CN107501396B - 一种用于诊断sfts患者预后情况的蛋白质及其应用 - Google Patents

一种用于诊断sfts患者预后情况的蛋白质及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种用于诊断SFTS患者预后情况的蛋白质及其应用，实施蛋白质包含氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示的肽段；还涉及使用该蛋白质制备的检测试剂盒。通过本发明的蛋白质及试剂盒，可检测SFTS患者体内是否存在保护性抗体，判断该患者的预后情况。当本发明的试剂盒检测为阳性时，患者预后良好，都能存活，当检测结果为阴性时，患者预后不良，80％的阴性患者都死亡，可见本发明的试剂盒具有对SFTS患者具有可靠的预后判断能力。检测结果呈阳性的SFTS病人可以采取保守治疗，呈阴性的SFTS病人，应采取应急治疗。

Description

一种用于诊断SFTS患者预后情况的蛋白质及其应用
技术领域
本发明涉及SFTS治疗和诊断领域，更特别地，涉及一种用于诊断SFTS患者预后情况的蛋白质及其应用，还涉及包含该蛋白质的ELISA检测试剂盒。
背景技术
自2004年以来，我国多地发生了一系列发热伴出血、白细胞减少及血小板减少、多脏器受损的病例。患者多来自华中山区，农业区，流行时间为每年的4到8月份，与节肢动物活动繁殖期相吻合，病例都有明确的蜱虫叮咬里是，其发病死亡率为12％-30％。该病的其他症状有胃肠不适、纳差厌食、恶心、腹泻、疲劳乏力、相对缓脉等，实验室检查发现白细胞减少和酶学改变等，其中，丙氨酸转氨酶(alanine transaminase，ALT)、谷草转氨酶(aspartate aminotransferase，AST)和肌酸激酶(creatine kinase，CK)均有升高。所述症状与感染嗜中性粒细胞无形体(anaplasmaphagocytophilum)的患者相似，但经国家疾控中心相关研究证实，该病病原体是一种新的布尼亚病毒，又称发热伴血小板减少综合征布尼亚病毒(severe fever withthrombocytopenia syndrome bunyavirus，sftsv)，属于布尼亚病毒科蛉热病毒属的一种新病毒。
与其它布尼亚病毒科白蛉热病毒属病毒类似，sftsv是一种球形、有包膜的负链RNA病毒，直径90-100nm，基因组RNA分为大(L)、中(M)、小(s)3个节段。L节段碱基长度是6368bp，其中包含2084个氨基酸的编码框；M节段碱基长度为3378bp，其中编码两种糖蛋白(Gn、Gc)的前体；S节段长为1744bp，编码核蛋白(Nucleocapsid protein，NP)和非结构蛋白NSs蛋白。
可用于新布尼亚病毒检测或确认的方法有病毒分离、免疫荧光检测(immunofluorescence assay，IFA)、酶联免疫吸附检测(enzyme—linked immunosorbentassay，ELISA)、微量中和检测(microneutralization test，MNT)及分子生物学方法(reverse transcription polymerase chain reaction，RT—PCR)。
基于RT-PCR的检测标准已经建立，但是该方法操作复杂，依赖贵重仪器，不便于区县医院推广检测，另外RT-PCR只能说明病毒存在体内感染，不能说明病毒在体内复制状态以及既往感染水平和疫苗的保护作用。
ELISA方法操作简便，不依赖贵重仪器，目前的ELISA主要是检测病毒的NP抗原以及针对NP的抗体，由于NP抗原为病毒核衣壳抗原，因此针对NP抗原的ELISA检测试剂盒确实能够给PCR检测提供印证病毒感染的方法，但不能提供体内保护抗体的水平；由于NP蛋白为核衣壳蛋白，不直接参与病毒吸附侵入感染细胞的过程，针对NP的抗体不能阻止病毒感染机体，因此检测针对NP的抗体ELISA试剂盒只能反应体内免疫***对病毒的抗体反应，不能直接反应保护抗体的水平。
发明内容
发明人在研究过程中发现，针对GN包膜蛋白的抗体能阻止SFTSV感染细胞，具有中和活性。故推测，检测针对GN抗体的ELISA试剂盒将能显示体内保护抗体的水平，能更好的辅助临床诊断和治疗SFTSV病毒感染。为证实上述假设，发明人从GN蛋白中截取一段，用来检测患者血液样品中的GN抗体情况，并观察患者的病程发展情况。出乎意料地，发明人发现，检测结果与患者的生死密切相关，检测结果为阳性的SFTS感染者全部存活，而80％的阴性SFTS感染者死亡。
基于以上发现，本发明提供了一种用于诊断SFTS患者预后情况的蛋白质，其包含氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示的肽段。
在一个优选实施方案中，所述肽段的C端连接有标签。标签的加入可在制备中有利于纯化，也可在检测过程中起鉴别作用。
在一个实施方案中，所述标签肽为多聚组氨酸标签、兔Fc或荧光标记。
本发明还提供了表达上述蛋白质的表达载体，其特征在于，包含编码所述蛋白质的核酸，以及位于所述核酸序列上游的启动子。
在一个实施方案中，所述核酸中编码SEQ ID NO:1所示的肽段的核苷酸序列如SEQID NO:3所示。
在一个实施方案中，所述表达载体的5’端还连接有编码IL2信号肽的核苷酸序列。通过添加IL2信号肽，可促进该蛋白质的分泌。
本发明还提供了上述蛋白质在制备诊断SFTS感染者预后情况的试剂中的应用。
本发明还提供了一种用于诊断SFTS患者预后情况的试剂盒，其中包括上述的蛋白质，以及检测所述蛋白质的抗体。
在一个优选实施方案中，所述试剂盒中包含两种所述蛋白质，分别为捕获用蛋白质和检测用蛋白质，所述检测用蛋白质上具有所述捕获用蛋白质上没有的标签。捕获用蛋白质可捕获样品中的抗SFTSV抗体，检测用蛋白质可特异性结合捕获的抗SFTSV抗体，并且检测用蛋白质上的标签可用于显示该检测用蛋白质的存在与否，从而体现样品中是否存在抗SFTSV抗体。
在一个具体实施方案中，所述试剂盒包括以下试剂：
1)包被了所述捕获用蛋白质的固体基质，例如，可为包被0.1-10μg/ml sGN-his蛋白(即，C端加多聚组氨酸标签)于96孔酶免透明聚苯乙烯微孔板；
2)封闭液，例如，可为含有5％脱脂奶粉的PBST；
3)包含所述检测用蛋白质的溶液，例如，可为用封闭液稀释的工作浓度为0.1-10μg/ml sGN-rFc蛋白(即，C端加兔Fc标签)，也可是荧光标记的sGN；
4)显示用试剂组，显示用试剂组用根据检测用蛋白质上的标签来设计。例如，当蛋白质为sGN-rFc时，显示用试剂组可包括偶联了HRP的羊抗兔二抗以及TMB显色底物。
通过本发明的蛋白质及试剂盒，可检测SFTS患者体内是否存在保护性抗体，判断该患者的预后情况。当本发明的试剂盒检测为阳性时，患者预后良好，都能存活，当检测结果为阴性时，患者预后不良，80％的阴性患者都死亡，可见本发明的试剂盒具有对SFTS患者具有可靠的预后判断能力。检测结果呈阳性的SFTS病人可以采取保守治疗，呈阴性的SFTS病人，应采取应急治疗。
附图说明
图1为pFuse-sGN-his的质粒图；
图2为pVAX1-sGN-rFc的质粒图；
图3为SDS-PAGE检测纯化的sGN-his和sGN-rFc蛋白的电泳照片；
图4为WB检测人血清和GN蛋白结合反应的电泳照片，1-10是康复期病人Pt1-10；12-15是死亡病人Pt12-15；N2、N4、N11是健康人,M为蛋白marker；
图5为ELISA检测人血清样品的OD450nm的统计图。
具体实施方式
以下结合实例对本发明的原理和特征进行描述，所举实例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。
从NCBI网站获取HB29SFTSV的GN蛋白序列和基因序列信息，进行序列分析，选取不同区段进行优化表达以及表达纯化实验，根据表达实验和免疫实验的结果，发明人出乎意料地发现，当用SEQ ID NO:1所示氨基酸序列进行检测时，显示检测成阳性的患者预后良好，反之，检测结果呈阴性的患者预后不良，百分之八十的阴性患者均死亡，可见，该肽段与预后具有强烈的相关性。基于以上研究成果，本实施例提供的方案如下。
1.抗原肽(Gn)的表达和纯化
在SEQ ID NO:1对应的核酸序列SEQ ID NO:2的基础上进行人类密码子优化，得到SEQ ID NO:3，以更利于人肾上皮细胞系293F的表达，此外，在SEQ ID NO:3的N端连接IL2信号肽(即，在5’端连接IL2信号肽的编码序列)以促进蛋白的分泌。并在C端连接6个组氨酸作为His-tag(即，在3’端连接6个组氨酸的编码序列，最终得到的融合蛋白在本文中称为sGN-his)，或在C端连接兔Fc(即，在3’端连接兔Fc的编码序列，得到的融合蛋白在本文中称为sGN-rFc)。将以上核酸序列分别克隆岛真核表达载体pVAX1中，得到sGN-his的表达载体(图1)和sGN-rFc的表达载体(图2)。将上述两个表达载体分别转入293F悬浮细胞中，分别表达sGN-his和sGN-rFc。
收集细胞转染上清，通过Ni+NTA柱纯化sGN-his，Protein A纯化sGN-rFc，获得两种蛋白。SDS-PAGE检测蛋白分子量和纯度。如图2所示，sGN-his和sGN-rFc蛋白条带大小和预期的一致，纯度大于90％，表明sGN-his和sGN-rFc蛋白表达成功。
2.Western blot检测病人血清与sGN-his蛋白的反应
10％的SDS-PAGE胶用来分离sGN-his蛋白，通过湿转法将蛋白电转到PVDF膜，5％脱脂奶粉封闭，将不同的病人血清以及健康人血清均以5％脱脂牛奶1:300稀释，4℃孵育过夜，PBST洗涤3次。goat-anti-human-HRP二抗以5％脱脂牛奶稀释，终浓度为1:4万，室温孵育1h，PBST洗膜5次，ECL显示，暗室曝光。结果如表1和图4所示，健康人血清不与sGN-his蛋白结合，死亡病人血清均不与sGN-his蛋白结合，康复期的病人血清有9/10与sGN-his蛋白结合；这些结果提示，WB阳性的SFTS病人，存活率为9/9(泳道1-8和10)，100％，WB阴性的SFTS病人存活率为1/5(泳道9)，20％，死亡率为4/5(泳道12-15)，80％。
由此可见，该抗原肽的检测结果与SFTS患者的存活和死亡强烈相关。
表1健康者和不同患者的WB血清结合总览
3.ELISA试剂盒
针对该抗原肽的检测特性，设计出ELISA试剂盒，以利于临床检测。该试剂盒包括：
(1)GN-his蛋白包被的96孔酶免透明聚苯乙烯微孔板；
(2)封闭液：5％脱脂奶粉溶于PBST，
(3)检测用蛋白：封闭液稀释的工作浓度为0.1ug/ml～10ug/ml sGN-rFc蛋白；
(4)显示剂，包括：二抗：Goat-anti-rabbit-HRP的二抗(Jackson immuneresearch公司，711-035-152)和TMB底物(Biopanda Cat NO.TMB-S-003)。
其中，GN-his蛋白包被的96孔酶免透明聚苯乙烯微孔板可通过以下方法制备：用包被液稀释sGN-his蛋白，至终浓度为0.1-10μg/ml，每孔150-200μl加入酶标板中，4℃过夜。
4.ELISA试剂盒的使用方法
本试剂盒于2-8℃保存，有效期6个月。使用前将试剂盒平衡至室温(约30分钟)。未用完的微孔板条须与干燥剂及其自封袋密封2-8℃保存。实验前将液体试剂轻轻震荡混匀，使用后立即密闭放回2-8℃保存。在实验过程中设立空白对照，即，没有包被sGN-his蛋白的微孔，具体检测方法如下：
S1：洗板，以洗涤缓冲液PBST洗涤3遍，PBST 150-200μl/孔，5min/次，甩干孔中洗涤液并于无尘吸水纸上扣拍两下将包被sGN-his蛋白的微孔板条平衡至室温，洗液洗板3次；
S2：封闭，封闭液150-200μl/孔，37℃封闭1小时，洗液洗板3次；
S3：上样，病人及健康人血清用封闭液以1：1，1：5倍两个梯度稀释，预先在八连排中稀释，之后20μl/孔加入到封闭好的孔中，置于37℃1.5小时，上样完毕洗涤3遍；
S4：检测用蛋白孵育，洗板后添加20μl终浓度为500ng/μl的sGN-rFc蛋白，37℃孵育1.5小时，上样完毕洗涤3遍；
S5：显示，洗液洗板3次，添加用封闭液稀释的Goat-anti-rabbit-HRP的二抗37℃孵育1小时，洗板后添加TMB底物显色，10分钟后用1M H2SO4进行终止；
S6：:读板，于酶标仪上波长450nm处读取OD值，并保存数据。
结果判断：
复孔差异应小于10％。
阳性对照，阴性对照正常。
将读取的OD值作如下计算：
P/N＝(实验值-空白对照)/(阴性对照-空白对照)
当P/N值≥2.1时，同时OD值>0.2时，表明实验组为阳性，反之则为阴性。
ELISA检测结果显示10位SFTS康复期血清里，8位显示阳性，2位显示阴性；4位死亡SFTS病人的血清里均不含有针对GN蛋白的抗体；作为阴性对照，29位健康人的血清均没检出针对GN蛋白的抗体，说明该试剂盒假阳性率为0％，具有极好的特异性检测(图5)。结果显示，ELISA试剂盒的检测结果与WB检测人血清与sGN-his蛋白的结合基本一致(表2)。即ELISA和WB阳性的SFTS病人，存活率均为100％，WB阴性的SFTS病人死亡率为4/5，80％，ELISA检测阴性的SFTS病人死亡率,4/6，66.7％。因此该试剂盒对SFTS病人血清阳性和阴性的结果对于辅助治疗SFTS感染具有十分重要的临床价值；实验结果提示对于ELISA阳性的SFTS病人可以采取保守治疗，对于ELISA阴性的SFTS病人，应采取应急治疗。
表2 ELISA试剂盒检测结果总览
以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 源道隆（苏州）医学科技有限公司
<120> 一种用于诊断SFTS患者预后情况的蛋白质及其应用
<130> 1
<160> 3
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 433
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 1
Asp Ser Gly Pro Ile Ile Cys Ala Gly Pro Ile His Ser Asn Lys Ser
1 5 10 15
Ala Gly Ile Pro His Leu Leu Gly Tyr Ser Glu Lys Ile Cys Gln Ile
20 25 30
Asp Arg Leu Ile His Val Ser Ser Trp Leu Arg Asn His Ser Gln Phe
35 40 45
Gln Gly Tyr Val Gly Gln Arg Gly Gly Arg Ser Gln Val Ser Tyr Tyr
50 55 60
Pro Ala Glu Asn Ser Tyr Ser Arg Trp Ser Gly Leu Leu Ser Pro Cys
65 70 75 80
Asp Ala Asp Trp Leu Gly Met Leu Val Val Lys Lys Ala Lys Glu Ser
85 90 95
Asp Met Ile Val Pro Gly Pro Ser Tyr Lys Gly Lys Val Phe Phe Glu
100 105 110
Arg Pro Thr Phe Asp Gly Tyr Val Gly Trp Gly Cys Gly Ser Gly Lys
115 120 125
Ser Arg Thr Glu Ser Gly Glu Leu Cys Ser Ser Asp Ser Gly Thr Ser
130 135 140
Ser Gly Leu Leu Pro Ser Asp Arg Val Leu Trp Ile Gly Asp Val Ala
145 150 155 160
Cys Gln Pro Met Thr Pro Ile Pro Glu Glu Thr Phe Leu Glu Leu Lys
165 170 175
Ser Phe Ser Gln Ser Glu Phe Pro Asp Ile Cys Lys Ile Asp Gly Ile
180 185 190
Val Phe Asn Gln Cys Glu Gly Glu Ser Leu Pro Gln Pro Phe Asp Val
195 200 205
Ala Trp Met Asp Val Gly His Ser His Lys Ile Ile Met Arg Glu His
210 215 220
Lys Thr Lys Trp Val Gln Glu Ser Ser Ser Lys Asp Phe Val Cys Tyr
225 230 235 240
Lys Glu Gly Thr Gly Pro Cys Ser Glu Ser Glu Glu Lys Ala Cys Lys
245 250 255
Thr Ser Gly Ser Cys Arg Gly Asp Met Gln Phe Cys Lys Val Ala Gly
260 265 270
Cys Glu His Gly Glu Glu Ala Ser Glu Ala Lys Cys Arg Cys Ser Leu
275 280 285
Val His Lys Pro Gly Glu Val Val Val Ser Tyr Gly Gly Thr Arg Val
290 295 300
Arg Pro Lys Cys Tyr Gly Phe Ser Arg Met Met Ala Thr Leu Glu Val
305 310 315 320
Asn Pro Pro Glu Gln Arg Ile Gly Gln Cys Thr Gly Cys His Leu Glu
325 330 335
Cys Ile Asn Gly Gly Val Arg Leu Ile Thr Leu Thr Ser Glu Leu Arg
340 345 350
Ser Ala Thr Val Cys Ala Ser His Phe Cys Ser Ser Ala Ser Ser Gly
355 360 365
Lys Lys Ser Thr Glu Ile His Phe His Ser Gly Ser Leu Val Gly Lys
370 375 380
Thr Ala Ile His Val Lys Gly Ala Leu Val Asp Gly Thr Glu Phe Thr
385 390 395 400
Phe Glu Gly Ser Cys Met Phe Pro Asp Gly Cys Asp Ala Val Asp Cys
405 410 415
Thr Phe Cys Arg Glu Phe Leu Lys Asn Pro Gln Cys Tyr Pro Ala Lys
420 425 430
Lys
<210> 2
<211> 1299
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
gattcgggcc caatcatctg cgcaggaccc atccactcaa acaagagtgc tggcataccc 60
cacctgcttg gttactctga gaagatttgt cagatagatc ggctgataca tgtttcgtca 120
tggctcagga accactcgca atttcaaggc tacgttgggc agcgaggtgg acgctctcag 180
gttagctact acccagctga gaattcttac tcgaggtgga gtggacttct aagcccctgt 240
gatgctgatt ggcttgggat gcttgtcgtg aagaaggcta aggagtctga tatgatagtt 300
cctgggcctt catacaaggg gaaagtcttt tttgaacggc caacttttga tggatacgta 360
ggctggggct gtggcagtgg gaagtctagg actgagtcag gagagctctg cagttcagac 420
tcagggacaa gttctggtct tctgccctcg gatagggttc tctggatagg tgatgttgct 480
tgtcagccta tgacacccat ccctgaggag acatttctgg agctgaagag ttttagccaa 540
agtgaattcc cagacatatg taaaattgat ggcattgtgt tcaaccagtg tgagggtgag 600
agtctacccc agccctttga tgttgcatgg atggatgttg gccactctca taagatcatc 660
atgagggagc acaagaccaa atgggtacaa gagagctcat ccaaggattt tgtgtgctac 720
aaggaaggga ctggaccttg ttctgaatca gaagaaaagg cttgtaagac cagtggatca 780
tgcagagggg acatgcagtt ttgcaaggtg gcaggttgcg aacatggaga ggaggcatct 840
gaggccaagt gtagatgctc acttgtgcac aagcctgggg aagtcgttgt gtcatatgga 900
gggacgcgtg tcagaccaaa gtgctacggt ttctccagaa tgatggcaac actggaggtg 960
aacccaccag agcaaaggat tggtcaatgc actggctgcc atctagaatg cataaatggg 1020
ggtgtgaggc taatcactct aaccagtgag ctcaggtcag ctactgtctg tgcttcccac 1080
ttttgcagtt ctgcctcaag tggtaagaaa agcacggaga ttcatttcca ctcaggatca 1140
ttggttggga aaacagctat ccatgtcaaa ggggcattgg tagatggaac tgaattcaca 1200
tttgagggta gttgcatgtt cccagatgga tgtgatgcag tggactgcac attctgtcgt 1260
gagtttctaa aaaatcctca gtgctaccct gcaaagaag 1299
<210> 3
<211> 1299
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
gattcaggcc ctattatttg tgctggccct atccacagca acaagtccgc cggcatccct 60
cacctgctgg gctacagcga gaagatctgc cagatcgata gactgatcca cgtgagcagc 120
tggctgagga accactccca gttccagggc tacgtgggcc agaggggcgg ccggtctcag 180
gtgagctact atccagccga gaacagctat tctcggtgga gcggcctgct gtccccttgt 240
gacgctgatt ggctgggcat gctcgtggtg aagaaggcca aggagagcga tatgatcgtg 300
ccaggcccct cctacaaggg caaggtgttc tttgagagac caaccttcga cggctatgtg 360
ggctggggct gcggctccgg caagtctagg accgagtctg gcgagctgtg ctctagcgac 420
agcggcacat cctctggcct gctgcctagc gatcgggtgc tgtggatcgg cgacgtggcc 480
tgccagccaa tgacccctat cccagaggag acatttctgg agctgaagag cttctcccag 540
tctgagtttc cagatatctg taagatcgac ggcatcgtgt tcaatcagtg tgagggcgag 600
tctctgcccc agccttttga tgtggcctgg atggacgtgg gccactccca caagatcatc 660
atgcgggagc acaagacaaa atgggtgcag gagagctcct ctaaggattt cgtgtgctat 720
aaggagggca ccggcccctg tagcgagtcc gaggagaagg cctgcaagac atctggcagc 780
tgtcggggcg acatgcagtt ttgcaaggtg gctggctgtg agcacggcga ggaggcctcc 840
gaggccaagt gcagatgttc tctggtgcac aagcccgggg aggtggtggt gagctacggc 900
ggcacccggg tgagacctaa gtgctatggc ttttccagga tgatggccac cctggaggtg 960
aacccccctg agcagcggat cggccagtgc acaggctgtc acctggaatg tatcaatggc 1020
ggcgtgcggc tgatcaccct gacatctgag ctgagaagcg ccacagtgtg cgcctcccac 1080
ttctgttcct ccgcctctag cggcaagaag tctaccgaga tccactttca ctccggctct 1140
ctggtgggca agacagccat ccacgtgaag ggcgccctgg tggatggcac cgagttcaca 1200
tttgagggca gctgcatgtt ccccgacggc tgtgatgccg tggactgcac cttttgtagg 1260
gagtttctga agaacccaca gtgttaccca gctaagaag 1299

Claims (10)

1.一种用于诊断SFTS患者预后情况的蛋白质，其特征在于，氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。
2.根据权利要求1所述的蛋白质，其特征在于，所述肽段的C端连接有标签。
3.根据权利要求2所述的蛋白质，其特征在于，所述标签为多聚组氨酸标签、兔Fc或荧光标记。
4.权利要求1-3中任一项所述的蛋白质的表达载体，其特征在于，包含编码所述蛋白质的核酸，以及位于所述核酸序列上游的启动子。
5.根据权利要求4所述的表达载体，其特征在于，所述核酸中编码SEQ ID NO:1所示的肽段的核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示。
6.根据权利要求4所述的表达载体，其特征在于，所述表达载体的5’端还连接有编码IL2信号肽的核苷酸序列。
7.权利要求1-3中任一项所述的蛋白质在制备诊断SFTS感染者预后情况的试剂中的应用。
8.一种用于诊断SFTS患者预后情况的试剂盒，其特征在于，包括权利要求1-3中任一项所述的蛋白质，以及检测所述蛋白质的抗体。
9.根据权利要求8所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中包含两种所述蛋白质，分别为捕获用蛋白质和检测用蛋白质，所述检测用蛋白质上具有所述捕获用蛋白质上没有的标签。
10.根据权利要求9所述的试剂盒，其特征在于，包含以下试剂：
1)包被了所述捕获用蛋白质的固体基质；
2)封闭液；
3)含有所述检测用蛋白质的溶液；
4)显示用试剂组。
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