CN107641657A - 一种黄牛acvr1基因***/缺失的检测方法及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种黄牛ACVR1基因***/缺失的检测方法及其应用。以待测黄牛全基因组DNA为模板，以引物对P1为引物，通过PCR技术扩增ACVR1基因，再进行琼脂糖凝胶电泳，根据电泳结果鉴定ACVR1基因在AC_000159.1:g33007‑33023位点存在不同的基因型。结果发现，ACVR1基因16‑bp***/缺失的不同类型与中国黄牛管围和胸围等生长发育性状之间存在显著相关，提示ACVR1基因16‑bp***/缺失可作为提高中国黄牛生长发育性状的DNA标记，有利于快速建立生长发育性状优良的黄牛遗传资源群体。

Description

一种黄牛ACVR1基因***/缺失的检测方法及其应用

技术领域

本发明属于现代生物技术与家畜育种领域，涉及基因***/缺失的检测，特别涉及一种检测中国黄牛ACVR1基因16-bp***/缺失的方法。

背景技术

动物育种技术主要包括以表型和表型值为基础的常规育种技术和以DNA多态为基础的分子育种技术。作为分子育种技术体系的重要组成部分，分子标记辅助选择(marker-assisted selection，MAS)育种技术首先检测重要基因的DNA多态性，然后分析DNA多态与遗传性状之间的相关性，最后再根据与遗传性状显著相关的DNA标记进行性状选择。作为现代分子生物学技术发展过程中孕育而生的新技术，MAS育种技术可以在DNA水平上快速准确地分析个体的遗传组成，该方法通过有性杂交将目的基因转移到需要改良的亲本中，将目标基因型的鉴定与传统育种相结合，从而实现对基因型的直接选择，提高育种目标的定向性。该方法在早期选择、进行无损害的性状评价和选择及提高育种效率等方面具有优越性。

在MAS育种技术体系中，寻找重要功能基因、筛查重要基因遗传变异位点，并分析重要功能基因遗传变异位点与生长性能的相关性，是分子标记辅助选择技术应用的前提和关键。作为分子遗传标记的重要方式之一，***/缺失(indel)是一种新型分子标记。Indel是指DNA序列上核苷酸片段的***或缺失而引起DNA序列的改变，造成包括人类在内的物种之间染色体基因组的多样性。Indel是指基因组中片段长度在1-50bp之间的***或缺失，可能包括微小CNV(Copy number variations)，利用indel分析个体基因组可以更好地解释个体的表型差异，因此从DNA水平上对小片段核苷酸的差异进行indel检测在动物分子育种的MAS体系中具有重要意义。

***/缺失是DNA或蛋白质序列水平上发生频率仅次于残基替换的进化改变，indel 多态性是基因组中一种特殊类型的二等位基因遗传标记，表现为基因组中***或缺失了不同大小的小片段DNA。Indel大致分成以下5大类：(1)单碱基对的***/缺失；(2)单一碱基的***/缺失；(3)重复单元为2～15碱基的多碱基对***/缺失；(4)转座子***/缺失；(5)任意DNA序列的***/缺失多态性。随着比较基因组学的深入研究，indel为理论研究和遗传育种应用研究提供了大量的生物信息，其作为新一代的遗传学鉴定标记，兼具SNP的优点，与SNP相比，均是源于单突变事件，其突变频率较低，约为10^-8，相对比较稳定。在结构上属于二等位基因多态性，等位基因都固定且已知，能够通过很小的扩增子进行扩增(<50bp)，提高了扩增高度降解DNA的成功率。作为一种重要的遗传标记， indel的研究最早聚焦在分子生物学及生物医学领域。遍布于整个基因组的indel频率仅次于SNP，其中约三分之一位于已知的基因区域内，还有一些位于决定基因功能的关键性区域，如启动子区和外显子区。分子生物学家最早将其用于基因表型相关的研究，希望通过将人类性状、疾病症状或是易感性进行联系，从而达到基因诊断和治疗的目的。2005 年，Bhangale等报道了一种能够从目的基因中全面识别indel变异的方法，并应用该方法从330个备选基因中找到2393个indel变异位点，得出人类基因组中***/缺失态出现的频率高于***多态性的结论，同时提出，indel和SNP的形成机制可能不同，但其进化史是相似的。

随着经济发展和人们生活水平的不断提高，社会对黄牛产品的需求不断加强，但由于近年来牛肉、牛奶等产品严重短缺，所以育种专家期望更早、更好、更快地获得生产性状优异的黄牛品种。在高产、优质和高效的黄牛育种目标上，黄牛育种专家一直关注生长发育性状，但仅靠传统育种手段是不行的，还需要依靠分子育种技术。即首先筛选与黄牛生长发育性状密切相关的重要候选基因的DNA标记，然后进行基因多态性的检测，最后是进行基因多态性与生长发育性状的关联分析，从而实现MAS和实现早期诊断选择。

骨形态发生蛋白(bone morphogenetic protein，BMP)受体属于丝氨酸/苏氨酸激酶受体，分为2类，Ⅰ类受体和Ⅱ类受体。BMPⅠ型受体(BMPRⅠ)包括ALK1、ACVR1 (又名ALK2、ACTR1等)、ALK3和AKL5，BMPⅡ型受体包括BMPR2和ACVR2。类型Ⅰ受体负责信号的传导，类型Ⅱ受体负责与配体结合以及调控类型Ⅰ受体的表达。当类型Ⅱ受体与配体结合后，类型Ⅱ受体与类型Ⅰ受体形成稳定的四聚体复合物，并将类型Ⅰ受体磷酸化，激活Ⅰ型受体，进而募集下游蛋白。体外实验证明该四聚体复合物可以与多种配体相结合，例如BMP4、BMP6、BMP7、BMP9以及激活素等，但是其体内自然配体还未解析，所涉及的通路包括BMP、p38/MAPK和PI3K/Akt等信号通路。此外，结构方面，ACVR1具有ALK受体的典型结构域，包括胞外配体结合结构域、跨膜结构域、近膜区的甘氨酸-丝氨酸(GS)富集结构域和蛋白激酶结构域。

ACVR1基因是胚胎发育和生长必不可少的，涉及了多细胞和组织类型，如肌肉、骨骼和神经***等，并且在小鼠发育过程具有时空表达特异性。研究表明敲除ACVR1基因使得小鼠胚胎在发育早期就出现阻滞现象，因此研究ACVR1基因在组织/器官发育中的功能时多采用条件突变(conditional mutants)。目前对ACVR1基因的研究主要集中在进行性肌肉骨化症(Fibrodysplasia Ossificans Progressiva，FOP)以及神经胶质瘤(DiffuseIntrinsic Pontine Glioma，DIPG)等疾病的研究上，并揭示了与两者相关的关键突变。ACVR1基因 3’UTR具有miR-148a的靶位点，miR148a属于miR-148家族(miR-148a、miR-148b和 miR-152)，该家族具有调控细胞增殖与凋亡的作用。此外，ACVR1还可以通过SOST及DKK1来间接调控Wnt信号通路。

牛ACVR1基因位于BTA2：39287889-39361502(UMD 3.1.1)，全长73614bp，包含 10个外显子，9个内含子，mRNA序列比对发现序列相似度达87％，说明该基因具有功能保守性。但是目前有关ACVR1基因的研究主要集中在人和小鼠上，在家畜家禽上研究报道较少。Animal QTLdb数据库中有7个包含牛ACVR1基因的QTL(利用基因组扫描和GWAS鉴定)，涉及了产奶、产肉和脂肪沉积相关性状，但都没有进行进一步的验证研究。这7个QTL的跨度～17Mb(BTA2：37604171-54426732)，包含了46个基因和1个 miRNA，但这7个QTL的共有区域为BTA2：39293326-39330039，该区域仅仅包含ACVR1 基因，说明该基因是控制牛生产性状的重要候选功能基因。

但目前，选取ACVR1基因作为调节生长发育的候选基因，通过检测牛ACVR1基因的遗传变异，并与生长性状进行关联分析，以期为肉牛标记辅助选择(MAS)提供重要的分子标记的研究，尚未见到报道。

发明内容

本发明的目的在于提供一种黄牛ACVR1基因***/缺失的检测方法及其应用。

为达到上述目的，本发明采用了以下技术方案：

一种黄牛ACVR1基因***/缺失的检测方法，包括以下步骤：

以待测中国黄牛的全基因组DNA为模板，以引物对P1为引物，通过PCR扩增待测中国黄牛ACVR1基因片段，该片段包含所述ACVR1基因16-bp***/缺失多态位点；再对PCR扩增得到的片段进行琼脂糖凝胶电泳；根据琼脂糖凝胶电泳结果鉴定待测中国黄牛ACVR1基因16-bp***/缺失多态位点的***/缺失多态性；

所述的引物对P1为：

上游引物：5’-CACGGAAGAGACAGACCAGTATT-3’；

下游引物：5’-TGGGGGAGAGTTCCATCTGTTT-3’。

所述PCR的反应体系包括2×Taq PCR SuperMix(包括Taq DNA聚合酶、dNTPs和反应缓冲液，浓度为2×)5～12.5μL；上游引物0.3～1μL；下游引物0.3～1μL(上下游引物浓度各为10pmol/μL)；模板DNA(浓度为50ng/μL黄牛基因组DNA)0.3～1μL；去离子水4.1～9.5μL；共10～25μL体积的PCR扩增体系。

所述PCR的扩增反应程序包括以下步骤：1)95℃预变性5min，然后进入步骤2)； 2)循环：94℃变性30s，59.1℃复性30s，72℃延伸30s；共36个循环，然后进入步骤3)；3)72℃延伸10min。

所述琼脂糖凝胶电泳采用的琼脂糖凝胶的质量浓度为3.5％。

所述***/缺失多态性为：***/***基因型表现为166bp一条带纹；***/缺失基因型表现为166bp和150bp两条带纹；缺失/缺失基因型表现为150bp一条带纹。

上述黄牛ACVR1基因***/缺失的检测方法在中国黄牛分子标记辅助选择育种中的应用。所述***/缺失多态位点的缺失/缺失基因型(DD)可作为中国黄牛胸围和管围指数的 DNA标记。

一种黄牛ACVR1基因***/缺失的检测试剂盒，该试剂盒包括上述用于PCR扩增中国黄牛ACVR1基因中16-bp***/缺失多态位点的引物对P1。

本发明的有益效果体现在：

本发明根据ACVR1基因的序列设计引物，分别以5个黄牛品种的基因组DNA为模板，进行PCR扩增，并对PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，电泳后获得黄牛的ACVR1基因的***/缺失多态性(AC_000159.1:g33007-33023的***/缺失多态性)。

本发明对5个黄牛品种的***/缺失多态性位点基因型进行了检测和基因频率分析，对上述***/缺失多态性位点与黄牛部分生长性状(如管围、胸围)进行关联分析，结果表明该位点能够作为提高中国黄牛管围(P＝0.014)和胸围(P＝0.024)的分子标记。

本发明提供了针对该***/缺失多态性位点的检测方法，通过设计的引物经PCR扩增后再经琼脂糖凝胶电泳鉴定，能够简单、快速、低成本、精确的检测其***/缺失的多态性，从而为黄牛良种选育提供依据，有利于快速建立生长发育性状优良的黄牛遗传资源群体，加快良种选育速度。

附图说明

图1为黄牛ACVR1基因16-bp***/缺失(indel)多态位点(AC_000159.1: g33007-33023ins位点)的PCR产物电泳结果(WW、WD和DD基因型)。

图2为黄牛ACVR1基因PCR产物测序结果图：33007-33023位***/缺失位点处，16bp***序列(Insert DNAsequences)显示于框内，***位置如图中“△”所示。

具体实施方式

下面结合附图和实施例对本发明做详细说明，所述是对本发明的解释而不是限定。

本发明利用PCR扩增方法对黄牛ACVR1基因在AC_000159.1:g33007-33023ins位点突变可能产生的***/缺失多态性进行检测，并将其与生长性状进行关联分析，验证其是否可以作为黄牛分子育种中辅助选择的分子标记，从而加快良种选育速度。

(一)实验药品与试剂

1.生化试剂与生物学试剂：①蛋白酶K(购自华美生物工程公司)；②Marker I(购自天根生化科技(北京)有限公司)。

2.普通试剂：普通试剂从华美生物工程公司购买，为进口分装产品：Tris、EDTA、NaCl、NaOH、KCl、Na₂HPO₄、KH₂PO₄、Tris饱和酚、氯仿、异戊醇、无水乙醇、醋酸钠、十二烷基磺酸钠(SDS)、溴化乙锭(EB)、溴酚蓝、二甲基苯氰FF、乙酸、蔗糖、硼酸、琼脂糖等。

3.溶液与缓冲液：所有溶液与缓冲液均采用去离子超纯水配制。高压灭菌条件为15 bf/in(1.034×10⁵Pa)，25min。试剂配制方法均参考Sambrook等编著的《分子克隆实验指南》。

1)提取组织样DNA所用溶液：除了基因组DNA提取时的公用溶液外，还配制以下试剂：①2mol/L NaCl：11.688g溶于水，定容至100mL，高压灭菌。②组织DNA提取液(100mL)：lmol/L Tris-Cl(pH 8.0)l mL，0.5mol/L EDTA(pH 8.0)20mL，2mol/L NaCl 5mL，定容至100mL。

2)琼脂糖电泳分析所用溶液:①1×TBE缓冲液：取10×TBE 100mL定容至1000mL。②上样缓冲液：0.25％溴酚蓝，0.25％二甲苯青FF，及40.0％(w/v)蔗糖水溶液。

(二)黄牛ACVR1基因indel位点(AC_000159.1:g33007-33023ins位点)PCR引物的设计

在NCBI上检索牛ACVR1基因的序列，并利用Premier 5.0设计能够扩增包含牛ACVR1 基因第22内含子区域16-bp indel位点的PCR引物对P1，其引物序列如下：

上游引物：5’-CACGGAAGAGACAGACCAGTATT-3’；

下游引物：5’-TGGGGGAGAGTTCCATCTGTTT-3’；

上述引物对P1对黄牛基因组扩增，能够扩增包含黄牛ACVR1基因在 AC_000159.1:g33007-33023ins位点的indel的不同的基因型片段。理论上，当33007与 33023nt之间的GCAGTAGACTTCATTT缺失时，PCR产物经琼脂糖凝胶电泳检测之后是 150bp大小的一条带纹；33007与33023nt之间的GCAGTAGACTTCATTT***时，PCR 产物经琼脂糖凝胶电泳检测之后是166bp大小的一条带纹。33007与33023nt之间的 GCAGTAGACTTCATTT***/缺失时，PCR产物经琼脂糖凝胶电泳检测之后是150bp+166 bp两条带纹。为此，根据理论分析结果，***/***基因型(WW)表现为166bp一条带纹，***/缺失基因型(WD)表现为150bp+166bp两条带纹，缺失/缺失基因型(DD)表现为150 bp一条带纹。

(三)以引物对P1PCR扩增待测黄牛的ACVR1基因片段

1、黄牛样本的采集

实验所用的动物为5个品种黄牛共计840个样本，具体采集情况参见表1：

表1.黄牛样本的采集

2、组织样品DNA的提取与分离

1)取约10mg耳组织样，放于1.5mL的离心管中，用小剪刀尽量剪碎。

2)加入600μL组织DNA提取液，10％SDS至终浓度为1％，蛋白酶K至终浓度为 100μg/mL，55.0℃消化过夜，最好保证组织样较均匀地分布在组织提取液中。

3)将溶液冷却至室温，加入等体积的Tris饱和酚，盖紧管盖，缓慢地来回颠倒离心管，至少持续10min以上，12000r/min离心15min。

4)取上清液，加入等体积的酚:氯仿(1:1)，盖紧管盖，缓慢地来回颠倒离心管，至少持续10min以上，12000r/min离心15min。

5)取上清液，加入等体积的氯仿:异戊醇(24:1)，盖紧管盖，缓慢地来回颠倒离心管，至少持续10min以上，12000r/min离心15min。

6)取上清液，加入1/10体积的3mol/L乙酸钠和2倍体积的冰冷无水乙醇，盖紧管盖，缓慢地来回颠倒离心管，直至液体清亮，出现白色絮状DNA。

7)挑出DNA，放进一个1.5mL的离心管中，加入500μL 70％乙醇，盖紧管盖，缓慢地来回颠倒离心管，然后12000r/min离心3～5min，小心倒掉乙醇，将管倒置于吸水纸上。

8)再一次向离心管中加入500μL 70％乙醇，盖紧管盖，缓慢地来回颠倒离心管，然后12000r/min离心3～5min，小心倒掉乙醇，将管倒置于吸水纸上。

9)待干燥后，加入60μL灭菌超纯水，为使其完全溶解，4℃保存过夜，待检测。

3、琼脂糖凝胶电泳检测DNA

1)将凝胶电泳槽洗干净，用胶带纸将两端封住，插上梳子。

2)称取2.8g的琼脂糖，转入三角瓶中，加入1×TBE 80mL使其悬浮，微波炉中火加热，待沸腾2次拿出，待其冷却至不烫手时加入终浓度为0.5μg/mL的核酸染料。然后快速将琼脂糖溶液轻微摇动，防止出现气泡。

3)混匀后(约60℃)，立即将琼脂糖溶液到入槽内。如出现气泡，立即用移液器移出。

4)完全冷却凝固(约25～40min)后，拔掉梳子，去掉两端胶带纸。

5)向电泳槽中加入1×TBE缓冲液，使液面高出胶面2～5mm。

6)取DNA样品2～4μL，加2μL上样缓冲液后混匀，统一上样(注意枪头的顺序应前后对应)，并将DNAMarker加在一边。

7)120V电压，电泳1h。

8)在紫外分析仪上观察，如果有RNA则需要纯化，如果有明显降解，需重新提取相应样品的DNA。

4、DNA的纯化

1)500μL的DNA溶液中加入10％SDS使其终浓度为0.1％，加入蛋白酶K至终浓度达到100μg/mL。

2)55℃保温10h左右。

3)等体积苯酚:氯仿:异戊醇(25:24:1)和氯仿分别抽提一次。

4)12000r/min离心5min分相，吸取上层水相至另一离心管中。

5)加入1/10体积3mol/L醋酸钠和2倍体积冰冷无水乙醇沉淀DNA。

6)倒掉液体，70％乙醇洗涤后凉干，加入60μL灭菌超纯水溶解，4℃待检测。

5、分光光度法检测DNA

用紫外光光度计测定DNA样品在260nm、280nm处的OD值。计算DNA含量和 OD₂₆₀/OD₂₈₀的比值。如OD₂₆₀/OD₂₈₀比值小于1.6，说明样品中含有较多的蛋白质或酚，则应进行纯化；若比值大于1.8，则应该考虑去除RNA纯化。

DNA浓度(ng/μL)＝50×OD₂₆₀值×稀释倍数

DNA检测完毕后，取出一定的量稀释至50ng/μL，存于-20℃备用，其余的存放于-80℃。

6、PCR扩增

PCR反应体系采用混合加样法，即根据每一个反应体系所需的各种组分的数量和1次反应所需的PCR反应的个数，算出各种反应组分的总量，加入到1个1.5mL离心管中，充分混匀后瞬时离心，再分装到每个0.2mL Eppendorf PCR管中，然后加入模板DNA，再瞬时离心后进行PCR扩增；PCR反应体系包括2×Taq PCR SuperMix(包括Taq DNA 聚合酶、dNTPs和优化的反应缓冲液，浓度为2×)12.5μL；上游引物1.0μL；下游引物 1.0μL(上下游引物浓度均为10pmol/μL)；模板DNA(浓度为50ng/μL黄牛基因组DNA) 1.0μL；去离子水9.5μL；共25μL体积的PCR扩增体系。

7、PCR反应的程序

PCR扩增反应程序为：95℃预变性5min；94℃变性30s，59.1℃复性30s，72℃延伸30s，36个循环；72℃延伸10min，12℃保存扩增产物。

(四)扩增PCR产物后琼脂糖凝胶电泳分析

1)制作加有核酸染料的3.5％的琼脂糖凝胶，点样后120V电压，电泳1h；

2)待分子量不同的DNA片段分离清晰时，在BIO-RAD Gel Doc 2000凝胶成像***成像；

3)根据琼脂糖凝胶电泳成像分析indel多态性。

用BIO-RAD Gel Doc 2000凝胶成像***照相分析，判断***/缺失(indel)的多态性：

黄牛基因组的ACVR1基因在AC_000159.1:g33007-33023ins位点的***/缺失(indel) 的多态性的琼脂糖凝胶电泳结果为：***/缺失基因型(WD)表现为150bp和166bp两条条带，***/***基因型(WW)表现为166bp一条条带，缺失/缺失基因型(DD)表现为150bp 一条条带，参见图1；测序验证参见图2。

(五)黄牛ACVR1基因indel位点的频率统计分析

1)基因和基因型频率

基因型频率是指一个群体中某种基因型个体数占总个体数的比率。P_TT＝N_TT/N，其中 P_TT代表某一位点的TT基因型频率；N_TT表示群体中具有TT基因型的个体数；N为检测群体的总数量。

基因频率是指一个群体中某一基因数对其等位基因总数的相对比率。计算的公式可以写成：P_T＝(2N_TT+N_Ta1+N_Ta2+N_Ta3+N_Ta4+……+N_Tan)/2N

式中，P_T表示等位基因T频率，N_TT表示群体中具有TT基因型的个体数量，N_Tai表示群体中具有Tai基因型个体数量，a1～an为等位基因T的n个互不相同的复等位基因。

在不同黄牛品种ACVR1基因16-bp***/缺失(indel)位点中的基因型频率及等位基因频率如表2所示。皮南牛、柴达木牛、夏南牛、秦川牛和南阳牛的等位基因“W”的频率分别为0.424、0.683、0.614、0.767和0.692，相应的等位基因“D”的频率为0.576、0.317、0.386、0.233和0.308，等位基因“W”和“D”的频率均大于1％，故为稳定存在***/ 缺失(indel)等位基因类型，参见表2。

表2.黄牛ACVR1基因indel频率分布表

(六)黄牛ACVR1基因indel位点基因效应的关联分析

基因型数据：PCR扩增后琼脂糖凝胶电泳识别的基因型。

生产数据：皮南牛、柴达木黄牛、夏南牛、秦川牛和南阳牛的体高、体重、体长、体斜长、十字部高、腹围、管围、胸围、胸宽、胸深、腰角宽、坐骨端宽、尻长等体尺性状数据。

关联分析模型：利用SPSS(18.0)软件来分析品种，不同因素与生长形状相关性。首先要对所得数据描述性的统计分析，来确定是不是存在离群值。然后根据数据的特性，利用方差分析、多元线性模型或者t分析进而来分析基因型的效应。在数据处理的过程中，依据影响体重、体尺生长发育的指标的因素的不同，考虑到个体的效应，基因之间的互作以及基因型的效应，采用固定的模型来进行相关分析。此外，根据实际条件来进行取舍，完整模型如下所示：Y_ijklm＝μ+A_i+G_j+B_k+S_l+e_ijklm，其中Y_ijklm为个体表型记录，μ为总体均数，A_i为年龄效应，G_j为基因型效应，B_k为品种效应，S_l为性别效应，e_ijklm为随机残差效应。

结果表明：在对840只中国黄牛群体的研究中，ACVR1基因的16-bp***/缺失(indel) 多态性对中国黄牛的管围(P＝0.014)和胸围(P＝0.024)均有显著影响(P<0.05)。因此， ACVR1基因16-bp***/缺失(indel)是中国黄牛生长发育胸围和管围的***/缺失(indel)遗传标记，参见表3。

表3.ACVR1基因indel多态性对中国黄牛生长性状的影响

注：同行数据所标字母相异表示差异显著(a,b:P<0.05)或极显著(A,B:P<0.01)。

序列表

<110> 西北农林科技大学

<120> 一种黄牛ACVR1基因***/缺失的检测方法及其应用

<160> 2

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工合成()

<400> 1

cacggaagag acagaccagt att 23

<210> 2

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工合成()

<400> 2

tgggggagag ttccatctgt tt 22

Claims (8)

1.一种黄牛ACVR1基因***/缺失的检测方法，其特征在于：包括以下步骤：

以待测黄牛基因组DNA为模板，以引物对P1为引物，通过PCR扩增待测黄牛ACVR1基因的部分片段；对PCR扩增得到的片段进行琼脂糖凝胶电泳；根据电泳结果鉴定待测黄牛ACVR1基因16-bp***/缺失多态位点的基因型；

所述引物对P1为：

上游引物：5’-CACGGAAGAGACAGACCAGTATT-3’；

下游引物：5’-TGGGGGAGAGTTCCATCTGTTT-3’。

2.根据权利要求1所述一种黄牛ACVR1基因***/缺失的检测方法，其特征在于：所述PCR扩增的反应体系包括10pmol/μL上游引物0.3～1μL、10pmol/μL下游引物0.3～1μL及50ng/μL模板DNA0.3～1μL。

3.根据权利要求1所述一种黄牛ACVR1基因***/缺失的检测方法，其特征在于：所述PCR扩增的反应程序包括以下步骤：95℃预变性5min；94℃变性30s，59.1℃复性30s，72℃延伸30s；共36个循环；72℃延伸10min。

4.根据权利要求1所述一种黄牛ACVR1基因***/缺失的检测方法，其特征在于：所述琼脂糖凝胶电泳采用的琼脂糖凝胶的质量浓度为3.5％。

5.根据权利要求1所述一种黄牛ACVR1基因***/缺失的检测方法，其特征在于：所述***/缺失多态位点的基因型为：***/***基因型表现为166bp一条带纹；***/缺失基因型表现为166bp和150bp两条带纹；缺失/缺失基因型表现为150bp一条带纹。

6.一种如权利要求1所述的黄牛ACVR1基因***/缺失的检测方法在黄牛分子标记辅助选择育种中的应用。

7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于：所述***/缺失多态位点的缺失/缺失基因型可作为黄牛胸围和管围指数的DNA标记。

8.一种黄牛ACVR1基因***/缺失的检测试剂盒，其特征在于：包括用于扩增包含ACVR1基因16-bp***/缺失多态位点的黄牛基因组DNA片段的引物对P1，所述引物对P1为：

上游引物：5’-CACGGAAGAGACAGACCAGTATT-3’；

下游引物：5’-TGGGGGAGAGTTCCATCTGTTT-3’。