CN107529770A - 用于高蛋白发酵奶产品的蛋白酶 - Google Patents

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Abstract

本披露提供了关于制备具有高蛋白质含量的发酵奶产品例如高蛋白酸奶、希腊酸奶、浓缩酸奶或酸性稀奶油的组分、方法和用途，所述制备包括将微生物和外源性蛋白酶应用于具有至少或大于6.5％的蛋白质含量的奶底物。设想了类别EC 3.4.21(丝氨酸内肽酶)、EC 3.4.24(金属内肽酶)和EC 3.4.17(金属羧肽酶)的蛋白酶的应用。尤其是中性蛋白酶(Protex 7L)和Protex 6L的应用导致粘度降低和良好风味。

Description

用于高蛋白发酵奶产品的蛋白酶
相关申请的交叉引用
本申请要求于2015年4月6日提交的题目为“Proteases for High ProteinFermented Milk Products[用于高蛋白发酵奶产品的蛋白酶]”的美国临时专利申请号62/143,639的优先权和权益。
通过引用并入序列表
将于2016年1月26日创建的并与此一道提交的、大小为73,308字节的名称为“20160126_NB40943PCT_ST25.txt”的文件中提供的序列表通过引用以其整体并入本文。
技术领域
本发明涉及一种制备发酵奶产品的酶法。该方法包括用一种或多种蛋白酶和微生物处理包含4％(w/w)或更高蛋白质含量的奶底物；并且允许经处理的奶底物发酵以产生发酵奶产品。
背景技术
最近的研究描述了更高的蛋白质摄入可以具有的积极效果，例如更好的体重控制、更高的肌肉力量和肌肉减少症的延迟发作(Loveday等人，2009；Luhovyy等人，2007；Hayes和Cribb，2008；Campbell和Leidy，2007)。这些积极效果导致对富含蛋白质的产品的需求不断增加，并且推动了食品工业开发更多更好的产品，并解决了高蛋白食品普遍低稳定性的问题(Labuza等人，2007；Zhou和Labuza，2006)。高蛋白食品的主要问题之一是随着时间的推移，高蛋白食品常常在营养特性和物理特性方面发生改变。
具有高蛋白含量的酸奶可能显示出营养特性以及工艺特性方面的变化。虽然营养变化(如饱和感的强调)主要是有利的，但是工艺特性(例如典型增稠和凝胶化特性)引起加工、质地和流变学变化。在大多数情况下，这些变化是不利的(Bertenshaw等人，2008；Purwanti等人，2010)。
在酸奶中，较高的蛋白质含量产生更紧密的产品基质，其中蛋白质之间的距离减小，从而导致产品在储存期间硬化和脱水收缩(Purwanti等人，2010；Labuza等人，2007；Zhou和Labuza，2006)。此外，在普通热处理期间，聚集可以发生在富集蛋白质的乳产品悬浮液中(Singh和Nath，2004)。此外，感官特性受到这些质地变化的影响，改变了酸奶在硬度、粘度和视觉外观方面的感官特性，这些质地变化有助于消费者对这些产品的可接受性(Lee和Lucey，2004a，b；Lucey，2002)。
本披露通过提供改善高蛋白奶产品的特性(例如流变学特性)的组分、方法和用途解决了这些问题，例如，酸奶产品的粘度和整体可接受性。
发明内容
本披露提供了用于制备奶产品的组分和方法。
在以下分别编号的段落中阐述了组分和方法的多个方面和实施例。
1.一种用于制备发酵奶产品的方法，该方法包括：
(a)用一种或多种蛋白酶和微生物处理包含4％(w/w)或更高蛋白质含量的奶底物；并且
(b)允许经处理的奶底物发酵以产生发酵奶产品。
2.如段落1所述的方法，其特征在于该奶底物的蛋白质含量为10％(w/w)或更高。
3.如段落1或2所述的方法，其特征在于，将该奶底物用蛋白质强化或进行浓缩以便增加其蛋白质含量到至少4％(w/w)。
4.如前述段落中任一项所述的方法，其中所述一种或多种蛋白酶中的一种属于酶委员会(E.C.)编号3.4.17、3.4.21或3.4.24。
5.如前述段落中任一项所述的方法，其中所述一种或多种蛋白酶中的一种来自M4家族。
6.如前述段落中任一项所述的方法，其中所述一种或多种蛋白酶中的一种是金属蛋白酶。
7.如段落6所述的方法，其中所述蛋白酶与SEQ ID No.3的氨基酸序列具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的同一性。
8.如段落7所述的方法，其中所述蛋白酶与SEQ ID No.3的氨基酸序列具有至少90％的同一性。
9.如段落8所述的方法，其中所述蛋白酶与SEQ ID No.3的氨基酸序列具有至少95％的同一性。
10.如段落1至3中任一项所述的方法，其中所述一种或多种蛋白酶中的一种是枯草杆菌蛋白酶、丝氨酸蛋白酶、酸性蛋白酶或中性蛋白酶。
11.如段落10所述的方法，其中所述蛋白酶与SEQ ID No.1的氨基酸序列具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的同一性。
12.如段落11所述的方法，其中所述蛋白酶与SEQ ID No.1的氨基酸序列具有至少90％的同一性。
13.如段落12所述的方法，其中所述蛋白酶与SEQ ID No.1的氨基酸序列具有至少95％的同一性。
14.如段落10所述的方法，其中所述蛋白酶与SEQ ID No.2的氨基酸序列具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的同一性。
15.如段落14所述的方法，其中所述蛋白酶与SEQ ID No.2的氨基酸序列具有至少90％的同一性。
16.如段落15所述的方法，其中所述蛋白酶与SEQ ID No.2的氨基酸序列具有至少95％的同一性。
17.如前述段落中任一项所述的方法，其中在巴氏灭菌步骤之前用所述一种或多种蛋白酶处理所述奶底物。
18.如前述段落中任一项所述的方法，其中将所述一种或多种蛋白酶与所述微生物一起添加。
19.如前述段落中任一项所述的方法，其中在巴氏灭菌步骤之前，将枯草杆菌蛋白酶、丝氨酸蛋白酶、酸性蛋白酶或中性蛋白酶添加到该奶底物中。
20.如段落19所述的方法，其中在巴氏灭菌步骤之前，将枯草杆菌蛋白酶或丝氨酸蛋白酶添加到该奶底物中。
21.如前述段落中任一项所述的方法，其中将金属蛋白酶与所述微生物一起添加。
22.如前述段落中任一项所述的方法，其中在巴氏灭菌步骤之前将枯草杆菌蛋白酶或丝氨酸蛋白酶添加到该奶底物中，并且其中将金属蛋白酶与所述微生物一起添加。
23.如段落19、20或22所述的方法，其中所述枯草杆菌蛋白酶或丝氨酸蛋白酶与SEQ ID No.1或SEQ ID No.2的氨基酸序列具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的同一性。
24.如段落21或22所述的方法，其中该金属蛋白酶与氨基酸SEQ ID No.3具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的同一性。
25.根据前述段落中任一项所述的方法，其中该微生物是乳酸菌。
26.根据段落25所述的方法，其中该微生物属于链球菌属(Streptococcus)、乳球菌属(Lactococcus)、乳杆菌属(Lactobacillus)、明串珠菌属(Leuconostoc)、假明串珠菌属(Pseudoleuconostoc)、片球菌属(Pediococcus)、丙酸杆菌属(Propionibacterium)、肠球菌属(Enterococcus)、短杆菌属(Brevibacterium)或双歧杆菌属(Bifidobacterium)或其任何组合。
27.根据段落25或26所述的方法，其中该微生物是嗜热培养物YO-MIXTM 860。
28.一种发酵奶产品，其可通过如前述段落中任一项所述的方法获得。
29.一种发酵奶产品，其具有4％(w/w)或更高蛋白质含量并且包含一种或多种外源性蛋白酶和外源性微生物。
30.如段落29所述的发酵奶产品，其特征在于，该奶底物的蛋白质含量为10％(w/w)或更高。
31.如段落29或30所述的发酵奶产品，其特征在于，将该奶底物用蛋白质强化或进行浓缩以便增加其蛋白质含量到至少4％(w/w)。
32.如段落29-31中任一项所述的发酵奶产品，其中所述一种或多种蛋白酶中的一种属于酶委员会(E.C.)编号3.4.17、3.4.21或3.4.24。
33.如段落29-32中任一项所述的发酵奶产品，其中所述一种或多种蛋白酶中的一种来自M4家族。
34.如段落29-33中任一项所述的发酵奶产品，其中所述一种或多种蛋白酶中的一种是金属蛋白酶。
35.如段落29-31中任一项所述的发酵奶产品，其中所述一种或多种蛋白酶中的一种是枯草杆菌蛋白酶、丝氨酸蛋白酶、酸性蛋白酶或中性蛋白酶。
36.根据段落29-35中任一项所述的发酵奶产品，其中该微生物是乳酸菌。
37.根据段落36所述的发酵奶产品，其中该微生物属于链球菌属、乳球菌属、乳杆菌属、明串珠菌属、假明串珠菌属、片球菌属、丙酸杆菌属、肠球菌属、短杆菌属或双歧杆菌属或其任何组合。
38.根据段落36或37所述的发酵奶产品，其中该微生物是嗜热培养物YO-MIXTM860。
39.根据段落28至38中任一项所述的发酵奶产品，其中该发酵奶产品是高蛋白酸奶、希腊酸奶、浓缩酸奶(Labneh)或酸性稀奶油。
40.蛋白酶在生产高蛋白发酵奶产品中用于以下各项的用途：
(a)改进粘度；
(b)改进胶凝强度；
(c)改进质地；
(d)改进凝乳的硬度；
(e)提供较早的发酵开始；
(f)提供凝胶化的较早开始；
(g)提供较早的发酵结束；
(h)减少脱水收缩；
(i)改进保质期；
(j)改进风味；
(k)减小黏性；或
(l)(a)至(k)的任何组合。
41.一种参考实例中的任一个、基本如上文所描述的方法、发酵奶产品或用途。
附图说明
通过参考对说明性实施例进行阐述的以下详细说明，将获得对本发明的特征和优点的更好理解，在这些实施例中利用了本发明的原理，并且在这些附图中：
图1示出了在储存5天后，在巴氏灭菌前90分钟，添加P7L对具有10％的蛋白质含量的搅拌酸奶的剪切粘度的影响。用SMP将乳标准化，并在43℃下使用YM 410发酵至最终pH为4.6。
图2A-2D示出了添加P6L对具有10％的蛋白质含量的搅拌酸奶的剪切粘度的影响。在5℃下储存14天后。(A：YM 860，SMP；B：YM 860，MP70；C：YM 410，SMP；D：YM 410，MP70)发酵条件：43℃，pH：4.6
图3A-3D示出了在巴氏灭菌后，添加P6L和P7L对具有10％的蛋白质含量的搅拌酸奶的剪切粘度的影响。在5℃下储存5天后。(P6L：A：SMP；B：MP70；P7L：C：SMP；D：MP70)发酵条件：43℃，pH：4.6
图4示出了来自实例2的样品1-4的std1。
图5示出了来自实例2的样品1-4的能量。
图6示出了来自实例2的样品1-4的热比率。
图7示出了来自实例2的样品1-4的近热比率。
图8A和B分别示出了SEQ ID No.1和Seq ID.No.2。
图9A-U示出了几种酶的序列。
图10示出了在添加和不添加NP7L的浓缩酸奶发酵中表观粘度的增加。
图11示出了添加和不添加NP7L的浓缩酸奶发酵的预测口腔中稠度。
图12示出了添加和不添加NP7L的浓缩酸奶发酵的预测口腔中粘性。
图13示出了在添加和不添加NP7L的、含有9％(w/w)脂肪的酸性稀奶油中表观粘度的增加(上升曲线)。
图14示出了酸性稀奶油发酵(具有蛋白质强化、具有NP7L或两者结合)的预测“口腔中稠度”
图15示出了酸性稀奶油发酵(具有蛋白质强化、具有NP7L或两者结合)的预测口腔中粘性。
图16示出了添加和不添加NP7L的、含有酸性稀奶油的9％(w/w)脂肪的感官评价的蜘蛛图(***两种酶促的样品都不同于非酶化的(p<0.05))。
图17示出了在发酵之前浓缩乳、随后乳酸发酵(YO-MIX 860，43C；1.5％(w/w)脂肪；添加和不添加NP7L；***p<0.001，**p<0.01，*p<0.05)的蜘蛛图。
图18示出了在发酵之前浓缩乳、随后乳酸发酵(YO-MIX 860，43C；0.25％(w/w)脂肪；添加和不添加NP7L；***p<0.001，**p<0.01，*p<0.05)的蜘蛛图。
图19示出了具有8％(w/w)蛋白质(A)和9％(w/w)蛋白质(B)的、含有强化高蛋白质的酸奶的感官分析。
发明详述
本披露提供了改善高蛋白奶产品的特性的方法、装置、组分和试剂盒。在一些实施例中，本披露提供了通过使用一种或多种酶改善高蛋白质富集的奶产品的特性的方法、装置、组分和试剂盒。在一些实施例中，本披露提供了改善富含蛋白质的发酵奶产品的流变学特性和整体可接受性(例如，富含蛋白质的酸奶产品的粘度)的方法、装置、组分和试剂盒。
除非另外定义，本文所用的全部技术术语和科学术语具有与本披露所属领域的普通技术人员通常所理解的相同意义。Singleton等人，DICTIONARY OF MICROBIOLOGY ANDMOLECULAR BIOLOGY[微生物学和分子生物学词典]，第20版，John Wiley and Sons[约翰威利父子公司]，纽约(1994)，以及Hale和Marham，THE HARPER COLLINS DICTIONARY OFBIOLOGY[哈珀柯林斯生物学词典]，Harper Perennial[哈珀永久出版社]，纽约州(1991)为技术人员提供了本披露中所使用的许多术语的通用词典。
本披露并不受本文披露的示例性方法和材料的限制，并且与本文所述的那些方法和材料相似或等同的任何方法和材料都可以用于本披露的实施例的实践或测试。数值范围包括限定范围的数值在内。除非另外指明，任何核酸序列均以5'至3'取向从左到右书写，氨基酸序列以氨基至羧基取向从左到右书写。
本文提供的标题并不是对本披露的各个方面或实施例的限制，这些方面或实施例可以通过将本说明书作为一个整体来参考而得到。因此，把说明书作为一个整体参考时，以下立即定义的术语得以更全面地定义。
必须注意，除非上下文另外明确指示，否则如在此和所附权利要求中所使用，单数形式“一个/一种(a/an)”和“该”包括复数指示物。因此，例如提及“蛋白酶”包括多个这样的酶，并且提及“饲料”包括提及一种或多种饲料以及本领域技术人员已知的其等效物，等等。
本文讨论的出版物只是为了它们在本申请的提交日之前的披露内容而提供。本文中的内容都不应理解为承认此类出版物构成所附权利要求书中的现有技术。
奶产品
在一些实施例中，本发明提供了改善发酵奶产品的特性的方法、装置、组分和试剂盒。
“发酵奶产品”是还可以称为“食物产品”或“饲料产品”的产品，优选食用产品。发酵奶产品是通过用微生物(如下所定义)发酵而产生的产品。
在一些实施例中，该发酵奶产品是奶产品，优选酸奶、希腊酸奶、浓缩酸奶、冷冻酸奶、干酪(例如酸凝乳干酪、硬干酪、半硬干酪、白软干酪)、黄油、酪乳、奶渣、酸性稀奶油、开菲尔(kefir)、基于发酵乳清的饮料、乳酒、乳饮料、酸奶饮料、发酵乳、熟化奶油、清爽干酪、乳、发酵乳、凝乳、奶产品滞留物、加工奶酪、白软干酪、奶油甜点或婴儿奶粉。在一些实施例中，该发酵奶产品是酸奶，优选凝固酸奶或搅拌酸奶。
搅拌的酸奶已经在发酵后搅拌至少5至60秒。最优选地，搅拌的酸奶已经在发酵后搅拌至少10秒。最优选地，搅拌的酸奶已经在发酵后搅拌至少20秒。在优选的实施例中，搅拌的酸奶已经在发酵后搅拌至少30秒。搅拌可以用手动混合器或电动混合器进行。凝固酸奶在发酵后不搅拌。发酵后可以将凝固酸奶冷却然后储存。这是在不搅拌的情况下进行的。
如以上使用的短语“发酵后”意指当发酵结束时。当达到发酵培养物的特定pH时，发酵优选地结束。该pH优选在3与6之间，最优选在4与5之间。在一个实施例中，发酵结束时的pH是4.1。在另外的实施例中，发酵结束时的pH是4.2。在另一个实施例中，发酵结束时的pH是4.3。在另一个实施例中，发酵结束时的pH是4.4。在另一个实施例中，发酵结束时的pH是4.5。在另一个实施例中，发酵结束时的pH是4.6。在另一个实施例中，发酵结束时的pH是4.7。在另一个实施例中，发酵结束时的pH是4.8。在另外的实施例中，发酵结束时的pH是4.9。
在一些实施例中，发酵在使如下所述使用的低pH敏感性肽酶的活性失活或降低的pH下结束。这是pH 4.6-4.8。
如本文所用，术语“酸奶(yoghurt)”是具有相同含义的“酸奶(yogurt)”的替代拼写。
在优选的实施例中，在发酵步骤期间或之后搅拌发酵奶产品。优选搅拌进行至少5至60秒或多于60秒。在一个实施例中，搅拌进行至少10至30秒。在另外的实施例中，搅拌进行至少12至20秒。在优选的实施例中，搅拌进行至少15秒。搅拌可以用手动混合器或电动混合器进行。
在一个实施例中，将该发酵奶产品冷却，优选立即进行。这种冷却可以例如使用水浴或热交换器进行。优选将该发酵奶产品冷却至20℃-30℃。最优选将该发酵奶产品冷却至约25℃或至25℃。
可替代地，在一个实施例中，将该发酵奶产品冷却至1℃-10℃的较低温度，最优选4℃-6℃。在一个实施例中，通过将该发酵奶产品置于冷室或冰箱中来缓慢地进行冷却。
在优选的实施例中，将该发酵奶产品立即冷却至20℃-30℃，最优选冷却至约25℃或至25℃。然后将该发酵奶产品冷却第二次，但这次冷却至1℃-10℃，最优选4℃-6℃。在一个实施例中，将该发酵奶产品冷却第二次至3℃。在另一个实施例中，将该发酵奶产品冷却第二次至4℃。在另外的实施例中，将该发酵奶产品冷却第二次至5℃。
在一些实施例中，将该第二次冷却缓慢进行例如超过10至48个小时。在一个实施例中，冷却进行超过12至20小时。在优选的实施例中，冷却进行超过15至20小时。在最优选的实施例中，冷却进行超过10小时或冷却进行超过15小时。最优选地，在冷室或冰箱中进行该第二次冷却。
在一些实施例中，在发酵后和任何冷却步骤之前立即进行上述搅拌。搅拌还可以在两个冷却步骤之间进行。
本发明的方法可以进一步包括发酵后的储存步骤。这可以在搅拌和/或冷却(一次或多次)之后进行，优选在两者之后进行。
通过本发明的方法生产的发酵奶产品具有以下特征中的一个或多个：
(a)改善的粘度；(b)改善的凝胶强度；(c)改善的质地；(d)改善的凝乳的硬度；(e)较早的发酵开始；(f)较早的凝胶化开始；(g)较早的发酵结束；(h)降低的脱水缩合；(i)改进的保质期；(j)改善的风味(例如，较少的异味)；(k)降低的粘性；或(l)(a)至(k)的任何组合。
在一个实施例中，通过本发明的方法生产的发酵奶产品具有改善的粘度。
在一个实施例中，通过本发明的方法生产的发酵奶产品具有改善的凝胶强度。
在一个实施例中，通过本发明的方法生产的发酵奶产品具有改善的质地。
在另外的实施例中，通过本发明的方法生产的发酵奶产品具有改善的凝乳硬度。
在一个实施例中，通过本发明的方法生产的发酵奶产品具有较早的发酵开始。
在另外的实施例中，通过本发明的方法生产的发酵奶产品具有较早的凝胶化开始。
在优选的实施例中，通过本发明的方法生产的发酵奶产品具有较早的发酵结束。
在一个实施例中，通过本发明的方法生产的发酵奶产品具有降低的脱水收缩。
在优选的实施例中，通过本发明的方法生产的发酵奶产品具有改进的保质期。
在优选的实施例中，通过本发明的方法生产的发酵奶产品具有改善的风味。
在优选的实施例中，通过本发明的方法生产的发酵奶产品具有降低的粘性。
这些特征改变该发酵奶产品(优选酸奶)的质地，并且还改变口感和味道。在一些实施例中，通过本发明的方法生产的发酵奶产品具有改善的味道，例如较少的异味和/或较少的苦味。
本发明的发酵奶产品比不通过本发明的方法生产的和/或不使用本文所述的一种或多种酶生产的发酵奶产品(最优选酸奶)还具有更长的保质期。
如本文所用，“更长的保质期”是指该发酵奶产品可以储存更长时间而不会改变质地、口感或味道，或者产品的脱水收缩增加。
储存优选在低温、优选低于10℃、最优选0℃-10℃、并且更优选4℃-6℃下进行。
在一些实施例中，通过本发明的方法生产的发酵奶产品(最优选酸奶)的保质期相比于不通过本发明的方法生产的和/或不使用本文所述的一种或多种酶生产的发酵奶产品的保质期增加了5至28天。
在一些实施例中，通过本发明的方法生产的发酵奶产品的保质期相比于不通过本发明的方法生产的和/或不使用本文所述的酶生产的发酵奶产品的保质期增加了5至28天。
当比较这两种发酵奶产品时，例如通过本发明的方法生产的产品与通过其他方法生产的一种产品相比，它们应当是相同类型的发酵奶产品，例如酸奶。这在以下实例中展示。
如本文所用，术语“奶底物”可以涵盖任何乳或奶产品。特别地，该奶底物可以是动物来源的，特别是牛奶、绵羊奶或山羊奶。在一个实施例中，该奶底物可以是减脂乳、1％脂肪乳、0.1％脂肪乳、半脱脂乳(semi-skimmed milk)或脱脂乳(skimmed milk)(分别也称为半脱脂乳(semi-skim milk)和脱脂乳(skim milk))。该奶底物还可以是混合乳。奶底物是对其应用如本文所述的本发明的方法的起始材料。
如本文所用的“接种的奶底物”是指向其中加入乳酸菌(LAB)的奶底物。
本发明的方法中使用的奶底物具有4％(w/w)或更高的蛋白质含量。例如，该奶底物可以具有4.5％、5％、5.5％、6％、6.5％、7％、7.5％、8％、8.5％、9％、9.5％或10％(w/w)或更多的蛋白质含量。蛋白质含量通常是按照蛋白质重量比体积(w/v)或蛋白质重量比总重量(w/w)来测量。在本文未指定的情况下，可以假设蛋白质含量的测量按照蛋白质重量对总重量(w/w)进行的。具有4％(w/w)或更多的蛋白质含量的奶底物或发酵奶产品在本文中称为“高蛋白”。
在20℃下，乳的密度通常落在1.026kg/L至1.034kg/L内。脱脂乳(non-fat milk)比全脂乳具有更高的密度，并且更高的蛋白质导致更高的密度。乳的密度根据其成分的质量含量由其成分的密度给出。以下各乳组分的密度(在20℃下)主要贡献乳密度：水0.998g/cm3；脂肪0.931g/cm3；蛋白质1.451g/cm3(平均)；乳糖1.545g/cm3(平均)；盐3.000g/cm3。由于乳具有约1kg/L的典型密度，所以按照蛋白质重量比体积(w/v)或蛋白质重量比总重量(w/w)测量或表示的蛋白质含量将提供非常相似的结果，因此可被视为等效测量。
该奶底物可以被标准化或均质化。例如，可以按1％至20％或更多的蛋白质含量(w/w)将该奶底物标准化。在一些实施例中，可以按4％-15％蛋白质(w/w)将该奶底物标准化。在一些实施例中，可以按在或约6％蛋白质(w/w)将该奶底物标准化。在其他实施例中，可以按在或约10％蛋白质(w/w)将该奶底物标准化。在一些实施例中，可以按大约高于4％或大约高于10％蛋白质(w/w)将该奶底物标准化。
可替代地，可以按1％至20％或更多的蛋白质重量比体积(w/v)将该奶底物标准化。在一些实施例中，可以按4％-15％蛋白质w/v将该奶底物标准化。在一些实施例中，可以按在或约6％蛋白质w/v将该奶底物标准化。在其他实施例中，可以按在或约10％蛋白质w/v将该奶底物标准化。在一些实施例中，可以按大约高于4％或大约高于10％蛋白质w/v将该奶底物标准化。
在一些实施例中，将该奶底物用蛋白质强化。在一个实施例中，将该奶底物用乳蛋白(如脱脂奶粉)、乳蛋白(例如MP 70)或乳清蛋白浓缩物(例如WPC 80)强化。在一些实施例中，以4％至20％或更多蛋白质(w/w)将已经用另外的蛋白质强化的奶底物标准化。在一些实施例中，可以按4％-15％蛋白质(w/w)将已经用另外的蛋白质强化的奶底物标准化。在一些实施例中，可以按在或约4％蛋白质(w/w)将已经用另外的蛋白质强化的奶底物标准化。在一些实施例中，可以按在或约6％蛋白质(w/w)将已经用另外的蛋白质强化的奶底物标准化。在其他实施例中，可以按在或约10％蛋白质(w/w)将已经用另外的蛋白质强化的奶底物标准化。在一些实施例中，可以按高于4％或高于10％蛋白质w/w将已经用另外的蛋白质强化的奶底物标准化。
在一些实施例中，以4％至20％或更多蛋白质重量比体积(w/v)将已经用另外的乳蛋白强化的奶底物标准化。在一些实施例中，可以按4％-15％蛋白质w/v将已经用另外的乳蛋白强化的奶底物标准化。在一些实施例中，可以按在或约4％蛋白质w/v将已经用另外的乳蛋白强化的奶底物标准化。在一些实施例中，可以按在或约6％蛋白质w/v将已经用另外的乳蛋白强化的奶底物标准化。在其他实施例中，可以按在或约10％蛋白质w/v将已经用另外的乳蛋白强化的奶底物标准化。在一些实施例中，可以按高于4％或高于10％蛋白质w/v将已经用另外的乳蛋白强化的奶底物标准化。
在一些实施例中，将该奶底物浓缩以便增加蛋白质含量。可以将该奶底物进行超滤或蒸发以便浓缩该乳。
在优选的实施例中，在发酵前使用超滤来浓缩该乳，而不是在发酵后应用分离器方法。这种方法的一个优点是每升乳产量更高，因为大多数乳清蛋白在超滤之后将存在于浓缩物中，而这些在分离器方法中损失。另一个优点是不产生酸性乳清。因为由于低pH而难以加工，酸性方法价值不大，并且经常用作奶产品成本下的动物饲料。相比之下，来自超滤的洗脱液可以用于生产乳糖或含有乳糖和矿物的粉末。另外的优点是需要更少的发酵罐容量，例如大约50％的容量。此外，超滤技术允许更好地控制最终产品中的蛋白质含量。
可以按0至5％或更多脂肪w/v将该奶底物标准化。在一个实施例中，可以按0-1％脂肪w/v将该奶底物标准化。在优选的实施例中，可以按约0.1％或0.1％脂肪w/v将该奶底物标准化。在另一个实施例中，可以按约0.025％至0.05％脂肪w/v将该奶底物标准化。在另外的实施例中，可以按约0.025％至0.05％脂肪w/v将该奶底物标准化。在另外的实施例中，可以按约1％至5％脂肪w/v将该奶底物标准化。在优选的实施例中，可以按约2％至4％脂肪w/v将该奶底物标准化。在另外的实施例中，可以按约3％脂肪w/v将该奶底物标准化。
可以针对脂肪含量和蛋白质含量两者将该奶底物标准化。在一些实施例中，可以按4％-10％蛋白质(w/w)和0-1％脂肪(w/w)将该奶底物标准化。在一些实施例中，可以按在或约6.0％至10.0％蛋白质(w/w)和0至10％脂肪(w/w)将该奶底物标准化。在一些实施例中，可以按在或约10.0％蛋白质(w/w)和0.1％脂肪(w/w)将该奶底物标准化。
在其他实施例中，可以按4％-10％蛋白质和0-1％脂肪v/w将该奶底物标准化。在一些实施例中，可以按在或约6.0％至10.0％蛋白质w/v和0至10％脂肪v/w将该奶底物标准化。在一些实施例中，可以按在或约10.0％蛋白质w/v和0.1％脂肪w/v将该奶底物标准化。
可以将该奶底物浓缩、缩合、热处理、蒸发或过滤。它也可以被干燥或生产自干乳或干奶粉或其他干奶产品。它可以是UHT乳。它可以是再水化的。
优选在用本文所述的酶处理之前或之后对该奶底物进行巴氏灭菌和/或预巴氏灭菌。巴氏灭菌包括将该奶底物加热到至少72℃持续至少15秒，优选25秒或更多秒。在一个实施例中，在至少73℃下进行巴氏灭菌持续至少15秒。在一个实施例中，在至少75℃下进行巴氏灭菌持续至少15秒。在另外的实施例中，在至少85℃下进行巴氏灭菌持续至少15秒。在另外的实施例中，在至少90℃下进行巴氏灭菌持续至少15秒。在另一个实施例中，在至少95℃下进行巴氏灭菌持续至少15秒。
巴氏灭菌可以进行至少30秒。在一些实施例中，巴氏灭菌可以进行至少1分钟。在另外的实施例中，巴氏灭菌可以进行至少2-15分钟。在另一个实施例中，巴氏灭菌可以进行至少3-10分钟。在另外的实施例中，巴氏灭菌可以进行至少15分钟或更多分钟。巴氏灭菌可以在高压釜中进行。在一些实施例中，在至少95℃下进行巴氏灭菌持续4-6分钟。在一些实施例中，预巴氏灭菌和巴氏灭菌两者都进行。在一些实施例中，在标准化之前对生乳进行预巴氏灭菌。在一些实施例中，在72℃-80℃(如72℃-75℃或72℃)下进行预巴氏灭菌。在一个实施例中，将预巴氏灭菌进行15-25秒，最优选15秒。在本发明的一个方面中，在标准化之后将该奶底物进行巴氏灭菌。优选地，它在上述温度下进行并且持续上述时间。在一些实施例中，将标准化后的巴氏灭菌在约90℃下进行约10分钟，优选在90℃下进行10分钟。也可以在不进行标准化的情况下进行如上所述的巴氏灭菌。
在一个方面中，该奶底物具有6-8的pH(发酵前)，最优选在pH 6-7处或附近，并且在一些实施例中，在pH 6.7-6.8处或附近。用本文所述的一种或多种酶处理该奶底物。如本文所用，术语“处理”和“处理的”可以涵盖添加、混合、培养、搅拌、接触、发酵、接种、掺和和施用。在一些实施例中，在巴氏灭菌之前或之后用本文所述的一种或多种酶处理该奶底物。在一些实施例中，在巴氏灭菌之前用如本文所述的一种或多种酶处理该奶底物，并在巴氏灭菌之后用如本文所述的另外的一种或多种酶处理该奶底物。用于巴氏灭菌之前的处理的一种或多种酶可以与用于巴氏灭菌之后的处理的一种或多种酶相同，或者它们可以不同。在一些实施例中，用于巴氏灭菌之前的处理的一种或多种酶与用于巴氏灭菌之后的处理的一种或多种酶不同。
术语“处理”在本文中用于表示将一种或多种蛋白酶和微生物添加到该奶底物中。
蛋白水解酶
在一个方面中，本发明涉及用于改善奶产品特性的***、组分和方法，该***、组分和方法包括在该过程期间添加一种或多种酶。在一个实施例中，本发明提供了用于改善奶产品特性的组分和方法，所述方法包括在该过程期间添加一种或多种单独的或与其他酶组合的蛋白酶。
根据本发明使用的蛋白酶是外源性蛋白酶。如本文所用的术语“外源性”是指该蛋白酶通常不发现于乳中，并且因此获得自不同(即，非乳)来源。
如本文所用的术语“蛋白酶(protease)”与肽酶或蛋白酶(proteinase)同义。
用于在本发明中使用的蛋白酶可以是枯草杆菌蛋白酶(E.C.3.4.21.62)或芽孢杆菌溶素(E.C.3.4.24.28)或碱性丝氨酸蛋白酶(E.C.3.4.21.x)或角蛋白酶(E.C.3.4.x.x)。适合地，用于在本发明中使用的蛋白酶可以是蛋白酶内肽酶K(EC 3.4.2.1.64)、链霉蛋白酶、木瓜蛋白酶、内肽酶Arg-C、内切蛋白酶Gluc-C(EC 3.4.21.19)、肠激酶(EC 3.4.21.9)、胶原酶(EC 3.4.24.3)、嗜热菌蛋白酶(EC 3.4.24.27)、胰蛋白酶(EC 3.4.21.4)、胰凝乳蛋白酶(EC 3.4.21.1)、胃蛋白酶(EC 3.4.23.1)、曲霉蛋白酶(EC 3.4.23.18)、sedolisin(EC3.4.21.100)或二肽基肽酶(EC 3.4.14.1)。
优选地，根据本发明的蛋白酶是枯草杆菌蛋白酶、丝氨酸蛋白酶、金属蛋白酶、酸性蛋白酶、中性蛋白酶或角蛋白酶。合适的蛋白酶包括动物、植物或微生物来源的蛋白酶。化学修饰的或蛋白工程化的突变体也是适合的。该蛋白酶可以是丝氨酸蛋白酶或金属蛋白酶，例如碱性微生物蛋白酶或胰蛋白酶样蛋白酶。碱性蛋白酶的实例是枯草杆菌蛋白酶，尤其是衍生自芽孢杆菌属的那些，例如枯草杆菌蛋白酶Novo、枯草杆菌蛋白酶Carlsberg、枯草杆菌蛋白酶309(参见例如，美国专利号6,287,841)、枯草杆菌蛋白酶147和枯草杆菌蛋白酶168(参见例如，WO 89/06279)。胰蛋白酶样蛋白酶的实例是胰蛋白酶(例如猪或牛来源的)和镰孢霉属蛋白酶(参见例如，WO 89/06270和WO 94/25583)。有用的蛋白酶的实例还包括但不限于WO 92/19729和WO 98/20115中描述的变体。其全部通过引用结合在此。
在一个实施例中，用于在本发明中使用的蛋白酶可以是以下一种或多种商业产品中的一种或多种蛋白酶：
另外地或可替代地，该蛋白酶可以包含在以下可商购产品中的一种或多种中：KannaseTM、NovoCarne TenderTM、和Novozym 37020、Novo-Pro DTM(全部可获自诺维信公司)；BioSorb-ACDPTM(努尔创作公司(NoorCreations)，印度)；或AngelTM酸性蛋白酶(安琪酵母有限公司(Angel Yeast Co,Ltd.)，中国)。
适合地，该蛋白酶可以是来自以下各项的蛋白酶：芽孢杆菌属(如枯草芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、嗜碱芽孢杆菌和地衣芽孢杆菌)、木霉属(Trichoderma)、拟诺卡氏菌属(Nocardiopsis)、沙雷氏菌属(Serratia)或曲霉属(Aspergillus)。
在一个实施例中，该蛋白酶来自芽孢杆菌属。适合地，该蛋白酶可以来自物种枯草芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、嗜碱芽孢杆菌、迟缓芽孢杆菌和地衣芽孢杆菌。在一个实施例中，该蛋白酶来自物种枯草芽孢杆菌。在一个实施例中，该蛋白酶具有氨基酸SEQ ID No.1。在一些实施例中，该蛋白酶与氨基酸SEQ ID No.1具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的同一性。
在一个实施例中，该蛋白酶具有氨基酸SEQ ID No.2。在一些实施例中，该蛋白酶与氨基酸SEQ ID No.2具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的同一性。
在一个实施例中，该蛋白酶具有氨基酸SEQ ID No.3。在一些实施例中，该蛋白酶与氨基酸SEQ ID No.3具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的同一性。
在一些实施例中，用于在本发明中使用的蛋白酶可以是低pH敏感性肽酶。
在一些实施例中，用于在本发明中使用的蛋白酶可以是金属蛋白酶。
如本文所用的术语“金属蛋白酶”是指具有蛋白酶活性的酶，其中该酶的催化机制涉及金属，通常在活性位点中具有金属离子。在一些实施例中，该金属蛋白酶是低pH敏感性肽酶。金属蛋白酶的一个或多个金属离子可以是任何金属离子。最优选地，如本文所用的金属蛋白酶包含锌、钙或锌和钙的组合的一个或多个金属离子。
用螯合剂处理除去金属离子并使金属蛋白酶失活。例如，EDTA是从金属蛋白酶中去除必需的锌并因此使酶失活的金属螯合剂。
在一些实施例中，如本文使用的金属蛋白酶在活性位点处具有一个二价离子或两个二价离子或多于两个二价离子。
在一些实施例中，如本文所用的金属蛋白酶在活性位点中具有锌离子，最优选Zn2 +。在一些优选的金属蛋白酶中，可能存在一个锌离子，在其他中可能存在两个或更多个锌离子。
优选地，金属蛋白酶包含形成金属离子结合位点或其部分的His-Glu-Xaa-Xaa-His基序(其中“Xaa”是任何氨基酸)。
在一个实施例中，其中金属蛋白酶是谷氨酸锌蛋白(GluZincin)超家族的成员，锌离子通过氨基酸基序His-Glu-Xaa-Xaa-His与另外的谷氨酸结合。优选地，其含有1个锌离子和2个钙离子。
在一些实施例中，该金属蛋白酶来自M4家族或谷氨酸锌蛋白超家族。该M4酶家族的特征在于，该家族中的所有酶结合单一的催化的锌离子。如在许多其他金属蛋白酶家族中一样，存在His-Glu-Xaa-Xaa-His基序。在Biochem.J.[生物化学杂志]290:205-218(1993)中进一步定义了M4家族。
在一些实施例中，本发明中使用的金属蛋白酶采用类似于蛋白质数据库结构1BQB(金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)金属蛋白酶)、1EZM(铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)金属蛋白酶)和1NPC(蜡样芽孢杆菌(Bacillus cereus)金属蛋白酶))的3D结构。在优选的实施例中，该金属蛋白酶具有同类相食自溶位点。这意味着该金属蛋白酶可以引起其自身裂解。
如本文所用，术语“金属蛋白酶(metalloprotease)”可以与“金属肽酶”、“金属蛋白酶(metalloproteinase)”和“中性蛋白酶”互换使用。在一些实施例中，金属蛋白酶或如本文所述的蛋白酶是低pH敏感性的。如本文所用，术语“低pH敏感性”是指其最适pH值与新鲜乳的pH值(pH 6.5-6.7)相同或接近并且其活性在pH 4.6-4.8下相比在pH 6.5-6.7下低至少2倍的肽酶。
在一些实施例中，本发明中使用的低pH敏感性肽酶在pH 4.6-4.8下相比在pH6.5-6.7下具有低至少10倍的活性，并且最优选低至少15倍。
在一些实施例中，在发酵期间有机酸(例如乳酸)的生产降低了pH并使在本发明的方法期间的低pH敏感性肽酶失活。
在一些实施例中，该低pH敏感性肽酶在4.6-4.8的低pH下不可逆地失活。在优选的实施例中，使本发明中使用的肽酶减少或失活的低pH是通过发酵引起的。最优选地，这种低pH是由糖到有机酸的微生物发酵引起的，例如乳糖到乳酸的发酵引起的。最优选地，失活是永久的，并且因此所得的发酵奶产品含有很少、没有或只有痕量的活性肽酶。优选地，通过终端发酵，或在储存之前或期间，蛋白水解活性降低，最优选地停止。
作为金属蛋白酶的低pH敏感性肽酶的低pH下的活性降低优选地是通过金属离子的解离引起的。如上所述，这些金属离子对该酶的功能是必需的。
如本文所用，在肽酶的上下文中，术语“降低的活性”意指与pH 6.5-6.7的活性最大值下的肽酶活性单位相比，2倍或以上单位的肽酶活性的蛋白酶活性(也称为“肽酶活性”、“酶活性”、“内肽酶活性”或“外切肽酶活性”)降低。在优选的实施例中，“降低的活性”是指小于在pH 6.5-6.7的活性最大值下的50％的活性。
如本文所用，在肽酶的上下文中，术语“失活”意指与pH 6.5-6.7的活性最大值下的肽酶活性单位相比，2倍或以上单位的肽酶活性的蛋白酶活性降低。在优选的实施例中，“失活”是指小于在pH 6.5-6.7的活性最大值下的90％的活性。将内肽酶活性的一个单位定义为由1μg(微克)NP7L活性蛋白引起的在450nm下每分钟的吸光度增加，如实例1所述(Omondi等人(2001))。
在一个实施例中，该低pH敏感性肽酶是热稳定的肽酶。如本文所用，术语“热稳定的”意指酶在大于30℃、优选30℃-60℃的温度下具有蛋白酶活性。
在本发明的一个实施例中，该低pH敏感性肽酶属于酶委员会(E.C.)编号3.4.17、3.4.21或3.4.24。
在另外的实施例中，该低pH敏感性肽酶是嗜热菌蛋白酶、NprE分子、蛋白水解素、短梗霉素(aureolysin)、Gentlyase或分散酶(Dispase)、或与此类酶具有高百分比同一性的肽酶。
在一些实施例中，本发明中使用的低pH敏感性肽酶不是凝乳酶或类凝乳酶(即，不具有类凝乳酶活性并且不特异性切割Met105-Phe106键)，并且不属于EC编号3.4.23.4。本发明中使用的低pH敏感性肽酶优选地不切割Met105-Phe106键，并且最优选地严格仅不切割Met105-Phe106键。在一些实施例中，使用的肽酶由不包括任何信号序列的成熟蛋白组成或包含该成熟蛋白。在另外的实施例中，该肽酶由包括信号序列的全长蛋白质组成或包含该全长蛋白质。
在一些实施例中，该低pH敏感性肽酶是非哺乳动物来源的，并且最优选非动物来源的。在一些实施例中，该低pH敏感性肽酶是细菌肽酶、真菌肽酶、古细菌肽酶或人工肽酶。在一些实施例中，该低pH敏感性肽酶是细菌金属蛋白酶、真菌金属蛋白酶、古细菌金属蛋白酶或人工金属蛋白酶。
人工肽酶是其中一个或多个氨基酸已被突变、取代、缺失或在其他方面改变的酶，因此该酶的氨基酸序列不同于野生型，其中该野生型可从活的生物体获得。人工肽酶还可以称为变体肽酶。
如本文所用的细菌来源的肽酶优选地获得自或可获得自芽孢杆菌属物种、最优选解淀粉芽孢杆菌或短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)。最优选地，该低pH敏感性肽酶是NP7L或与其具有高百分比同一性，该NP7L也称为NprE、Protex 7L、P7L、FoodPro PNL、芽孢杆菌溶素或中性蛋白酶(Neutrase)。这样的肽酶显示为SEQ ID NO:3(图9A)，并由SEQ IDNO:10(图9K)的核苷酸序列编码。NP7L是一种金属蛋白酶。
如本文所用的细菌来源的肽酶还可以是NP14L(SEQ ID NO:6，图9E)或与其具有高百分比同一性，该NP14L也称为嗜热菌蛋白酶和Protex 14L。NP14L也是一种金属蛋白酶。
如本文所用的真菌来源的肽酶优选地获得自或可获得自青霉属(参见例如SEQ IDNO:7，图9F)、曲霉属(参见例如SEQ ID NO:9，图9H)、发光杆菌属(Photorhabdus)或木霉属(Trichoderma)物种。
如本文所用的古细菌来源的肽酶优选地来自硫化叶菌属(Sulfolobus)、最优选硫磺矿硫化叶菌(Sulfolobus solfataricus)。
在一个实施例中，如本文所用的低pH敏感性肽酶包含具有SEQ ID NO:3的氨基酸序列的多肽或与SEQ ID NO:3的氨基酸序列具有至少70％、例如至少75％、例如至少80％、例如至少85％、例如至少90％、例如至少95％、例如至少97％、例如至少98％、例如至少99％的序列同一性的多肽、或其功能变体。
在一个实施例中，如本文所用的低pH敏感性肽酶包含具有SEQ ID NO:3的氨基酸序列的多肽或与SEQ ID NO:3的氨基酸序列具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、98％、99％的序列同一性的多肽、或其功能变体。
在一个实施例中，如本文所用的低pH敏感性肽酶包含具有SEQ ID NO:3的氨基酸序列的多肽或具有一个或若干个氨基酸缺失、取代和/或添加的多肽、或其功能变体。例如，这样的多肽可以具有1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20或更多个氨基酸缺失、取代和/或添加。
在一个实施例中，如本文所用的低pH敏感性肽酶包含具有SEQ ID NO:4的氨基酸序列的多肽或与SEQ ID NO:4的氨基酸序列具有至少70％、例如至少75％、例如至少80％、例如至少85％、例如至少90％、例如至少95％、例如至少97％、例如至少98％、例如至少99％的序列同一性的多肽、或其功能变体。
在一个实施例中，如本文所用的低pH敏感性肽酶包含具有SEQ ID NO:4的氨基酸序列的多肽或与SEQ ID NO:4的氨基酸序列具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、98％、99％的序列同一性的多肽、或其功能变体。
在一个实施例中，如本文所用的低pH敏感性肽酶包含具有SEQ ID NO:4的氨基酸序列的多肽或具有一个或若干个氨基酸缺失、取代和/或添加的多肽、或其功能变体。例如，这样的多肽可以具有1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20或更多个氨基酸缺失、取代和/或添加。
在一个实施例中，如本文所用的低pH敏感性肽酶包含具有SEQ ID NO:5的氨基酸序列的多肽或与SEQ ID NO:5的氨基酸序列具有至少70％、例如至少75％、例如至少80％、例如至少85％、例如至少90％、例如至少95％、例如至少97％、例如至少98％、例如至少99％的序列同一性的多肽、或其功能变体。
在一个实施例中，如本文所用的低pH敏感性肽酶包含具有SEQ ID NO:5的氨基酸序列的多肽或与SEQ ID NO:5的氨基酸序列具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、98％、99％的序列同一性的多肽、或其功能变体。
在一个实施例中，如本文所用的低pH敏感性肽酶包含具有SEQ ID NO:5的氨基酸序列的多肽或具有一个或若干个氨基酸缺失、取代和/或添加的多肽、或其功能变体。例如，这样的多肽可以具有1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20或更多个氨基酸缺失、取代和/或添加。
在一个实施例中，如本文所用的低pH敏感性肽酶包含具有SEQ ID NO:6的氨基酸序列的多肽或与SEQ ID NO:6的氨基酸序列具有至少70％、例如至少75％、例如至少80％、例如至少85％、例如至少90％、例如至少95％、例如至少97％、例如至少98％、例如至少99％的序列同一性的多肽、或其功能变体。
在一个实施例中，如本文所用的低pH敏感性肽酶包含具有SEQ ID NO:6的氨基酸序列的多肽或与SEQ ID NO:6的氨基酸序列具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、98％、99％的序列同一性的多肽、或其功能变体。
在一个实施例中，如本文所用的低pH敏感性肽酶包含具有SEQ ID NO:6的氨基酸序列的多肽或具有一个或若干个氨基酸缺失、取代和/或添加的多肽、或其功能变体。例如，这样的多肽可以具有1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20或更多个氨基酸缺失、取代和/或添加。
在一个实施例中，如本文所用的低pH敏感性肽酶包含具有SEQ ID NO:7的氨基酸序列的多肽或与SEQ ID NO:7的氨基酸序列具有至少70％、例如至少75％、例如至少80％、例如至少85％、例如至少90％、例如至少95％、例如至少97％、例如至少98％、例如至少99％的序列同一性的多肽、或其功能变体。
在一个实施例中，如本文所用的低pH敏感性肽酶包含具有SEQ ID NO:7的氨基酸序列的多肽或与SEQ ID NO:7的氨基酸序列具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、98％、99％的序列同一性的多肽、或其功能变体。
在一个实施例中，如本文所用的低pH敏感性肽酶包含具有SEQ ID NO:7的氨基酸序列的多肽或具有一个或若干个氨基酸缺失、取代和/或添加的多肽、或其功能变体。例如，这样的多肽可以具有1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20或更多个氨基酸缺失、取代和/或添加。
在一个实施例中，如本文所用的低pH敏感性肽酶包含具有SEQ ID NO:9的氨基酸序列的多肽或与SEQ ID NO:9的氨基酸序列具有至少70％、例如至少75％、例如至少80％、例如至少85％、例如至少90％、例如至少95％、例如至少97％、例如至少98％、例如至少99％的序列同一性的多肽、或其功能变体。
在一个实施例中，如本文所用的低pH敏感性肽酶包含具有SEQ ID NO:9的氨基酸序列的多肽或与SEQ ID NO:9的氨基酸序列具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、98％、99％的序列同一性的多肽、或其功能变体。
在一个实施例中，如本文所用的低pH敏感性肽酶包含具有SEQ ID NO:9的氨基酸序列的多肽或具有一个或若干个氨基酸缺失、取代和/或添加的多肽、或其功能变体。例如，这样的多肽可以具有1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20或更多个氨基酸缺失、取代和/或添加。
在一个实施例中，如本文所用的低pH敏感性肽酶包含具有SEQ ID NO:11的氨基酸序列的多肽或与SEQ ID NO:11的氨基酸序列具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、98％、99％的序列同一性的多肽、或其功能变体。
在一个实施例中，如本文所用的低pH敏感性肽酶包含具有SEQ ID NO:16的氨基酸序列的多肽或与SEQ ID NO:16的氨基酸序列具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、98％、99％的序列同一性的多肽、或其功能变体。
在一个实施例中，如本文所用的低pH敏感性肽酶包含具有SEQ ID NO:17的氨基酸序列的多肽或与SEQ ID NO:17的氨基酸序列具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、98％、99％的序列同一性的多肽、或其功能变体。
在一个实施例中，如本文所用的低pH敏感性肽酶包含具有SEQ ID NO:18的氨基酸序列的多肽或与SEQ ID NO:18的氨基酸序列具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、98％、99％的序列同一性的多肽、或其功能变体。
在一个实施例中，如本文所用的低pH敏感性肽酶包含具有SEQ ID NO:19的氨基酸序列的多肽或与SEQ ID NO:19的氨基酸序列具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、98％、99％的序列同一性的多肽、或其功能变体。
在一个实施例中，如本文所用的低pH敏感性肽酶包含具有SEQ ID NO:20的氨基酸序列的多肽或与SEQ ID NO:20的氨基酸序列具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、98％、99％的序列同一性的多肽、或其功能变体。
在一个实施例中，如本文所用的低pH敏感性肽酶包含具有SEQ ID NO:21的氨基酸序列的多肽或与SEQ ID NO:21的氨基酸序列具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、98％、99％的序列同一性的多肽、或其功能变体。
在一个实施例中，如本文所用的低pH敏感性肽酶包含具有SEQ ID NO:22的氨基酸序列的多肽或与SEQ ID NO:22的氨基酸序列具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、98％、99％的序列同一性的多肽、或其功能变体。
如本文所用，肽酶的“功能变体”意味着尽管存在改变如取代、缺失、突变、丢失或另外的结构域和其他修饰，但该酶仍具有肽酶活性。
如本文所用，金属蛋白酶的“功能变体”意味着尽管存在改变如取代、缺失、突变、丢失或另外的结构域和其他修饰，但该酶仍具有金属蛋白酶活性。
在一个实施例中，该低pH敏感性肽酶包含包括信号肽(也称为信号序列)的全长酶。信号序列指导多肽通过特定原核或真核细胞膜的分泌。在一个实施例中，该低pH敏感性肽酶包含具有SEQ ID NO:3的氨基酸序列、缺乏信号序列的多肽。在一个实施例中，本发明中使用的低pH敏感性肽酶包含具有SEQ ID NO:4的氨基酸序列、但缺乏信号序列的多肽。在另外的实施例中，本发明中使用的低pH敏感性肽酶包含具有SEQ ID NO:5的氨基酸序列、但缺乏信号序列的多肽。在另外的实施例中，本发明中使用的低pH敏感性肽酶包含具有SEQID NO:6的氨基酸序列、但缺乏信号序列的多肽。在另外的实施例中，本发明中使用的低pH敏感性肽酶包含具有SEQ ID NO:7的氨基酸序列、但缺乏信号序列的多肽。在另外的实施例中，本发明中使用的低pH敏感性肽酶包含具有SEQ ID NO:9的氨基酸序列、但缺乏信号序列的多肽。在另外的实施例中，本发明中使用的低pH敏感性肽酶包含具有SEQ ID NO:11的氨基酸序列、但缺乏信号序列的多肽。在另外的实施例中，本发明中使用的低pH敏感性肽酶包含具有SEQ ID NO:16的氨基酸序列、但缺乏信号序列的多肽。在另外的实施例中，本发明中使用的低pH敏感性肽酶包含具有SEQ ID NO:17的氨基酸序列、但缺乏信号序列的多肽。在另外的实施例中，本发明中使用的低pH敏感性肽酶包含具有SEQ ID NO:18的氨基酸序列、但缺乏信号序列的多肽。在另外的实施例中，本发明中使用的低pH敏感性肽酶包含具有SEQID NO:19的氨基酸序列、但缺乏信号序列的多肽。在另外的实施例中，本发明中使用的低pH敏感性肽酶包含具有SEQ ID NO:20的氨基酸序列、但缺乏信号序列的多肽。在另外的实施例中，本发明中使用的低pH敏感性肽酶包含具有SEQ ID NO:21的氨基酸序列、但缺乏信号序列的多肽。在另外的实施例中，本发明中使用的低pH敏感性肽酶包含具有SEQ ID NO:22的氨基酸序列、但缺乏信号序列的多肽。
在另外的实施例中，该低pH敏感性肽酶包含与缺乏信号肽的SEQ ID NO:3、4、5、6、9、11或13-22具有至少70％、例如至少75％、例如至少80％、例如至少85％、例如至少90％、例如至少95％、例如至少97％、例如至少98％、例如至少99％的序列同一性的氨基酸序列、或其功能变体。在另外的实施例中，该低pH敏感性肽酶包含与SEQ ID NO:3、4、5、6、9、11或16-22具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、98％、99％的序列同一性并还缺乏信号肽的氨基酸序列、或其功能变体。
在另外的实施例中，该低pH敏感性肽酶由具有SEQ ID NO:2的氨基酸序列的多肽或与SEQ ID NO:2的氨基酸序列具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、98％、99％的序列同一性的多肽组成。
在另外的实施例中，该低pH敏感性肽酶由具有SEQ ID NO:4的氨基酸序列的多肽或与SEQ ID NO:4的氨基酸序列具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、98％、99％的序列同一性的多肽组成。
在另外的实施例中，该低pH敏感性肽酶由具有SEQ ID NO:5的氨基酸序列的多肽或与SEQ ID NO:5的氨基酸序列具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、98％、99％的序列同一性的多肽组成。
在另外的实施例中，该低pH敏感性肽酶由具有SEQ ID NO:6的氨基酸序列的多肽或与SEQ ID NO:6的氨基酸序列具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、98％、99％的序列同一性的多肽组成。
在另外的实施例中，该低pH敏感性肽酶由具有SEQ ID NO:7的氨基酸序列的多肽或与SEQ ID NO:7的氨基酸序列具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、98％、99％的序列同一性的多肽组成。
在另外的实施例中，该低pH敏感性肽酶由具有SEQ ID NO:9的氨基酸序列的多肽或与SEQ ID NO:9的氨基酸序列具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、98％、99％的序列同一性的多肽组成。
在另外的实施例中，该低pH敏感性肽酶由具有SEQ ID NO:11的氨基酸序列的多肽或与SEQ ID NO:11的氨基酸序列具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、98％、99％的序列同一性的多肽组成。
在另外的实施例中，该低pH敏感性肽酶由具有SEQ ID NO:16的氨基酸序列的多肽或与SEQ ID NO:16的氨基酸序列具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、98％、99％的序列同一性的多肽组成。
在另外的实施例中，该低pH敏感性肽酶由具有SEQ ID NO:17的氨基酸序列的多肽或与SEQ ID NO:17的氨基酸序列具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、98％、99％的序列同一性的多肽组成。
在另外的实施例中，该低pH敏感性肽酶由具有SEQ ID NO:18的氨基酸序列的多肽或与SEQ ID NO:18的氨基酸序列具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、98％、99％的序列同一性的多肽组成。
在另外的实施例中，该低pH敏感性肽酶由具有SEQ ID NO:19的氨基酸序列的多肽或与SEQ ID NO:19的氨基酸序列具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、98％、99％的序列同一性的多肽组成。
在另外的实施例中，该低pH敏感性肽酶由具有SEQ ID NO:20的氨基酸序列的多肽或与SEQ ID NO:20的氨基酸序列具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、98％、99％的序列同一性的多肽组成。
在另外的实施例中，该低pH敏感性肽酶由具有SEQ ID NO:21的氨基酸序列的多肽或与SEQ ID NO:21的氨基酸序列具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、98％、99％的序列同一性的多肽组成。
在另外的实施例中，该低pH敏感性肽酶由具有SEQ ID NO:22的氨基酸序列的多肽或与SEQ ID NO:22的氨基酸序列具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、98％、99％的序列同一性的多肽组成。
像所有蛋白质一样，肽酶可以由具有核苷酸序列的核酸编码。本发明中使用的低pH敏感性肽酶可以获得自或可获得自例如如通过SEQ ID NO:10或其变异(其编码SEQ IDNO:3)、或者SEQ ID NO:8或其变异(其编码SEQ ID NO:7)所示的核酸。所述核酸可以在宿主细胞中表达。所述核酸可以获得自或可获得自宿主细胞。
在一些实施例中，与本文所述的一种或多种酶相比，该酶的氨基酸总数小于350、例如小于340、例如小于330、例如小于320、例如小于310、例如小于300个氨基酸、例如在200至350个氨基酸的范围内、例如在220至345个氨基酸的范围内。
在一些实施例中，该酶的氨基酸序列具有至少一个、二个、三个、四个、五个、六个、七个、八个、九个或十个氨基酸取代。
氨基酸序列可以从合适的来源制备/分离，或者其可以通过合成制得或者其可以通过利用重组DNA技术制备。
在本发明中涵盖的蛋白质可以与其他蛋白质(特别是酶)一起使用。因此，本发明还涵盖蛋白质的组合，其中该组合包含本发明的蛋白酶和另一种酶(其可以是根据本发明的另一种蛋白酶)。
优选地，当与本发明的范围本身有关或当由本发明的范围本身所涵盖时，氨基酸序列不是天然的酶。就这一点而言，术语“天然的酶”意指处于其天然环境中并且当其已经由其天然核苷酸序列表达时的整个酶。
糖苷酶
该奶底物可以另外地用一种或多种糖苷酶处理。该处理可以在本文描述的方法的任何点发生。可以在发酵期间添加一种或多种糖苷酶。
糖苷酶水解糖苷键。
在本发明的一个方面中，该糖苷酶是N-连接或O-连接的糖苷酶。在一些实施例中，该糖苷酶是属于酶委员会(E.C.)编号3.5.1.52的PNGase F。
在其他实施例中，该糖苷酶是属于E.C.3.2.1.96的内切糖苷酶。在一些实施例中，该糖苷酶是属于E.C.3.5.1.52的PNGase A。在一些实施例中，该糖苷酶是属于E.C.3.2.1.18的神经氨酸酶(NaNase)。在一些实施例中，该糖苷酶选自SEQ ID NO.12，即PNGase A((肽-N(4)-(N-乙酰基-β-D-葡糖胺基)天冬酰胺酰胺酶，EC 3.5.1.52)；SEQ IDNO:13，即PNGase F；SEQ ID NO:14，即内切糖苷酶H(内切-β-N-乙酰葡糖胺酶H，EC3.2.1.96)；或SEQ ID NO:15，即N-乙酰半乳糖胺酶；或与其任何一个具有至少70％、例如至少75％、例如至少80％、例如至少85％、例如至少90％、例如至少95％、例如至少97％、例如至少98％、例如至少99％的序列同一性的糖苷酶。
在一些实施例中，该糖苷酶包含具有SEQ ID No.12、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14或SEQ ID NO:15的氨基酸序列的多肽，或包含与其任何一个具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、98％、99％的序列同一性的糖苷酶。在一些实施例中，该糖苷酶包含具有SEQ ID No.12的氨基酸序列的多肽或与其具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、98％、99％的序列同一性的糖苷酶。在一些实施例中，该糖苷酶包含具有SEQ IDNo.13的氨基酸序列的多肽或与其具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、98％、99％的序列同一性的糖苷酶。在一些实施例中，该糖苷酶包含具有SEQ ID No.14的氨基酸序列的多肽或与其具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、98％、99％的序列同一性的糖苷酶。在一些实施例中，该糖苷酶包含具有SEQ ID No.15的氨基酸序列的多肽或与其具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、98％、99％的序列同一性的糖苷酶。
配制和包装
可以将本发明中使用的一种或多种酶和/或本发明的起子培养物配制成任何合适的形式。
配制可以包括造粒、胶囊化、囊片化、制锭、混合、包衣、分层、形成可咀嚼或可溶性片剂、配制成剂量控制的包装、配制成棒状包装和粉化。
配制还可以包括向本发明中使用的低pH敏感性肽酶和/或本发明的起子培养物中添加其他成分。适合的成分包括例如食物成分、糖类、碳水化合物和奶产品。
在一些实施例中，配制不包括添加任何另外的微生物。在优选的实施例中，配制确实包括添加任何另外的微生物，例如另外的乳酸菌菌株。
可以包装本发明中使用的一种或多种酶和/或本发明的起子培养物。
在一些实施例中，包装在冷冻和/或干燥和/或混合本发明中使用的一种或多种酶和/或本发明的起子培养物之后发生。
适合地，该包装可以包括真空包装、小囊、盒、泡罩包装、棒状包装或罐。
如本发明所用，该一种或多种蛋白酶可以与载体、优选不溶性载体混合。在一些实施例中，该一种或多种蛋白酶可以混合载体以获得浆液。可以将浆液干燥以获得干燥的酶粉。这可以用作起子培养物或用于起子培养物中。
在一些实施例中，该干燥的浆料粉末含有体积平均直径大于10pm-30pm、最优选大于30pm的颗粒，并且干燥的酶粉中不溶性载体的含量为基于干燥的酶粉的重量的至少10％(w/w)且最多90％(w/w)。该不溶性载体优选地选自下组，该组由以下各项组成：聚乙烯聚吡咯烷酮(PVPP)、微晶纤维素、小麦淀粉和麦芽糖糊精，优选微晶纤维素，并且它可以含有崩解剂。这些已经在WO/2014/177644A1，实例1-13中描述。
本发明的方法可以使用试剂盒进行。优选地，这样的试剂盒包含如本文所述的一种或多种蛋白酶和微生物，该一种或多种蛋白酶和微生物可以如上所述处于起子培养物的形式和/或被配制和/或被包装。可以取决于微生物的类型和奶底物的类型来调节本文所述的一种或多种肽酶的具体组合及其剂量。例如，当使用的微生物含有较高比例的益生菌时或当奶底物具有高百分比的乳蛋白时，可以使用如本文所述的较高剂量的一种或多种肽酶和/或更具活性的蛋白酶。
剂量
优选地，本文所述的一种或多种酶的剂量是在0.1μg至1000μg活性酶蛋白/千克奶底物的范围内，更优选地它是在1μg至100μg活性酶蛋白/kg奶产品的范围内，更优选地它是5-15μg活性酶/kg奶底物，并且甚至更优选地它是10μg活性酶蛋白/kg奶底物。在一些实施例中，本文所述的一种或多种蛋白酶的剂量是0.1-1μg活性酶蛋白/kg奶底物。
在一些实施例中，本发明的方法在一个方面中使用0.01-30单位肽酶的剂量。在一些实施例中，本发明的方法在一个方面中使用00.1-10单位肽酶的剂量。在一些实施例中，本发明的方法使用0.1-1单位肽酶的剂量。在一些实施例中，使用每100ml接种的奶底物的约0.9单位肽酶或精确0.9单位肽酶。可替代地，该肽酶剂量可以按每千克奶底物的量来测量。例如，在一些实施例中，本发明的方法使用高达1-10000μg的剂量给予至1千克奶底物(即，酶浓度在1-10000ppb(十亿分之几)的范围内)。在一些实施例中，该肽酶剂量是高达1-100ppb的量。
如果酶的剂量太低，则可能不会导致期望的效果，然而过度剂量可能导致将作为聚合物的乳蛋白过度水解转化为寡聚物和甚至氨基酸。过度剂量可能改变酸奶产品的质地、凝胶化、降低粘度、硬度。可以取决于发酵期间使用的微生物的类型和比例以及奶底物中存在的乳蛋白的量和类型来调节本文所述的一种或多种肽酶的剂量。例如，当使用的微生物含有较高比例的益生菌时或当奶底物具有高百分比的乳蛋白时，可以使用如本文所述的较高剂量的一种或多种肽酶。
在一些实施例中，选择本文所述的一种或多种酶的剂量，使得高蛋白奶底物的粘度降低而不超过由于小苦味肽的释放导致的苦味感的阈值。
已经用肽酶处理的奶底物或发酵奶产品也可以称为“酶促的(enzymated)”。
发酵
如本文所用，术语“发酵”是指使用微生物如酵母和细菌或其任何组合将碳水化合物(例如糖)转化成醇和CO2或有机酸。发酵通常在厌氧条件下进行。使用发酵生产了发酵产品。
如本文所用，术语“允许经处理的奶底物发酵”是指发酵该奶底物。这可以包括在适合的条件(例如厌氧)下和在适合的温度下孵育经处理的奶底物足够的一段时间使发酵发生。
在本发明的发酵奶产品的情况下，优选地，它们由接种有乳酸菌或具有GRAS状态的任何微生物的奶底物产生，并且可以通过发酵乳碳水化合物来使乳发生酸化。例如，嗜热培养物例如YO-Mix 465、532、860或414，或者嗜常温培养物例如Choozit 220、Choozit 230或Probat 505。这些培养菌株可从杜邦公司商购获得。在一个实施例中，该奶底物在35℃-55℃、优选40℃-50℃下发酵。该温度范围对于嗜热微生物或嗜热培养物是优选的。最优选地，嗜热微生物或嗜热培养物的发酵温度是41℃。在一些实施例中，该发酵温度是42℃。在一些实施例中，该发酵温度是43℃。在其他实施例中，该发酵温度是44℃。在一些实施例中，该发酵温度是45℃。在另一个实施例中，该奶底物在15℃-30℃、优选20℃-25℃下发酵。该温度范围对于嗜常温微生物或嗜常温培养物是优选的。最优选地，嗜常温微生物或嗜常温培养物的发酵温度是21℃。在一些实施例中，该发酵温度是22℃。在一些实施例中，该发酵温度是23℃。在其他实施例中，该发酵温度是24℃。在一些实施例中，该发酵温度是25℃。发酵温度的实例包括在30℃、37℃和43℃下。发酵温度可以影响所得发酵奶产品的特性。
在一些实施例中，发酵在水浴或热交换器中进行。在一些实施例中，发酵在发酵罐或烧杯中进行。具体地，针对搅拌酸奶在发酵罐中进行发酵或针对凝固酸奶在烧杯中进行发酵。
在一些实施例中，当达到特定pH时，发酵结束。该pH优选地是比奶底物的起始pH更酸性的pH，最优选地是在3与6之间的pH，更优选地是在4与5之间。在一些实施例中，发酵结束时的pH是4.5-4.8。在一些实施例中，发酵结束时的pH是4.7。在一些实施例中，发酵结束时的pH是4.7。在一些实施例中，发酵结束时的pH是在或约4.6。
最优选地，当pH的降低减少了低pH敏感性肽酶的活性或使其完全失活时，发酵结束。
在一些实施例中，发酵后，将现在的发酵奶产品冷却，优选如上所述立即冷却(参见标题为“发酵奶产品”的部分)。这可以在搅拌之前或之后，或者取决于优选的产品不发生搅拌。这种冷却可以例如使用水浴进行。如上所述，冷却可以在一个或两个步骤中进行。在一些实施例中，将该发酵奶产品冷却至20℃-30℃。在一些实施例中，将该发酵奶产品冷却至约25℃或至25℃。可替代地，在一个实施例中，在本发明的方法的步骤(b)之后，将该发酵奶产品冷却至1℃-10℃、最优选4℃-6℃的较低温度。在一些实施例中，通过将该发酵奶产品置于冷室或冰箱中来缓慢地进行这种冷却。可替代地，可以一个接一个地(如上所述)应用这两个冷却步骤。
可以通过冷却或通过可以抑制或杀死发酵培养物的微生物的pH而停止发酵。冷却停止发酵过程。如上进一步所述，该发酵奶产品可以储存在优选4℃-6℃下。
微生物
如本文所述的方法使用微生物。这是出于发酵目的。根据本发明使用的微生物是外源性微生物。如本文所用的术语“外源性”意指该微生物通常不发现于乳中，并且因此获得自不同的(即，非乳)来源。
在一些实施例中，所述微生物是乳酸菌。
如本文所用，术语“乳酸菌”(LAB)是指产生乳酸作为碳水化合物发酵的最终产物的任何细菌。在具体实施例中，该LAB选自下组，该组由以下各项组成：链球菌属、乳球菌属、乳杆菌属、明串珠菌属、假明串珠菌属、片球菌属、丙酸杆菌属、肠球菌属、短杆菌属和双歧杆菌属物种或其任何组合、及其任何菌株。
适合的微生物菌株的实例包括乳酸乳球菌乳酸亚种(Lactococcus lactis subsplactis)、乳酸乳球菌干酪亚种(Lactococcus lactis subsp cremoris)、乳酸乳球菌乳酸亚种二乙酰乳酸生物变种(Lactococcus lactis subsp.lactis biovar diacetylactis)、肠膜明串珠菌干酪亚种(Leuconostoc mesenteroides subsp cremoris)、嗜热链球菌(Streptococcus thermophilus)和德氏乳杆菌保加利亚亚种(Lactobacillusdelbrueckii subsp.Bulgaricus)。发酵或以其他方式生长的微生物(特别是LAB)菌落可以称为“培养物”。
在一个方面中，该LAB是嗜常温培养物。在一些实施例中，这样的LAB的发酵在15℃-30℃、最优选20℃-25℃下进行。
嗜常温培养物可以是例如Probat 505、Choozit 220或Choozit 230。这些培养物可从杜邦公司商购获得。
在另外的方面中，该LAB是嗜热培养物。在一些实施例中，这样的LAB的发酵在30℃-55℃、最优选37℃-43℃、并且最优选在43℃下进行。
嗜热培养物可以是例如YO-MIX 414、532和860。这些培养物可从杜邦公司商购获得。
在一个实施例中，本发明中使用的嗜热培养物是YO-MIXTM 860。该培养物包括由WO2004/085607(通过引用并入本文)所教导的嗜热链球菌菌株CNCM I-2980和德氏乳杆菌保加利亚亚种。
特别地，该乳酸菌(LAB)可以用于混合培养物、接种物或起子培养物中。
起子培养物
乳酸菌(LAB)可以用于起子培养物中。
在具体实施例中，本发明的起子培养物包含如上所述的LAB和低pH敏感性肽酶。
本发明的起子培养物可以是冷冻的、干燥的(例如喷雾干燥)、冷冻干燥的、液体、固体、处于颗粒或冷冻颗粒的形式、或处于粉末或干燥的粉末的形式。可以如上所述配制和/或包装该起子培养物。
该起子培养物还可以包含多于一种LAB菌株。在一些实施例中，所述LAB起子培养物具有的LAB浓度为在107CFU/g与1011CFU/g起子培养物之间，并且更优选为至少107、至少108、至少109、至少1010或至少1011CFU/g起子培养物。
本发明还提供了如上所定义的起子培养物的用途。
本发明的起子培养物可以优选地用于生产发酵奶产品，特别是本发明的发酵奶产品。可以获得本发明的发酵乳产品，并且可通过将起子培养物添加到奶底物中并允许经处理的奶底物发酵获得本发明的发酵乳产品。
方法
在一些实施例中，本文所述的方法生产发酵奶产品。所述发酵乳产品具有如上所述的意想不到的特性。本发明的发酵奶产品优选地具有改善的粘度。优选地，所述发酵奶产品具有改善的凝胶强度。优选地，所述发酵奶产品具有改善的质地。在一个实施例中，所述发酵奶产品具有改善的凝乳硬度。优选地，所述发酵奶产品具有较早的发酵开始和/或较早的凝胶化开始和/或较早的发酵结束。在优选的实施例中，所述发酵奶产品具有降低的脱水收缩。在一个实施例中，所述发酵奶产品具有改进的保质期。
在一些实施例中，本发明的发酵奶产品具有以下特征中的一个或多个：(a)改善的粘度；(b)改善的凝胶强度；(c)改善的质地；(d)改善的凝乳的硬度；(e)较早的发酵开始；(f)较早的凝胶化开始；(g)较早的发酵结束；(h)降低的脱水缩合；(i)改进的保质期和/或(j)改善的味道。
具体地，本发明包括一种或多种蛋白酶在生产如上所讨论的发酵奶产品中的用途。在一些实施例中，本披露包括用于制备发酵奶产品的方法，该方法包括：(a)用一种或多种蛋白酶和微生物处理蛋白质含量高于4％的奶底物；并且(b)允许经处理的奶底物发酵以生产该发酵奶产品。在一些实施例中，该奶底物的蛋白质含量在5％与10％之间。在一些实施例中，该奶底物的蛋白质含量为10％或更高。在一些实施例中，该奶底物中的肽裂解水平等于或大于20％。
在一些实施例中，所述一种或多种蛋白酶中的一种属于酶委员会(E.C.)编号3.4.17、3.4.21或3.4.24。在一些实施例中，所述一种或多种蛋白酶中的一种来自M4家族。在一些实施例中，该一种或多种蛋白酶是金属蛋白酶。
在一些实施例中，该蛋白酶与氨基酸SEQ ID No.3具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的同一性。在一些实施例中，该蛋白酶与氨基酸SEQ ID No.3具有至少90％的同一性。在一些实施例中，该蛋白酶与氨基酸SEQ ID No.3具有至少95％的同一性。在一些实施例中，所述一种或多种蛋白酶中的一种是枯草杆菌蛋白酶、丝氨酸蛋白酶、酸性蛋白酶或中性蛋白酶。在一些实施例中，该蛋白酶与氨基酸SEQ ID No.1具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的同一性。在一些实施例中，该蛋白酶与氨基酸SEQ ID No.1具有至少90％的同一性。在一些实施例中，该蛋白酶与氨基酸SEQ ID No.1具有至少95％的同一性。
在一些实施例中，该蛋白酶与氨基酸SEQ ID No.2具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的同一性。在一些实施例中，该蛋白酶与氨基酸SEQ ID No.2具有至少90％的同一性。在一些实施例中，该蛋白酶与氨基酸SEQ ID No.2具有至少95％的同一性。在一些实施例中，在如上所述的巴氏灭菌步骤之前，用所述一种或多种蛋白酶处理该奶底物。
在一些实施例中，将该一种或多种蛋白酶与所述微生物一起添加。在一些实施例中，在巴氏灭菌步骤之前，将枯草杆菌蛋白酶、丝氨酸蛋白酶、酸性蛋白酶或中性蛋白酶添加到奶底物中。在一些实施例中，在巴氏灭菌步骤之前，将枯草杆菌蛋白酶或丝氨酸蛋白酶添加到奶底物中。
在一些实施例中，将金属蛋白酶与所述微生物一起添加。在一些实施例中，在巴氏灭菌步骤之前，将枯草杆菌蛋白酶或丝氨酸蛋白酶添加到奶底物中，并且其中将金属蛋白酶与所述微生物一起添加。在一些实施例中，该枯草杆菌蛋白酶或丝氨酸蛋白酶与氨基酸SEQ ID No.1或SEQ ID No.2具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的同一性。
在一些实施例中，金属蛋白酶与氨基酸SEQ ID No.3具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的同一性。在一些实施例中，选择本文所述的一种或多种蛋白酶的剂量，使得高蛋白奶底物的粘度降低而不超过由于小苦味肽的释放导致的苦味感的阈值。在一些实施例中，该微生物是乳酸菌。在一些实施例中，该微生物属于链球菌属、乳球菌属、乳杆菌属、明串珠菌属、假明串珠菌属、片球菌属、丙酸杆菌属、肠球菌属、短杆菌属和双歧杆菌属或其任何组合。
使乳发酵以生产发酵奶产品的过程是本领域熟知的，并且具体的条件取决于所使用的奶底物和微生物的类型、发酵产物所需的最终规格和具体的发酵过程而变化。本文所述的方法可以应用于本领域已知的任何发酵过程。应当理解，本文所述的组分和方法的某些参数可以取决于发酵奶产品所需的特性和/或具体的发酵过程和/或具体微生物进行调整以获得发酵奶产品的这样的最佳特性。
实例
本披露在以下实例中进一步详细描述，其不意欲以任何方式限制本披露所要求保护的范围。附图旨在被认为是本披露的说明书和描述的组成部分。提供下列实例以说明但不限制所要求保护的披露内容。
实例1
以下实例的目的是降低高蛋白质酸奶的粘度。为了将该乳标准化为10％(w/v)的蛋白质含量，应用脱脂奶粉和乳蛋白(Milkprotein)70。在巴氏灭菌之前或之后，将不同量的Protex 7L(P7L)和Protex 6L(P6L)添加到酸奶中，以便测试最佳条件以降低酸奶粘度。使用YM 860和YM410在43℃下进行发酵至最终pH为4.6。由YM 860生产的高蛋白酸奶比用YM410发酵的酸奶表现出整体更好的外观。对于所使用的蛋白质源，乳蛋白70在酸奶一般质地方面表现出更好的特性，并且与来自用SMP标准化的乳的酸奶相比具有较少的异味。巴氏灭菌后当以剂量>22.4U/kg添加P7L时，显示出与酶添加有关的最佳结果。将80U/kg P7L添加到用MP70标准化的酸奶中导致了剪切应力降低30％，其是本研究中达到的最高降低。
材料与方法
搅拌酸奶样品的实验室规模生产
将脱脂奶粉、乳蛋白(MP 70)或乳清蛋白浓缩物(WPC 80)添加到脱脂乳(1.5％(w/v)脂肪；爱氏晨曦公司(Arla)，维比(Viby)，丹麦)中，以便将该乳标准化至10％(w/v)的蛋白质含量。为了测试它们粘度降低的能力，在进行发酵之前，在巴氏灭菌(600s，90℃)之前或之后90分钟添加Protex 6L(P6L)和Protex 7L(P7L)。通过应用YO-Mix 860(YM 860)和YO-Mix 410(YM 410)来开始发酵。这两种培养物都用于具有较高蛋白质含量的酸奶的奶产品工业中。施用相当高量的预培养物(5mL/L)，因为在添加酶后很高量的蛋白质和其部分水解导致缓冲能力增加，其在预试验中导致非常长的发酵时间(数据未显示)。将接种的乳倒入各自含有100ml的玻璃烧杯中，并在43℃下发酵至最终pH为4.6。随后，将酸奶首先通过用汤匙手动混合30次，然后使用在1级水平的手动混合器(IdeenWelt公司，罗斯曼(Rossmann)，德国)在玻璃烧杯中将它们搅拌15秒。将酸奶装入塑料杯中并用盖子封闭以防止酸奶干燥。直到在5天、14天和27天后进行测量，将样品储存在5℃下。
流变学分析
使用粘度计(布鲁克菲尔德公司(Brookfield)，米德尔伯勒(Middleboro)，美国)30rpm、转子S62测量在巴氏灭菌之前的巴氏灭菌乳的粘度。
针对搅拌的酸奶样品，在储存6天和14天后进行流动曲线。使用安东帕公司(AntonPaar)的MCR302流变仪进行测量。流变仪应用对产品明确定义的剪切率(旋转)，并测量进行该测量所需的力。该仪器通常用于在工业规模的工厂中针对口感模拟剪切应力，从而给出有关产品稳健性的信息。流变仪绘制流动曲线。这意味着在增加的剪切率(上升的曲线)期间测量剪切应力。在定义的端点处，剪切率再次降低，并获得下降的曲线。曲线之间的区域提供有关产品中结构恢复潜力的信息。
来自安东帕公司的MCR 302流变仪可以用于表征饮用酸奶和搅拌酸奶。它能够预测(和量化)稠度、粘性和口感。该仪器可以用于其他应用和产品。多年的实验表明，可以在特定剪切率下估计感官属性。
表1：从流动曲线提取感官属性
感官属性 剪切率值
口中稠度 10s-1
口中粘性 10s-1至40s-1
口中口感 端点200s-1或350s-1
使用具有测量锥CP50-2/TG的测量***CP50-2/TG-SN25648在10℃下测量流动曲线。在Y上升＝0,1-200s-1的增加的剪切率和随后Y下降＝200-0,1s-1的降低的剪切率期间测量流动曲线，仅考虑以下结果中增加的剪切率。
结果和讨论
所使用的蛋白质来源和热处理的影响
为了检查在加工性方面是否存在有利的蛋白质来源，使用SMP、Promilk 70和WPC80来获得10％(w/v)的蛋白质含量。已经在发酵前，就在巴氏灭菌(90℃，10分钟)之后，确认了粘度的增加，无论使用何种蛋白质来源。添加乳清蛋白(WPC 80)导致了凝胶样产品，这使得进一步加工是不可能的。
这种固体性可以通过不利的乳清蛋白比例结合热处理长度和温度的不利组合来解释，该不利的乳清蛋白比例结合热处理长度和温度的不利组合导致主要由乳清蛋白组成的聚集体的形成(Beaulieu等人，1999，Chever等人，2014)。由MP 70制成的巴氏灭菌乳显示在粘度方面比就在巴氏灭菌之后的SMP更好的结果。然而，用SMP标准化的乳很难倒出并且具有许多可见的团块，而添加MP 70的乳与对照有更多的相似。作为对照，不添加任何蛋白质的乳与样品一起进行巴氏灭菌。表2中所示的粘度测量结果表明在这两个样品中添加蛋白质导致粘度增加。对SMP测量的高粘度证实了非常粘稠的产品的印象，其在进一步加工期间难以处理。
表2显示了与来自同一批次但无任何蛋白质添加的乳(3.5％(w/v)蛋白质含量)相比，巴氏灭菌后用SMP或MP70标准化的具有10％(w/v)的蛋白质含量的乳的粘度。
表2.巴氏灭菌后具有10％(w/v)的蛋白质含量的乳的粘度
粘度[mPa·s]
脱脂奶粉 560
乳蛋白70 28
对照 3
这些结果的可能解释是较高蛋白质含量的Promilk 70(70％(w/w)蛋白质)。由于SMP仅具有约36％(w/w)的蛋白质含量，因此与MP70相比，需要向该乳中添加更高量的SMP，导致更高的干物质并从而导致更高的粘度。也可能乳清蛋白比例在MP70中更为有利，导致更少聚集。
试图避免乳清蛋白的聚集，也测试了不同的热处理。将乳在高压釜中在85℃下仅加热1分钟，其对于富含WPC的样品也产生坚硬的产品。与SMP和MP70混合的乳与就在巴氏灭菌后的正常热处理相比显示出更薄的稠度(数据未显示)。为了确定这两种蛋白质来源在由不同培养物(YM 410、YM 860)发酵的产品中的影响，对富含SMP的乳以及对通过添加MP 70实现10％(w/v)的蛋白质含量的乳进行以下实验两次。
在先前的实验中显示了与巴氏灭菌相关的蛋白质添加至乳的一般问题之后，进行了以下实验来处理发酵的高蛋白酸奶的粘度降低以及蛋白质来源、所使用的培养物以及尤其是酶P6L和P7L的添加具有的影响。当在巴氏灭菌前添加到乳中时，添加不同量的P6L或P7L对酸奶粘度的影响
与没有酶添加的对照样品相比，在乳巴氏灭菌之前90分钟添加P7L导致可测量的降低的粘度。图1示出了在发酵前针对P7L添加而实现的最好结果。添加76U/Kg P7L导致在储存5天后剪切应力降低12％。
但是酸奶具有其他缺点。它们是十足的颗粒状，显示出大的团块，并且在流变仪测量期间也引起问题。
P6L的添加，也在发酵前90分钟添加，显示出更有希望的结果。就在巴氏灭菌后第一个阳性结果是可见的。添加了P6L的乳与对照相比显示出较少的团块、通常较低的粘度，并且因此该乳更容易处理，添加了更多的酶。与其中添加了P7L的酸奶相比，所生产的酸奶也显示出更显著的粘度降低。流变仪测量的结果示于图2A-2D中。
结果表明对于使用YM 860(图2A和2B)生产的搅拌酸奶样品，测量了比对于通过YM410发酵的酸奶(图2C和2D)略高的剪切应力以及从而略高的粘度。然而，添加酶似乎对通过YM 860发酵的酸奶具有更多的影响。那里，针对具有SMP的酸奶测量出剪切应力减少约17％，并且当添加3％(v/w)P6L时，针对MP70酸奶测量出剪切应力减少20％。对于YM 410，对于测试的P6L的最高量，剪切应力仅降低9％(SMP)和6％(MP70)。此外，YM 860在所有测试的样品中都产生普通的奶油质地和较少的颗粒性，因此所有以下试验都使用YM 860进行。还应当提到的是，在发酵前添加的所有测试的酶浓度下，针对SMP或针对MP70都不会感觉到苦味或其他异味。
添加P6L和P7L对酸奶粘度的影响；在巴氏灭菌后添加
已经表明，P7L不适合在巴氏灭菌之前使用，在以下实验中当在巴氏灭菌之后添加该P7L时，应当显示出其对粘度的影响。此外，还测试了P6L的添加。再次测试了SMP和MP70两者。获得的结果示于图3(A-D)中。
与对照样品相比，在巴氏灭菌后P6L以及P7L的添加两者都导致了酸奶粘度的可见改善。这也可以由流变仪结果在数字上表现出来。对于添加了P6L并且将SMP用于标准化的酸奶，2.33％(v/w)的添加导致剪切应力降低了13％。对于具有MP70的酸奶，降低了21％。
当添加大量的P7L时，获得甚至更好的结果。然而，正如其他研究的结果所预期的，11.2U/kg和22.4U/kg的添加导致测量的剪切应力略微增加，80U/kg的添加导致剪切应力显著降低21％(对于SMP)和剪切应力显著降低30％(对于MP70)。这里，酸奶显示出奶油质地，几乎没有可见的团块。
添加了各种不同量的P7L的酸奶样品的味道显示，具有MP70的酸奶被认为具有更令人愉快的味道、具有较少的异味。对于68U/kg和80U/kg P7L的添加，用SMP调节蛋白质含量导致了轻微的煮熟的香味。
结论
该研究显示，通过添加Protex 7L和/或Protex 6L，有可能降低高蛋白酸奶样品的粘度，其中对于通过添加MP70而标准化至10％蛋白质含量并通过YM 860发酵的酸奶显示出最好的结果。此外，结果表明，为了降低粘度，最有利的是在巴氏灭菌后添加P7L。对于P6L，添加的时间不如对于P7L那么重要。在巴氏灭菌后添加80U/kg P7L至用MP70标准化并用YM860发酵的乳中实现了最高的粘度降低(30％)。
实例2
这个实例的目的是生产更平滑的高蛋白酸奶。
加工期间的测量温度/保持时间：
为了将该乳标准化至10％(w/w)的蛋白质含量，应用乳蛋白70。在巴氏灭菌之前或之后，将不同量的Protex 7L和Protex 6L添加到酸奶中，以便测试生产更平滑的高蛋白酸奶的最佳条件。使用YM 860在43℃下进行发酵至最终pH为4.6。
材料与方法
搅拌酸奶样品的实验室规模生产
将乳蛋白(MP 70)和奶油(38％(w/w)；爱氏晨曦公司(Arla)，维比(Viby)，丹麦)添加到脱脂乳(0.1％(w/w)脂肪；爱氏晨曦公司(Arla)，维比(Viby)，丹麦)中，以便将该乳标准化至10％(w/w)的蛋白质含量和1.5％(w/w)的脂肪含量。将该乳在良好的搅拌下在45℃下混合。在巴氏灭菌和均质化之前添加Protex 6L，该巴氏灭菌和均质化在95℃下进行6分钟(P1：65℃；均质化80巴；P2：80℃；P3：95℃持续6分钟)。在巴氏灭菌后，将该乳冷却至22℃，并且就在通过应用YO-Mix 860(YM 860)开始发酵之前，将Protex 7L以7.8U*kg-1的剂量与培养物一起添加。将此培养物用于具有较高蛋白质含量的酸奶的奶产品工业。将接种的乳倒入各自含有100ml的玻璃烧杯中，并在43℃下发酵至最终pH为4.6。一旦达到pH 4.6，就手动搅拌酸奶并随后用相比由完全打开的背压阀产生的背压没有另外的背压的PHE冷却至24℃，并且接着储存在冷室(4℃-6℃)中。
搅拌的酸奶-UHT-MINI
程序1)混合所有粉末成分，并在良好搅拌下在45℃下将除酶以外的干共混物添加到乳/水中；1a)冷却至环境温度至约20℃-25℃；1b)将酶Protex 6L添加到试验编号2和4中，在搅拌下酶化30分钟Mini UHT。
通过添加2l UHT乳开始；2-预热至65℃(P1)；3)在65℃/200巴下均质化；4)预热至80℃(P2)；5)95℃巴氏灭菌6分钟(P3)；6)冷却至45℃(K1)；7)冷却至5℃(K2)；通过添加1l乳结束
将Protex 7L添加到试验3和4中；8)实时发酵：添加起子培养物YO-mix 860；9)在43℃下发酵；10)通过Cinac pH设备测量发酵；11)发酵至pH 4.60；12)在板式热交换器上冷却至24℃；13)填充；15-储存在5℃下。
图4-7示出了结果。结果表明，所有四个样品都是暗淡的，但样品1和2比样品3和4更呈颗粒状，如从std1所见。非常光滑的表面具有高“Std1”值。通过测量高斯金字塔(Gaussian Pyramid)中的基础水平(0)和第一水平(1)处的标准偏差a来计算Std1。Std1是来自水平1的值除以来自水平0的值。
样品3和4也比样品1和2显得更白且更亮(从能量和热比率/近热比率值可见)。
能量＝从整个样本反射多少光。
热比率＝从表面扫描的图片中看到的小红色环反射多少光。
近热比率＝从表面扫描的图片中看到的绿色环反射多少光。
已经开发了表面扫描来可视化并量化来自食物表面的光反射，例如，酸奶如何表现光泽和颗粒状。表面扫描使用具有六个LED的环形灯和标准灰度级相机。光滑且非常有光泽的酸奶充当完美的镜子，导致LED的清晰图象，然而颗粒状酸奶是“糟糕的镜子”，并且因此导致非常扩散的图像，其中LED不可见。
实例3
通过结合和不结合海藻酸盐应用NP7L，蛋白质强化的浓缩酸奶的质地增强。
传统上已经通过在酸奶中物理分离乳清和随后浓缩奶产品固体(主要是蛋白质)来生产浓缩酸奶。主要由于其高水平的脂肪和蛋白质(8％-15％脂肪和5％-7％蛋白质)，没有分离的浓缩酸奶的生产很少达到与传统方法相同的质地。砂质的、柔软的和暗淡样子的质地代表了对于寻求用不涉及通过分离浓缩的卫生方法来规模化生产浓缩酸奶的奶产品生产商要克服的严重障碍。将脱脂调配乳用MPC70和甜乳清粉末在蛋白质(6.1％(w/v))和脂肪(8.0％(w/v))方面进行标准化。在加工之前添加0.20％-0.40％的NaCl和0.054％-0.072％的海藻酸钠作为工业化浓缩酸奶的常用配方的一部分。将标准化的乳在板式热交换器(PHE；95℃；6分钟)中进行巴氏灭菌。随后，将该乳冷却至4℃过夜储存，并且然后加热并分别用YO-Mix 300(20DCU/100L；杜邦培养单位)和CHOOZIT MA14(10DCU/100L)接种。同时，每100ml接种的乳中添加适量的NP7L(22.5-34.0单位/kg)，其被调整到每个特定的蛋白质浓度。发酵在35℃下在5升桶的水浴中进行。一旦达到pH 4.6，就手动搅拌浓缩酸奶并随后用相比由完全打开的背压阀产生的背压没有另外的背压的PHE冷却至20℃-22℃，并接着在冷室中冷却至4℃-6℃。将浓缩酸奶样品储存28天，然而使用锥板法在4天后测量流动曲线。
在应用NP7L时，通过添加NP7L，表观粘度以及预测的“口中粘度”(剪切率为10s*-1下的提取剪切应力)显著增加(图10和图11)。此外，由于酶促处理的浓缩酸奶与海藻酸盐添加物一起的斜率具有负斜率的事实(图12)，消除了口中粘性(剪切率范围为33-160s*-1的线性回归的斜率)。还观察到NP7L剂量与最终的浓缩酸奶粘度之间的正相关性(数据未显示)。在NP7L存在下生产的浓缩酸奶在勺子上很稠，在口中和眼睛里很光滑，并且具有熔化的黏附感(mouthcoating)，所有这些都是除非使用具有或不具有海藻酸盐的NP7L，否则无法获得的积极的属性。
实例4
使用NP7L的酸性稀奶油的质地增强
将预巴氏灭菌的脱脂乳(72℃；15秒)用38％脂肪(w/w)的奶油在脂肪(5.0％和9.0％(w/w))方面进行标准化，分别导致含有5％和9％脂肪的酸性稀奶油基质的蛋白质含量为3.7％和3.5％(w/w)。在另外的试验中，将该乳标准化至4.2％(w/w)蛋白质和5％(w/w)脂肪以及4.2％(w/w)蛋白质和9％(w/w)脂肪的蛋白质和脂肪。将蛋白质强化的乳在板式热交换器(PHE；95℃；6分钟)中进行巴氏灭菌。随后，将该乳冷却至4℃过夜储存，并且然后再加热至45℃并冷却至22℃以避免脂肪结晶，并分别用ProbatTM 505(7DCU/100L；杜邦培养单位)和3克/100L的乳酸乳球菌干酪亚种进行接种。同时，每100ml接种的乳中添加适量的NP7L(6.4-8.5单位/kg)，其被调整到每个特定的蛋白质浓度。发酵在22℃下在5升桶的水浴中进行约16-18小时。一旦达到pH 4.6，终止该酸性稀奶油发酵，手动搅拌并且用调节至水平5(5％)的Ytron-Z 1.50FC-2.0.1(YTRON工艺技术股份有限公司(YTRON Processtechnology GmbH)，巴德恩多尔夫(Bad Ensdorf)，德国)通过串联的板式热交换器使其光滑，然后装入杯子并在冷室中储存在4℃-6℃下。将酸性稀奶油样品储存28天，然而使用锥板法在14天后测量流动曲线。
在应用NP7L时，通过添加NP7L，表观粘度(图13)以及预测的“口中稠度”(剪切率10s*-1下的提取剪切应力；图14)显著增加。此外，蛋白质强化与NP7L酶化一起导致高于蛋白质强化和NP7L添加各自的总和的协同增加的粘度。总体而言，产品的质地由稠度主导，而生产的酸性稀奶油的粘性(剪切率范围为33-160s*-1的线性回归的斜率)较低。此外，由于与非酶促处理的参考相比，酶促处理的酸性稀奶油或强化并酶促处理的酸性稀奶油的斜率具有负斜率或较不陡峭的事实，口中粘性显著降低(图15)。还观察到NP7L剂量与最终的酸性稀奶油粘度之间的正相关性(数据未显示)。
实例5
添加和不添加NP7L的酸性稀奶油的感官分析
如下制备含9％(w/w)脂肪的酸性稀奶油基质。将脱脂乳(约4443g)、奶油38％脂肪(约1421g)和脱脂奶粉(约146g)在45℃下在良好搅拌下混合，并在95℃下进行均质化和巴氏灭菌6分钟(P1：65℃；均质化80巴；P2：80℃；P3：95℃持续6分钟)。在巴氏灭菌后，将该乳冷却至22℃，并添加起子培养物混合物(7DCU/100L ProbatTM 505和3克/100L的乳酸乳球菌干酪亚种)。同时，添加在3.4U/kg与5.8U/kg之间的NP7L。发酵在22℃下进行直至测量到pH4.60。接下来，用调节至水平5(5％)的Ytron-Z 1.50FC-2.0.1(YTRON工艺技术股份有限公司(YTRON Process technology GmbH)，巴德恩多尔夫(Bad Ensdorf)，德国)，使该酸性稀奶油穿过串联的板式热交换器，然后将其装入杯子并在冷室中储存在4℃-6℃下。最终产品具有9.09％(w/w)的脂肪含量和4.0％(w/w)的蛋白质含量。将酸性稀奶油样品储存至少5天但不超过14天，并通过感官评判小组进行评估。为了描述对感觉可感知产品属性的影响，选择了描述性感官分析。描述性分析的基础是ISO 13299“感官分析-方法-建立感官特征的一般指导”。在感官描述性分析中，每个描述符的强度分别用指示低强度和高强度的两个定位点在直线标度上进行评估。在训练期/校准期中向评判小组教导了低和高的定位点。所有样品一式三份进行评估。该感官评判小组由7人组成，在参加此分析的描述性分析之前，他们都已经通过了基本的感官筛选测试，然后才被纳入该评判小组。将评判小组成员对产品属性的识别和强度量表进行了培训。属性的定义可以在表3中找到。
表3：高蛋白酸奶感官评估中测试的属性的定义
如图16所示，在应用NP7L时，感官属性：粗糙表面、风味丰满、甜味、苦味、酸的、脂肪感和软/柔软依然不显著。然而，与粘度相关的所有属性都显著增加(p<0.05)(搅拌阻力、稠流勺和上颚力)。在应用NP7L时，苦味没有改变(不显著)。
实例6
在发酵浓缩脱脂乳产生高蛋白酸奶之前的感官分析
将预巴氏灭菌的脱脂乳(72℃；15秒)进行超滤(定制的；20kDa螺旋膜；4h；4℃-6℃)以便将该乳浓缩至10％(w/w)蛋白质。将预浓缩的乳用渗透物稀释至9％(w/w)蛋白质并进行巴氏灭菌或保持冷冻(-20℃)不超过6周，解冻，并且然后用冷冻的渗透物稀释。将UF预浓缩的乳如下进行巴氏灭菌。预热至65℃(P1)，在65℃/200巴下均质化，预热至80℃(P2)，并最后95℃灭菌6分钟(定制的巴氏灭菌器，Service Teknik公司，兰讷斯(Randers)，丹麦)。随后，将该乳冷却至10℃直到发酵开始。随着使用起子培养物YO-MixTM 860(20DCU/100L)，同时将18.4U/kg NP7L添加到该乳中。发酵在43℃下进行直到pH 4.60，随后将酸奶手动搅拌并且用调节至30％的Ytron-Z1.50FC-2.0.1(YTRON工艺技术股份有限公司(YTRONProcess technology GmbH)，巴德恩多尔夫(Bad Ensdorf)，德国)穿过串联的板式热交换器，然后装入杯子并在冷室中储存在4℃-6℃下。
为了描述对感觉可感知产品属性的影响，选择了描述性感官分析。描述性分析的基础是ISO 13299“感官分析-方法-建立感官特征的一般指导”。在感官描述性分析中，每个描述符的强度分别用指示低强度和高强度的两个定位点在直线标度上进行评估。在训练期/校准期中向评判小组教导了低和高的定位点。所有样品一式三份进行评估。该感官评判小组由8人组成，在参加此分析的描述性分析之前，他们都已经通过了基本的感官筛选测试，然后才被纳入该评判小组。将评判小组成员对产品属性的识别和强度量表进行了培训。属性的定义可以在表4中找到。
表4：高蛋白酸奶感官评估中测试的属性的定义
如图17和18所示，在以18.4U/kg的剂量添加NP7L后，黏附感显著减少以及光泽度显著增加(p<0.05)，高蛋白酸奶含有0.25％(w/w)脂肪以及1.5％(w/w)脂肪。属性“光泽度”增加(p<0.05)。对勺子的阻力和口中粘性显著降低(p<0.01)。颗粒感、干酪质、对勺子的粘性、口中稠流以及软/柔软感觉显著降低(p<0.001)。在应用NP7L时，苦味没有改变(不显著)。
实例7
高蛋白酸奶的感官分析
为了描述对感觉可感知产品属性的影响，选择了描述性感官分析。描述性分析的基础是ISO 13299“感官分析-方法-建立感官特征的一般指导”。在感官描述性分析中，每个描述符的强度分别用指示低强度和高强度的两个定位点在直线标度上进行评估。在训练期/校准期中向评判小组教导了低和高的定位点。所有样品一式三份进行评估。该感官评判小组由7人组成，在参加此分析的描述性分析之前，他们都已经通过了基本的感官筛选测试，然后才被纳入该评判小组。将评判小组成员对产品属性的识别和强度量表进行了培训。属性的定义可以在表5中找到。
表5：高蛋白酸奶感官评估中测试的属性的定义
对于感官分析，搅拌酸奶是在Mini-UHT(Service Teknik公司，丹麦)上生产的。使用来自Aral Amba公司(维比(Viby)，丹麦)的预巴氏杀菌的脱脂乳(72℃；15s)，并用乳蛋白浓缩物70[5.6％(w/w)]和WPC 34[2.0％(w/w)]强化至8％(w/w)和9％(w/w)的蛋白质。该酸奶的最终脂肪含量为1.5％(w/w)。将除了酶的所有粉末成分在45℃下混合。对于具有8％蛋白质的乳，以16.3至32.6U/kg的范围添加商品酶产品(Protex 7L)，并且对于9％蛋白质乳，以18.4至36.7U/kg的范围添加商品酶产品(Protex 7L)。酶剂量对应于0.6％(w/w应用的蛋白质)和1.2％(w/w应用的蛋白质)。将制备的酸奶乳预热至65℃(P1)，在65℃/200巴下均质化，加热至80℃(P2)，并在95℃下巴氏灭菌6分钟(P3)。随后，将该乳冷却至5℃并储存过夜。第二天早上，添加YO-mix 860(20DCU/100L；杜邦公司，布拉布兰(Brabrand)，丹麦)以开始发酵。发酵在43℃下进行并通过在pH 4.6-4.65下冷却而终止。将酸奶在具有增加的背压(另外2巴)的板式热交换器上冷却，以降低最终产品的粘度。将该产品在5℃下储存直到该产品被分析。含有8％(w/w)蛋白质和9％(w/w)蛋白质的酸奶(对照(无酶)，对于8％蛋白质酸奶的16.3U/kg和32.6U/kg，以及对于9％蛋白质酸奶的18.4U/kg和36.7U/kg)的感观数据)示于图19(A)和(B)中。
如图19所示，与非酶促的酸奶参考相比，在这两个酸奶试验中应用P7L时，可以显著改善光泽度、光滑度、粉末味道(粉状物)以及涩感。令人惊讶的是，与酶促的酸奶相比，酶促的酸奶的苦味没有受到影响(增加)。
虽然已经显示并在本文描述了本发明的优选实施例，仅通过举例的方式来提供这样的实施例对本领域技术人员将是显而易见的。在不偏离本发明的情况下，许多变化、改变和替换将是本领域的技术人员能想到的。应该理解的是，在此说明的本发明的实施例的不同替代方案可以用于实施本发明。预期的是以下权利要求书限定了本发明的范围以及由此覆盖在这些权利要求和它们的等效物的范围内的方法和结构。
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Claims (41)

1.一种用于制备发酵奶产品的方法，该方法包括：
(a)用一种或多种蛋白酶和微生物处理包含4％(w/w)或更高蛋白质含量的奶底物；并且
(b)允许该经处理的奶底物发酵以产生该发酵奶产品。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于该奶底物的蛋白质含量为10％(w/w)或更高。
3.如权利要求1或2所述的方法，其特征在于，将该奶底物用蛋白质强化或进行浓缩以便增加其蛋白质含量到至少4％(w/w)。
4.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述一种或多种蛋白酶中的一种属于酶委员会(E.C.)编号3.4.17、3.4.21或3.4.24。
5.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述一种或多种蛋白酶中的一种来自M4家族。
6.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述一种或多种蛋白酶中的一种是金属蛋白酶。
7.如权利要求6所述的方法，其中所述蛋白酶与SEQ ID No.3的氨基酸序列具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的同一性。
8.如权利要求7所述的方法，其中所述蛋白酶与SEQ ID No.3的氨基酸序列具有至少90％的同一性。
9.如权利要求8所述的方法，其中所述蛋白酶与SEQ ID No.3的氨基酸序列具有至少95％的同一性。
10.如权利要求1至3中任一项所述的方法，其中所述一种或多种蛋白酶中的一种是枯草杆菌蛋白酶、丝氨酸蛋白酶、酸性蛋白酶或中性蛋白酶。
11.如权利要求10所述的方法，其中所述蛋白酶与SEQ ID No.1的氨基酸序列具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的同一性。
12.如权利要求11所述的方法，其中所述蛋白酶与SEQ ID No.1的氨基酸序列具有至少90％的同一性。
13.如权利要求12所述的方法，其中所述蛋白酶与SEQ ID No.1的氨基酸序列具有至少95％的同一性。
14.如权利要求10所述的方法，其中所述蛋白酶与SEQ ID No.2的氨基酸序列具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的同一性。
15.如权利要求14所述的方法，其中所述蛋白酶与SEQ ID No.2的氨基酸序列具有至少90％的同一性。
16.如权利要求15所述的方法，其中所述蛋白酶与SEQ ID No.2的氨基酸序列具有至少95％的同一性。
17.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中在巴氏灭菌步骤之前用所述一种或多种蛋白酶处理所述奶底物。
18.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中将所述一种或多种蛋白酶与所述微生物一起添加。
19.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中在巴氏灭菌步骤之前，将枯草杆菌蛋白酶、丝氨酸蛋白酶、酸性蛋白酶或中性蛋白酶添加到该奶底物中。
20.如权利要求19所述的方法，其中在巴氏灭菌步骤之前，将枯草杆菌蛋白酶或丝氨酸蛋白酶添加到该奶底物中。
21.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中将金属蛋白酶与所述微生物一起添加。
22.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中在巴氏灭菌步骤之前将枯草杆菌蛋白酶或丝氨酸蛋白酶添加到该奶底物中，并且其中将金属蛋白酶与所述微生物一起添加。
23.如权利要求19、20或22所述的方法，其中所述枯草杆菌蛋白酶或丝氨酸蛋白酶与SEQ ID No.1或SEQ ID No.2的氨基酸序列具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的同一性。
24.如权利要求21或22所述的方法，其中该金属蛋白酶与氨基酸SEQ ID No.3具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的同一性。
25.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中该微生物是乳酸菌。
26.根据权利要求25所述的方法，其中该微生物属于链球菌属(Streptococcus)、乳球菌属(Lactococcus)、乳杆菌属(Lactobacillus)、明串珠菌属(Leuconostoc)、假明串珠菌属(Pseudoleuconostoc)、片球菌属(Pediococcus)、丙酸杆菌属(Propionibacterium)、肠球菌属(Enterococcus)、短杆菌属(Brevibacterium)或双歧杆菌属(Bifidobacterium)或其任何组合。
27.根据权利要求25或26所述的方法，其中该微生物是嗜热培养物YO-MIXTM 860。
28.一种发酵奶产品，其可通过如前述权利要求中任一项所述的方法获得。
29.一种发酵奶产品，其具有4％(w/w)或更高蛋白质含量并且包含一种或多种外源性蛋白酶和外源性微生物。
30.如权利要求29所述的发酵奶产品，其特征在于，该奶底物的蛋白质含量为10％(w/w)或更高。
31.如权利要求29或30所述的发酵奶产品，其特征在于，将该奶底物用蛋白质强化或进行浓缩以便增加其蛋白质含量到至少4％(w/w)。
32.如权利要求29-31中任一项所述的发酵奶产品，其中所述一种或多种蛋白酶中的一种属于酶委员会(E.C.)编号3.4.17、3.4.21或3.4.24。
33.如权利要求29-32中任一项所述的发酵奶产品，其中所述一种或多种蛋白酶中的一种来自M4家族。
34.如权利要求29-33中任一项所述的发酵奶产品，其中所述一种或多种蛋白酶中的一种是金属蛋白酶。
35.如权利要求29-31中任一项所述的发酵奶产品，其中所述一种或多种蛋白酶中的一种是枯草杆菌蛋白酶、丝氨酸蛋白酶、酸性蛋白酶或中性蛋白酶。
36.根据权利要求29-35中任一项所述的发酵奶产品，其中该微生物是乳酸菌。
37.根据权利要求36所述的发酵奶产品，其中该微生物属于链球菌属、乳球菌属、乳杆菌属、明串珠菌属、假明串珠菌属、片球菌属、丙酸杆菌属、肠球菌属、短杆菌属或双歧杆菌属或其任何组合。
38.根据权利要求36或37所述的发酵奶产品，其中该微生物是嗜热培养物YO-MIXTM860。
39.根据权利要求28至38中任一项所述的发酵奶产品，其中该发酵奶产品是高蛋白酸奶、希腊酸奶、浓缩酸奶或酸性稀奶油。
40.蛋白酶在生产高蛋白发酵奶产品中用于以下各项的用途：
(a)改进粘度；
(b)改进凝胶强度；
(c)改进质地；
(d)改进凝乳的硬度；
(e)提供较早的发酵开始；
(f)提供较早的凝胶化开始；
(g)提供较早的发酵结束；
(h)减少脱水收缩；
(i)改进保质期；
(j)改进风味；
(k)减小黏性；或
(l)(a)至(k)的任何组合。
41.一种参考实例中的任一个、基本如上文所描述的方法、发酵奶产品或用途。
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