CN109536617A - 猪incenp第四外显子区snp鉴定与应用 - Google Patents

猪incenp第四外显子区snp鉴定与应用 Download PDF

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Abstract

本发明属于猪分子标记制备领域，具体涉及猪INCENP第四外显子区SNP鉴定与应用。本发明得到一种与公猪繁殖性状关联的SNP分子标记，其核苷酸序列如SEQ ID NO:1，或SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3所示，在所述的SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3所示的序列327bp处分别存在一个C/T，C/T和T/C的突变，上述等位基因的突变引起Tsp45I‑RFLP的多态性。利用该分子标记在长白猪、大白猪中进行了与公猪繁殖性状的关联分析。还公开了该分子标记的分型检测方法，为公猪繁殖性状提供了新的标记，可用于公猪繁殖性状评测和遗传改良。

Description

猪INCENP第四外显子区SNP鉴定与应用
技术领域
本发明涉及猪育种与猪的分子标记辅助选择领域，具体涉及猪INCENP外显子区SNP作为公猪繁殖性状分子标记的鉴定与应用。
背景技术
分子标记辅助选择(MAS，marker-assisted selection)是随着现代分子生物学技术的迅速发展而产生的新技术，它可以从分子水平上快速准确地分析个体的遗传组成，从而实现对基因型的直接选择，进行分子育种。分子标记直接以DNA的形式表现，在生物体的各个组织各个发育阶段均可检测到，不受季节环境限制；多态性丰富，数量多；大多数为共显性，能区别纯合体和杂合体。因此，分子标记辅助选择具有高准确性，可用于早期选种，缩短世代间隔。利用分子标记辅助选择进行分子育种与常规育种相结合，可以加快品种改良的速度。
单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism,SNP)标记是同一物种不同个体基因组DNA的等位序列上单个核苷酸存在差别的现象，它具体是指由基因组单核苷酸变异引起的DNA序列多态性，包括碱基转换、颠换、单碱基***或缺失等，被公认为是最新的第三代DNA分子标记。根据SNP在基因中的位置可分为基因编码区SNP(coding-region SNP，cSNP)、基因周边SNP(perigenic SNP，pSNP)以及基因间SNP(intergenic SNP，iSNP)三类。SNP在DNA分子上分布不均匀，在非转录区SNP频率要高于转录区SNP频率，这可能是受进化中选择的压力影响。转录区的SNP一般与蛋白的表达有关，而非转录区的SNP则可以调控基因的表达。所以这两类SNP不仅都可以作为分子标记，还可能与一些动物的生产性状有直接关系。外显子是真核生物基因蛋白编码序列，是编码基因重要结构，单个核苷酸的变异可以引起氨基酸的改变，从而导致蛋白质结构组装和功能行使。因此，研究编码基因外显子SNP可以解释基因功能的变化。
内着丝粒蛋白(inner centromere protein，INCENP)是多功能性结构域蛋白，包含(135kD和155kD)两种类型多肽，这两种多肽参与细胞***过程染色体蛋白的分配。INCENP定位于姐妹染色单体连接的着丝粒处，可能参与姐妹染色单体的分离。***后期与着丝粒分离，随着染色体向两级移动，收缩形成环状区域，完成其功能(Cooke C A et al1987)。在有关大鼠的研究中，发现INCENP作为动态蛋白，在减数***过程中，随着不同时期的变化，其位置也随之而改变。在大鼠第一次减数***的前期和中期，INCENP聚集于着丝粒，中期在赤道板上形成环状；在第一次减数***后期，INCENP脱离染色体，INCENP平行于纺锤体轴穿越赤道板；第一次减数***末期，INCENP收缩成环，最终参与胞质***(Heck MM et al 1987)。着丝粒在细胞***过程的扮演角色不言而喻，内着丝粒蛋白作为保证着丝粒功能的重要蛋白质，如果其结构发生变化均会造成细胞***异常。INCENP作为多结构域蛋白质，包含氨基端和羧基端，同时还包含一个中央卷曲螺旋结构域基序。内部200多个氨基酸组成卷曲螺旋结构域，该结构能够结构蛋白二聚化组装(Yuan D et al 2015)。INCENP的羧基端有一个保守的60～80个氨基酸组成的IN-box结构域。减数***过程中，染色体乘客复合体中Aurora B激酶与IN-box结构域结合，磷酸化INCENP蛋白，INCENP的磷酸化和去磷酸化对着丝粒发挥功能有重要作用(Cormier A et al 2013)。在***发生整个过程，涉及***的增殖和分化，经过两次减数***形成***，因此INCENP作为细胞***过程重要蛋白质，影响***形成的整个过程。实验室数据表明INCENP在不同品种公猪睾丸中存在差异表达。有关公猪INCENP外显子区SNP的研究目前未见报道。因此在分子水平上研究公猪INCENP基因外显子区的SNP，分析其与公猪繁殖性状的关系，具有重要的意义。
发明内容
本发明目的在于克隆猪INCENP第四外显子区734bp的序列，其核酸序列如序列表SEQ ID NO:1(杜洛克猪)、SEQ ID NO:2(长白猪)、SEQ ID NO：3(大白猪)所示。通过对三个猪种的上述序列进行Cluster W比对，寻找SNP位点，建立相应的SNP分型方法，分析其与公猪繁殖性状的关系，为公猪的繁殖性状标记辅助选择提供有用的遗传标记。
这个分子标记是从三个猪品种的相同一段序列的比较重发现的，突变在同一个位点，其中杜洛克和长白猪中是C，而在大白猪中为T。这种差异可能与猪的一些性状差异有关。所以可以作为一个标记。不是三个标记，实在三个品种的不一样从而可作为一个标记。
本发明通过以下技术方案实现：
选择杜洛克猪、长白猪、大白猪为实验材料，分别从三个猪品种如杜洛克猪、长白猪和大白猪猪血液中提取基因组DNA，以猪INCENP基因的mRNA序列为种子，在猪的基因组中进行比对，根据其外显子序列设计如下引物：
正向引物F：5'CTCCGCAGCAAGGACAAGG 3'，
反向引物R：5'AGGCACAAAGGACCACCCAC 3'；
利用该引物对对INCENP基因进行PCR扩增，通过PCR产物回收、克隆和测序后，利用Cluster W进行序列比对。得到猪INCENP即位于该734bp扩增片段内部的1处的单核苷酸多态性(SNP)，即：在序列表SEQ ID NO:1所示序列的327位碱基处存在一个C/T突变(杜洛克猪)，在序列表SEQ ID NO:2所示序列的327位碱基处存在一个C/T突变(长白猪)，在序列变SEQ ID NO：3所示序列的327位碱基处存在一个T/C突变(大白猪)，上述等位基因的突变导致Tsp45I酶切位点的改变。其SNP位点如图2所示。
本发明提供了检测上述序列327bp处C/T变异的Tsp45I-RFLP基因型分型方法。
进一步本发明提供了利用Tsp45I-RFLP方法确定不同基因型个体与公猪繁殖性状之间的相关关系的关联分析的应用。
附图说明
图1：杜洛克猪、长白猪、大白猪INCENP基因第四外显子区域734bp片段的扩增条带。附图标记说明：图中泳道：M为DS2000Marker，其他泳道为猪INCENP基因第四外显子区域734bp片段的扩增条带。
图2：杜洛克猪、长白猪、大白猪INCENP基因第四外显子区域734bp序列的比对结果和SNP位点(碱基加方框的为突变后的碱基)。
图3：猪INCENP第四外显子区域PCR-Tsp45I-RFLP检测结果。琼脂糖浓度为2﹪。附图标记说明：泳道M为DS2000Maker，泳道1、3-7为TT基因型，泳道2为CC基因型，泳道8为AB基因型。
具体实施方式
对序列表的说明：
序列表SEQ ID NO:1是克隆的杜洛克猪INCENP基因第四外显子区域的核苷酸序列。长度为734bp。在该序列的327位碱基处的T是突变后的碱基。
序列表SEQ ID NO:2是克隆的长白猪INCENP基因第四外显子区域的核苷酸序列。长度为734bp。在该序列的327位碱基处的T是突变后的碱基。
序列表SEQ ID NO:3是克隆的大白猪INCENP基因第四外显子区域的核苷酸序列。长度为734bp。在该序列的327位碱基处的C是突变后的碱基。
实施例1利用苯酚抽提法提取公猪***基因组DNA
将现场所采公猪(来自广西扬翔猪基因科技有限公司下属亚计山猪人工授精中心，为常规报道的美系杜洛克猪、长白猪、大白猪品种，下同)新鲜***注入10ml离心管中，于-20℃冷冻保存。在0℃以下运输至实验室，然后水浴解冻，提取公猪***基因组DNA。具体步骤如下：
(1)取1ml猪的***，置于一支2ml离心管中，5000rpm 7min离心，弃上清。
(2)每支离心管加入1000ul***洗涤液(1M Tris-Hcl(PH＝8.0)10ml，0.5M EDTA(PH＝8.0)20ml，5M NaCl 100ml，加入ddH2O 870ml，混合均匀，常规高压蒸汽灭菌，室温下保存)或生理盐水，反复吹打混匀，12000rpm 7min离心，弃上清。
(3)重复以上洗涤步骤1～2次。
(4)每支离心管加入1000ul***裂解液(0.5M EDTA 2ml，1M Tris-Hcl 1ml，10％SDS 10ml，β-巯基乙醇2ml，5M NaCl 2ml，加入双蒸水80ml，混合均匀，常规高压蒸汽灭菌，室温保存。)和15～20ul蛋白酶K(10mg/ml)，充分吹打混匀，55℃消化过夜(12h左右)。
(5)每支离心管加入样品等体积约1000ul苯酚，剧烈颠倒震荡10min使两相充分混匀，直至形成乳白色偏黄的乳浊液，4℃12000rpm离心15min，转移上清液至另一干净离心管；离心后液体分3层，下层淡黄色液体为苯酚，中层乳白色的为蛋白质，上层清亮上清液溶有DNA。吸取上清液时缓慢吸取，小心不要吸到蛋白质，可以事先准备好剪掉尖端的蓝色移液枪头以减少机械剪切力，并防止搅动液面。由于***提取DNA蛋白质较多，容易蛋白污染，以上苯酚抽提步骤根据情况可以重复1～2次。
(6)分别加入上清液等体积的苯酚/氯仿/异戊醇(体积比为25：24：1)，充分颠倒震荡10min，4℃12000rpm离心10min，转移上清液至另一干净离心管。
(7)往上清液中加入等体积的氯仿异戊醇(体积比为24:1)，重复上述抽提步骤。
(8)向最后获得的上清液中加入2.5倍体积(约1300ul)的无水乙醇(-20℃过夜预冷)和十分之一体积(约60ul)的醋酸钠(NaAC，pH 5.2)以沉淀DNA，颠倒晃动离心管，若提取成功，应能看到絮状成团的DNA分子。
(9)用枪头将DNA沉淀挑出，置于装有对应号码的EP管中，室温下让乙醇挥发干净，加入适量的超纯水溶解DNA。
(10)在DNA浓度测定仪上测定其浓度与纯度，并在1％琼脂糖凝胶80伏电泳约2h，紫外灯下检测DNA提取质量。
实施例2:公猪INCENP第四外显子区域特异DNA片段的获得及单核苷酸多态性(SNP)检测方法的建立
选择外来血缘的猪，例如美系“杜洛克猪”、“长白猪”、“大白猪”(来自广西扬翔猪基因科技有限公司下属亚计山猪人工授精中心，为常规报道的美系品种，实施本发明不限于上述品种)以猪INCENP基因(GeneBank登录号为NC_010444)的mRNA序列为种子，在猪的基因组中进行比对，根据其第四外显子序列设计如下引物：
正向引物F：5’CTCCGCAGCAAGGACAAGG 3’，
反向引物R：5’AGGCACAAAGGACCACCCAC 3’；
分别以杜洛克猪、长白猪、大白猪血液基因组DNA为模板，用上述引物对进行PCR扩增(见图1)。
PCR反应体系见表1。
表1 PCR反应体系
PCR反应条件见表2。
表2 PCR反应条件
PCR产物经回收、克隆后，进行序列测定。测序工作由上海生工生物工程股份有限公司完成。经Cluster W比对分析，序列比对结果见图2。上述片段大小为734bp，在该序列的327位碱基处存在C/T变异，该等位基因的突变引起了Tsp45I酶切位点多态性。
取PCR扩增产物8μl，加入限制性内切酶INCENP1μl，10×bufferR 2μl，于37℃酶切。酶切产物经2﹪琼脂糖凝胶电泳检测，在紫外灯下观察并记录酶切结果。酶切后片段分为3种基因型：CC基因型有734bp一条带；CT基因型有734bp、327bp和407bp三条带；TT基因型有327bp、407bp两条带。结果如图3所示。
实施例3：本发明克隆的分子标记与公猪繁殖性状的关联分析及应用
基因型频率和等位基因频率的统计
基因型频率：是指一个群体中特定基因型占群体内全部基因型的比例。基因型频率的统计方法为：基因型频率＝该基因型个体数/测定群体总数
等位基因频率：是指一个群体中某一基因占该位点上总基因的相对比例。等位基因频率的统计方法：该基因纯合子基因型频率+含有该基因的杂合子基因型频率/2
表3 INCENP第四外显子区SNP在2个品种猪中基因型频率和等位基因频率
为了确定猪INCENP基因第四外显子区域SNP与公猪繁殖性状表型差异是否相关，选择了广西扬翔猪基因科技有限公司下属亚计山猪人工授精中心公猪群中193头公猪为试验材料，其中长白猪124头、大白猪69头，采用PCR-Tsp45I-RFLP方法进行多态性检测，进行基因型频率和等位基因频率的统计，并分析猪NTF3基因5’侧翼启动子区SNP不同基因型与公猪繁殖性状的相关关系。采用SAS统计软件glm程序进行单标记方差分析，模型如下：
模型Yijkl＝μ+Gi+Pj+Ak+Sl+eijkl
其中Yijkh为公猪繁殖性状值，μ为群体均值，Gi为基因型效应，Pj为家系效应，Ak为年龄效应，Sl为季节效应，eijkl为随机残差。并假定服从N(0，S2)。文中关联分析数据采用最小二乘均值±标准误表示。
表4长白猪中INCENP基因不同基因型与公猪繁殖性状的统计分析
注：以上数值为最小二乘均值±标准误；同行含有相同字母表示差异不显著，不同小写字母表示差异显著(P<0.05)，不同大写字母表示差异极显著(p<0.01)；基因效应*表示p<0.05，**表示p<0.01
由表4可知，在长白猪公猪***量性状方面，CC基因型与CT基因型公猪***量显著高于TT基因型(P<0.05)，且该性状的加性效应显著(P<0.05)。在***直线速度方面，CT基因型公猪***直线速度显著高于TT基因型(P<0.05)，且该性状显性效应显著(P<0.05)。以上分析可知，CT基因型在长白猪公猪种群中为优势基因型。
表5大白猪中INCENP基因不同基因型与公猪繁殖性状的统计分析
注：以上数值为最小二乘均值±标准误；同行含有相同字母表示差异不显著，不同小写字母表示差异显著(P<0.05)，不同大写字母表示差异极显著(p<0.01)；基因效应*表示p<0.05，**表示p<0.01
由表5可知，在大白猪公猪***量性状方面，CT基因型公猪***量显著大于CC与TT基因型(P<0.05)，且显性效应显著(P<0.05)。在***畸形率方面，CT基因型公猪***畸形率显著低于TT基因型(P<0.05)，且加性效应显著(P<0.05)。以上分析可知，CT基因型在大白猪公猪种群中为优势基因型。
序列表
<110> 华中农业大学
<120> 猪INCENP第四外显子区SNP鉴定与应用
<141> 2018-12-05
<160> 3
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 734
<212> DNA
<213> 猪(Sus scrofa)
<220>
<221> exon
<222> (1)..(734)
<220>
<221> mutation
<222> (327)..(327)
<400> 1
ctccgcagca aggacaaggt ggagaagctg gccacggtgg tggcagaaaa cggctccgtc 60
ctgcggcggg tgacccgtgc tacggccgcc gctgccactg ccactgcggc agtgacggcg 120
atggcccctg agtctcccac gacgctgacc aagaagccca gggatagcct ggccccatgc 180
ccgctggtgc ccatggtgga gataggtgcc agcgagcgcc agagcgccga gcagcacctc 240
agccagctcc acactgccca ggccccggcc tccacggatg aggactcaac gcccaagaag 300
tcagaggcca gcagaccgga gcccgttacc gtgagctccc tgatgaccac accccagggc 360
cccaagggcc gaggggtcgg agcagggcgc tccgcctcca agctccggat cgcggtgggc 420
tccccgggcc cgcaggactc gcctggctct ccagcctccc cgtggcagga gcgggtgctg 480
gcgcccatcc tgccagataa tttctccacg cccacgggct cccgcgtgga ccggcggtca 540
gtgcggcgca gcctgatcac cccgggctcc caggtcttgc cggcccagca gtccgcccag 600
gtttccaaag agcagagcac cgtccgaaga tcaagccgaa agattgccaa gaaggccacc 660
aaagagccgg ctgcttctgc ccgcatcatc tgtgagtctg gggtcaaggg tgtggtgggt 720
ggtcctttgt gcct 734
<210> 2
<211> 734
<212> DNA
<213> 猪(Sus scrofa)
<220>
<221> exon
<222> (1)..(734)
<220>
<221> mutation
<222> (327)..(327)
<400> 2
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ctgcggcggg tgacccgtgc tacggccgcc gctgccactg ccactgcggc agtgacggcg 120
atggcccctg agtctcccac gacgctgacc aagaagccca gggatagcct ggccccatgc 180
ccgctggtgc ccatggtgga gataggtgcc agcgagcgcc agagcgccga gcagcacctc 240
agccagctcc acactgccca ggccccggcc tccacggatg aggactcaac gcccaagaag 300
tcagaggcca gcagaccgga gcccgttacc gtgagctccc tgatgaccac accccagggc 360
cccaagggcc gaggggtcgg agcagggcgc tccgcctcca agctccggat cgcggtgggc 420
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<210> 3
<211> 734
<212> DNA
<213> 猪(Sus scrofa)
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<222> (1)..(734)
<220>
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ggtcctttgt gcct 734

Claims (4)

1.一种与公猪繁殖性状关联的SNP标记，其核苷酸序列如SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3所示，在上述序列的327位碱基处分别存在一个C/T，C/T或T/C的等位基因突变；上述突变分别导致Tsp45I酶切位点的改变，并分别引起Tsp45I-RFLP多态性。
2.扩增权利要求1所述序列的引物对，其特征在于，所述引物对的序列如下所示：
正向引物CTCCGCAGCAAGGACAAGG，
反向引物AGGCACAAAGGACCACCCAC。
3.权利要求1所述的SNP标记在公猪繁殖性状评测和辅助选择中的应用。
4.权利要求2所述的引物对在公猪繁殖性状评测和辅助选择中的应用。
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