val Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
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Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
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Thr Ser Ile His Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
100 105 110
<210> 2
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
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Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp Ile Lys Thr Gln
20 25 30
Leu Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Thr Leu Ile
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Tyr Tyr Ala Thr Asp Leu Ala Asp Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
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Ser Gly Ser Gly Gln Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gln His Asp Asp Arg Pro Phe
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Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
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<210> 3
<211> 112
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
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Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr
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Tyr Met Tyr Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
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Gly Glu Ile Asn Pro Thr Gln Gly Asp Val Asn Phe Asn Glu Met Phe
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Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
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Thr Ser Ile Phe Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
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<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
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Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp Ile Lys Tyr Gln
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Leu Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Thr Leu Ile
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Tyr Tyr Ala Thr Asp Leu Ala Asp Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
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Ser Gly Ser Gly Gln Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
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<210> 5
<211> 112
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
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<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
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Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Glu Asp Tyr
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Tyr Met Tyr Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
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<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
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<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
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<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
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<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<211> 112
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Val Phe Thr Asp Tyr
20 25 30
Tyr Met Tyr Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Glu Ile Asn Pro Thr Ser Gly Asp Val Asn Phe Asn Glu Met Phe
50 55 60
Lys Ser Arg Val Thr Met Thr Val Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Thr Ser Ile Phe Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
100 105 110
<210> 14
<211> 112
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 14
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr
20 25 30
Tyr Met Tyr Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Glu Ile Asn Pro Thr Ser Gly Asp Val Asn Phe Asn Glu Met Phe
50 55 60
Lys Ser Arg Val Thr Met Thr Val Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Thr Ser Ile Phe Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
100 105 110
<210> 15
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 15
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp Ile Lys Tyr Gln
20 25 30
Leu Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Thr Leu Ile
35 40 45
Tyr Tyr Ser Thr Asp Leu Ala Asp Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Gln Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Val Gln His Asp Asp Arg Pro Phe
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105
<210> 16
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 16
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp Ile Lys Tyr Gln
20 25 30
Leu Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Thr Leu Ile
35 40 45
Tyr Tyr Ala Thr Phe Leu Ala Asp Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Gln Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Val Gln His Asp Asp Arg Pro Phe
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105
<210> 17
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 17
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp Ile Lys Tyr Gln
20 25 30
Leu Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Thr Leu Ile
35 40 45
Tyr Tyr Ala Thr Ser Leu Ala Asp Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Gln Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Val Gln His Asp Asp Arg Pro Phe
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105
<210> 18
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 18
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp Ile Lys Tyr Gln
20 25 30
Leu Thr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Thr Leu Ile
35 40 45
Tyr Tyr Ala Thr Asp Leu Ala Asp Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Gln Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Val Gln His Asp Asn Arg Pro Phe
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105
<210> 19
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 19
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp Ile Lys Tyr Gln
20 25 30
Leu Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Thr Leu Ile
35 40 45
Tyr Tyr Ala Thr Tyr Leu Ala Asp Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Gln Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Val Gln His Asp Asp Arg Pro Phe
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105
<210> 20
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 20
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp Ile Lys Tyr Gln
20 25 30
Leu Thr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Thr Leu Ile
35 40 45
Tyr Tyr Ala Thr Asp Leu Ala Asp Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Gln Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Val Ser His Asp Asp Arg Pro Phe
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105
<210> 21
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 21
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp Ile Gly Tyr Gln
20 25 30
Leu Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Thr Leu Ile
35 40 45
Tyr Tyr Ala Thr Asp Leu Ala Asp Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Gln Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Val Gln His Tyr Asp Arg Pro Phe
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105
<210> 22
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 22
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp Ile Lys Tyr Gln
20 25 30
Leu Thr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Thr Leu Ile
35 40 45
Tyr Tyr Ala Thr Asp Leu Ala Asp Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Gln Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Val Gln His Ser Asp Arg Pro Phe
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105
<210> 23
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 23
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp Ile Lys Tyr Gln
20 25 30
Leu Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Thr Leu Ile
35 40 45
Tyr Tyr Ala Thr Asp Leu Ala Asp Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Gln Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Val Gln His Asp Asp Arg Pro Phe
85 90 95
Ser Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105
<210> 24
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 24
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp Ile Lys Tyr Gln
20 25 30
Leu Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Thr Leu Ile
35 40 45
Tyr Tyr Ala Thr Asp Arg Ala Asp Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Gln Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Val Gln His Asp Asp Arg Pro Phe
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105
<210> 25
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 25
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp Ile Lys Tyr Gln
20 25 30
Leu Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Thr Leu Ile
35 40 45
Tyr Tyr Ala Gly Asp Leu Ala Asp Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Gln Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Val Gln His Asp Asp Arg Pro Phe
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105
<210> 26
<211> 336
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 26
caggttcagc tggttcagtc tggcgccgaa gtgaagaaac ctggcgcctc tgtgaaggtg 60
tcctgcaagg cttctggcta crybtttvvs rmbtactaca tgtactgggt ccgacaggct 120
cctggacagg gactcgagtg gatcggcgag rtyaatcctw cwhmkggcga cgtgmrcttc 180
aacgagatgt tcaagtcccg cgtgaccatg accgtggaca cctctacctc taccgcctac 240
atggaactgt ccagcctgag atctgaggac accgccgtgt actactgcac cwcyatcttt 300
tattggggcc agggcacact ggtcaccgtg tcctct 336
<210> 27
<211> 321
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 27
gacatcgtga tgacccagtc tccatcctct ctgtccgcct ctgtgggcga cagagtgacc 60
atcacatgca aggcsagcca ggacatcrrg tatcagytgw cbtggtatca gcagaagcct 120
ggcaaggccc ctaagacact gatctactac kcyrsykhtc kggccgatgg cgtgccctct 180
agattttccg gctctggctc tggccaagag tttaccctga caatctccag cctgcagcct 240
gaggacttcg ccacctacta ctgcgttymg cackmyraya gacccttcwc ytttggccag 300
ggcaccaagc tggaaatcaa g 321
<210> 28
<211> 1409
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 28
ttcgaagccg ccaccatggg atggtcttgt atcatcctgt ttctggtggc taccgccaca 60
ggcgtgcata gccaggttca gctggttcag tctggcgccg aagtgaagaa acctggcgcc 120
tctgtgaagg tgtcctgcaa ggcttctggc tacrybtttv vsrmbtacta catgtactgg 180
gtccgacagg ctcctggaca gggactcgag tggatcggcg agrtyaatcc twcwhmkggc 240
gacgtgmrct tcaacgagat gttcaagtcc cgcgtgacca tgaccgtgga cacctctacc 300
tctaccgcct acatggaact gtccagcctg agatctgagg acaccgccgt gtactactgc 360
accwcyatct tttattgggg ccagggcaca ctggtcaccg tgtcctctgc ttccaccaag 420
ggcccctccg tgttccccct ggctccctct tccaagagca ccagcggcgg caccgctgct 480
ctgggatgtc tggtgaagga ctacttccct gagcctgtga ccgtgtcctg gaattccggc 540
gccctgacct ccggcgtgca cacattccct gctgtgctgc agtcctccgg cctgtatagc 600
ctgtcctccg tggtgacagt gcctagctcc agcctgggca cccagaccta tatctgcaac 660
gtgaaccaca agcctagcaa taccaaggtg gacaagaagg tggagcctaa gagctgcgac 720
aagacccaca cctgtcctcc atgtcctgct ccagaactgc tcggcggacc ttccgtgttc 780
ctgtttcctc caaagcctaa ggacaccctg atgatcagca gaacccctga agtgacctgc 840
gtggtggtgg atgtgtccca cgaggatccc gaagtgaagt tcaattggta cgtggacggc 900
gtggaagtgc acaacgccaa gaccaagcct agagaggaac agtacrmcag cacctacaga 960
gtggtgtccg tgctgaccgt gctgcaccag gattggctga acggcaaaga gtacaagtgc 1020
aaggtgtcca acaaggccct gcctgctcct atcgagaaaa ccatcagcaa ggccaagggc 1080
cagcctaggg aaccccaggt ttacacactg cctccaagca gggacgagct gaccaagaat 1140
caggtgtccc tgacctgcct ggtcaagggc ttctaccctt ccgatatcgc cgtggaatgg 1200
gagagcaatg gccagcctga gaacaactac aagacaaccc ctcctgtgct ggacagcgac 1260
ggctcattct tcctgtacag caagctgaca gtggacaaga gcagatggca gcagggcaac 1320
gtgttcagct gcagcgtgat gcacgaggcc ctgcacaacc actacaccca gaagtccctg 1380
agcctgtctc ctggcaaata attaattaa 1409
<210> 29
<211> 1400
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 29
ttcgaagccg ccaccatggg atggtcttgt atcatcctgt ttctggtggc taccgccaca 60
ggcgtgcata gccaggttca gctggttcag tctggcgccg aagtgaagaa acctggcgcc 120
tctgtgaagg tgtcctgcaa ggcttctggc tacrybtttv vsrmbtacta catgtactgg 180
gtccgacagg ctcctggaca gggactcgag tggatcggcg agrtyaatcc twcwhmkggc 240
gacgtgmrct tcaacgagat gttcaagtcc cgcgtgacca tgaccgtgga cacctctacc 300
tctaccgcct acatggaact gtccagcctg agatctgagg acaccgccgt gtactactgc 360
accwcyatct tttattgggg ccagggcaca ctggtcaccg tgtcctctgc ctccaccaag 420
ggcccaagcg tgtttccact ggctccctgc tctcggtcca ccagcgagtc tacagccgct 480
ctgggctgtc tggtgaagga ttatttccct gagccagtga cagtgtcttg gaactccggc 540
gccctgacct ctggagtgca cacatttcct gctgtgctgc agagctctgg cctgtactcc 600
ctgtccagcg tggtgaccgt gccatcttcc agcctgggca caaagaccta tacatgcaac 660
gtggaccata agccctccaa tacaaaggtg gataagagag tggagagcaa gtacggcccc 720
ccttgcccac cctgtccagc tcctgagttc ttaggaggac catccgtgtt cctgtttcct 780
ccaaagccta aggacaccct gatgatcagc cgcaccccag aggtgacatg cgtggtggtg 840
gacgtgtctc aggaggatcc tgaggtgcag ttcaactggt atgtggatgg cgtggaggtg 900
cacaatgcta agaccaagcc cagggaggag cagtttaata gcacctaccg ggtggtgtct 960
gtgctgacag tgctgcatca ggactggctg aacggcaagg agtataagtg caaggtgtcc 1020
aataagggcc tgccttcttc catcgagaag accatcagca aggccaaggg ccagcctagg 1080
gagccacagg tgtacacact gcccccttct caggaggaga tgaccaagaa ccaggtgtcc 1140
ctgacatgtc tggtgaaggg cttctatcct tctgacatcg ctgtggagtg ggagtccaat 1200
ggccagccag agaacaatta caagaccaca ccacccgtgc tggacagcga tggctctttc 1260
tttctgtatt ccagactgac cgtggataag agccgctggc aggagggcaa cgtgttttcc 1320
tgcagcgtga tgcatgaggc cctgcacaat cattacacac agaagtctct gtccctgagc 1380
ctgggcaagt aattaattaa 1400
<210> 30
<211> 723
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 30
aagcttgccg ccaccatggg ctggtcttgt attatcctgt ttctggtggc tacagctaca 60
ggcgtgcact ctgacatcgt gatgacccag tctccatcct ctctgtccgc ctctgtgggc 120
gacagagtga ccatcacatg caaggcsagc caggacatcr rgtatcagyt gwcbtggtat 180
cagcagaagc ctggcaaggc ccctaagaca ctgatctact ackcyrsykh tckggccgat 240
ggcgtgccct ctagattttc cggctctggc tctggccaag agtttaccct gacaatctcc 300
agcctgcagc ctgaggactt cgccacctac tactgcgtty mgcackmyra yagacccttc 360
wcytttggcc agggcaccaa gctggaaatc aagaggaccg tggctgcccc cagcgtgttc 420
atcttccctc ctagcgacga gcagctgaag agcggcaccg ctagcgtggt gtgtctgctg 480
aataacttct atcccaggga ggccaaggtg cagtggaagg tggataacgc cctgcagagc 540
ggcaactccc aggagtccgt gaccgagcag gactccaagg acagcaccta ctccctgagc 600
tccaccctga ccctgtccaa ggctgattat gagaagcaca aggtgtatgc ttgcgaggtg 660
acacaccagg gcctgtccag ccctgtgacc aagagcttca accggggcga gtgctaactc 720
gag 723

Claims (8)

1.特异性结合PV-1蛋白的抗体或其抗原结合片段，其特征在于：所述抗体或其抗原结合片段包含重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区和所述轻链可变区均由决定簇互补区和框架区组成；所述重链可变区和所述轻链可变区的决定簇互补区均由CDR1、CDR2和CDR3组成；
所述重链可变区的CDR1的氨基酸序列如SEQ ID NO: 3的第26-35位所示；
所述重链可变区的CDR2的氨基酸序列如SEQ ID NO: 3的第50-66位所示；
所述重链可变区的CDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO: 3的第97-101位所示；
所述轻链可变区的CDR1的氨基酸序列如SEQ ID NO: 4的第24-34位所示；
所述轻链可变区的CDR2的氨基酸序列如SEQ ID NO: 4的第50-56位所示；
所述轻链可变区的CDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO: 4的第89-97位所示。
2.根据权利要求1所述的抗体或其抗原结合片段，其特征在于：所述重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO: 3所示。
3.根据权利要求1所述的抗体或其抗原结合片段，其特征在于：所述轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO: 4所示。
4.根据权利要求1所述的抗体或其抗原结合片段，其特征在于：所述抗体或其抗原结合片段为HLPV-P01，所述HLPV-P01重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO: 3所示，轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO: 4所示。
5.根据权利要求1-4任一所述的抗体或其抗原结合片段，其特征在于：所述抗体或其抗原结合片段还包括重链恒定区和轻链恒定区，
所述重链恒定区为IgG1的重链恒定区、IgG4的重链恒定区；
所述轻链恒定区为Kappa的轻链恒定区。
6.权利要求1-5所述抗体或其抗原结合片段的相关生物材料，其特征在于：所述相关生物材料为如下任一种：
B1）编码权利要求1-5中任一所述抗体或其抗原结合片段的核酸分子；
B2）编码权利要求1-5中任一所述抗体或其抗原结合片段的重链和轻链的核酸分子；
B3）编码权利要求1-5中任一所述抗体或其抗原结合片段的重链可变区和轻链可变区的核酸分子；
B4）含有B1）-B3）任一所述核酸分子的表达盒；
B5）含有B1）-B3）任一所述核酸分子的重组载体、或含有B4）所述表达盒的重组载体；
B6）含有B1）-B3）任一所述核酸分子的重组微生物、或含有B4）所述表达盒的重组微生物、或含有B5）所述重组载体的重组微生物。
7.根据权利要求6所述的相关生物材料，其特征在于：
所述B2）编码权利要求1-5中任一所述抗体或其抗原结合片段的重链的核酸分子为核苷酸序列如SEQ ID No.28或SEQ ID No.29所示的核酸分子；
所述B2）编码权利要求1-5中任一所述抗体或其抗原结合片段的轻链的核酸分子为核苷酸序列如SEQ ID No.30所示的核酸分子；
所述B3）编码权利要求1-5中任一所述抗体或其抗原结合片段的重链可变区的核酸分子为核苷酸序列如SEQ ID No.26所示的核酸分子；
所述B3）编码权利要求1-5中任一所述抗体或其抗原结合片段的轻链可变区的核酸分子为核苷酸序列如SEQ ID No.27所示的核酸分子。
8.权利要求1-5中任一所述抗体或其抗原结合片段或权利要求6或7所述的生物材料在制备用于结合PV-1蛋白的产品中的应用。
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