CN114591862B - 一种提高玉米秸秆黄贮品质的犏牛瘤胃自然共培养物及其应用 - Google Patents

一种提高玉米秸秆黄贮品质的犏牛瘤胃自然共培养物及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明属于微生物益生菌应用技术领域，具体涉及一种提高玉米秸秆黄贮品质的犏牛瘤胃的新美鞭菌和甲烷短杆菌的自然共培养物(Methanobrevibacterolleyae)Cattle‑YakTZ1，所述的菌剂可以用于制备玉米秸秆黄贮饲料，显著地提升了玉米秸秆的黄贮感官品质、营养成份和粗饲料营养价值，具有极为广阔的应用前景。

Description

一种提高玉米秸秆黄贮品质的犏牛瘤胃自然共培养物及其 应用
技术领域
本发明涉及生物技术可再生能源领域，具体为一种提高玉米秸秆黄贮品质的犏牛瘤胃自然共培养物及其应用。
背景技术
我国牦牛占世界总牦牛数的90％以上，约2000万头。黄牛是我国本地品种，具有耐粗饲、适应性强等优点。犏牛是牦牛的衍生牛种，是牦牛种群不断创新结出的果实。犏牛是牦牛与黄牛或改良牛种间远缘杂交的F1代杂种，公黄牛与母牦牛杂交，其杂种称黄犏牛，公牦牛与母黄牛杂交，其杂种称牦犏牛。无论黄犏牛、牦犏牛雄性均不育，其生长发育、产肉、役力等生产性能上均明显优于牦牛亲代，在高海拔地区适应生态环境的能力高于黄牛亲代，对提高牧区人民生活水平、繁荣牧区经济，保持三江源区生态平衡具有十分重要意义。调查发现截止至2012 年青海省犏牛占牛总数的3.5％，不少于12万头，且犏牛生长发育快、抗病力强，一般不易得病，适于高山放牧，且犏牛肉、役兼用，产奶性能好，奶质量高，表现出明显的杂种优势。同样饲养条件下，与黄牛和牦牛相比，在体重、体长、体高等各个方面，犏牛均表现出突出的杂种优势。同一地区生长的黄牛、犏牛和牦牛的饲料转化率、肉品质、乳品质不同，造成这种差异的原因除了遗传差异外，我们也推测与瘤胃微生物之间关系紧密。牦牛和犏牛瘤胃液真菌区系遗传距离更为接近，与黄牛瘤胃液真菌差异较大。犏牛适应高寒生态条件，耐粗饲、耐严寒、耐低氧的恶劣自然环境。犏牛瘤胃内栖息着独特的，复杂多样，大量的微生物群落协同高效降解野牧草为犏牛提供生存能量和营养物质。研究表明反刍动物瘤胃内的厌氧真菌能产生一系列高活性降解植物细胞壁的木质纤维素降解酶，包括纤维素酶、半纤维素酶 (主要是木聚糖酶)、漆酶和酯酶等，在瘤胃木质纤维素的降解中发挥了重要作用。厌氧真菌可以利用和降解的底物包括可溶性糖，以及纤维素、木聚糖、葡聚糖等复杂的结构性多糖和贮存性多糖等。体外降解实验表明甲烷菌可以利用厌氧真菌的代谢产物，与厌氧真菌形成稳定的共培养物，这个过程中促进了厌氧真菌和甲烷菌的生长，同时显著提高了厌氧真菌对木质纤维素底物的降解和利用，同时产生更高活性的木质纤维素降解酶，以及大量甲烷和乙酸作为主要发酵终产物。
玉米是世界主要农作物之一。玉米穗收取之后，剩下的玉米秸秆作为农业作物的副产品，具有很大的饲喂价值，作为食草家畜的粗饲料资源，特别在反刍动物方面应用极其广泛。我国作为农业大国，玉米秸秆分布广、数量多，每年的玉米秸秆产量高达2亿吨以上，但有很大一部分的秸秆都被焚烧处理，不仅浪费了大量的资源，而且造成了严重的空气污染。玉米秸秆营养成份丰富，有机物质含量平均为15％，是一种非常有价值的可再生资源。但玉米秸秆也是一种天然的纤维劣质饲料，其中的有机物质直接当做饲料的营养价值很低。组成玉米秸秆细胞壁的主要成分为纤维素、半纤维素、木质素和果胶多糖，其中粗纤维占据了干物质的75.4％，也有较少量的粗蛋白质(6％—7％)和粗脂肪(1％—2％)，但品质较差。相关研究表明，玉米秸秆中的纤维素、半纤维素被木质素包裹，其中部分纤维素、半纤维素与木质素以共价形式结合，形成紧密的结构限制了玉米秸秆的利用率。经过对秸秆进行适当的物理、化学、生物技术处理，其营养价值和适口性会得到很大的提升。目前，处理秸秆饲料的方法包括：青贮、黄贮、氨化、热喷。在现代经济发展的背景下，如何充分利用农作物秸秆，如何将资源效益转化为经济效益，具有十分重要的社会、经济和生态意义。玉米秸秆的综合利用具有广阔的前景。玉米秸秆的可溶性碳水化合物和纤维物质含量很高，可以为微生物和酶提供充足的底物，所以采用青贮、黄贮或酶预处理等生物法处理秸秆是一种很好的选择。
黄贮，将一些干黄的秸秆、麦草等原料(水分含量一般在10％—30％)通过调节其水分含量，使其一般达到青贮的水分含量(65％—75％)，从而通过乳酸菌发酵产生的乳酸、乙酸等来降低贮存过程中的pH值，从而达到延长贮存期的目的。在奶牛饲养中可以用黄贮玉米秸秆代替一部分青贮玉米秸秆，对奶牛的产奶量无显著影响，但降低了饲养成本，解决了因气候、季节等因素导致的青贮饲料短缺的问题。国内外学者试图通过添加尿素、酶制剂、蔗糖、乳酸菌、亚硝酸钠、甲酸、丙酸等生物、化学添加剂等加块酸化进程、避免不良发酵，获得高质量青贮或黄贮饲料的发酵品质。研究发现，在提高发酵品质方面纤维素酶和木聚糖酶效果优于其他酶制剂；在营养品质方面纤维素酶、木聚糖酶和β-葡聚糖酶的效果优于其他酶制剂。纤维素酶、木聚糖酶和β-葡聚糖酶3种酶制剂更加适合作为全株玉米青贮或黄贮的添加剂。
采用从放牧犏牛瘤胃液中分离出的自然共生的新美鞭菌和甲烷短杆菌的自然共培养物的发酵液预处理玉米秸秆后再进行黄贮，是一个国内外首创的、新颖的、有效的手段。本发明意外地从犏牛瘤胃中分离出了一种新美鞭菌和甲烷短杆菌的自然共培养物(Methanobrevibacter olleyae)Cattle-YakTZ1，并使用此共培养物以玉米秸秆为底物的发酵液对干黄玉米秸秆进行预处理，然后再进行玉米秸秆黄贮，实验结果表明：经过所述的新美鞭菌和甲烷短杆菌的自然共培养物(Methanobrevibacter olleyae)Cattle-YakTZ1发酵液的预处理，能够明显提高玉米秸秆的黄贮感官品质；降低了玉米秸秆的中性洗涤纤维素(NDF)和酸性洗涤纤维素(ADF)含量；快速降低了玉米秸秆在黄贮发酵中的pH值；显著地提高了乳酸的含量，乳酸/乙酸含量比明显高于其他组，以同型乳酸发酵为；发酵后期丁酸含量低，说明腐败菌、霉菌及酪酸菌的繁殖活动受到限制；显著地提高了乙醇的含量；氨态氮/总氮含量比下降，饲料蛋白转化成氨氮的量较少；显著地提高了粗蛋白的含量。即：显著提高了玉米秸秆的黄贮感官品质、营养成份和粗饲料营养价值。
发明内容
本发明的首要目的是提供一种提高玉米秸秆黄贮品质的犏牛瘤胃的新美鞭菌和甲烷短杆菌的自然共培养物(Methanobrevibacter olleyae)Cattle-YakTZ1，所述的新美鞭菌和甲烷短杆菌的自然共培养物(Methanobrevibacter olleyae)Cattle-YakTZ1于2021年11月25日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCCNo.23971，保藏地址是北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，邮编为100101；电话为：0 10-64807355；传真为：010-64807288。
所述的新美鞭菌和甲烷短杆菌的自然共培养物(Methanobrevibacter olleyae)Cattle-YakTZ1中的新美鞭菌的IT1S序列如SEQ ID No.1所示；所述的新美鞭菌和甲烷短杆菌的自然共培养物(Methanobrevibacter olleyae)Cattle-YakTZ1中的甲烷短杆菌的IT1S序列如SEQ ID No.2所示。
本发明的第二目的是提供所述的新美鞭菌和甲烷短杆菌的自然共培养物(Methanobrevibacter olleyae)Cattle-YakTZ1的培养方法，包括将所述的新美鞭菌和甲烷短杆菌的自然共培养物(Methanobrevibacter olleyae)Cattle-YakTZ1在厌氧环境中进行培养的步骤。
本发明的第三目的是提供所述的新美鞭菌和甲烷短杆菌的自然共培养物(Methanobrevibacter olleyae)Cattle-YakTZ1的发酵液。
本发明的第四目的是提供一种农作物秸秆黄贮饲料的制备方法，包括在黄贮工程中添加所述的新美鞭菌和甲烷短杆菌的自然共培养物(Methanobrevibacter olleyae)Cattle-YakTZ1发酵液的步骤。
本发明的第五目的是提供一种黄贮菌剂，包括所述的新美鞭菌和甲烷短杆菌的自然共培养物(Methanobrevibacter olleyae)Cattle-YakTZ1菌体。
本发明的第六目的是提供一种黄贮饲料添加剂，所述的黄贮饲料添加剂的活性成分为所述的新美鞭菌和甲烷短杆菌的自然共培养物(Methanobrevibacter olleyae)Cattle-YakTZ1。
优选的，所述的黄贮饲料添加剂为玉米秸秆黄贮添加剂。
本发明的第七目的是提供一种黄贮饲料，所述的黄贮饲料中含有权利要求6所述的黄贮饲料添加剂。
本发明的第八目的是提供所述的新美鞭菌和甲烷短杆菌的自然共培养物(Methanobrevibacter olleyae)Cattle-YakTZ1在制备黄贮饲料添加剂中的应用。
本发明的第九目的是提供所述的新美鞭菌和甲烷短杆菌的自然共培养物(Methanobrevibacter olleyae)Cattle-YakTZ1在制备黄贮饲料中的应用。
本发明的有益效果是：本发明首先提供了一种新美鞭菌和甲烷短杆菌的自然共培养物 (Methanobrevibacter olleyae)Cattle-YakTZ1菌剂的发酵液，所述的菌剂发酵液可以用于制备玉米秸秆黄贮饲料。所述的菌剂发酵液用于制备黄贮饲料的优势是：(1)明显提高了玉米秸秆的黄贮感官品质；(2)降低了玉米秸秆的中性洗涤纤维素(NDF)和酸性洗涤纤维素(ADF) 含量；(3)快速降低了玉米秸秆在黄贮发酵中的pH值；(4)显著提高了乳酸的含量，乳酸/乙酸含量比明显高于其它2组，以同型乳酸发酵为主；(5)发酵后期丁酸含量很低，说明腐败菌、霉菌及酪酸菌的繁殖活动受到限制；(6)显著提高了乙醇的含量；(7)氨态氮/总氮含量比最低，表明饲料蛋白转化成氨氮的量较少；(8)显著提高了粗蛋白的含量，黄贮饲料营养价值高于其它2组。即就是说，本发明所述的新美鞭菌和甲烷短杆菌的自然共培养物(Methanobrevibacter olleyae)Cattle-YakTZ1对干黄玉米秸秆进行预处理后再接种普通青黄贮菌剂进行黄贮发酵显著地提升了玉米秸秆的黄贮感官品质、营养成份和粗饲料营养价值，具有极为广阔的应用前景。
附图说明
图1不同预处理组黄贮发酵过程中秸秆的感官品质变化
(a.实验组黄贮30d；b.空白组黄贮30d；c.对照组黄贮30d；d.实验组黄贮45d；e.空白组黄贮45d；f.对照组黄贮45d)
图2发酵过程中干物质含量动态变化
图3发酵过程中中性洗涤纤维素动态变化
图4发酵过程中酸性洗涤纤维素动态变化
图5发酵过程中pH动态变化
图6发酵过程中乳酸动态变化
图7发酵过程中乙酸动态变化
图8发酵过程中乙醇动态变化
图9发酵过程中氨态氮/总氮动态变化
图10发酵过程中粗蛋白含量的动态变化
具体实施方式
需要注意的是，这里所使用的术语仅是为了描述具体实施方式，而非意图限制根据本发明的示例性实施方式。如在这里所使用的，除非上下文另外明确指出，否则单数形式也意图包括复数形式，此外，还应当理解的是，当在本说明书中使用术语“包含”和/或“包括”时，其指明存在特征、步骤、操作和/或它们的组合。
结合具体实例对本发明作进一步的说明，以下实例仅是为了解释本发明，并不对其内容进行限定。如果实施例中未注明的实验具体条件，通常按照常规条件，或按照试剂公司所推荐的条件；下述实施例中所用的试剂、耗材等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
本发明中，青贮是将收割的鲜(青)秸秆粉碎后直接窖贮、装袋或打捆包裹贮藏的一种技术。青贮料经压实密封，在适宜的湿度条件下，自身所含有的或添加的微生物厌氧发酵，使贮料内部的pH降到4.5左右。此时，大部分微生物都会停止繁殖，最后乳酸菌也被自身产生的乳酸所控制而停止生长，从而达到青贮的目的。由于青贮要求秸秆含水率在60％～70％以上，含水率过低时便不能作业，因此受到时间上的限制。
本发明中，黄贮是利用己变干(黄)秸秆做原料，经机械揉搓粉碎后，加适量水和生物菌剂，压捆以后再装袋贮存的一种技术。黄贮加入的高效菌剂的发酵液，在适宜的厌氧环境下，将部分的纤维素、半纤维素，甚至一些木质素分解，并转化为葡萄糖、木糖等糖类。糖类经有机酸发酵转化为乳酸、乙酸和丙酸，并抑制丁酸菌和霉菌等有害菌的繁殖，最后达到与青贮同样的贮存效果。
实施例一、新美鞭菌和甲烷短杆菌的自然共培养物(Methanobrevibacterolleyae) Cattle-YakTZ1菌剂的制备
将新美鞭菌和甲烷短杆菌的自然共培养物(Methanobrevibacter olleyae)Cattle-YakTZ1 菌液以10％(v/v)接种量接种到液体厌氧培养基中，加入1％(w/v)干燥粉碎的玉米秸秆作为底物，同时加入复合抗生素，置39℃厌氧培养72h即得到高活力菌剂。
厌氧培养基配方：酵母膏1.0g，NaHCO35.0g，刃天青(1.0g/L)1mL，L-半胱氨酸盐酸盐 1.7g，盐溶液I 82.5mL，盐溶液II 16.5mL，蒸馏水定容至1000mL。
盐溶液I包括NaCl 6g，(NH4)2SO4 3g，KH2PO4 3g，CaCl2·2H2O 0.4g，MgSO4·2H2O0.6g，蒸馏水定容至1000mL。
盐溶液II包括4g K2HPO4，蒸馏水定容至1000mL。
加入不同的粗饲料底物后除氧并充入二氧化碳。高温高压灭菌。
作为优选，复合抗生素为青霉素钠和硫酸链霉素，浓度分别1600IU/mL和2000IU/mL。
实施例二、新美鞭菌和甲烷短杆菌的自然共培养物(Methanobrevibacterolleyae) Cattle-YakTZ1的发酵液预处理玉米秸秆后再接种青黄贮菌剂进行黄贮。
玉米秸秆：取自甘肃省定西市，收集时间2020年12月冬季，收集时含水量5.25％，属于干黄状态，粉碎至0.5-1cm备用。
放牧犏牛瘤胃新美鞭菌和甲烷短杆菌的自然共培养物(Methanobrevibacterolleyae) Cattle-YakTZ1发酵液：将50mL新美鞭菌和甲烷短杆菌的自然共培养物(Methanobrevibacter olleyae)Cattle-YakTZ1接种至含有粉碎风干的玉米秸秆为底物的450mL厌氧真菌液体培养基的厌氧瓶中培养72h后收集发酵液，并将发酵液于5000r/min离心10min后获取上清液备用。
商品木聚糖酶液：来自白银赛诺生物科技有限公司，为粉末状木聚糖酶，酶活性为60万 u/g。将商品木聚糖酶溶于蒸馏水中溶解至饱和后，离心弃沉淀取木聚糖酶上清液备用。
黄贮菌剂：普通常用的乳酸杆菌草料青、黄贮发酵剂。在1000mL水中加入1g菌种粉末， 10g红糖，培养20h后备用。
黄贮发酵的预处理实验设计如下表1：
表1黄贮发酵预处理实验设计
Figure BDA0003562176270000061
如表1所示，将干黄玉米秸秆分为3个预处理组，空白组添加蒸馏水至水分含量在65.48％，对照组添加饱和木聚糖酶液进行预处理至水分含量在64.72％，实验组添加犏牛瘤胃新美鞭菌和甲烷短杆菌的自然共培养物(Methanobrevibacter olleyae)Cattle-YakTZ1进行预处理至水分含量在65.05％。以上3组分别预处理玉米秸秆48h后分别装入发酵罐中，分别接种普通青黄贮菌剂后密封隔氧放置在室温环境下(25℃左右)进行固态发酵。每个处理组进行 3个平行试验。分别于15d、30d和45d取出相应的发酵样品，然后从感官品质、木质纤维素组份、发酵特性和营养成份等各方面对玉米秸秆的黄贮品质进行分析测定，来综合评定采用犏牛瘤胃新美鞭菌和甲烷短杆菌的自然共培养物(Methanobrevibacter olleyae)Cattle-YakTZ1 降解玉米秸秆所产发酵液预处理干黄玉米秸秆后再进行玉米秸秆黄贮的发酵品质。
实施例三、玉米秸秆黄贮品质的分析测定
1.玉米秸秆黄贮感官评定
开封后，先按照德国农业协会的青黄贮质量评分标准(即从气味、结构、色泽三个维度对青贮饲料进行打分评定)对开封后的玉米秸秆黄贮样品进行感官品质评定，评分标准如表 2所示。
表2黄贮感官评定标准
Figure BDA0003562176270000071
2.玉米秸秆木质纤维素分析
2.1干物质(DM)含量测定
取适量样品用粉碎机进行粉碎，过40目筛，将过筛的样品放入干燥坩埚中105℃烘干4h 恒重，放入干燥器中冷却至室温。
Figure BDA0003562176270000072
M1—105℃烘干前试样及称重皿重
M2—105℃烘干后试样及称重皿重
M0—已恒重的称样皿重
2.2中性洗涤纤维素(NDF)的测定
取适量样品用粉碎机进行粉碎，过40目筛，将过筛的样品放入干燥坩埚中105℃烘干4h 恒重，放入干燥器中冷却至室温。将处理好的样品放入样品袋标记后丙酮浸泡20min，放入通风处10min，让残留的丙酮挥发。
将浸泡过的样品放入阿尔法F6800型全自动纤维测定仪中，打开中性洗涤纤维素程序；待程序结束后放入干燥坩埚中105℃烘干4h恒重，放入干燥器中冷却至室温。
Figure BDA0003562176270000081
M3—干燥后样品+滤袋的重量
M2—样品的初始重量
M1—滤袋的重量
2.3酸性洗涤纤维素(ADF)的测定
取适量样品用粉碎机进行粉碎，过40目筛，将过筛的样品放入干燥坩埚中105℃烘干4h 恒重，放入干燥器中冷却至室温。将处理好的样品放入样品袋标记后丙酮浸泡20min，放入通风处10min，让残留的丙酮挥发。
将浸泡过的样品放入阿尔法F6800型全自动纤维测定仪中，打开酸性洗涤纤维素程序；待程序结束后放入干燥坩埚中105℃烘干4h恒重，放入干燥器中冷却至室温。
Figure BDA0003562176270000082
M3—干燥后样品+滤袋的重量
M2—样品的初始重量
M1—滤袋的重量
3.玉米秸秆发酵特性和营养成份测定
3.1 pH值测定
取50g样品按照1:9的比例进行打浆，然后四层纱布过滤，3900r/min离心10min，抽滤后取上清液，用pH计测出对应液体的pH值。
3.2乳酸、乙酸、丁酸含量测定
精密称取乳酸、乙酸、丁酸色谱标准品(纯度不低于99.5％)用水稀释并定容至100mL 制成混合标准储备液，4℃保存备用，将储备液用蒸馏水稀释配制成5、50、100、150、300、 500mg/L系列混合标准工作也，经0.33μm孔膜过滤后待上机分析，吸取200μL H3PO4溶于 1000mL蒸馏水中配制成有机酸提取液代用，取1mLH3PO4用蒸馏水定容至1000mL配制成色谱流动相，经0.33μm孔膜过滤后待用。
色谱柱：Phenomenex MARS MOA(300mm*7.8mm，10μm，8％交联度)，配同系50mm 保护柱，流动相0.1％H3PO4溶液(v/v)，流速0.60mL/min，色谱柱温度57℃，示差检测器温度30℃，响应时间4s，进样量20μL。
取50g样品按照1:9的比例进行打浆，然后四层纱布过滤，16000r/min离心10min，经 0.33μm孔膜过滤后待上机进样，启动程序。采用峰面积外标法计算目标物的含量。
3.3乙醇(EA)含量测定
准确称取样品10g加入100mL蒸馏水进行匀浆，8000g、25℃离心10min，取上清液备用；根据微量法测定乙醇含量(上海原鑫生物微量法测定乙醇含量试剂盒)说明书，开始试验前将6mL试剂三加入试剂二中充分溶解待用。
吸取试剂一100μL、试剂二50μL、试剂四10μL、上清液40μL混匀后记录450nm下初始吸光值A1，和37℃避光孵育10min后的吸光度值A2，△A＝A2-A1。
标准条件下测定回归方程为y＝0.0256x+0.0055R2＝0.9991
x为乙醇含量(μmol/mL)，y为吸光度值差△A
Figure BDA0003562176270000091
3.4氨态氮含量测定
准确移去氨态氮标准溶液1、2、4、8、16和32mg/100mL各40μL，加入到预先标好的玻璃试管中，各管不加40μL甲醇混匀，加入2.5mL苯酚显色剂混匀，加入2.0mL次氯酸钠溶液混匀，在37℃下水浴10min，取出后室温放置10min，用于紫外分光光独具波长650nm 处，以实际空白为残币，测量其吸光度值。以氨态氮浓度(mg/100mL)为横坐标，相应吸光度值为纵坐标，绘制标准曲线，简历先行拟合回归方程。
取50g样品按照1:9的比例进行打浆，然后四层纱布过滤，3900r/min离心10min，抽滤后取上清液备用。吸取备用液80μL加入到玻璃试管中，加入2.5mL苯酚显色剂混匀，加入2.0mL次录酸钠溶液混匀，在37℃下水浴保存10min，取出后室温下放置10min，与紫外分光光度计650nm处，以试剂空白为参比，测量其吸光度值。
氨态氮浓度(mg/100mL)＝C1-C0
C1—标准曲线上查得的氨态氮浓度，单位为mg/100mL
C0—空白实验查得的氨态氮浓度,单位为mg/100mL
3.5粗蛋白含量测定
消化：3g硫酸钾、0.2g硫酸铜、0.5g样品、10mL浓硫酸、漏斗放于石墨消解仪中，记录消煮总体积V，同时做消化空白试验样品(3g硫酸钾、0.2g硫酸铜、10mL浓硫酸)，设定消解温度与时间：180℃/30min—250℃/3min—320℃/30min—400℃/30min，若没有消化好，再400℃消化40min—1h，直到消解到蓝绿色为止，并记录消煮后的消煮液体积V’。
将已消解的消解管放置在蒸馏仪上，同时接一个锥形瓶。设置自动参数，稀释水量20mL，蒸馏时间5min，淋洗水量20mL，空蒸时：硼酸、氢氧化钠调为10mL，加样时：硼酸20mL，氢氧化钠40mL。250mL锥形瓶中加入2—3滴混合指示剂(开始和硼酸先变红，后吸收氨之后变蓝，若颜色不正常，则仪器不正常。)，锥形瓶中的液体用0.05mol/L的HCL滴定至无色，记录消耗HCL的体积V2/V1。
Figure BDA0003562176270000101
V2—滴定试样所消耗盐酸标准滴定溶液的体积
V1—滴定空白所消耗盐酸标准滴定溶液的体积
m—试样质量
V—试样消煮液总体积
V’—蒸馏容消煮液体积
4.数据分析
基础数据经Excel 2010初步整理并制作图表，利用SPSS 20.0软件对试验数据进行统计分析，采用单因子ANOVO模型处理，并用Duncan方法对数据进行多重比较分析，以平均值±标准差表示测定结果，P＜0.05代表数据存在显著性差异性。
5.结果分析
5.1黄贮感官评定结果
表3为发酵过程中感官评定的结果。由表3可知，实验组在整个发酵周期内，感官评定结果均为“优等”，气味均表现为有微弱的丁酸臭味，有较强的酸味、芳香味弱，秸秆茎叶结构保持良好，与原料颜色相似。对照组发酵0d—15d时，感官评定结果均为“优等”，发酵30d时为“良好”，差异主要体现在玉米秸秆茎叶结构保持较差，略有变色，微有丁酸臭味；发酵45d时为“较差”，黄贮表面微有发霉现象，丁酸喂较重。空白组发酵0d—15d时，感官评定结果均为“良好”，带有微弱的丁酸臭味，发酵30d时为“较差”，黄贮表面出现发霉现象，带有严重的丁酸味，发酵45d时为“腐败”，表面已严重发霉，如图1所示，带有强烈的霉味，严重污染，黄贮玉米秸秆呈墨绿色。
表3玉米秸秆黄贮感官评定结果
Figure BDA0003562176270000111
5.2黄贮发酵过程中木质纤维素的测定
5.2.1原料营养成份
表4玉米秸秆原料营养成份
Figure BDA0003562176270000112
5.2.2干物质(DM)含量动态变化
图2为玉米秸秆固态发酵过程中干物质(DM)的动态变化，可以看出：随着发酵时间的延长，空白组DM含量总体呈下降趋势，对照组DM含量呈上升后平稳趋势，在30d和45d 时DM含量差异不显著(P>0.05)，实验组DM含量呈逐渐上升趋势，其中实验组黄贮30d 时DM含量显著高于其他组(P<0.05)，空白组黄贮45d时DM含量相对较低。
5.2.3中性洗涤纤维素(NDF)含量动态变化
图3为玉米秸秆固态发酵过程中中性洗涤纤维(NDF)含量的动态变化，可以看出：随着发酵时间的延长，空白组NDF含量呈逐渐增高的趋势，对照组与实验组NDF含量总体呈下降趋势。其中对照组在30d和45d时NDF含量差异不显著(P>0.05)，空白组30d和45d 时NDF含量差异不显著(P>0.05)。实验组在发酵45d时NDF含量相对其他组较低。
5.2.4酸性洗涤纤维素(ADF)含量动态变化
图4为玉米秸秆固态发酵过程中酸性洗涤纤维(ADF)含量的动态变化，可以看出随着发酵时间的延长，空白组ADF含量总体呈先降低后增加的趋势，且发酵15d和30d时差异不显著(P>0.05)，对照组与实验组ADF含量总体均呈减小趋势，且对照组发酵30d和45d时差异不显著(P>0.05)，其中实验组黄贮45d时ADF含量显著低于其他组(P<0.05)。
5.3黄贮发酵过程中发酵特性和营养成份测定
5.3.1 pH值动态变化
图5为玉米秸秆固态发酵过程中pH值的动态变化，可以看出：随着发酵时间的延长，空白组pH值总体呈增高趋势，且在45d时pH值显著高于其他处理组(P<0.05),对照组与实验组pH值总体呈先下降后上升趋势，其中对照组在黄贮15d和30d时差异不显著(P>0.05)，实验组在30d时的pH值在整个发酵周期内显著低于其他处理组(P<0.05)。
5.3.2乳酸(LA)含量动态变化
图6为玉米秸秆固态发酵过程中乳酸(LA)含量的动态变化，可以看出：随着发酵时间的延长，空白组呈先上升后下降的趋势，在30d时空白组LA含量达到最高，对照组与实验组的LA含量均呈逐渐上升的趋势，在45d时乳酸含量达到最高，其中实验组在45d时LA 含量显著高于其他处理组(P<0.05)。
5.3.3乙酸(AA)含量动态变化
图7为玉米秸秆固态发酵过程中乙酸(AA)含量的动态变化，可以看出：随着发酵时间的延长，空白组和对照组的AA含量随发酵时间的延长呈逐渐上升趋势，实验组的AA含量呈先下降后上升趋势，在30d时达到最低，其中30d时对照组与实验组AA含量差异不显著 (P>0.05)，空白组在45d时AA含量显著高于其他组(P<0.05)。
5.3.4乳酸/乙酸比值与丁酸含量动态变化
表5玉米秸秆黄贮发酵中乳酸/乙酸比值与丁酸含量的动态变化
Figure BDA0003562176270000121
Figure BDA0003562176270000131
5.3.5乙醇(EA)含量动态变化
图8为玉米秸秆固态发酵过程中乙醇(EA)含量的动态变化，可以看出：随着发酵时间的延长，空白组和对照组的EA含量随发酵时间的延长呈先上升后下降趋势，在30d时达到最高，实验组的EA含量呈逐渐下降趋势，在45d时达到最低。
5.3.6氨态氮/总氮(AN/TN)含量动态变化
图9为玉米秸秆固态发酵过程中氨态氮/总氮(AN/TN)比值的动态变化。由图9可以看出，随着发酵时间的延长，空白组的AN/TN比值总体呈上升趋势，其中空白组在发酵45d时AN/TN比值显著高于其他组(P<0.05)，对照组与实验组的AN/TN比值总体呈逐渐上升趋势，在黄贮15d时空白组与对照组的AN/TN比值差异不显著(P>0.05)。
5.3.7粗蛋白(CP)含量动态变化
图10为玉米秸秆固态发酵过程中粗蛋白(CP)的动态变化，可以看出：随着发酵时间的延长，空白组CP含量呈逐渐降低的趋势，对照组在15—30d时呈降低趋势，在30d和45d时CP含量差异不显著(P>0.05)。实验组CP含量呈逐渐降低趋势，在在30d和45d时CP 含量差异不显著(P>0.05)，且实验组在30d和45d时CP含量显著高于空白组和对照组 (P<0.05)。
实验结果统计结果如表6所示。
表6玉米秸秆黄贮45d的品质分析测定
Figure BDA0003562176270000132
Figure BDA0003562176270000141
Figure BDA0003562176270000151
综上所述，本发明经添加犏牛瘤胃新美鞭菌和甲烷短杆菌的自然共培养物(Methanobrevibacter olleyae)Cattle-YakTZ1的高效发酵液对玉米秸秆预处理48h后，再接种普通黄贮菌剂进行玉米秸秆黄贮发酵45d(实验组)，其玉米秸秆的黄贮品质不但显著地优于直接接种普通黄贮菌剂进行玉米秸秆黄贮发酵45d的黄贮品质(空白组)，而且也优于添加商品饲用木聚糖酶对玉米秸秆预处理48h后，再接种普通黄贮菌剂进行玉米秸秆黄贮发酵 45d的黄贮品质(对照组)。其显著的优势主要表现在以下8个方面：1.明显地提高了玉米秸秆的黄贮感官品质；2.降低了玉米秸秆的中性洗涤纤维素(NDF)和酸性洗涤纤维素(ADF) 含量；3.快速降低了玉米秸秆在黄贮发酵中的pH值；4.显著提高了乳酸的含量，乳酸/乙酸含量比明显高于其它2组，以同型乳酸发酵为主；5.发酵后期丁酸含量很低，说明腐败菌、霉菌及酪酸菌的繁殖活动受到限制；6.显著提高了乙醇的含量；7.氨态氮/总氮含量比最低，表明饲料蛋白转化成氨氮的量较少；8.显著提高了粗蛋白的含量，黄贮饲料营养价值高于其它2组。综合得出结论：本发明专利所述的犏牛瘤胃新美鞭菌和甲烷短杆菌的自然共培养物 (Methanobrevibacter olleyae)Cattle-YakTZ1对干黄玉米秸秆进行预处理后再接种普通青黄贮菌剂进行黄贮发酵显著地提升了玉米秸秆的黄贮感官品质、营养成份和粗饲料营养价值，具有极为广阔的应用前景。
序列表
<110> 甘肃省科学院生物研究所
<120> 一种提高玉米秸秆黄贮品质的犏牛瘤胃自然共培养物及其应用
<160> 2
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 395
<212> DNA
<213> 犏牛(bull)
<400> 1
cttggtcatt tagaggaagt aaaagtcgta acaaggtttc cgtaggtgaa cctgcggaag 60
gatcattaaa aaatatcgct cgattgagag tgatttaata atcatcctac cctttgtgaa 120
tttgttgttt gtaataattt tttttgattt taaaaaaaaa ttatttatgg ttttgtctat 180
ccctaaaatt ggtttgttgt gaaatgaatc aaatttaggg aataggcttt cataaataag 240
ttttttttaa agtcttaaaa gaccttcttt aaaattaaac ttttgtattc atttgtctaa 300
atttttttta aaataattta aaaacaactt ttgacaatgg atctcttggt tctcgcaacg 360
atgaagaacg cagcaaaatg cgataagtaa ttcat 395
<210> 2
<211> 1270
<212> DNA
<213> 犏牛(bull)
<400> 2
tgctcagtaa cacgtggata acctaccctt aggactggga taaccctggg aaactggggc 60
taataccgga tagatgattt ttttcctgta atggtgtttt gtttaaatgt ttttttttcg 120
cctaaggatg ggtctgcggc agattaggta gttggttggg taatggctta ccaagcctat 180
gatctgtacg ggttgtgaga gcaagagccc ggagatggaa cctgagacaa ggttccaggc 240
cctacggggc gcagcaggcg cgaaacctcc gcaatgtgag aaatcgcgac ggggggatcc 300
caagtgccat tcttaacggg atggcttttc ttaagtgtaa aaagcttttg gaataagagc 360
tgggcaagac cggtgccagc cgccgcggta acaccggcag ctctagtggt agctgttttt 420
attgggccta aagcgttcgt agccggtttg gtaagtcact ggtgaaatcc tgtagcttaa 480
ctatgggaat tgctggtgat actgttgaac ttgaggtcgg gagaggttag cggtactccc 540
agggtagagg tgaaattctg taatcctggg aggaccacct gtggcgaagg cggctaactg 600
gaacgaacct gacggtgagg gacgaaagct aggggcgcga accggattag atacccgggt 660
agtcctagcc gtaaacgatg cggacttggt gttgggatgg ctttgagccg ctccggtgcc 720
gaagggaagc tgttaagtcc gccgcctggg aagtacggtc gcaagactga aacttaaagg 780
aattggcggg ggagcaccac aacgcgtgga gcctgcggtt taattggatt caacgccgga 840
catctcacca ggagcgacag ctgtatgatt accaggctga tgaccttgtt tgactagctg 900
agaggaggtg catggccgcc gtcagctcgt accgtgaggc gtcctgttaa gtcaggcaac 960
gagcgagacc acgcccttag ttaccatcag attctttgga atgctgggca cactaagggg 1020
accgccagtg ataaattgga ggaaggagtg gacgacggta ggtccgtatg ccccgaatcc 1080
cctgggctac acgcgggcta caatggctgg gacaatgggt tccgacgccg aaaggtggag 1140
gtaatctttt aaacctagtc gtagttcgga ttgagggctg taactcgccc tcatgaagct 1200
ggaatgcgta gtaatcgcgt gtcacaatcg cgcggtgaat acgtccctgc tccttgcaca 1260
caccggtaac 1270

Claims (10)

1.一种提高玉米秸秆黄贮品质的犏牛瘤胃新美鞭菌和甲烷短杆菌的自然共培养物(Methanobrevibacter olleyae)Cattle-YakTZ1，其特征在于，所述的新美鞭菌和甲烷短杆菌的自然共培养物(Methanobrevibacter olleyae)Cattle-YakTZ1保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.23971。
2.权利要求1所述的新美鞭菌和甲烷短杆菌的自然共培养物(Methanobrevibacterolleyae)Cattle-YakTZ1的培养方法，其特征在于，包括将所述的厌氧真菌和甲烷菌共培养物(N.frontalis+M.olleyae)Cattle-YakTZ1在厌氧环境中进行培养的步骤。
3.权利要求1所述的新美鞭菌和甲烷短杆菌的自然共培养物(Methanobrevibacterolleyae)Cattle-YakTZ1的发酵培养物。
4.一种农作物秸秆黄贮饲料的制备方法，其特征在于，包括在黄贮工程中添加权利要求1所述的新美鞭菌和甲烷短杆菌的自然共培养物(Methanobrevibacter olleyae)Cattle-YakTZ1发酵液的步骤。
5.一种黄贮添加剂，其特征在于，包括权利要求1所述的新美鞭菌和甲烷短杆菌的自然共培养物(Methanobrevibacter olleyae)Cattle-YakTZ1菌体。
6.一种黄贮饲料添加剂，其特征在于，所述的黄贮饲料添加剂的活性成分为权利要求1所述的新美鞭菌和甲烷短杆菌的自然共培养物(Methanobrevibacter olleyae)Cattle-YakTZ1。
7.如权利要求6所述的黄贮饲料添加剂，其特征在于，所述的黄贮饲料添加剂为玉米秸秆黄贮添加剂。
8.一种黄贮饲料，其特征在于，所述的黄贮饲料中含有权利要求6所述的黄贮饲料添加剂。
9.权利要求1所述的新美鞭菌和甲烷短杆菌的自然共培养物(Methanobrevibacterolleyae)Cattle-YakTZ1在制备黄贮饲料添加剂中的应用。
10.权利要求1所述的新美鞭菌和甲烷短杆菌的自然共培养物(Methanobrevibacterolleyae)Cattle-YakTZ1在制备黄贮饲料中的应用。
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