CN107574234A - 一种检测黄牛acvr1基因单核苷酸多态性的方法及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种检测黄牛ACVR1基因单核苷酸多态性的方法及其应用。以包含ACVR1基因的待测黄牛全基因组DNA为模板，以引物对1F为引物，PCR扩增黄牛ACVR1基因，其包括在黄牛ACVR1基因第41793位为C或T的碱基多态性；用限制性内切酶消化PCR扩增产物之后，再对酶切后的扩增片段进行琼脂糖凝胶电泳；根据琼脂糖凝胶电泳结果鉴定黄牛ACVR1基因第41793位的单核苷酸多态性；由于该方法是一种在DNA水平上筛查和检测到与黄牛生产性状密切相关的分子遗传标记，因此，可以用于中国黄牛肉用生长性状的标记辅助选择，快速建立遗传资源优良的黄牛种群。

Description

一种检测黄牛ACVR1基因单核苷酸多态性的方法及其应用

技术领域

本发明属于分子遗传学领域，涉及基因单核苷酸多态性(SNP)的检测，特别涉及一种检测黄牛ACVR1基因第41793位单核苷酸多态性的PCR-RFLP方法。

背景技术

单核苷酸多态性(SNP)就是指基因组DNA序列中由于单个核苷酸(A/T/C/G)的替换而引起的多态性。因此，通常所说的SNP包括单个碱基的替换、***、缺失。一个SNP表示在基因组某个位点上有一个核苷酸的变化，主要由单个碱基的转换或者颠换所引起；具有转换型变异的SNPs约占2/3。CpG二核苷酸的胞嘧啶是基因组中最易发生突变的位点，其中大多数是甲基化的，可自发地脱去氨基而形成胸腺嘧啶。

在任何已知或未知的基因内或附近都可能找到数量不等的SNPs，根据它们在基因组中分布的位置可分为基因编码区SNPs(cSNPs)、基因周边SNPs(pSNPs)和基因间SNPs(iSNPs)等三类。总的说来，cSNP比较少，因为在外显子内的变异率仅占周围序列的1/5，但它在遗传病和育种的研究中却具重要意义，因此倍受关注。根据对遗传性状的影响，cSNPs又可分为两种：一种是同义cSNPs，即SNP所致编码序列的改变并不影响其所翻译的蛋白质中氨基酸序列，突变碱基与未突变碱基的“含义”相同；另一种是非同义cSNPs，即碱基序列的改变将导致编码氨基酸的改变，从而产生蛋白质序列的改变，可能最终影响到蛋白质的功能。因此，对编码区SNPs的非同义突变来说，它们可能对基因功能有直接的重要影响。不仅如此，在群体遗传研究中，这些SNPs作为遗传标记在群体遗传和生物进化的研究中也具有重要意义。

在一个二倍体生物群体中，SNPs可能是由2个、3个或4个等位基因构成，但实际上3个或4个等位基因的SNPs很罕见，故SNPs通常被简单地称为二等位基因分子标记。目前，主要采用几种不同的路线来发现SNP：即DNA序列测定方法、PCR-SSCP与DNA测序结合法、AS-PCR方法、引物延伸法和寡核苷酸连接反应等。在这些SNP检测技术中，DNA序列测定法是最为准确的SNP检测方法，但其检测费用较高，不适合大规模群体分型；利用PCR-SSCP与DNA测序结合法检测SNP可以适当降低检测费用，但PCR-SSCP的实验过程比较长，操作比较繁琐，且实验过程中存在假阳性问题；AS-PCR方法作为一种新型的SNP检测方法，在未来的应用领域中具有非常广阔的前景，但是，该方法需要设计特别的引物，且只能针对特定的基因位点，同时，检测过程中还存在误检的概率，因此，目前不具有普遍应用的特点；而引物延伸法和寡核苷酸连接反应技术检测SNP位点，需要平板读数仪、基因芯片、微球阵列技术和质谱仪等检测平台，对于一般的分子实验室来说可实施性不强。

聚合酶链式反应-限制性片段长度多态性(PCR-RFLP)方法是一种检测SNP的有效技术，在发现SNP位点后使用限制性内切酶进行切割，然后进行琼脂糖、聚丙烯凝胶电泳分析，就能准确地鉴别SNP位点。PCR-RFLP方法不仅具有DNA测序法的准确性，又克服了费用昂贵、繁琐操作、假阳性的缺点，而且所检测的序列位点无特殊性要求。

骨形态发生蛋白(bone morphogenetic protein，BMP)受体属于丝氨酸/苏氨酸激酶受体，分为2类，Ⅰ类受体和Ⅱ类受体。BMPⅠ型受体(BMPRⅠ)包括ALK1、ACVR1(又名ALK2、ACTR1等)、ALK3和AKL5，BMPⅡ型受体包括BMPR2和ACVR2。类型Ⅰ受体负责信号的传导，类型Ⅱ受体负责与配体结合以及调控类型Ⅰ受体的表达。当类型Ⅱ受体与配体结合后，类型Ⅱ受体与类型Ⅰ受体形成稳定的四聚体复合物，并将类型Ⅰ受体磷酸化，激活Ⅰ型受体，进而募集下游蛋白。体外实验证明该四聚体复合物可以与多种配体相结合，例如BMP4、BMP6、BMP7、BMP9以及激活素等，但是其体内自然配体还未解析，所涉及的通路包括BMP、p38/MAPK和PI3K/Akt等信号通路。此外，结构方面，ACVR1具有ALK受体的典型结构域，包括胞外配体结合结构域、跨膜结构域、近膜区的甘氨酸-丝氨酸(GS)富集结构域和蛋白激酶结构域。

ACVR1基因是胚胎发育和生长必不可少的，涉及了多细胞和组织类型，如肌肉、骨骼和神经***等，并且在小鼠发育过程具有时空表达特异性。研究表明敲除ACVR1基因使得小鼠胚胎在发育早期就出现阻滞现象，因此研究ACVR1基因在组织/器官发育中的功能时多采用条件突变(conditional mutants)。目前对ACVR1基因的研究主要集中在进行性肌肉骨化症(FibrodysplasiaOssificansProgressiva，FOP)以及神经胶质瘤(Diffuse IntrinsicPontine Glioma，DIPG)等疾病的研究上，并揭示了与两者相关的关键突变。ACVR1基因3’UTR具有miR-148a的靶位点，miR148a属于miR-148家族(miR-148a、miR-148b和miR-152)，该家族具有调控细胞增殖与凋亡的作用。此外，ACVR1还可以通过SOST及DKK1来间接调控Wnt信号通路。

牛ACVR1基因位于BTA2：39287889-39361502(UMD 3.1.1)，全长73614bp，包含10个外显子，9个内含子，mRNA序列比对发现序列相似度达87％，说明该基因具有功能保守性。但是目前有关ACVR1基因的研究主要集中在人和小鼠上，在家畜家禽上研究报道较少。AnimalQTLdb数据库中有7个包含牛ACVR1基因的QTL(利用基因组扫描和GWAS鉴定)，涉及了产奶、产肉和脂肪沉积相关性状，但都没有进行进一步的验证研究。这7个QTL的跨度～17Mb(BTA2：37604171-54426732)，包含了46个基因和1个miRNA，但这7个QTL的共有区域为BTA2：39293326-39330039，该区域仅仅包含ACVR1基因，说明该基因是控制牛生产性状的重要候选功能基因。

但目前，选取ACVR1基因作为调节生长发育的候选基因，通过检测牛ACVR1基因的遗传变异，并与生长性状进行关联分析，以期为肉牛标记辅助选择(MAS)提供重要的分子标记的研究，尚未见到报道。

发明内容

本发明的目的在于提供一种检测黄牛ACVR1基因单核苷酸多态性的方法及其应用，从而加快良种选育速度。

为达到上述目的，本发明采用了以下技术方案：

一种检测黄牛ACVR1基因单核苷酸多态性的方法，包括以下步骤：

以包含ACVR1基因的待测黄牛全基因组DNA为模板，以引物对1F为引物，PCR扩增黄牛ACVR1基因部分片段；用限制性内切酶RspRSⅡ(MseⅠ)消化PCR扩增产物之后，再对酶切消化后的扩增片段进行琼脂糖凝胶电泳；根据琼脂糖凝胶电泳结果鉴定黄牛ACVR1基因第41793位的单核苷酸多态性；

所述的引物对1F为：

正向上游引物：5’-TAAAAGGCGCAATCAAGAACGCC-3’；

反向下游引物：5’-AACTCACGTAAGCGTGCCAG-3’。

所述的PCR扩增反应程序包括以下步骤：95℃预变性5min；38个循环：94℃变性30s，65℃退火30s，72℃延伸30s；72℃终延伸10min。

所述的琼脂糖凝胶的质量浓度为3.5％。

根据琼脂糖凝胶电泳结果鉴定黄牛ACVR1基因第41793位的单核苷酸多态性为：CC基因型表现为264bp的一条条带；TT基因型表现为239bp的一条条带；CT基因型表现为264bp和239bp的两条条带。

一种检测黄牛ACVR1基因单核苷酸多态性的试剂盒，包括上述检测黄牛ACVR1基因第41793位单核苷酸多态性的引物对1F。

与现有技术相比，本发明具有以下有益的技术效果：

本发明提供的黄牛ACVR1基因单核苷酸多态性检测方法，第41793位C到T的转换突变造成一个RspRSⅡ(MseⅠ)自然酶切位点的产生，通过电泳检测分型可以准确、快速、方便、低成本、高精确度的检测到ACVR1基因在第41793位的单核苷酸多态性。便于推广应用在DNA水平上筛查和检测与黄牛生产性状密切相关的遗传标记，可用于黄牛的分子育种。

本发明对3个黄牛品种的SNP基因型进行了检测和基因频率分析，发现上述SNP位点与黄牛部分生长性状的关联，为ACVR1基因的SNP与中国黄牛生长性状关系的建立奠定了基础，以便用于中国黄牛标记辅助选择(MAS)，从而快速建立遗传资源优良的黄牛种群。

附图说明

图1为黄牛ACVR1基因(引物对1F)的PCR扩增产物电泳图。

图2为黄牛ACVR1基因PCR扩增产物测序图。

图3为黄牛ACVR1基因PCR扩增产物RspRSⅡ酶切的电泳图；其中泳道M为Marker I(600bp，500bp，400bp，300bp，200bp，100bp)，CC基因型表现为264bp的条带；TT基因型表现为239bp的条带；CT基因型表现为264和239bp的条带。

具体实施方式

下面结合附图和实施例对本发明做进一步的详细说明，所述是对本发明的解释而不是限定。

本发明对黄牛ACVR1基因第41793位碱基突变可能产生编码蛋白表达水平发生变化的单核苷酸多态性进行检测，利用PCR-RFLP方法检测黄牛ACVR1基因的该单核苷酸多态性，并将其与生长性状进行关联分析，验证其是否可以作为黄牛分子育种中辅助选择的分子标记。

1、黄牛ACVR1基因Exon4部分区域PCR引物的设计

以NCBI所公布的牛(AC_000159.1)序列为参考，利用Primer 5.0设计能够扩增包含黄牛ACVR1基因第四外显子区域的PCR引物(引物对1F)，其引物序列分别如下：

正向引物：5’-TAAAAGGCGCAATCAAGAACGCC-3’

反向引物：5’-AACTCACGTAAGCGTGCCAG-3’

以上述引物对黄牛基因组扩增，能够扩增包含黄牛ACVR1基因第四外显子区域的基因片段；对扩增的片段进行测序鉴定后，发现当ACVR1基因第41793位(AC_000159.1)碱基由C突变为T时，导致编码氨基酸密码子由CTC突变为CTT，氨基酸保持不变，仍然是Leu，发生了同义突变；并且这一突变形成了限制性内切酶RspRSⅡ(MseⅠ)的酶切位点。

2、以引物对1F进行PCR扩增待测黄牛的ACVR1基因片段

(1)黄牛样本的采集

本发明具体以3个中国黄牛品种的种群作为检测对象，具体采集样本见表1：夏南牛(215头)、秦川牛(105头)、南阳牛(107头)。

表1.黄牛样本的采集

(2.1)血样基因组DNA的分离、提取

1)冷冻血样(主要为血细胞)室温解冻，转移500μL至1.5mL Eppendorf离心管，加入等体积PBS液，充分混匀，12000r/min离心10min(4℃)，弃去上清液，重复上述步骤至上清液透明、沉淀呈淡黄色；

2)在离心管中加入DNA抽提缓冲液500μL，摇动，使血细胞沉淀脱离离心管管壁，37℃水浴1h；

3)加蛋白酶K至3μL(20mg/mL)并混匀，55℃过夜至澄清，尚未澄清者，可补加1μL蛋白酶K混匀继续消化直至澄清；

4)将反应液冷却至室温，加Tris-饱和酚500μL，温和摇动离心管20min，使其充分混匀；4℃，12000r/min离心10min，将上清液转入另一1.5mL离心管中，重复一次；

5)加氯仿500μL，充分混匀20min，4℃，12000r/min离心10min，将上清液转入另一1.5mL离心管中；

6)加氯仿、异戊醇混合液(24:1)500μL，充分混匀20min，4℃，12000r/min离心10min，将上清液转入另一1.5mL离心管中；

7)加0.1倍体积的NaAc缓冲液及2倍体积的冰冷的无水乙醇，混合转动离心管，直至白色的絮状沉淀析出，-20℃保存30～60min；

8)4℃，12000r/min离心10min，弃去上清液，用70％冰冷乙醇漂洗DNA沉淀2次；

9)4℃，12000r/min离心10min，弃去上清液，室温下使乙醇挥发干净；

10)干燥后的DNA溶于80～100μL的TE液，4℃保存直至DNA完全溶解，0.8％琼脂糖凝胶电泳检测其质量，-80℃保存。

(2.2)纯化

11)500μL的DNA溶液中加入10％SDS使其终浓度为0.1％，加入蛋白酶K至终浓度达到50μg/mL；

12)5℃保温10h左右；

13)等体积苯酚、氯仿、异戊醇(25:24:1)和氯仿分别抽提一次；

14)12000r/min离心5min分相，吸取上层水相至另一离心管中；

15)加入1/10体积3mol/L醋酸钠和2倍体积冰冷无水乙醇沉淀DNA；

16)倒掉液体，70％乙醇洗涤后晾干，加入60μL灭菌超纯水溶解，4℃待检测。

(3)PCR扩增及产物酶切

PCR反应体系采用混合加样法，即根据每一个反应体系所需的各种组分的数量和1次反应所需的PCR反应的个数，算出各种反应组分的总量，加入到1个1.5mL离心管中，充分混匀后瞬时离心，再分装到每个0.2mL Eppendorf离心管中，然后加入模板DNA，再瞬时离心后进行PCR扩增；对PCR扩增产物进行酶切消化反应。

1)PCR总反应体系为10μL，见表2；

表2.PCR反应体系

2)PCR反应程序，见表3；

表3.PCR反应程序

3)RspRSⅡ(MseⅠ)酶切反应体系25μL，见表4。

表4.RspRSⅡ(MseⅠ)酶切反应体系

注：酶切消化条件为60℃，5～10h

参见图1，PCR扩增的目的条带为264bp。

3、RFLP检测

1)制作含有核酸染料的质量浓度3.5％琼脂糖凝胶分别对RspRSⅡ酶切后的PCR产物进行检测，点样后120V电压电泳1h；

2)待分子量不同的DNA片段分离清晰时，在BIO-RAD Gel Doc 2000凝胶成像***成像；

3)根据琼脂糖凝胶电泳结果分析SNP多态性：

用BIO-RAD Gel Doc 2000凝胶成像***照相分析，判断并区分出不同的带型：

ACVR1基因的第41793位碱基由C突变为T时，1F扩增的ACVR1基因产物的第41793～41795序列为TTAA，该序列正是限制性内切酶RspRSⅡ(MseⅠ)的识别位点，当没有发生突变时，此处就不存在RspRSⅡ(MseⅠ)的识别位点。

由于黄牛为2倍体，所以黄牛基因组的ACVR1基因的第41793位的SNP，经过RspRSⅡ(MseⅠ)酶切及3.5％琼脂糖凝胶电泳后，可显示出不同基因型的条带，结果为：

如图3所示，纯合子AA型的两条DNA链在第41793位不能被RspRSⅡ(MseⅠ)切开，所以表现为264bp的条带；纯合子GG型的两条DNA链在第41793位能被RspRSⅡ(MseⅠ)切开，所以表现为239bp的条带；杂合子AG型的一条DNA链在第41793位能被RspRSⅡ(MseⅠ)切开，所以表现为264bp和239bp的条带，25bp的条带由于太小，在凝胶上不能显示出来。

4、不同基因型个体PCR产物的纯化和测序

PCR-RFLP检测之后，挑选出不同基因型个体，进行PCR扩增，并分别对PCR产物进行切胶回收及纯化：在紫外灯下从琼脂糖凝胶上切下含目的片段的凝胶，放入1.5mL离心管中，然后用PCR产物回收纯化试剂盒(北京天根生物公司)纯化PCR产物，按照试剂盒说明书操作。

根据琼脂糖凝胶电泳结果，把不同基因型个体的PCR纯化产物送南京金斯瑞生物科技有限公司进行正反双向测序；同时，进行SNP位置分析，结果表明包含264bp条带的个体为CC基因型，其第41793位的测序图的确表示为(C-C)；含239bp条带的个体为TT基因型，其第41793位的测序图的确表示为(T-T)；含264bp和239bp条带的个体为CT基因型，其第41793位的测序图的确表示为(C-T)，参见图2。

5、黄牛ACVR1基因SNP位点的频率统计分析

1)基因和基因型频率

基因型频率是指一个群体中某种基因型个体数占总个体数的比率。P_AA＝N_AA/N，其中P_AA代表某一位点的AA基因型频率；N_AA表示群体中具有AA基因型的个体数；N为检测群体的总数量。

基因频率是指一个群体中某一基因数对其等位基因总数的相对比率。计算的公式可以写成：P_A＝(2N_AA+N_Aa1+N_Aa2+N_Aa3+N_Aa4+……+N_Aan)/2N

式中，P_A表示等位基因A频率，N_AA表示群体中具有AA基因型的个体数量，N_Aai表示群体中具有Aai基因型个体数量，a1～an为等位基因A的n个互不相同的复等位基因。

在不同黄牛品种ACVR1基因第41793位SNP中等位基因A频率和G频率变化如表5所示。

表5.黄牛ACVR1基因第41793位多态位点基因频率分布表

6、黄牛ACVR1基因SNP位点基因效应的关联分析

基因型数据：识别的基因型(CC、TT和CT)。

生产数据：3个中国黄牛(夏南牛、秦川牛、南阳牛)共计427头个体为实验动物以及中国黄牛的生长性状(体高、体重、体长、体斜长、十字部高、腹围、管围、胸围、胸宽、胸深、腰角宽、坐骨端宽、尻长)。

关联分析模型：

先对数据进行描述分析，确定是否存在离群值，再利用最小二乘分析对数据校正；根据数据特征，应用SPSS(16.0)软件的GLM过程分析基因型和瓶中对各性状效应。在对基因型效应进行分析时采用了固定模型：

Y_ijklm＝μ+A_i+G_j+B_k+S_l+e_ijklm，

其中：Y_ijklm为个体表型记录，μ为总体均数，A_i为年龄效应，G_j为基因型效应，B_k为品种效应，S_l为性别效应，e_ijklm为随机残差效应。

结果表明(见表6)：ACVR1基因第41793位多态位点，CC基因型个体的胸深高于TT基因型个体且差异显著(P<0.05)。其他性状与基因型间差异不显著。说明该多态位点可以作为黄牛胸深性状选择的遗传标记。

表6.ACVR1基因第41793位多态位点与中国黄牛生长性状之间的方差分析

注：同行数据所标字母相异表示差异显著(a,b:P<0.05)。

序列表

<110> 西北农林科技大学

<120> 一种检测黄牛ACVR1基因单核苷酸多态性的方法及其应用

<160> 2

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工合成()

<400> 1

taaaaggcgc aatcaagaac gcc 23

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工合成()

<400> 2

aactcacgta agcgtgccag 20

Claims (9)

1.一种检测黄牛ACVR1基因单核苷酸多态性的方法，其特征在于：包括以下步骤：

以待测黄牛基因组DNA为模板，以引物对1F为引物，PCR扩增黄牛ACVR1基因部分片段，用限制性内切酶RspRSⅡ或RspRSⅡ的同裂酶酶切PCR扩增产物，再对酶切后的片段进行琼脂糖凝胶电泳，根据电泳结果鉴定黄牛ACVR1基因单核苷酸多态性位点的基因型；

所述引物对1F为：

正向上游引物：5’-TAAAAGGCGCAATCAAGAACGCC-3’；

反向下游引物：5’-AACTCACGTAAGCGTGCCAG-3’。

2.如权利要求1所述一种检测黄牛ACVR1基因单核苷酸多态性的方法，其特征在于：所述PCR扩增的反应程序包括以下步骤：95℃预变性5min；94℃变性30s，65℃退火30s，72℃延伸30s，38个循环；72℃延伸10min。

3.如权利要求1所述一种检测黄牛ACVR1基因单核苷酸多态性的方法，其特征在于：所述黄牛ACVR1基因单核苷酸多态性位点定位于牛参考序列AC_000159.1第41793位。

4.如权利要求1所述一种检测黄牛ACVR1基因单核苷酸多态性的方法，其特征在于：所述同裂酶选自限制性内切酶MseⅠ。

5.如权利要求1所述一种检测黄牛ACVR1基因单核苷酸多态性的方法，其特征在于：所述电泳采用的琼脂糖凝胶的质量浓度为3.5％。

6.如权利要求1所述一种检测黄牛ACVR1基因单核苷酸多态性的方法，其特征在于：所述黄牛ACVR1基因单核苷酸多态性位点的基因型为：CC基因型表现为264bp的一条条带；TT基因型表现为239bp的一条条带；CT基因型表现为264bp和239bp的两条条带。

7.如权利要求1所述的检测黄牛ACVR1基因单核苷酸多态性的方法在黄牛分子标记辅助选择育种中的应用。

8.如权利要求7所述的应用，其特征在于：所述黄牛ACVR1基因单核苷酸多态性位点的CC基因型或C等位基因可作为黄牛生长发育性状选择的DNA标记。

9.一种检测黄牛ACVR1基因单核苷酸多态性的试剂盒，其特征在于：包括基于PCR-RFLP法检测黄牛ACVR1基因单核苷酸多态性位点基因型的引物对1F；

所述引物对1F为：

正向上游引物：5’-TAAAAGGCGCAATCAAGAACGCC-3’；

反向下游引物：5’-AACTCACGTAAGCGTGCCAG-3’。