CN112500494A - 用于新型冠状病毒检测的抗原及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明提出的一种用于新型冠状病毒检测的抗原及其制备方法，所述用于新型冠状病毒检测的抗原包括基于核衣壳蛋白的融合蛋白。该用于新型冠状病毒检测的抗原及其制备方法，通过融合技术获得含有新型冠状病毒的核衣壳蛋白的融合蛋白，使融合蛋白具有新型冠状病毒核衣壳蛋白天然空间结构特征的同时改善其性质，用于新型冠状病毒检测时灵敏度高、特异性强，更适宜用于新型冠状病毒检测以提高新型冠状病毒的检出率，确保新型冠状病毒肺炎的及时确诊，能够有效避免疫情的扩散。

Description

用于新型冠状病毒检测的抗原及其制备方法

技术领域

本发明涉及生物医药检测领域，特别是涉及一种用于新型冠状病毒检测的抗原及其制备方法。

背景技术

新型冠状病毒肺炎(Corona Virus Disease 2019，COVID-19)是由感染新型冠状病毒(SARS-CoV-2，亦称2019-nCoV)引起的以肺部病变为主的新发传染病，可引起消化***和神经***的损伤，严重者可导致死亡。目前针对2019-nCoV的还没有特效治疗药物，疫苗也处于临床试验阶段，患者的早诊断、及时收治和隔离对有效控制疫情至关重要。新冠病毒感染的大量排查主要还是采用核酸检测，核酸检测因其敏感性强成为疑似病例确诊的金标准，但该技术对实验场所及人员要求高、操作繁琐、受环境条件影响比较大，容易受气溶胶的污染出现假阳性。传统的抗原抗体反应是临床实验室检测的重要补充，利用抗原去检测感染者血清中的抗体是快速筛查和核酸辅助诊断的重要手段。目前很多公司已经开发出通过血清学诊断方法用于COVID-19临床诊断的检测试剂盒，如胶体金法和传统ELISA方法，筛选出SARS-CoV-2中保守的具有优势表位的抗原或联合抗原是血清学诊断成功的关键。SARS-CoV-2基因大小约为29.8kb，基因组被注释为含有14个开放阅读框(Opening readingframe，ORF)，共编码27～28个蛋白质。核衣壳蛋白(N蛋白)是SARS-CoV-2的一种主要的结构蛋白，其位于病毒内部，是干扰素(Interferon，IFN)的拮抗剂和病毒编码的RNA干扰抑制因子，与病毒的复制有关，N蛋白在β属冠状病毒之间相对比较保守，合成数量众多，具有很强抗原性，在诱导宿主免疫应答甚至发病机制中发挥重要作用，常被用作冠状病毒诊断的抗原位点。但是现有的直接基于N蛋白作为抗原用于检测SARS-CoV-2的方法检出率低，影响COVID-19的确诊效率及疫情的控制。

发明内容

基于此，有必要针对现有的直接基于N蛋白作为抗原用于检测SARS-CoV-2的方法检出率低，影响COVID-19的确诊效率及疫情的控制的问题，提供一种用于新型冠状病毒检测的抗原及其制备方法。

本发明提出的一种用于新型冠状病毒检测的抗原，所述用于新型冠状病毒检测的抗原包括基于核衣壳蛋白的融合蛋白。

在其中的一个实施例中，所述基于核衣壳蛋白的融合蛋白为可溶性蛋白。

在其中的一个实施例中，所述基于核衣壳蛋白的融合蛋白为核衣壳蛋白的氨基酸序列或部分氨基酸序列与二硫化物氧化还原酶A的氨基酸序列或部分氨基酸序列融合表达生成的融合蛋白；或，核衣壳蛋白的氨基酸序列或部分氨基酸序列与二硫化物氧化还原酶C的氨基酸序列或部分氨基酸序列融合表达生成的融合蛋白。

在其中的一个实施例中，所述二硫化物氧化还原酶A的核苷酸序列为如SEQ IDNo.1所示的核苷酸序列或如SEQ ID No.1所示的核苷酸序列的突变序列；

所述二硫化物氧化还原酶C的核苷酸序列为如SEQ ID No.2所示的核苷酸序列或如SEQ ID No.2所示的核苷酸序列的突变序列；

所述核衣壳蛋白的核苷酸序列为如SEQ ID No.3所示的核苷酸序列或如SEQ IDNo.3所示的核苷酸序列的突变序列。

在其中的一个实施例中，所述核衣壳蛋白的核苷酸序列与所述二硫化物氧化还原酶A的核苷酸序列的C端直接连接或通过接头连接；

所述核衣壳蛋白的氨基酸序列与所述二硫化物氧化还原酶C的氨基酸序列的C端直接连接或通过接头连接。

在其中的一个实施例中，所述基于核衣壳蛋白的融合蛋白通过原核表达***表达生成。

本发明还提出了一种用于新型冠状病毒检测的抗原的制备方法，所述制备方法包括以下步骤：

根据如SEQ ID No.3所示的核苷酸序列合成核衣壳蛋白基因片段；

通过内切酶SalⅠ以及内切酶NheⅠ将所述核衣壳蛋白基因片段从克隆载体上切下；

将所述核衣壳蛋白基因片段克隆到载体PET-DsbA或PET-DsbC上，转化到原核表达***中诱导表达生成基于核衣壳蛋白的融合蛋白。

在其中的一个实施例中，合成所述核衣壳蛋白基因片段的上游引物的核苷酸序列如SEQ ID No.5所示；合成所述核衣壳蛋白基因片段的下游引物的核苷酸序列如SEQ IDNo.6所示。

在其中的一个实施例中，所述制备方法还包括以下步骤：

对所述基于核衣壳蛋白的融合蛋白进行亲和纯化和/或凝胶纯化。

在其中的一个实施例中，所述原核表达***为大肠杆菌。

上述用于新型冠状病毒检测的抗原及其制备方法，通过融合技术获得含有新型冠状病毒的核衣壳蛋白的融合蛋白，使融合蛋白具有新型冠状病毒核衣壳蛋白天然空间结构特征的同时改善其性质，用于新型冠状病毒检测时灵敏度高、特异性强，更适宜用于新型冠状病毒检测以提高新型冠状病毒的检出率，确保新型冠状病毒肺炎的及时确诊，能够有效避免疫情的扩散。

进一步地，上述用于新型冠状病毒检测的抗原及其制备方法，基于核衣壳蛋白的融合蛋白为可溶性蛋白，该可溶性蛋白可以以上清的形式存在，在用于血清学检测时能够有效提高新型冠状病毒抗体的检出率，确保检测的准确性。

更进一步地，上述用于新型冠状病毒检测的抗原及其制备方法，将新型冠状病毒的核衣壳蛋白与二硫化物氧化还原酶A或二硫化物氧化还原酶C进行融合表达，充分利用二硫化物氧化还原酶C的二硫键异构酶和分子伴侣的生物特性，提高融合蛋白可溶性，促使融合蛋白在重组表达过程中以上清的形式存在，进而提高新型冠状病毒抗体的检出率，为血清学检测试剂盒打下物质基础。

附图说明

图1为本发明实施例1的SARS-CoV-2 N蛋白核苷酸分子量凝胶电泳鉴定结果图；

图2为本发明实施例1 DsbC-N融合蛋白在原核***内表达形式鉴定结果图；

图3为本发明实施例1纯化后DsbC-N融合蛋白的纯度鉴定结果图；

图4为本发明DsbC-N融合蛋白用于ELISA实验的检测结果图。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合具体实施方式对本发明进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施方式仅仅用以解释本发明，但并不用于限定本发明。

截止到2020年8月20日，世界感染SARS-CoV-2的人数超过2000万，在早期检测中，核酸检测发挥了巨大作用，达到了早诊断、早隔离的目的。随着新冠病毒的基因组序列的解析出来，各个结构蛋白的表达序列被测序，重组诊断抗原开始发挥作用。病毒感染机体时，在机体血清抗体中，IgM抗体出现最早，是急性期感染的诊断指标，但IgM浓度低、维持时间只有一周左右并且亲和力低；IgG抗体产生较晚，能提示染中后期或者是具有既往感染的产生，并且IgG抗体具有浓度高、维持时间长、亲和力高。目前已有多家生物公司研发出检测SARS-CoV-2 IgM和IgG抗体的诊断方法，为新型冠状病毒感染的辅助诊断和流行病调查提供了一个极好的检测手段。抗体检测的特异性与抗原位点的保守性密切相关，SARS-CoV-2的N蛋白是COVID-19检测的主要抗原位点，目前临床新冠病毒检测试剂盒大多采用N蛋白抗原或者刺突蛋白(S蛋白)抗原或者联用方法去检测血清抗体。但是采用N蛋白抗原或者刺突蛋白(S蛋白)抗原或者联用方法去检测血清抗体在敏感性和特异性方面仍有待进一步提高，以提高SARS-CoV-2的检出率。

为了提高N蛋白抗原在血清学诊断中的敏感性和特异性，同时提高N蛋白在原核重组中表达量，在本发明中，采用N蛋白与DsbA或DsbC融合表达的方法，由于在原核重组中，可溶性表达往往代表重组蛋白正确的空间折叠方式，为了保证了检测抗原的空表表位，本发明利用DsbA和DsbC蛋白分子伴侣和二硫键异构酶的生物学特性，获得了SARS-CoV-2 N蛋白的上清表达，很好保证了在血清学诊断中的检出率。

本发明提出的一种用于新型冠状病毒检测的抗原，用于新型冠状病毒检测的抗原包括基于核衣壳蛋白的融合蛋白。该用于新型冠状病毒检测的抗原，通过融合技术获得含有新型冠状病毒的核衣壳蛋白的融合蛋白，使融合蛋白具有新型冠状病毒核衣壳蛋白天然空间结构特征的同时改善其性质，用于新型冠状病毒检测时灵敏度高、特异性强，更适宜用于新型冠状病毒检测以提高新型冠状病毒的检出率，确保新型冠状病毒肺炎的及时确诊，能够有效避免疫情的扩散。

优选的，基于核衣壳蛋白的融合蛋白为可溶性蛋白，该可溶性蛋白可以以上清的形式存在，在用于血清学检测时能够有效提高新型冠状病毒抗体的检出率，确保检测的准确性。

作为一种可选实施方式，基于核衣壳蛋白的融合蛋白为核衣壳蛋白的氨基酸序列或部分氨基酸序列与二硫化物氧化还原酶A(DsbA)的氨基酸序列或部分氨基酸序列融合表达生成的融合蛋白；或，核衣壳蛋白的氨基酸序列或部分氨基酸序列与二硫化物氧化还原酶C(DsbC)的氨基酸序列或部分氨基酸序列融合表达生成的融合蛋白。蛋白质中二硫键的形成是原核生物和真核生物的重要过程，重组的融合蛋白的可溶性表达往往代表着蛋白正确的空间折叠方式、保持着蛋白的天然空间结构，为了保证新冠病毒核衣壳蛋白融合纯化过程的天然构想，本发明将新型冠状病毒的核衣壳蛋白与二硫化物氧化还原酶A或二硫化物氧化还原酶C进行融合表达，充分利用二硫化物氧化还原酶A和二硫化物氧化还原酶C的二硫键异构酶和分子伴侣的生物特性，提高融合蛋白可溶性，促使融合蛋白在重组表达过程中以上清的形式存在，进而提高新型冠状病毒抗体的检出率，为血清学检测试剂盒打下物质基础。

作为一种可选实施方式，二硫化物氧化还原酶A的核苷酸序列为如SEQ ID No.1所示的核苷酸序列或如SEQ ID No.1所示的核苷酸序列的突变序列；二硫化物氧化还原酶C的核苷酸序列为如SEQ ID No.2所示的核苷酸序列或如SEQ ID No.2所示的核苷酸序列的突变序列；核衣壳蛋白的核苷酸序列为如SEQ ID No.3所示的核苷酸序列或如SEQ ID No.3所示的核苷酸序列的突变序列。

其中，在实际进行核衣壳蛋白与二硫化物氧化还原酶A或二硫化物氧化还原酶C的融合表达过程中，可根据需要使核衣壳蛋白核苷酸序列进行突变以改善融合表达后的融合蛋白的特征，其中可选的突变方式包括增加、删除或替换核苷酸序列中的某一个或某几个核苷酸；同理，也可根据需要使二硫化物氧化还原酶A核苷酸序列或二硫化物氧化还原酶C核苷酸序列进行突变以改善融合表达后的融合蛋白的特征，同样可选的突变方式包括增加、删除或替换核苷酸序列中的某一个或某几个核苷酸。

作为一种可选实施方式，核衣壳蛋白的核苷酸序列与二硫化物氧化还原酶A的核苷酸序列的C端直接连接或通过接头连接；核衣壳蛋白的氨基酸序列与二硫化物氧化还原酶C的氨基酸序列的C端直接连接或通过接头连接。例如，可通过核苷酸序列为GGGGSGGGGS软性接头将核衣壳蛋白与二硫化物氧化还原酶A或二硫化物氧化还原酶C连接起来。

作为一种可选实施方式，基于核衣壳蛋白的融合蛋白通过原核表达***表达生成，优选的表达菌株为大肠杆菌。

本发明的第二大方面还提出了一种用于新型冠状病毒检测的抗原的制备方法，制备方法包括以下步骤：

根据如SEQ ID No.3所示的核苷酸序列合成核衣壳蛋白基因片段；

通过内切酶SalⅠ以及内切酶NheⅠ将核衣壳蛋白基因片段从克隆载体上切下；

将核衣壳蛋白基因片段克隆到载体PET-DsbA或PET-DsbC上，转化到原核表达***中诱导表达生成基于核衣壳蛋白的融合蛋白。

进一步可选的，合成核衣壳蛋白基因片段的上游引物的核苷酸序列如SEQ IDNo.5所示；合成核衣壳蛋白基因片段的下游引物的核苷酸序列如SEQ ID No.6所示。

本发明根据GenBank:MN908947.3报道的新型冠状病毒核衣壳蛋白的核酸序列，参照载体pET-DsbA和pET-DsbC多克隆位点，设计合成了针对核衣壳蛋白核苷酸的特异引物，在下游引物的5端引入大肠杆菌偏性的终止密码子TAA。具体的，上游引物的核苷酸序列为5-ACGCGTCGACTCTGATAATGGACC-3；下游引物的核苷酸序列为5-CTAGCTAGCTTAGGCCTGAGTTGAGTCAGC-3，并且上由引物以及下游引物的末端分别引入了内切酶SalⅠ的酶切位点GCTAG和内切酶NheⅠ的酶切位点GCTAG(序列中粗体部分)以便通过切酶SalⅠ以及内切酶NheⅠ将核衣壳蛋白基因片段从克隆载体切下。

可选的，本发明以载体pUC18-SARS-CoV-2核衣壳蛋白核苷酸序列为模板，在热激TaqDNA聚合酶作用下，通过上游引物和下游引物以常规PCR方法扩增SARS-CoV-2核衣壳蛋白核苷酸序列。

可选的，PCR方法扩增条件如下：

94℃预变性5min，98℃变性20s、68℃退火20s、72℃延伸80s进行30个循环，72℃延伸5min。

PCR扩增产物以1％琼脂糖电泳验证产物分子量后，对PCR扩增产物进行胶回收，回收的扩增产物和表达载体pET-DsbA或pET-DsbC均以SalⅠ和NheⅠ进行双酶切，通过1％的琼脂糖电泳切胶回收酶切后的产物，在T4DNA连接酶的作用下，把酶切回收产物(包括N蛋白基因片段和表达质粒pET-DsbA或pET-DsbC)中的N蛋白基因片断克隆连接到表达质粒pET-DsbA或pET-DsbC中，克隆连接产物转化至大肠杆菌感受态细胞BL21(DE3)，筛选阳性克隆产物进行测序。

取经测序正确的DsbA-N融合蛋白或DsbC-N融合蛋白工程菌接种于含卡那霉素浓度为50ng/ml的LB培养基中，置于摇床内在37℃条件下震荡培养激活，次日按1:50的比例转接到同样体系的LB培养基中，在37℃条件下进行震荡培养至菌液OD600达0.4h，加入IPTG使得终浓度为0.3mmoL，37℃条件下继续震荡培养诱导5h。诱导后菌液在4℃条件下、5000rpm离心收集菌体，沉淀菌体加入1×PBS缓冲液混匀后，冰育转态下进行超声破碎，4℃条件下、12000rpm离心30min，收集上清和沉淀，以12％的SDS-PAGE鉴定DsbA-N融合蛋白或DsbC-N融合蛋白在原核***内表达形式。

作为一种可选实施方式，制备方法还包括以下步骤：

对基于核衣壳蛋白的融合蛋白进行亲和纯化和/或凝胶纯化。

DsbA-N融合蛋白和DsbC-N融合蛋白的N端带有6×HIS标签，可利用chelatingsephrose进行亲和层析对融合表达后生成的收集上清和沉淀，纯化方便且纯化后融合蛋白的纯度较高。

利用亲和层析对表达后的超声上清蛋白进行目的蛋白纯化，在4℃条件下取离心上清按2mL/min的速度过镍离子亲和柱，以1×PBS平衡4个柱积后，以100mmoL咪唑洗脱杂蛋白3个柱积，再用200mmoL咪唑洗脱目的融合蛋白，收集目的蛋白，以15％的SDS-PAGE对纯化后融合蛋白进行纯度测定。

本发明的用于新型冠状病毒检测的抗原的主要用途为用于制备新型冠状病毒检测的试剂盒。

例如，试剂盒为胶体金试剂盒，融合蛋白通过胶体金标记后喷涂在金标垫上，胶体金的粒径为18nm～28nm，金标标记的融合蛋白在金标垫上的喷涂量为1.4μL/cm～2.0μL/cm。

又如，试剂盒为酶联免疫吸试剂盒，试剂盒包括抗原酶标板，抗原酶标板为融合蛋白被包被的酶标板，融合蛋白在酶标板上的包被浓度10μg/mL～20μg/mL，包被体积为80μL～120μL。优选的，融合蛋白在酶标板上的包被浓度15μg/mL，包被体积为100μL。

进一步可选的，试剂盒包括以下组成成分：

抗原酶标板、阳性抗体效价人血清、阳性抗体效价酶标试剂、阳性抗体效价样品稀释液、显色剂A液、显色剂B液、浓缩洗涤液、终止液、封板膜以及阴性对照品。

更进一步地，试剂盒组成成分的规格数量如下：

其中，可选的，阳性抗体效价酶标试剂为辣根过氧化物酶标记的抗人IgG抗体；阳性抗体效价血清为标定的含抗新型冠状病毒人血清；阳性抗体效价样品稀释液为含蛋白的缓冲液；浓缩洗涤液为含10％的表面活性剂的水溶液；显色剂A含不低于0.3g/L的过氧化物；显色剂B含不低于0.2g/L的TMB；终止液含硫酸(浓度不高于2.0mol/L)。

优选的，抗原酶标板的制备方法为将融合蛋白的水溶液包被在酶标板上，室温放置1.5h～2.5h后用PBST缓冲液洗板；以10％小牛血清于4℃封闭10h～15h后用PBST缓冲液洗板，制得抗原酶标板。

实施例1

1.材料

质粒pET-DsbC、表达菌种BL21(DE3)由本申请人保存；SARS-CoV-2 N蛋白表达序列核酸载体pUC18-SARS-CoV-2 N由北京万域美澜科技公司沈春奇老师惠赠；质粒提取试剂盒、DNA凝胶回收试剂盒购于天根生物科技公司；内切酶、T4 DNA连接酶、购自NEB公司；kapa保真DNA聚合酶和dNTP够自北京阅微基因公司；亲和树脂够自友谊中联生物科技公司；羊抗人IgG，TMB显色液够自索莱宝生物公司；对照样品新型冠状病毒IgG抗体检测试剂盒(酶联免疫法)为北京华大吉比爱生物技术公司，酶标板条上包被有SARS-CoV-2全病毒裂解液；30例临床确诊COVID-19患者血清，50例健康人血清由生物公司收集，ELISA实验委托公司完成；ELISA实验严格按照生物安全有关规定操作，遵循实验室操作的常规规定。

2.方法

2.1 SARS-CoV-2 N蛋白核苷酸扩增引物的制备

根据GenBank:MN908947.3报道的SARS-CoV-2 N蛋白核酸序列，参照载体pET-DsbC多克隆位点，设计合成了针对N蛋白核酸的特异引物，并在下游引物的5端引入大肠杆菌偏性的终止密码子TAA。上下游引物设计序列如下：

上游引物核苷酸序列P1:5-ACGCGTCGACTCTGATAATGGACC-3；

下游引物核苷酸序列

P2:5-CTAGCTAGCTTAGGCCTGAGTTGAGTCAGC-3。

上下游引物末端分别引入SalⅠ和NheⅠ酶切位点(斜线表示)。

以载体pUC18-SARS-CoV-2 N核酸为模板，在热激TaqDNA聚合酶作用下，通过引物P1和P2，常规PCR方法扩增SARS-CoV-2 N核酸，条件如下：94℃预变性5min，98℃变性20s、68℃退火20s、72℃延伸80s进行30个循环，72℃延伸5min。扩增的产物以1％琼脂糖电泳验证产物分子量，结果如图1所示，其中，序号1为本发明扩增产物SARS-CoV-2 N蛋白核酸序列；M为DL2000。在目的分子量大约为1260bp处存在清晰单一的条带，SARS-CoV-2 N蛋白全长420个氨基酸，对应分子量为1260bp，实验结果符合理论值。

2.2 pET-DsbC-N蛋白融合表达质粒的制备

对PCR扩增产物进行胶回收，回收的产物和表达载体pET-DsbC均以SalⅠ和NheⅠ进行双酶切，通过1％的琼脂糖电泳切胶回收酶切后的产物，在T4DNA连接酶的作用下，把回收片断克隆到表达质粒pET-DsbC中，连接产物转化至大肠杆菌感受态细胞BL21(DE3)，筛选阳性克隆进行测序。

2.3 DsbC-N融合蛋白的原核***表达

取经测序正确的pET-DsbC-N融合蛋白工程菌接种于含卡那霉素浓度为50ng/mL的LB培养基中，置于摇床内在37℃条件下震荡培养激活，次日按1:50的比例转接到同样体系的LB培养基中，在37℃条件下进行震荡培养至菌液OD600达0.4h，加入IPTG使得终浓度为0.3mmoL，37℃条件下继续震荡培养诱导5h。诱导后菌液在4℃条件下、5000rpm离心收集菌体，沉淀菌体加入1×PBS缓冲液混匀后，冰育转态下进行超声破碎，4℃条件下、12000rpm离心30min，收集上清和沉淀。

以12％的SDS-PAGE鉴定融合蛋白DsbC-N在原核***内表达形式，结果如图2所示，其中，M为低分子量蛋白标准；1为无诱导对照；2为表达的全菌体蛋白；3为表达菌体超声破碎后的上清；4为表达菌体超声破碎后的沉淀。

从图2中可以看出，DsbC-N融合蛋白在原核***内获得较高表达，融合蛋白占菌体总蛋白的30％以上，经过超声破碎后发现，DsbC-N融合蛋白主要以包涵体的形式存在超声沉淀中，其中约30％的DsbC-N融合蛋白以上清的形式存在，蛋白的上清的表达往往代表蛋白的天然状态，故在后续步骤中收集超声破碎后的上清准备亲和纯化。

2.4 DsbC-N融合蛋白的亲和纯化

DsbC-N融合蛋白的N端带有6×HIS标签，利用亲和层析对表达后超声上清蛋白进行目的蛋白纯化，在4℃条件下取离心上清按2mL/min的速度过镍离子亲和柱，以1×PBS平衡4个柱积后，以100mmoL咪唑洗脱杂蛋白3个柱积，再用200mmoL咪唑洗脱目的融合蛋白，收集目的蛋白。

以15％的SDS-PAGE对纯化后融合蛋白进行纯度测定，结果如图3所示，其中，M为低分子量蛋白标准；1、2、3为纯化后的DsbC-N融合蛋白。

从图3中可以看出，融合蛋白经亲和纯化后，纯度可达92％以上，高纯度的融合蛋白是后续开展血清学实验获得高特异性的保证。

进一步检测，获得的融合蛋白相对分子量为68×10³。

2.5 DsbC-N融合蛋白血清抗体ELISA实验

酶联免疫吸附试验(ELISA)通常用于进展期和恢复期患者血清病毒的抗体检测，是一种传统的实验室检测技术，对操作要求相对较低，使用ELISA方法可以明确患者是否近期或既往感染过SARS-CoV-2，有助于核酸检测阴性但临床上疑似患者的确诊。

步骤2.4纯化后的DsbC-N融合蛋白经水充分透析后，采用BCA方法进行浓度测定，以包被液将重组蛋白稀释为15μg/mL，酶标板每孔包被100μL，室温放置2h，PBST缓冲液洗板4次；10％小牛血清在4℃冰箱内封闭过夜，次日以PBST洗板5次，待测样本血清和健康人血清均以1:50倍稀释，每孔加入100μL，置于37℃温箱内孵育1h，洗板5次，拍干，以1:1000倍稀释的HRP标记的羊抗人IgG于37℃条件下孵育1h，PBST洗板5次，TMB显色，酶标仪检测A450nm波长处的A值，检测结果如图4所示。

对待测的30份经核酸检测阳性血清和50份健康者血清以对照样品新型冠状病毒IgG抗体检测试剂盒进行对比检测，实验方法严格按照试剂盒说明书进行。结果为出现1例假阴性，检出率为96％；出现假阳性2例，特异性为96％。

从图4中可以看出，SARS-CoV-2感染者阳性血清相对健康人血清而言，ELISA实验中A450值具有显著性差异。其中30例明确新冠肺炎血清阳性检出例数为29例，检出率为96％，与对照样品-现有IgG检测试剂盒符合率为100％；50例健康人对照血清检出1例，检出率为2％，特异性为98％。本实施例设定cut-off值为健康人血清检测平均A值+3倍标准差。

其中，在30例阳性样本中漏检一例，推测该样本来源患者可能处于“窗口期”，虽然核酸检测为阳性，但患者血液内还无法检测血液中的病毒抗体，或者是血清在长时间保存过程中，出现抗体聚集或降解，没有被抗原捕捉。

本发明获得的可溶性SARS-CoV-2 N蛋白的融合蛋白用于血清学诊断，敏感性强，特异性高。

实施例2

1.材料

质粒pET-DsbA、表达菌种BL21(DE3)由本申请人保存；SARS-CoV-2 N蛋白表达序列核酸载体pUC18-SARS-CoV-2 N由北京万域美澜科技公司沈春奇老师惠赠；质粒提取试剂盒、DNA凝胶回收试剂盒购于天根生物科技公司；内切酶、T4 DNA连接酶、购自NEB公司；kapa保真DNA聚合酶和dNTP够自北京阅微基因公司；亲和树脂够自友谊中联生物科技公司；羊抗人IgG，TMB显色液够自索莱宝生物公司；对照样品新型冠状病毒IgG抗体检测试剂盒(酶联免疫法)为北京华大吉比爱生物技术公司，酶标板条上包被有SARS-CoV-2全病毒裂解液；30例临床确诊COVID-19患者血清，50例健康人血清由生物公司收集，ELISA实验委托公司完成；ELISA实验严格按照生物安全有关规定操作，遵循实验室操作的常规规定。

2.方法

2.1 SARS-CoV-2 N蛋白核苷酸扩增引物的制备

根据GenBank:MN908947.3报道的SARS-CoV-2 N蛋白核酸序列，参照载体pET-DsbA多克隆位点，设计合成了针对N蛋白核酸的特异引物，并在下游引物的5端引入大肠杆菌偏性的终止密码子TAA。上下游引物设计序列如下：

上游引物核苷酸序列P1:5-ACGCGTCGACTCTGATAATGGACC-3；

下游引物核苷酸序列

P2:5-CTAGCTAGCTTAGGCCTGAGTTGAGTCAGC-3。

上下游引物末端分别引入SalⅠ和NheⅠ酶切位点(斜线表示)。

以载体pUC18-SARS-CoV-2 N核酸为模板，在热激TaqDNA聚合酶作用下，通过引物P1和P2，常规PCR方法扩增SARS-CoV-2 N核酸，条件如下：94℃预变性5min，98℃变性20s、68℃退火20s、72℃延伸80s进行30个循环，72℃延伸5min。扩增的产物以1％琼脂糖电泳验证产物分子量，经检测扩正的产物分子量大约为1260bp。

2.2 pET-DsbA-N蛋白融合表达质粒的制备

对PCR扩增产物进行胶回收，回收的产物和表达载体pET-DsbA均以SalⅠ和NheⅠ进行双酶切，通过1％的琼脂糖电泳切胶回收酶切后的产物，在T4DNA连接酶的作用下，把回收片断克隆到表达质粒pET-DsbA中，连接产物转化至大肠杆菌感受态细胞BL21(DE3)，筛选阳性克隆进行测序。

2.3 DsbA-N融合蛋白的原核***表达

取经测序正确的pET-DsbA-N融合蛋白工程菌接种于含卡那霉素浓度为50ng/mL的LB培养基中，置于摇床内在37℃条件下震荡培养激活，次日按1:50的比例转接到同样体系的LB培养基中，在37℃条件下进行震荡培养至菌液OD600达0.4h，加入IPTG使得终浓度为0.3mmoL，37℃条件下继续震荡培养诱导5h。诱导后菌液在4℃条件下、5000rpm离心收集菌体，沉淀菌体加入1×PBS缓冲液混匀后，冰育转态下进行超声破碎，4℃条件下、12000rpm离心30min，收集上清和沉淀。

以12％的SDS-PAGE鉴定融合蛋白DsbA-N在原核***内表达形式，检测结果显示，DsbA-N融合蛋白在原核***内获得较高表达，融合蛋白占菌体总蛋白的30％以上，经过超声破碎后发现，DsbA-N融合蛋白主要以包涵体的形式存在超声沉淀中，其中约30％的DsbA-N融合蛋白以上清的形式存在，蛋白的上清的表达往往代表蛋白的天然状态，故在后续步骤中收集超声破碎后的上清准备亲和纯化。

2.4 DsbA-N融合蛋白的亲和纯化

DsbA-N融合蛋白的N端带有6×HIS标签，利用亲和层析对表达后超声上清蛋白进行目的蛋白纯化，在4℃条件下取离心上清按2mL/min的速度过镍离子亲和柱，以1×PBS平衡4个柱积后，以100mmoL咪唑洗脱杂蛋白3个柱积，再用200mmoL咪唑洗脱目的融合蛋白，收集目的蛋白。

以15％的SDS-PAGE对纯化后融合蛋白进行纯度测定，融合蛋白经亲和纯化后纯度达92％以上，高纯度的融合蛋白是后续开展血清学实验获得高特异性的保证。

2.5 DsbA-N融合蛋白血清抗体ELISA实验

纯化的DsbA-N融合蛋白经水充分透析后，采用BCA方法进行浓度测定，以包被液将重组蛋白稀释为15μg/mL，酶标板每孔包被100μL，室温放置2h，PBST缓冲液洗板4次；10％小牛血清在4℃冰箱内封闭过夜，次日以PBST洗板5次，待测样本血清和健康人血清均以1:50倍稀释，每孔加入100μL，置于37℃温箱内孵育1h，洗板5次，拍干，以1:1000倍稀释的HRP标记的羊抗人IgG于37℃条件下孵育1h，PBST洗板5次，TMB显色，酶标仪检测A450nm波长处的A值。

对待测的30份经核酸检测阳性血清和50份健康者血清以对照样品新型冠状病毒IgG抗体检测试剂盒进行对比检测，实验方法严格按照试剂盒说明书进行。结果为出现1例假阴性，检出率为96％；出现假阳性2例，特异性为96％。

在实施例2中，SARS-CoV-2感染者阳性血清相对健康人血清而言，ELISA实验中A450值具有显著性差异。其中30例明确新冠肺炎血清阳性检出例数为29例，检出率为96％；50例健康人对照血清检出1例，检出率为2％，特异性为98％。本实施例设定cut-off值为健康人血清检测平均A值+3倍标准差。

以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

序列表

<110> 昆明市妇幼保健院；中国人民解放军总医院第八医学中心

<120> 用于新型冠状病毒检测的抗原及其制备方法

<130> 2020

<160> 7

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 567

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

gcgcagtatg aagatggtaa acagtacact accctggaaa aaccggtagc tggcgcgccg 60

caagtgctgg agtttttctc tttcttctgc ccgcactgct atcagtttga agaagttctg 120

catatttctg ataatgtgaa gaaaaaactg ccggaaggcg tgaagatgac taaataccac 180

gtcaacttca tgggtggtga cctgggcaaa gatctgactc aggcatgggc tgtggcgatg 240

gcgctgggcg tggaagacaa agtgactgtt ccgctgtttg aaggcgtaca gaaaacccag 300

accattcgtt ctgcttctga tatccgcgat gtatttatca acgcaggtat taaaggtgaa 360

gagtacgacg cggcgtggaa cagcttcgtg gtgaaatctc tggtcgctca gcaggaaaaa 420

gctgcagctg acgtgcaatt gcgtggcgtt ccggcgatgt ttgttaacgg taaatatcag 480

ctgaatccgc agggtatgga taccagcaat atggatgttt ttgttcagca gtatgctgat 540

acagtgaaat atctgtccga gaaaaaa 567

<210> 2

<211> 648

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

gatgacgcgg caattcaaca aacgttagcc aaaatgggca tcaaaagcag cgatattcag 60

cccgcgcctg tagctggcat gaagacagtt ctgactaaca gcggcgtgtt gtacatcacc 120

gatgatggta aacatatcat tcaggggcca atgtatgacg ttagtggcac ggctccggtc 180

aatgtcacca ataagatgct gttaaagcag ttgaatgcgc ttgaaaaaga gatgatcgtt 240

tataaagcgc cgcaggaaaa acacgtcatc accgtgttta ctgatattac ctgtggttac 300

tgccacaaac tgcatgagca aatggcagac tacaacgcgc tggggatcac cgtgcgttat 360

cttgctttcc cgcgccaggg gctggacagc gatgcagaga aagaaatgaa agctatctgg 420

tgtgcgaaag ataaaaacaa agcgtttgat gatgtgatgg caggtaaaag cgtcgcacca 480

gccagttgcg acgtggatat tgccgaccat tacgcacttg gcgtccagct tggcgttagc 540

ggtactccgg cagttgtgct gagcaatggc acacttgttc cgggttacca gccgccgaaa 600

gagatgaaag aattcctcga cgaacaccaa aaaatgacca gcggtaaa 648

<210> 3

<211> 1269

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

gtcgactctg ataatggacc ccaaaatcag cgaaatgcac cccgcattac gtttggtgga 60

ccctcagatt caactggcag taaccagaat ggagaacgca gtggggcgcg atcaaaacaa 120

cgtcggcccc aaggtttacc caataatact gcgtcttggt tcaccgctct cactcaacat 180

ggcaaggaag accttaaatt ccctcgagga caaggcgttc caattaacac caatagcagt 240

ccagatgacc aaattggcta ctaccgaaga gctaccagac gaattcgtgg tggtgacggt 300

aaaatgaaag atctcagtcc aagatggtat ttctactacc taggaactgg gccagaagct 360

ggacttccct atggtgctaa caaagacggc atcatatggg ttgcaactga gggagccttg 420

aatacaccaa aagatcacat tggcacccgc aatcctgcta acaatgctgc aatcgtgcta 480

caacttcctc aaggaacaac attgccaaaa ggcttctacg cagaagggag cagaggcggc 540

agtcaagcct cttctcgttc ctcatcacgt agtcgcaaca gttcaagaaa ttcaactcca 600

ggcagcagta ggggaacttc tcctgctaga atggctggca atggcggtga tgctgctctt 660

gctttgctgc tgcttgacag attgaaccag cttgagagca aaatgtctgg taaaggccaa 720

caacaacaag gccaaactgt cactaagaaa tctgctgctg aggcttctaa gaagcctcgg 780

caaaaacgta ctgccactaa agcatacaat gtaacacaag ctttcggcag acgtggtcca 840

gaacaaaccc aaggaaattt tggggaccag gaactaatca gacaaggaac tgattacaaa 900

cattggccgc aaattgcaca atttgccccc agcgcttcag cgttcttcgg aatgtcgcgc 960

attggcatgg aagtcacacc ttcgggaacg tggttgacct acacaggtgc catcaaattg 1020

gatgacaaag atccaaattt caaagatcaa gtcattttgc tgaataagca tattgacgca 1080

tacaaaacat tcccaccaac agagcctaaa aaggacaaaa agaagaaggc tgatgaaact 1140

caagccttac cgcagagaca gaagaaacag caaactgtga ctcttcttcc tgctgcagat 1200

ttggatgatt tctccaaaca attgcaacaa tccatgagca gtgctgactc aactcaggcc 1260

taagctagc 1269

<210> 4

<211> 418

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 4

Ser Asp Asn Gly Pro Gln Asn Gln Arg Asn Ala Pro Arg Ile Thr Phe

1 5 10 15

Gly Gly Pro Ser Asp Ser Thr Gly Ser Asn Gln Asn Gly Glu Arg Ser

20 25 30

Gly Ala Arg Ser Lys Gln Arg Arg Pro Gln Gly Leu Pro Asn Asn Thr

35 40 45

Ala Ser Trp Phe Thr Ala Leu Thr Gln His Gly Lys Glu Asp Leu Lys

50 55 60

Phe Pro Arg Gly Gln Gly Val Pro Ile Asn Thr Asn Ser Ser Pro Asp

65 70 75 80

Asp Gln Ile Gly Tyr Tyr Arg Arg Ala Thr Arg Arg Ile Arg Gly Gly

85 90 95

Asp Gly Lys Met Lys Asp Leu Ser Pro Arg Trp Tyr Phe Tyr Tyr Leu

100 105 110

Gly Thr Gly Pro Glu Ala Gly Leu Pro Tyr Gly Ala Asn Lys Asp Gly

115 120 125

Ile Ile Trp Val Ala Thr Glu Gly Ala Leu Asn Thr Pro Lys Asp His

130 135 140

Ile Gly Thr Arg Asn Pro Ala Asn Asn Ala Ala Ile Val Leu Gln Leu

145 150 155 160

Pro Gln Gly Thr Thr Leu Pro Lys Gly Phe Tyr Ala Glu Gly Ser Arg

165 170 175

Gly Gly Ser Gln Ala Ser Ser Arg Ser Ser Ser Arg Ser Arg Asn Ser

180 185 190

Ser Arg Asn Ser Thr Pro Gly Ser Ser Arg Gly Thr Ser Pro Ala Arg

195 200 205

Met Ala Gly Asn Gly Gly Asp Ala Ala Leu Ala Leu Leu Leu Leu Asp

210 215 220

Arg Leu Asn Gln Leu Glu Ser Lys Met Ser Gly Lys Gly Gln Gln Gln

225 230 235 240

Gln Gly Gln Thr Val Thr Lys Lys Ser Ala Ala Glu Ala Ser Lys Lys

245 250 255

Pro Arg Gln Lys Arg Thr Ala Thr Lys Ala Tyr Asn Val Thr Gln Ala

260 265 270

Phe Gly Arg Arg Gly Pro Glu Gln Thr Gln Gly Asn Phe Gly Asp Gln

275 280 285

Glu Leu Ile Arg Gln Gly Thr Asp Tyr Lys His Trp Pro Gln Ile Ala

290 295 300

Gln Phe Ala Pro Ser Ala Ser Ala Phe Phe Gly Met Ser Arg Ile Gly

305 310 315 320

Met Glu Val Thr Pro Ser Gly Thr Trp Leu Thr Tyr Thr Gly Ala Ile

325 330 335

Lys Leu Asp Asp Lys Asp Pro Asn Phe Lys Asp Gln Val Ile Leu Leu

340 345 350

Asn Lys His Ile Asp Ala Tyr Lys Thr Phe Pro Pro Thr Glu Pro Lys

355 360 365

Lys Asp Lys Lys Lys Lys Ala Asp Glu Thr Gln Ala Leu Pro Gln Arg

370 375 380

Gln Lys Lys Gln Gln Thr Val Thr Leu Leu Pro Ala Ala Asp Leu Asp

385 390 395 400

Asp Phe Ser Lys Gln Leu Gln Gln Ser Met Ser Ser Ala Asp Ser Thr

405 410 415

Gln Ala

<210> 5

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

acgcgtcgac tctgataatg gacc 24

<210> 6

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

ctagctagct taggcctgag ttgagtcagc 30

<210> 7

<211> 566

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 7

gcgcagtatg aagatggtaa acagtacact accctggaaa aaccggtagc tggcgcgccg 60

caagtgctgg agtttttctc tttcttcagc ccgcacagct atcagtttga agaagttctg 120

catatttctg ataatgtgaa gaaaaaactg ccggaaggcg tgaagatgac taaataccac 180

gtcaacttca tgggtggtga cctgggcaaa gatctgactc aggcatgggc tgtggcgatg 240

gcgctgggcg tggaagacaa agtgactgtt ccgctgtttg aaggcgtaca gaaaacccag 300

accattcgtt ctgcttctga tatccgcgat gtatttatca acgcaggtat taaaggtgaa 360

gagtacgacg cggcgtggaa cagcttcggg tgaaatctct ggtcgctcag caggaaaaag 420

ctgcagctga cgtgcaattg cgtggcgttc cggcgatgtt tgttaacggt aaatatcagc 480

tgaatccgca gggtatggat accagcaata tggatgtttt tgttcagcag tatgctgata 540

cagtgaaata tctgtccgag aaaaaa 566

Claims (10)

1.一种用于新型冠状病毒检测的抗原，其特征在于，所述用于新型冠状病毒检测的抗原包括基于核衣壳蛋白的融合蛋白。

2.根据权利要求1所述的用于新型冠状病毒检测的抗原，其特征在于，所述基于核衣壳蛋白的融合蛋白为可溶性蛋白。

3.根据权利要求2所述的用于新型冠状病毒检测的抗原，其特征在于，所述基于核衣壳蛋白的融合蛋白为核衣壳蛋白的氨基酸序列或部分氨基酸序列与二硫化物氧化还原酶A的氨基酸序列或部分氨基酸序列融合表达生成的融合蛋白；或，核衣壳蛋白的氨基酸序列或部分氨基酸序列与二硫化物氧化还原酶C的氨基酸序列或部分氨基酸序列融合表达生成的融合蛋白。

4.根据权利要求3所述的用于新型冠状病毒检测的抗原，其特征在于，所述二硫化物氧化还原酶A的核苷酸序列为如SEQ ID No.1所示的核苷酸序列或如SEQ ID No.1所示的核苷酸序列的突变序列；

所述二硫化物氧化还原酶C的核苷酸序列为如SEQ ID No.2所示的核苷酸序列或如SEQID No.2所示的核苷酸序列的突变序列；

所述核衣壳蛋白的核苷酸序列为如SEQ ID No.3所示的核苷酸序列或如SEQ ID No.3所示的核苷酸序列的突变序列。

5.根据权利要求4所述的用于新型冠状病毒检测的抗原，其特征在于，所述核衣壳蛋白的核苷酸序列与所述二硫化物氧化还原酶A的核苷酸序列的C端直接连接或通过接头连接；

所述核衣壳蛋白的氨基酸序列与所述二硫化物氧化还原酶C的氨基酸序列的C端直接连接或通过接头连接。

6.根据权利要求1至5任意一项所述的用于新型冠状病毒检测的抗原，其特征在于，所述基于核衣壳蛋白的融合蛋白通过原核表达***表达生成。

7.一种用于新型冠状病毒检测的抗原的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括以下步骤：

根据如SEQ ID No.3所示的核苷酸序列合成核衣壳蛋白基因片段；

通过内切酶SalⅠ以及内切酶NheⅠ将所述核衣壳蛋白基因片段从克隆载体上切下；

将所述核衣壳蛋白基因片段克隆到载体PET-DsbA或PET-DsbC上，转化到原核表达***中诱导表达生成基于核衣壳蛋白的融合蛋白。

8.根据权利要求7所述的用于新型冠状病毒检测的抗原的制备方法，其特征在于，合成所述核衣壳蛋白基因片段的上游引物的核苷酸序列如SEQ ID No.5所示；合成所述核衣壳蛋白基因片段的下游引物的核苷酸序列如SEQ ID No.6所示。

9.根据权利要求7所述的用于新型冠状病毒检测的抗原的制备方法，其特征在于，所述制备方法还包括以下步骤：

对所述基于核衣壳蛋白的融合蛋白进行亲和纯化和/或凝胶纯化。

10.根据权利要求7或8所述的用于新型冠状病毒检测的抗原的制备方法，其特征在于，所述原核表达***为大肠杆菌。

Images