CN109765379B - 结核分枝杆菌蛋白的应用 - Google Patents

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CN109765379B CN201811557374.8A CN201811557374A CN109765379B CN 109765379 B CN109765379 B CN 109765379B CN 201811557374 A CN201811557374 A CN 201811557374A CN 109765379 B CN109765379 B CN 109765379B
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Abstract

本发明涉及生物技术领域，公开了结核分枝杆菌蛋白的应用。本发明以结核分枝杆菌蛋白中的核糖激酶、脂肪酰‑AMP连接酶、胱硫醚β‑裂解酶和假定蛋白为诊断抗原，通过间接ELISA检测待测血清中相应的抗体，以判断待检者是否感染结核分枝杆菌，并进一步判断是否患结核病，具有很高的可靠性、特异性和灵敏性，可用于结核病的血清学诊断领域。

Description

结核分枝杆菌蛋白的应用
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体涉及结核分枝杆菌蛋白的应用。
背景技术
结核病(Tuberculosis,TB)是由传染性病原体结核分枝杆菌 (Mycobacteriumtuberculosis,MTB)感染引起的慢性传染性***共患病，是威胁人类健康的最主要传染性疾病之一。MTB主要分为人型、牛型、非洲型及鼠型，人类结核病90％以上由感染人型MTB引起，少数为牛型和非洲型所致。MTB可侵犯全身各器官***，患病部位以肺脏最为常见，也可累及肝、骨和脑等其它器官。MTB感染分为潜伏性与活动性两种状态。活动性肺结核是指痰涂片阳性者：即体内有MTB排出，MTB繁殖活跃，毒力强。TB的传染源主要是活动性的肺结核患者，其主要通过呼吸道传播，也可用过破损的皮肤、粘膜和消化道等途径传染。MTB携带者感染HIV后，由潜伏期发展为活动性期的可能性远高于未感染HIV者，病程发展更快。世界卫生组织发布的《2017全球结核病报告》公布2016年全球约有1040万新发TB病例，其中167万人死于TB。TB是全球第九大死因，在传染性疾病中排名第一，超过艾滋病，因此，TB已成为全球公共卫生安全的重大威胁。
目前，结核病的诊断方法主要有以下几种：(1)细菌学诊断：痰涂片镜检法简单、快速可靠，但其敏感性差；痰样本培养是结核病诊断的金标准，但传统固体培养时间需60～90天，液体培养及药敏试验约需20天，培养时间长，且约40％的成人肺结核患者的痰涂片标本检测为阴性。(2)血清学诊断： TB血清学诊断方法主要是利用免疫技术进行检测血清中特异性抗MTB的抗体。(3)结核菌素皮肤试验：感染过MTB的机体产生相应的致敏淋巴细胞，再次注射PPD后，机体会在皮试后的2～3天产生迟发型超敏反应，局部出现红肿硬节。该试验一直被应用于TB的临床诊断，但其特异性差，常与环境分枝杆菌和卡介苗(BCG)产生交叉反应。(4)MTB核酸扩增检测：该方法敏感性好，即使标本中拷贝数低的细菌也能被检出，但临床应用会有偏差，如标本处理不当，靶序列或扩增产物交叉污染等易造成假阴性。(5)IFN-γ释放试验：该方法是体外免疫检测的新方法，其商业化诊断试剂盒以EAST6 和CFP10蛋白作为刺激抗原，一般采 用酶联免疫吸附测定或者酶联免疫斑点方法检测机体全血或者外周血单核细胞中产生IFN-γ的T细胞数量及细胞因子变化量。
所有这些诊断方法中，血清学检测是体外诊断TB的有效方法，其检测方法简单、快速、高效和低廉，成为近年来TB诊断的研究热点。该方法通过基因工程获取重组抗原，再用间接ELISA检测重组抗原与病人血清的反应性，但这种方法难以满足高灵敏性和特异性的要求。因此，寻找特异性强和敏感性高的MTB抗原是提高TB血清学诊断阳性率的关键。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于提供结核分枝杆菌的核糖激酶、脂肪酰 -AMP连接酶、胱硫醚β-裂解酶和假定蛋白的新应用，使得所述结核分枝杆菌蛋白能够作为检测结核病的诊断抗原，并具备较高的灵敏度和特异性。
为了实现上述目的，本发明提供如下技术方案：
结核分枝杆菌蛋白中的核糖激酶、脂肪酰-AMP连接酶、胱硫醚β-裂解酶和假定蛋白中的一种或两种以上蛋白作为检测结核病的诊断抗原的应用。
结核分枝杆菌蛋白中的核糖激酶、脂肪酰-AMP连接酶、胱硫醚β-裂解酶和假定蛋白中的一种或两种以上蛋白及其编码基因在制备检测结核病的诊断抗原中的应用。
结核分枝杆菌蛋白中的核糖激酶、脂肪酰-AMP连接酶、胱硫醚β-裂解酶和假定蛋白中的一种或两种以上蛋白及其编码基因在制备检测结核病的试剂盒中的应用。
其中，上述核糖激酶为包含SEQ ID NO:1所示序列的蛋白，该蛋白为结核分枝杆菌核糖激酶全长蛋白(SEQ ID NO:5所示)的146～196氨基酸序列蛋白；所述脂肪酰-AMP连接酶为包含SEQ ID NO:2所示序列的蛋白，该蛋白为结核分枝杆菌脂肪酰-AMP连接酶全长蛋白(SEQ ID NO:6所示)的1～68 氨基酸序列蛋白；所述胱硫醚β-裂解酶为包含SEQ ID NO:3所示序列的蛋白，该蛋白为结核分枝杆菌胱硫醚β-裂解酶全长蛋白(SEQ ID NO:7所示)的43～72氨基酸序列蛋白；所述假定蛋白为包含SEQ ID NO:4所示序列的蛋白，该蛋白为结核分枝杆菌假定蛋白全长蛋白(SEQ ID NO:8所示)的1～73氨基酸序列蛋白。
本发明所述包含SEQ ID NO:1/2/3/4所示序列的蛋白不仅包括SEQ ID NO: 1/2/3/4所示序列蛋白本身，也包括SEQ ID NO:1/2/3/4所示序列蛋白与其它适宜蛋白形成的融合蛋白，例如SEQ ID NO:1-4所示序列蛋白彼此之间形成的融合蛋白，或与诸如组氨酸一类的筛选标签形成融合蛋白；同时也包括在SEQ ID NO:1-4所示序列蛋白各自对应的核糖激酶、脂肪酰-AMP连接酶、胱硫醚β-裂解酶和假定蛋白全长蛋白基础上缺失、添加或取代一个或多个氨基酸的蛋白，前提是所述缺失、添加或取代不涉及SEQ ID NO:1-4所示序列区域，例如在全长蛋白基础上添加诸如组氨酸一类的筛选标签。
本发明以结核病阳性血清为靶分子对T7噬菌体展示的结核分枝杆菌基因组DNA文库进行生物淘选，共获得19个阳性噬菌斑，对这些噬菌斑的PCR 扩增产物进行DNA测序，将所得DNA序列进行BLAST比对，结果表明19 个噬菌体的外源DNA序列中，共包括4种不同的序列(代表性噬菌体P1～P4)，这些序列分别与编码核糖激酶(对应噬菌体P1)、脂肪酰-AMP连接酶(对应噬菌体P2)、胱硫醚β-裂解酶(对应噬菌体P3)和假定蛋白(对应噬菌体 P4)基因的部分序列具有100％的同源性。
为检测上述代表性噬菌体P1～P4能否与TB阳性血清特异结合，本发明分别将TB阳性血清、阴性血清和BSA包被ELISA板，采用间接ELISA法检测上述代表性噬菌体P1～P4与TB阳性血清的反应性。结果显示，TB阳性血清组的代表性噬菌体P1～P4的A450值明显高于TB阴性血清组和BSA对照组的A450值，表明代表性噬菌体P1～P4能与TB阳性血清特异结合，也证明了这些噬菌体上展示的核糖激酶、脂肪酰-AMP连接酶、胱硫醚β-裂解酶和假定蛋白能够与TB阳性血清特异结合；
为进一步证实上述代表性噬菌体P1～P4能与TB阳性血清特异结合，利用斑点免疫印迹法上述代表性噬菌体P1～P4与TB阳性血清的结合情况。结果显示，噬菌体P1～P4组和阳性对照组均出现了明显的斑点，尤以噬菌体P1 的斑点更为明显，而野生噬菌体对照和阴性对照都没有出现斑点，表明菌体P1～P4均能与TB阳性血清特异结合，其中噬菌体P1更为明显，说明噬菌体 P1表面展示的核糖激酶为与TB阳性血清特异结合的优势诊断抗原。
为了验证SEQ ID NO:1-4所示序列蛋白各自对应的核糖激酶、脂肪酰 -AMP连接酶、胱硫醚β-裂解酶和假定蛋白全长蛋白在TB血清学诊断中的潜在应用价值，本发明以结核杆菌核糖激酶为对象，人工构建含有结核分枝杆菌核糖激酶基因(RK基因)的原核表达载体，表达并纯化了重组核糖激酶。结果显示，本发明成功扩增出大小为975bp的PCR产物，与RK基因的DNA 序列具有100％同源性，并成功构建了原核表达载体pET-28a(+)-RK，表达并纯化了含组氨酸标签的重组蛋白，SDS-PAGE分析显示纯化的重组蛋白显示为单一条带。经Western blot鉴定，表达的重组蛋白能与抗组氨酸标签的抗体和结核病阳性血清特异结合；
为了进一步验证核糖激酶全长蛋白在TB血清学诊断中的潜在应用价值，本发明用间接ELISA检测重组核糖激酶与不同临床血清的反应性，结果显示，重组核糖激酶与结核病阳性血清反应的OD值明显高于其与结核病阴性血清反应的OD值。ELISA反应的敏感性为90％，特异性为86％，ROC曲线下面积(AUC)为0.9741，这些结果说明核糖激酶全长蛋白在TB的血清学诊断中具有较好应用价值。
基于以上的试验结果，本发明提出了前述结核分枝杆菌的核糖激酶、脂肪酰-AMP连接酶、胱硫醚β-裂解酶和假定蛋白的一系列新应用。
根据本发明所提出的应用，本发明还提供了一种检测结核病的试剂盒，其包括包被有结核分枝杆菌蛋白中的核糖激酶、脂肪酰-AMP连接酶、胱硫醚β-裂解酶和假定蛋白中的一种或两种以上蛋白的载体；或者包括结核分枝杆菌蛋白中的核糖激酶、脂肪酰-AMP连接酶、胱硫醚β-裂解酶和假定蛋白中的一种或两种以上诊断抗原。
所述试剂盒为基于ELISA法的试剂盒，可进一步包含基于ELISA法的其他对应试剂，比如酶标抗原或抗体、显色底物、一抗、二抗等。
由以上技术方案可知，本发明以结核分枝杆菌蛋白中的核糖激酶、脂肪酰-AMP连接酶、胱硫醚β-裂解酶和假定蛋白为诊断抗原，通过间接ELISA 检测待测血清中相应的抗体，以判断待检者是否感染结核分枝杆菌，并进一步判断是否患结核病，具有很高的可靠性、特异性和灵敏性，可用于结核病的血清学诊断领域。
附图说明
图1所示为ELISA检测代表性噬菌体P1～P4与TB阳性血清的反应性结果；其中P1表示表面展示编码SEQ ID NO:1所示序列蛋白的代表性噬菌体 P1，P2表示表面展示编码SEQID NO:2所示序列蛋白的代表性噬菌体P2， P3表示表面展示编码SEQ ID NO:3所示序列蛋白的代表性噬菌体P3，P4表示表面展示编码SEQ ID NO:4所示序列蛋白的代表性噬菌体P4；*p<0.01；
图2所示为斑点免疫印迹试验检测代表性噬菌体P1～P4与TB阳性血清特异结合的结果；其中，A1-A4为代表性噬菌体P1～P4的结果；B1为TB阴性血清的结果；B2为TB阳性血清的结果；B3为对照野生型噬菌体的结果； B4为空白对照结果；
图3所示为重组核糖激酶的表达与纯化验证结果；其中，a为核糖激酶重组菌的PCR鉴定图，泳道1-7依次表示随机挑取的菌落克隆；b为表达的重组核糖激酶的SDS-PAGE分析，泳道1-2依次表示诱导的重组菌和未诱导的重组菌；c为纯化重组蛋白的SDS-PAGE分析，泳道1为纯化的重组蛋白；
图4所示为重组核糖激酶的Western blot鉴定；其中，1表示所用一抗为抗组氨酸的抗体，2表示所用一抗为结核病阳性血清，3表示所用一抗为结核病阴性血清；
图5所示为重组核糖激酶全长蛋白与临床血清的反应性与ROC曲线；其中，a为反应性结果；b为ROC曲线。
具体实施方式
本发明公开了结核分枝杆菌蛋白的应用，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明所述应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。
以下就本发明所提供的结核分枝杆菌蛋白的应用做进一步说明。
实施例1：代表性噬菌体P1～P4与TB阳性血清特异结合的ELISA检测试验
将100μLTB阳性血清(100μg/mL)包被微孔板(同时设立阴性血清对照和BSA对照)，4℃湿盒孵育过夜。弃去包被液后用封阻液(5％脱脂奶粉) 封阻2h，经PBST洗8次，分别向孔内加入150μL扩增的代表性噬菌体 (3×1011pfu，表面展示编码SEQ ID NO:1-4所示序列蛋白的T7噬菌体)，37℃孵育2h，用PBST洗8次，加经1:1000稀释的HRP标记的抗T7噬菌体抗体，37℃孵育2h后用PBST洗8次，分别加入A、B显色液，37℃避光15min，加入终止液后用酶标仪测定450nm处的吸光度值(A450)。
如图1所示：TB阳性血清组的代表性噬菌体P1～P4的A450值明显高于 TB阴性血清组和BSA对照组的A450值，说明代表性噬菌体P1～P4表面展示的SEQ ID NO:1-4所示序列蛋白能与TB阳性血清特异结合。
实施例2：代表性噬菌体P1～P4与TB阳性血清特异结合的斑点免疫印迹试验
用TBST(0.5％Tween 20)清洗经甲醇浸泡至透明的PVDF膜，往膜上滴加1μL扩增后的代表性噬菌体(1011pfu，表面展示的编码SEQ ID NO:1-4 所示序列蛋白的T7噬菌体)，于室温干燥后放入4℃冰箱封闭过夜，经TBST 洗膜3次后，加入初步纯化的TB阳性血清(1:50)，37℃孵育2h，TBST洗膜6次，加入HRP标记的羊抗人IgG抗体(1:4 000)于37℃浸膜1h，用TBST 洗膜6次后经ECL法发光、显影定影。同时设立阴性对照、空白对照、野生型噬菌体对照和阳性对照。
为进一步证实代表性噬菌体P1～P4能与TB阳性血清特异结合，利用斑点免疫印迹法检测代表性噬菌体P1～P4与TB阳性血清的结合情况。如图2 所示：代表性噬菌体P1～P4组和阳性对照组均出现了明显的斑点，尤以P1的斑点更为明显，而野生噬菌体对照和阴性对照都没有出现斑点，说明代表性噬菌体P1～P4表面展示的SEQ ID NO:1-4所示序列蛋白均能与TB阳性血清特异结合，其中P1更为明显，说明展示在P1表面的核糖激酶能与TB阳性血清特异结合，核糖激酶为与TB阳性血清特异结合的优势抗原。
实施例3：表达并纯化重组RK
构建含有RK基因的原核表达载体，表达并纯化重组核糖激酶。结果显示，成功扩增出大小为975bp的PCR产物，与RK基因的DNA序列具有100％同源性。成功构建了原核表达载体pET-28a(+)-RK(图3a)，表达并纯化了含组氨酸标签的重组蛋白(36kDa)(图3b)；如图3c所示，SDS-PAGE分析显示纯化的重组蛋白显示为单一条带。这些结果说明成功表达并纯化了重组核糖激酶全长蛋白。经Western blot鉴定，重组RK能与抗组氨酸标签的抗体和结核病阳性血清特异结合(图4)。
实施例4：重组RK在TB的血清学诊断中有好的敏感性与特异性
为了进一步评价核糖激酶全长蛋白在TB血清学诊断中的潜在应用价值，用间接ELISA检测实施例3重组RK与不同临床血清的反应性。
以实施例3中纯化、鉴定的重组核糖激酶全长蛋白作为抗原包被ELISA 微孔板，分别以临床收集的结核阳性血清和阴性血清作为一抗，间接ELISA 法检测临床血清中特异性IgG。
如图5所示，重组核糖激酶与结核病阳性血清反应的OD值明显高于其与结核病阴性血清反应的OD值。ELISA反应的敏感性为90％，特异性为86％， ROC曲线下面积(AUC)为0.9741，这些结果说明ELISA试验的结果可靠，核糖激酶全长蛋白在TB的血清学诊断中具有较好应用价值。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
序列表
<110> 南华大学
<120> 结核分枝杆菌蛋白的应用
<130> MP1828149
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<170> SIPOSequenceListing 1.0
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85 90 95
Leu Gly Ile Val Glu Val Leu Arg Leu Ile Thr Asp Arg Gly Asp Pro
100 105 110
Val Ile Val Asn Ser Pro Val Tyr Ala Pro Phe Tyr Ala Phe Val Ser
115 120 125
His Asp Gly Arg Arg Val Ile Pro Ala Pro Leu Arg Gly Asp Gly Arg
130 135 140
Ile Asp Leu Asp Ala Leu Gln Glu Ala Phe Ser Ser Ala Arg Ala Ser
145 150 155 160
Ser Gly Ser Ser Gly Asn Val Ala Tyr Leu Leu Cys Asn Pro His Asn
165 170 175
Pro Thr Gly Ser Val His Thr Ala Asp Glu Leu Arg Gly Ile Ala Glu
180 185 190
Arg Ala Gln Arg Phe Gly Val Arg Val Val Ser Asp Glu Ile His Ala
195 200 205
Pro Leu Ile Pro Ser Gly Ala Arg Phe Thr Pro Tyr Leu Ser Val Pro
210 215 220
Gly Ala Glu Asn Ala Phe Ala Leu Met Ser Ala Ser Lys Ala Trp Asn
225 230 235 240
Leu Gly Gly Leu Lys Ala Ala Leu Ala Ile Ala Gly Arg Glu Ala Ala
245 250 255
Ala Asp Leu Ala Arg Met Pro Glu Glu Val Gly His Gly Pro Ser His
260 265 270
Leu Gly Val Ile Ala His Thr Ala Ala Phe Arg Thr Gly Gly Asn Trp
275 280 285
Leu Asp Ala Leu Leu Arg Gly Leu Asp His Asn Arg Thr Leu Leu Gly
290 295 300
Ala Leu Val Asp Glu His Leu Pro Gly Val Gln Tyr Arg Trp Pro Gln
305 310 315 320
Gly Thr Tyr Leu Ala Trp Leu Asp Cys Arg Glu Leu Gly Phe Asp Asp
325 330 335
Ala Ala Ser Asp Glu Met Thr Glu Gly Leu Ala Val Val Ser Asp Leu
340 345 350
Ser Gly Pro Ala Arg Trp Phe Leu Asp His Ala Arg Val Ala Leu Ser
355 360 365
Ser Gly His Val Phe Gly Ile Gly Gly Ala Gly His Val Arg Ile Asn
370 375 380
Phe Ala Thr Ser Arg Ala Ile Leu Ile Glu Ala Val Ser Arg Met Ser
385 390 395 400
Arg Ser Leu Leu Glu Arg Arg
405
<210> 8
<211> 110
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
Met Arg Gly His Val Ala Glu Val Asn Gly Gly Val Ala Ala Met Ala
1 5 10 15
Leu Trp Phe Leu Asn Phe Ser Thr Trp Asp Gly Val Ala Gly Ile Tyr
20 25 30
Val Glu Asp Leu Phe Val Trp Pro Arg Phe Arg Arg Arg Gly Leu Ala
35 40 45
Arg Gly Leu Leu Ser Thr Leu Ala Arg Glu Cys Val Asp Asn Arg Tyr
50 55 60
Thr Arg Leu Ala Trp Ser Val Leu Asn Trp Asn Ser Asp Ala Ile Ala
65 70 75 80
Leu Tyr Asp Arg Ile Gly Gly Gln Pro Gln His Glu Trp Thr Ile Tyr
85 90 95
Arg Leu Ser Gly Pro Arg Leu Ala Ala Leu Ala Ala Pro Arg
100 105 110

Claims (6)

1.结核分枝杆菌蛋白中的核糖激酶、脂肪酰-AMP连接酶、胱硫醚β-裂解酶和假定蛋白中的一种或两种以上蛋白及其编码基因在制备检测结核病的诊断抗原中的应用；
所述核糖激酶为SEQ ID NO:1所示序列的蛋白；所述脂肪酰-AMP连接酶为SEQ ID NO:2所示序列的蛋白；所述胱硫醚β-裂解酶为SEQ ID NO:3所示序列的蛋白；所述假定蛋白为SEQ ID NO:4所示序列的蛋白。
2.根据权利要求1所述应用，其特征在于，所述核糖激酶为结核分枝杆菌核糖激酶全长蛋白；所述脂肪酰-AMP连接酶为结核分枝杆菌脂肪酰-AMP连接酶全长蛋白；所述胱硫醚β-裂解酶为结核分枝杆菌胱硫醚β-裂解酶全长蛋白；所述假定蛋白为结核分枝杆菌假定蛋白全长蛋白。
3.结核分枝杆菌蛋白中的核糖激酶、脂肪酰-AMP连接酶、胱硫醚β-裂解酶和假定蛋白中的一种或两种以上蛋白及其编码基因在制备检测结核病的试剂盒中的应用；
所述核糖激酶为SEQ ID NO:1所示序列的蛋白；所述脂肪酰-AMP连接酶为SEQ ID NO:2所示序列的蛋白；所述胱硫醚β-裂解酶为SEQ ID NO:3所示序列的蛋白；所述假定蛋白为SEQ ID NO:4所示序列的蛋白。
4.根据权利要求3所述应用，其特征在于，所述核糖激酶为结核分枝杆菌核糖激酶全长蛋白；所述脂肪酰-AMP连接酶为结核分枝杆菌脂肪酰-AMP连接酶全长蛋白；所述胱硫醚β-裂解酶为结核分枝杆菌胱硫醚β-裂解酶全长蛋白；所述假定蛋白为结核分枝杆菌假定蛋白全长蛋白。
5.一种检测结核病的试剂盒，其特征在于，包括包被有结核分枝杆菌蛋白中的核糖激酶、脂肪酰-AMP连接酶、胱硫醚β-裂解酶和假定蛋白中的一种或两种以上蛋白的载体；或者包括结核分枝杆菌蛋白中的核糖激酶、脂肪酰-AMP连接酶、胱硫醚β-裂解酶和假定蛋白中的一种或两种以上诊断抗原；
所述核糖激酶为SEQ ID NO:1所示序列的蛋白；所述脂肪酰-AMP连接酶为SEQ ID NO:2所示序列的蛋白；所述胱硫醚β-裂解酶为SEQ ID NO:3所示序列的蛋白；所述假定蛋白为SEQ ID NO:4所示序列的蛋白。
6.根据权利要求5所述试剂盒，其特征在于，所述核糖激酶为结核分枝杆菌核糖激酶全长蛋白；所述脂肪酰-AMP连接酶为结核分枝杆菌脂肪酰-AMP连接酶全长蛋白；所述胱硫醚β-裂解酶为结核分枝杆菌胱硫醚β-裂解酶全长蛋白；所述假定蛋白为结核分枝杆菌假定蛋白全长蛋白。
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