CN107616297A

CN107616297A - 一种秸秆发酵生产生物饲料的方法

Info

Publication number: CN107616297A
Application number: CN201710885587.2A
Authority: CN
Inventors: 钟成; 李栋梁; 舒月力; 贾士儒; 侯颖
Original assignee: Tianjin University of Science and Technology
Current assignee: Tianjin University of Science and Technology
Priority date: 2017-09-26
Filing date: 2017-09-26
Publication date: 2018-01-23

Abstract

本发明公开了一种秸秆发酵生产生物饲料的方法，具体步骤如下：(1)原料的预处理即汽爆预处理加碱处理后经水洗风干，粉碎过20目，4℃备用。汽爆预处理条件：秸秆2‑3cm，每次添加量200g，维持温度220℃，压力2.2MPa，维持时间5min，瞬间泄压，使物料***。碱预处理：汽爆后秸秆与2％NaOH溶液按料液比1∶20混合，于高压蒸汽灭菌121℃、处理1小时。(2)预酶解实验，预处理后小麦秸秆添加少量的酶进行预酶解，酶解体系为200ml，葡聚糖添加量10％(w/v)，采用分批补料。(3)同步糖化发酵实验，将菌种混合加入酶解液中，进行厌氧发酵，反应温度30‑32℃，发酵时间3‑5天，转速170‑220r/min，pH5～7。本发明生产的饲料有机物含量丰富，营养价值高具有促进牲畜生长的作用。

Description

一种秸秆发酵生产生物饲料的方法

技术领域

本实验属于生物饲料领域，涉及一种高效生产生物秸秆饲料的方法，特别是以小麦秸秆这种廉价原料生产新型微生物粗饲料。

背景技术

在草原禁牧、提倡舍饲的环境下，生物饲料是牛羊等反刍动物的必需原料。南方多稻草，北方多秸秆，但是稻草秸秆质地粗糙，蛋白含量低，并且木质素含量高，目前稻草秸秆大多数没有加工直接喂养反刍动物如奶牛等，但是直接喂养存适口性差、采食量低、消化率不高、营养价值极低等缺点，而且只能用于反刍动物，所以利用率极低。

传统的微生物饲料主要以青贮、黄贮、微贮等方式进行发酵生产，专利公开号CN104381742A公布了一种玉米秸秆微贮方法，该发明虽然操作简单，并且有效的提高了饲料的适口性，但是并没有提高饲料中蛋白含量，营养价值没有增加。本发明能明显提高饲料中的蛋白含量，并且营养价值高，适口性好。

现阶段主要研究的生物发酵饲料主要是以混合酶或混合菌直接利用秸秆纤维素进行发酵。专利公开号CN 104642731A公布了一种通过混合酶酶解秸秆进行生产，该发明明显提高了饲料中蛋白含量，但是饲料中仍含有大量木质素，而且由于秸秆木质纤维的结构抗性，酶解效果并不理想。本发明通过汽爆加碱预处理，破坏了木质纤维素的结构抗性，大大降低了木质素含量，并且通过多菌混合培养，能产生大量蛋白质及其他有益物质。专利公开号CN 105010728A 公布了一种通过混合菌种直接利用秸秆进行发酵的方法，该发明能有效降低生产成本，且产物丰富，但是初始菌群生长受到秸秆中单糖含量的影响，很难快速生长，所以发酵周期长，从而提高成本。本发明通过预处理后预酶解，有效的解决了这一问题，为菌群的初期生长提供了充足的糖元。

发明内容

为克服上述缺陷，本发明的目的在于提供一种秸秆发酵生产微生物饲料的方法。使其真蛋白大幅度增加，木质素大幅度降解，纤维素和半维素有效转化，益生菌、功能酶、功能营养物质丰富，必需氨基酸匀恒，饲养效果显著，价廉物美，保存期长，主要用于反当动物，市场容量大，环境友好，社会和经济效益明显。

为实现上述目的，本发明采用了一下技术方案：

一种秸秆发酵生产微生物饲料的方法，包括以下步骤：

(1)汽爆预处理：秸秆2-3cm，每次添加量200g，维持温度220℃，压力 2.2MPa，维持时间5min，瞬间泄压，使物料***，收集***后的物料，水洗至中性，4℃备用。

(2)碱预处理：称取步骤(1)所得汽爆后秸秆与2％NaOH溶液按料液比 1∶20混合，于高压蒸汽灭菌121℃、处理1小时，固体残渣水洗至中性，晾干后粉碎，过20目筛，4℃备用。

(3)由步骤(2)所得的小麦秸秆添加少量的酶进行预酶解，酶解体系为 200ml，葡聚糖添加量10％(w/v)，采用分批补料。预酶解在补料完毕后12- 24h结束，取样测试糖含量。

(4)将培养好植物乳酸菌、枯草芽孢杆菌、酿酒酵母菌、产朊假丝酵母菌、解淀粉芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌的菌悬液按照一定的比例混合接种到步骤(3) 所得的酶解液中，进行厌氧发酵，反应温度30-32℃，发酵时间3-5天，转速 170-220r/min，pH5～7。即可得固态流体饲料，通过烘干等方式就能得到固体饲料，进一步加工就可以得到有利于贮藏的生物饲料。

根据秸秆发酵生产生物饲料的方法，步骤(1)物料为小麦秸秆，秸秆含水量为20％-30％，***设备为5L中式蒸汽***反应罐。

根据秸秆发酵生产生物饲料的方法，步骤(2)中水洗所用水为去离子水。

根据秸秆发酵生产生物饲料的方法，步骤(3)酶为纤维素酶和β-葡萄糖苷酶的混合酶，比列为1∶1～2，纤维素酶添加量为10-15FPU/g(v/w)，酶为一次性加入，物料初始添加量为4％，后续每次补料3％，补料时间间隔分别为 8h、16h，糖含量测定通过高效液相色谱法进行测定。

根据秸秆发酵生产生物饲料的方法，步骤(4)混合菌中解淀粉芽孢杆菌：产朊假丝酵母菌：地衣芽孢杆菌：枯草芽孢杆菌：植物乳酸菌菌：酿酒酵母菌的体积比为0.5～1∶2～3∶0.5～1.5∶0.5～1.5∶2～3∶1～2，解淀粉芽孢杆菌、产朊假丝酵母菌、地衣芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、植物乳酸菌菌、酿酒酵母菌的浓度分别为(2～3)×10⁸个/ml、(4～5)×10⁸个/ml、(1～4)×10⁸个 /ml、(3～6)×10⁸个/ml、(4～6)×10⁸个/ml、(1～1.5)×10⁸个/ml。

本发明的的积极意义

1.本发明通过汽爆加碱预处理后，小麦秸秆纤维素的比表面积增加，木质素含量减少，半纤维素含量降低，使酶解时纤维素与酶的结合效率更大，预处理后经水洗降低了底物中抑制剂的含量，对底物中可被利用的糖进行了富集，从而增加了发酵体系中单糖的含量，有利于混合菌种在在发酵液中的生长。

2.本发明通过同步糖化发酵过程，预酶解产生的单糖以及在发酵过程中产生单糖都能及时的转化为产物，而且通过预酶解产生的糖又为混合菌株在发酵液中初期生长提供了必要的糖原，所以通过这种发酵过程产物的量最多。

3.本发明中培养基中养分充足，各种微生物能够迅速生长，在混合菌群生长的过程中会分泌有机酸、醇、醛、酯、维生素、抗生素、微量元素等多种有益物质，这些物质在培养液中又可以作为菌体生长的原材料，并且菌落的生长会产生大量的产物及副产物，这些产物及副产物中含有大量真蛋白，通过发酵产生的有机物有利于动物的消化吸收。

4.本发明有益菌群的的生长会产生乳酸、乙醇、醋酸等酸性物质，酸性物质的有利于改善私聊的手口型，提高采食率。

5.本发明秸秆原料来源广泛，产量丰富，一年四季随时可以生产，制备方法操作流程简单。

6.本发明生产的饲料，有机物含量丰富，营养价值高具有促进牲畜生长，增强牲畜抗病能力，减轻圈舍内粪便臭味，改善牲畜肉品质的作用。

附图说明

图1是秸秆发酵生产生物饲料的工艺流程图

具体实施方式

通过具体实施例对本发明的技术方案做进一步说明。

本发明关键在于比较未预处理、汽爆预处理、碱预处理和汽爆后碱预处理的物料在同步糖化共发酵后培养基中蛋白质的含量，所以，具体的实施方式主要区别是同步糖化发酵的原料的使用。具体方式实施如下

实施案例1

未处理的物料发酵

将未预处理的小麦秸秆剪切至2～3cm，通过粉碎机进行粉碎，通过20目筛选。

(2)未预处理物料进行预酶解，反应体积为200ml，葡聚糖添加量10％ (w/v)，采用分批补料的方式进行预酶解，初始添加量位4％，后续每次补料 3％，补料时间间隔分别为8h，16h，补料完毕后，预酶解12-24h。植物乳酸菌、枯草芽孢杆菌、酿酒酵母菌、产朊假丝酵母菌、解淀粉芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌的菌悬液按照一定的比例混合接种到酶解液中，进行厌氧发酵，反应温度 30-32℃，发酵时间3～5天，转速170～220r/min。即可得液态饲料，通过烘干等方式就能得到固体饲料，进一步加工又可以得到有利于贮藏的生物饲料。

实施案例2

将自然风干的小麦秸秆切割为长度小于2～3cm小段，按料液比为1∶20 (g：mL)加入2％NaOH溶液，混匀，于高压蒸汽灭菌锅中121℃、预处理1小时，固体残渣水洗至中性，风干后粉碎，过20目。

上述碱预处理物料进行预酶解，反应体积为200ml，葡聚糖负荷10％ (w/v)，采用分批补料的方式进行预酶解，初始添加量位4％，后续每次补料 3％，补料时间间隔分别为8h，16h，补料完毕后，预酶解12-24h。植物乳酸菌、枯草芽孢杆菌、酿酒酵母菌、产朊假丝酵母菌、解淀粉芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌的菌悬液按照一定的比例混合接种到酶解液中，进行厌氧发酵，反应温度 30-32℃，发酵时间3～5天，转速170-220r/min。即可得液态饲料，通过烘干等方式就能得到固体饲料，进一步加工又可以得到有利于贮藏的生物饲料。

实施案例3

将自然风干的秸秆2-3cm，每次添加量200g，维持温度220℃，压力 2.2MPa，维持时间5min，瞬间泄压，使物料***，收集***后的物料，固体残渣水洗至中性，风干后粉碎，过20目。

上述碱预处理物料进行预酶解，反应体积为200ml，葡聚糖负荷10％ (w/v)，采用分批补料的方式进行预酶解，初始添加量位4％，后续每次补料 3％，补料时间间隔分别为8h，16h，补料完毕后，预酶解12-24h。植物乳酸菌、枯草芽孢杆菌、酿酒酵母菌、产朊假丝酵母菌、解淀粉芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌的菌悬液按照一定的比例混合接种到酶解液中，进行厌氧发酵，反应温度 30-32℃，发酵时间3～5天，转速170～220r/min。即可得液态饲料，通过烘干等方式就能得到固体饲料，进一步加工又可以得到有利于贮藏的生物饲料。

实施案例4

自然风干的秸秆2-3cm，每次添加量200g，维持温度220℃，压力2.2MPa，维持时间5min，瞬间泄压，使物料***，收集***后的物料，固体残渣水洗至中性，风干。将汽爆后的物料按料液比为1∶20(g：mL)加入2％NaOH溶液，混匀，于高压蒸汽灭菌锅中121℃、预处理1小时，固体残渣水洗至中性，风干后粉碎，过20目。

上述汽爆加碱预处理物料进行预酶解，反应体积为200ml，葡聚糖负荷10％ (w/v)，采用分批补料的方式进行预酶解，初始添加量位4％，后续每次补料 3％，补料时间间隔分别为8h，16h，补料完毕后，预酶解12-24h。植物乳酸菌、枯草芽孢杆菌、酿酒酵母菌、产朊假丝酵母菌、解淀粉芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌的菌悬液按照一定的比例混合接种到酶解液中，进行厌氧发酵，反应温度30-32℃，发酵时间3～5天，转速170-220r/min。即可得液态饲料，通过烘干等方式就能得到固体饲料，进一步加工又可以得到有利于贮藏的生物饲料。

实施案例5

菌种的培养

植物乳酸菌的斜面培养基：牛肉膏10g、蛋白胨10g、酵母膏10g、葡萄糖 10g、吐温0.5ml、碳酸钙17g、溴甲酚绿0.1g、琼脂10～20g，pH约7.0。

植物乳酸菌液体培养基：其它配方与斜面培养基一样，不添加琼脂。2

将得到的菌株在斜面培养基上化线培养，进行分离纯化，培养温度30℃，去单菌落进行静置培养，时间12-24h。培养温度35-37℃，时间24-36h。

酿酒酵母菌斜面培养基：酵母提取物10g，蛋白陈20g，葡萄糖20g，加入15 琼脂粉定容至1L，pH约6.0

酿酒酵母液体培养基：其它配方与斜面培养基一样，不添加琼脂。

将得到的菌株在斜面培养基上化线培养，进行分离纯化，培养温度28- 35℃，时间12-24h。取单菌落进行摇床培养，培养温度28-35℃，转速170- 200r，时间12-24h。

产朊假丝酵母菌斜面培养基：明胶胨16g、胰蛋白胨10g、K₂SO₄10g、 MgCl21.4g琼脂15g溴化十六烷基三甲胺0.2g定容至1L，最终pH7.0。

产朊假丝酵母菌液体培养基：其它配方与斜面培养基一样，不添加琼脂。

培养方法同酿酒酵母。

解淀粉芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌斜面培养基：蛋白陈10g，牛肉膏5g，氯化钠5g，琼脂15g，葡萄糖20g，蒸馏水1000ml，最终pH7.0。

解淀粉芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌液体培养基：其它配方与斜面培养基一样，不添加琼脂。

实施案例6

糖含量的测定及发酵液中蛋白质的测定

(1)未预处理、碱预处理、汽爆预处理和汽爆加碱预处理的小麦秸秆的成分分析参照美国可再生能源实验室(NREL)的实验方法进行测定。

纤维素、木聚糖含量的测定方法：原料用72％硫酸在30℃下水解1小时，再加入84ml去离子水，在121℃下水解1小时，同时测定葡萄糖和木糖在高温稀酸环境下的回收率。水解液用0.22μm水相滤膜过滤，用高效液相色谱(HPLC)测定水解液中单糖含量，。D(+)-葡萄糖、D-(+)-木糖和L-(+)-阿拉伯糖作为混合标品，采用外标法进行定量分析。纤维素、木聚糖含量的计算公式：

其中：c_g、c_x分别表示水解液中葡萄糖、木糖浓度，单位g/L。生物质干重的单位g。

预酶解后的单糖含量同样通过高效液相色谱测定。

酸不溶性木质素和灰分含量的测定方法：取滤纸于105℃烘箱烘干至恒重，精确称量并记录滤纸重量。水解液残渣真空抽滤，抽滤后的残渣于105℃的烘箱中烘干至恒重，用马弗炉测定样品灰分。酸不溶性木质素含量的计算方法为：

其中：AIL％表示酸不溶性木质素的含量，m₁、m₂、m₃、m₄分别表示滤纸和固体的质量(g)、滤纸的质量(g)、灰分质量(g)和生物质干重(g)。

色谱柱条件如下：

色谱柱：Biorad Aminex HPX-87H色谱柱，配备相应的保护柱

进样量：20μL

流动相：5mM硫酸，用0.22μm水系膜过滤

流速：0.6ml/min

柱温：60℃

检测器类型：示差折光检测器

检测器温度：35℃

运行时间：13min

(2)蛋白质测定。发酵液每隔24h取样一次，将接入混合菌的一刻定为零时，之后取样时间为24h，48h，72h，96h，120h，148h，172h，196h。每次取样1ml样品离心取上清400μL，其中100μL用来测定糖分，其余用于测定蛋白含量。蛋白测定步骤如下：

A.完全解冻的蛋白标准品(5mg/ml)先混匀，再取10μL，稀释至250μL，使标准品的最终浓度为0.2mg/ml。标准品用0.9％氯NaCl或PBS稀释。

B. 5×G250染色液使用前颠倒3-5次混匀，取1ml5×G250染色液，加入4ml 双蒸水，婚约成1×G250染色液。

C.将标准品按0、2、4、6、8、12、16、20μL分别加到96孔板中，加PBS稀释液补足20μL。

D.将样品作适当稀释，加20μL到96孔板的样品孔中。

E.各孔加入200μL稀释后的1×G250染色液，室温放置3-5分钟。

F.用煤标配哟测定A595，根据标准曲线计算样品中蛋白含量。

此发明的研究目的在于提高饲料中蛋白质含量，关键点就在于检测各种处理中蛋白质的含量，样品中蛋白质含量是检测处理效果的重要标准。

以上实施例的说明只是用于帮助理解本发明的方法及其核心思想。应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也落入本发明权利要求的保护范围内。

Claims

1.一种秸秆发酵生产生物饲料的方法，包括以下步骤：

(1)汽爆预处理：秸秆2-3cm，每次添加量200g，维持温度220℃，压力2.2MPa，维持时间5min，瞬间泄压，使物料***，收集***后的物料，水洗至中性，4℃备用。

(2)碱预处理：称取步骤(1)所得汽爆后秸秆与2％NaOH溶液按料液比1∶20混合，于高压蒸汽灭菌121℃、处理1小时，固体残渣水洗至中性，晾干后粉碎，过20目筛，4℃备用。

(3)由步骤(2)所得的小麦秸秆添加少量的酶进行预酶解，酶解体系为200ml，葡聚糖添加量10％(w/v)，采用分批补料。预酶解在补料完毕后12-24h结束，取样测试糖含量。

(4)将培养好植物乳酸菌、枯草芽孢杆菌、酿酒酵母菌、产朊假丝酵母菌、解淀粉芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌的菌悬液按照一定的比例混合接种到步骤(3)所得的酶解液中，进行厌氧发酵，反应温度30-32℃，发酵时间3～5天，转速170-220r/min。即可得液态饲料，通过烘干等方式就能得到固体饲料，进一步加工又可以得到有利于贮藏的生物饲料。

2.根据权利要求1所述的一种秸秆发酵生产生物饲料的方法，其特征在于，秸秆含水量为20％-30％。，汽爆时，物料添加量为200g，压力2.2MPa，维持时间5min，瞬间泄压。碱处理时汽爆秸秆与2％NaOH溶液按1∶20混合，于高压蒸汽灭菌121℃、处理1小时。

3.根据权利要求1所述的一种秸秆发酵生产生物饲料的方法，其特征在于，汽爆和碱处理后的固体残渣水洗使用去离子水，水洗至中性，风干粉碎过20目，物料储存于4℃。

4.根据权利要求1所述的一种秸秆发酵生产生物饲料的方法，其特征在于，预酶解体系为200ml，葡聚糖添加量为10％(w/v)，采用分批补料发酵。分批补料酶比例，纤维素酶∶β-葡萄糖苷酶为1∶1-2，纤维素添加量为10-15FPU，初始物料添加量为4％，之后每次补加3％，补料时间间隔分别为8h、16h。预酶解时间为12-24h。

5.根据权利要求1所述的一种秸秆发酵生产生物饲料的方法，其特征在于，混合菌的比例为解淀粉芽孢杆菌∶产朊假丝酵母菌∶地衣芽孢杆菌∶枯草芽孢杆菌∶植物乳酸菌菌∶酿酒酵母菌的体积比为0.5～1∶2～3∶0.5～1.5∶0.5～1.5∶2～3∶1～2，解淀粉芽孢杆菌、产朊假丝酵母菌、地衣芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、植物乳酸菌菌、酿酒酵母菌的浓度分别为(2～3)×10⁸个/ml、(4～5)×10⁸个/ml、(1～4)×10⁸个/ml、(3～6)×10⁸个/ml、(4～6)×10⁸个/ml、(1～1.5)×10⁸个/ml。同步糖化发酵的条件为厌氧发酵，反应温度30-32℃，发酵时间3～5天，转速170-220r/min，pH5～7。