CN107501142B - 还原响应型含双二硫键的化学连接物及其制备与用途 - Google Patents

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Abstract

还原响应型含双二硫键的化学连接物及其制备与用途，涉及具有双巯基的化合物与其形成的具有双二硫键的化学连接物，其基于互不相干的双二硫键间的协同效应，构建具有独特氧化还原响应性的动态共价连接键。所述共价连接键具有与传统的单二硫键截然不同的氧化还原响应性；其在低还原剂浓度或细胞外条件下具有超高的稳定性，而在细胞内等强还原性条件下能够发生快速的还原断裂。有望应用于药物释放及生物传感领域，构建氧化还原响应型药物释放***，如单克隆抗体–药物偶联体等。

Description

还原响应型含双二硫键的化学连接物及其制备与用途
技术领域
本发明涉及具有双巯基的化合物与其形成的具有双二硫键的化学连接物，尤其是涉及还原响应型含双二硫键的化学连接物及其制备与用途。
背景技术
现有技术中大部分药物，尤其是在癌症化疗中有效的治疗剂，经常表现出体内急性毒性，在实践应用过程中存在毒副作用较大的问题，这限制了它们的应用。因此新的药物着重于开发更多和更安全的特异性治疗剂，特别是抗肿瘤剂需要对肿瘤细胞具有更大的有效性，但同时减少这些药物的副作用的数量和严重性。此外，现有药物的另一种缺点是它们在体内循环中的稳定性不足，多数药物进入体内后，随着血液循环到达人体的各个器官和组织，其中最终到达目标组织的部分较少，大部分药物在循环中分解，并积聚在人体健康组织中，达不到治疗效果。
有部分研究开发新的药物是前体药物的形式。前体药物，既前药是活性药物化学转化成自身无活性或低活性的衍生物，其利用化学或酶作用在到达作用位点之前或之后在体内转化成母体药物。为降低毒性，这种转化作用通常限于作用部位或靶组织而不是循环***或非靶组织。
制备前药以改变药物的药物动力学，改善溶解性、稳定性、降低毒性、增加特异性和增加药物的药理效果的持续时间。通过改变药物动力学来增加药物吸收、分布、生物转化和***，从而增加药物的生物利用度。在前药设计中，重要的是考虑以下因素：载体连接物的选择；前药必须为可逆的或生物可逆的药物衍生物且无活性或比活性成分的活性低；靶点的特异性与亲和性等。关于前药可参见例如Rautio,J.et al.,Nature ReviewsDrugDiscovery 7.3(2008):255-70和Chari,Ravi V.J.et al.,Angewandte ChemieInternational Edition 53.15(2014):3796-827。
目前，前药中连接物(Linker)使用的连接键主要有酯键、酰胺键、酰腙键、硫醚键和二硫键等共价键。其中，二硫键是被广泛运用的一种共价连接键。二硫键是生命体中重要的化学键，其在还原条件下，会发生断裂；在其他巯基物质的作用下，会发生双分子亲核取代反应产生新的二硫键和巯基分子。二硫键是蛋白质结构中最常见的动态共价键，其不仅可以有效地调控蛋白质的折叠过程，而且可以针对生物体内不同氧化还原环境作出响应。二硫键的响应性主要体现在其和巯基分子间可通过双分子亲核取代反应产生新的二硫键和巯基分子。
由于生物分子上通常含有巯基，如多肽及蛋白质上的半胱氨酸残基，非常利于修饰，可以方便地构建氧化还原响应型的生物功能材料，如药物释放***和活化型荧光成像探针等。在大部分基于二硫键构建的体系中，二硫键主要作为氧化还原响应型的连接键直接连接载体和载物分子(药物或荧光探针)，参见例如Santra,SantimukμL et al.,Journalof the American Chemical Society 133.41(2011):16680–16688。这些体系在生物环境中的响应性主要取决于二硫键在环境中的断裂动力学。为了提高基于二硫键的氧化还原响应型体系的生物性能，二硫键的稳定性必需经过精细地调控，以避免二硫键在到达目标位点之前(如在血液循环和细胞外环境中)提前发生断裂；同时也要保证其在到达目标位点后(如细胞内)能迅速发生断裂，并释放载物分子。
目前，主要有两种方法可应用于调控二硫键的稳定性：引入空间位阻提高二硫键稳定性；改变二硫键微环境调控其稳定性，参见Kellogg,Brenda A.et al.,BioconjugateChemistry 22.4(2011):717-27。尽管这些方法可以精确调控二硫键的稳定性，但二硫键在不同氧化还原环境中稳定性的差异却很难进行调控。对于传统的单二硫键，其在氧化还原环境中的响应方式是基于二硫键断裂速率和还原剂(巯基分子，如谷胱甘肽GSH)浓度之间的线性关系。提高二硫键的稳定性，虽然减少了前药连接物在体内循环中断裂的程度，但是也影响了其达到目标组织后释放的效率。传统的单二硫键的化学式如下：
因此，在实际应用中，非线性的响应方式尤其重要，即二硫键在低还原剂浓度下或弱还原性的环境中需具有更高的稳定性，而在高还原剂浓度或强还原性的环境中能更迅速的发生还原断裂。这种非线性的响应型一直无法在传统的单二硫键中实现，极大地限制了基于二硫键构建的生物功能材料的应用潜能。Wu等人在Zhai,LX,et al.Chem.Eur.J.,20.52(2014):17507-14中提出了一种基于两个二硫键的连接键形式，其通过两个可以互相协同作用的二硫键构成了一种具有非线性响应特点的连接键。然而，其中使用的萘二酰亚胺分子(NDI)母体存在一些缺点：在极性与非极性溶剂中的溶解性较差；体积较大，对其连接的运载物可能产生其他作用；响应性不能于进一步调控，无法进一步满足新型前药等应用的需求。
需要构建上述的双二硫键连接物体系，其基础是构成其连接物的单体分子的结构中具有双巯基官能团。在自然界及目前的研究中，已经存在较多的双巯基分子。其中，自然界中存在的分子有硫辛酸、二硫苏糖醇、2,3-二巯基丙醇及1,2-二巯基乙烷等；此外这类结构在多肽、蛋白质中也广泛存在，其在多肽序列上一般表现为Cys-Xaa-Cys及Cys-Xaa-Xaa-Cys的形式(其中Cys为半胱氨酸，Xaa为其他任意一种天然氨基酸)。在研究中，具有双巯基结构的分子通常基于二硫键的动态性质，用于构建动态组合化学库中。较为经常使用的分子为羧基苯二硫酚、3,5-双(巯甲基)苯甲酸，参见West,K.R.,et al.,Organic Letters7.13(2005):2615-8和Otto,S,et al.,Science 297.5581(2002):590-3。
以上分子虽然满足构成双二硫键连接物的基本要求，但是其中大部分并不能形成协同作用的双二硫键连接物。巯基的协同性直接受到巯基附近的空间结构的影响，包括巯基间分子骨架的刚性及巯基间的距离。不合适的结构会导致无法形成协同作用，产生过低或过高的稳定性：过低稳定性导致连接物在循环中直接断裂；过高稳定性导致连接物达到目标位点后无法断裂。因此，连接两个巯基基团的分子骨架需具有一定的刚性，且两个巯基间的间距需超过二硫键的键长。
一些双巯基化合物，如前诉的羧基苯二硫酚和3,5-双(巯甲基)苯甲酸，自身氧化时热力学稳定的产物是三聚体或多聚体，而一些双巯基化合物直接倾向于形成分子内的二硫键内环，最终导致形成具有双二硫键的二聚体的产率较低。且许多常见的双巯基化合物，也缺乏可以进一步反应与修饰的位点，使其并不能用于构成连接物。
从常识及所引文献可知，苯环是一类合适的具有多位点的刚性母体，其多取代的原料易得。对于巯基连接于苯环及巯基连接于苄位的情况，都有合适的合成方法。但是当巯基与苯环母体间隔一个碳原子以上及与巯基相连的碳原子带有取代的情况时，一般合成使用的卤素取代方法并不适用。因为这类位点无法通过苄位自由基取代进行卤代，而含有合适的修饰基团的多取代苯环母体原料也过于昂贵或无法直接购买，限制了其应用的空间。
此外，在构建这类连接物时还需要考虑分子本身的亲疏水性、溶解性、毒性、稳定性及结构，这些性质都影响着整个体系。最理想的情况是引入的双二硫键连接物只具有还原响应的性质，对负载物及组合物的其他影响都较小。
前药的递送与释放仍然是需要解决的重要问题，其中连接物的优化是一个关键，尽管本领域已经取得了一定进展，也仍然需要开发改进的连接物，调控连接物的稳定性及响应性，以满足不同的药物递送和释放的需求。
发明内容
本发明的目的在于针对现有单二硫键载药体系稳定性不足及刚性萘酰亚胺分子构建的双二硫键体系水溶性较差无法进一步应用的缺陷，提供可用于传感及递送的、体积较小、水溶性和响应性良好，以实现可精确调控的还原响应释放的还原响应型含双二硫键的化学连接物及其制备方法与用途。
一类双巯基化合物可依靠双巯基与自身或其他具有双巯基的物质相连，形成具有双二硫键的化合物。
一种基于键间协同效应调控二硫键氧化还原响应性的方法，所述方法包括提供一类含双二硫键的化学连接物及其制备方法，所述方法可以解决传统的单二硫键在生物环境中(如血液循环、细胞外及细胞内环境等)的稳定性和氧化还原响应性难以兼具的缺陷，所述方法中的双二硫键化合物作为连接物在可控药物递送、释放及生物传感的用途。
一类双巯基化合物的化学通式如下：
其中Ar表示芳基或者杂芳基；R1表示单键、亚烷基、取代亚烷基；Y表示羧基、氨基、羟基、叠氮基、磺酸基、卤素；R2独立地选自氢、烷基、烷氧基、芳基、杂芳基、卤素、硝基、氰基，其可以具有全部相同的化学结构、或全部不相同的化学结构、或其中的任意几个具有相同的化学结构，并且a是从0到3的一个整数；R3、R4各自独立地选自单键、亚烷基、取代亚烷基；R5表示氢或乙酰基；当R3为单键时，R4不能为单键；当R3为亚甲基时，R4不能为亚甲基；所述术语“烷基”是指1～8个碳原子的直链、支链或环状的饱和烃基，所述烷基可选自甲基、乙基、丙基、异丙基、丁基、异丁基、叔丁基等中的一种，优选1～4个碳原子的直链、支链烷基；所述术语“亚烷基”是指直链1～3个碳原子的亚烷基，优选1～2个碳原子的亚烷基；所述术语“取代亚烷基”是指至少一个氢原子被烷基、烷氧基、芳基等基团取代的所述亚烷基；所述术语“烷氧基”是指1～6个碳原子的直链、支链的烷氧基；所述术语“芳基”是指6～15个碳原子的单环或多元稠环芳香烃，优选6～10个碳原子的芳香烃，所述芳香烃选自苯基或萘基，最好为苯基；所述术语“杂芳基”是指包含3～15个碳且含有至少一个N、O或S原子的芳香环，所述芳香环可选自吡咯基、吡啶基、嘧啶基、类似基团等中的一种；所述术语“卤素”包括氟、氯、溴、碘等中的一种。
所述一类双巯基化合物的化学通式可表示为：
所述一类双巯基化合物的制备方法包括以下步骤：
方法(I)：当巯基直接连接于芳基时，采用含有羟基取代的芳基、杂芳基化合物；第一步，通过其在N，N-二甲基甲酰胺中与N,N-二甲基氨基硫代甲酰氯在碱作用下缩合；第二步，在二苯醚中，加热至200℃进行重排反应；第三步，在乙二醇及水中，通过氢氧化钾水解；第四步，通过乙酸酐及碱对巯基进行保护。该反应路线示意如下：
方法(II)：当巯基间隔一个碳原子与芳基相连时，采用烷基取代的芳基、杂芳基化合物，且该烷基与芳基相连的碳原子上至少有一个氢原子；第一步，在四氯化碳中通过溴代丁二酰亚胺及过氧化苯甲酰进行苄位自由基溴代反应；第二步，通过硫代乙酸钾进行取代反应。该反应路线示意如下：
方法(III)：当巯基间隔两个碳原子与芳基相连时，采用烷基取代的芳基、杂芳基化合物，且该烷基与芳基相连的碳原子上至少有一个氢原子；第一步，在四氯化碳中通过NBS及过氧化苯甲酰进行苄位自由基溴代反应；第二步，通过与三苯基磷反应得到三苯基磷盐，之后与含有醛或酮的化合物发生维悌希(wittig)反应。第三步，通过与硫代乙酸在光引发剂的催化及紫外线作用下进行加成反应或通过偶氮二异丁腈催化在加热下进行加成反应。该反应路线示意如下：
方法(IV)：当巯基间隔两个碳原子与芳基相连时，采用卤素取代的芳基、杂芳基化合物；第一步，通过与烯基硼酸在碱、四三苯基磷钯作用下进行铃木偶联反应；第二步，通过与硫代乙酸在光引发剂的催化及紫外线作用下进行加成反应或通过偶氮二异丁腈催化在加热下进行加成反应。该反应路线示意如下：
在方法(I)、方法(II)、方法(III)和方法(IV)中使用的巯基保护基为乙酰基，其可以通过碱，在室温下温和地脱除，其中碱为氢氧化钠、氢氧化钾、乙醇钠、甲醇钠等中的一种；溶剂为水、乙醇、甲醇、乙腈、四氢呋喃等中的一种。由于巯基具有乙酰基保护，使得在进行后续的合成时，不会产生巯基氧化形成副产物或巯基气味难闻的问题。
在方法(II)和方法(III)的第一步中，溴代丁二酰亚胺和与每个能够反应的碳原子位点投料量摩尔比为(1～2.5)︰1，过氧化苯甲酰与每个能够反应的碳原子位点投料量摩尔比为(0.05～0.2)︰1，反应温度为60～80℃，反应时间为2～12h。
在方法(II)的第二步中，硫代乙酸钾和与每个能够反应的溴原子位点投料量摩尔比为(1～2.5)︰1，反应温度为20～60℃，反应时间为2～24h。所述溶剂为丙酮、乙腈、N，N-二甲基甲酰胺、四氢呋喃、1,4-二氧六环、甲醇、乙醇等中的一种。
在方法(III)的第二步中，三苯基膦和与每个能够反应的溴原子投料量摩尔比为(1.2～2.5)︰1，反应温度为50～80℃，反应时间为8～12h。含有醛或酮的化合物和每个能够反应的三苯基膦氢溴酸盐位点的投料量摩尔比为1.2～2︰1，碱和和每个能够反应的三苯基膦氢溴酸盐位点的投料量摩尔比为(1.2～2)︰1，反应时间为1～8h。溶剂为水、二氯甲烷、四氢呋喃等；碱为氢氧化钠、乙醇钠、甲醇钠、叔丁醇钾等中的一种。
在方法(III)的第三步和方法(IV)的第二步中，硫代乙酸和每个能够反应的烯烃位点的投料量摩尔比为(2～8)︰1，光引发剂和每个能够反应的烯烃位点的投料量摩尔比为(0.1～0.5)︰1，反应时间为12～48h。溶剂为四氢呋喃、1,4-二氧六环、乙腈等中的一种；光引发剂为安息香二甲醚、安息香、二乙氧基苯乙酮等中的一种；使用的紫外光光波长为254～365nm。
在方法(III)的第三步和方法(IV)的第二步中，硫代乙酸和每个能够反应的烯烃位点的投料量摩尔比为(2～8)︰1，偶氮二异丁腈和每个能够反应的烯烃位点的投料量摩尔比为(0.1～0.5)︰1，反应温度为60～80℃，反应时间为12～48h。溶剂为四氢呋喃、1,4-二氧六环、四氯化碳、苯等中的一种。
在方法(IV)的第一步中，烯基硼酸和每个能够反应的卤素位点的投料量摩尔比为(1～2)︰1，碱和每个能够反应的卤素位点的投料量摩尔比为(2～6)︰1，四三苯基磷钯和每个能够反应的卤素位点的投料量摩尔比为(0.1～0.5)︰1，反应温度为80～120℃，反应时间为6～24h。溶剂为N，N-二甲基甲酰胺、1,4-二氧六环、水、甲苯等中的一种；碱为碳酸钠、碳酸钾，磷酸钾等中一种。
在方法(I)、方法(II)、方法(III)和方法(IV)中的一种，使用相应的原料，可以合成间隔碳原子数相等的双巯基分子，例如使用方法(III)可以合成3,5-双(2-巯乙基)苯甲酸；使用方法(IV)可以合成3,5-双(2-巯丙基)-苯甲酸。
在方法(I)、方法(II)、方法(III)和方法(IV)中的组合，使用相应的原料，可以合成间隔碳原子数不相等的双巯基分子，例如使用方法(III)及方法(II)结合可得到3-(2-(乙酰巯基)乙基)-5-(2-(乙酰巯基)甲基)苯甲酸及3-(2-巯乙基)-5-(巯甲基)苯甲酸。
所述还原响应型含双二硫键的化学连接物的化学通式为：
其中M1及M2是含双巯基的化合物，依靠各自的双巯基形成双二硫键，构成二聚体形式，S为硫原子；M1选自双巯基化合物、羧基苯二硫酚、3,5-双(巯甲基)苯甲酸等中的一种；M2选自双巯基化合物、硫辛酸、2,3-二巯基丙醇、2,3-二巯基丙酸、1,2-二巯基丙胺、羧基苯二硫酚、3,5-双(巯甲基)苯甲酸、具有Cys-Xaa-Cys、Cys-Xaa-Xaa-Cys序列的由3-30氨基酸残基组成的多肽等中的一种；当M1为羧基苯二硫酚时，M2不能为羧基苯二硫酚；所述多肽中残基Xaa选自氨基酸甘氨酸(Gly，G)、丙氨酸(Ala，a)、缬氨酸(Val，V)、亮氨酸(Leu，L)、异亮氨酸(Ile，I)、苯丙氨酸(Phe，P)、色氨酸(Trp，W)、酪氨酸(Tyr，Y)、天冬氨酸(Asp，D)、天冬酰胺(Asn，N)、谷氨酸(Glu，E)、赖氨酸(Lys，K)、谷氨酰胺(Gln，Q)、甲硫氨酸(Met，M)、丝氨酸(Ser，S)、苏氨酸(Thr，T)、脯氨酸(Pro，P)、组氨酸(His，H)、精氨酸(Arg，R)等中一种。
所述还原响应型含双二硫键的化学连接物可为M1及M2代表所述双巯基化合物、M1代表所述双巯基化合物及M2代表所述多肽。
所述还原响应型含双二硫键的化学连接物的制备方法，以含双巯基的化合物为原料，通过二硫二吡啶活化或二甲亚砜氧化的方法制备，二甲亚砜氧化使用的溶剂为二甲基亚砜与pH 7.4磷酸缓冲液混合溶液，所述二甲基亚砜与pH 7.4磷酸缓冲液的体积比为20︰80，氧化巯基化合物摩尔浓度控制为约1mM；二硫二吡啶与每个能够反应的巯基位点投料量摩尔比为(1～10)︰1，二硫二吡啶使用的溶剂为甲醇、乙醇、乙腈、水、二甲基亚砜、N，N-二甲基甲酰胺等中的一种。
本发明的有益效果：
(1)所述一类双巯基化合物相比常见的双巯基化合物具有可以功能化的反应性官能团，为构建具有多功能的生物材料提供基础。所述的制备方法简单，成本低廉，易于工业化。此外，还可以简便地合成不同取代的双巯基分子。所合成的巯基分子带有乙酰基保护，可以减少后续反应时的副反应。
(2)所述一类双巯基化合物经过优选，不会或很难形成分子内二硫键，主要构成分子间的二硫键，形成多二硫键大环分子，主要形成双二硫键分子。使用所述的含双二硫键的化学连接物的制备方法，可以高产率地得到产物，减少多巯基化合物反应中常见的副产物。
(3)所述一类含双二硫键的化学连接物，由于其基于巯基形成二硫键的反应，因此可以简易地合成一系列具有不同还原响应性质的连接物。此外，构成该连接物的所述一类双巯基化合物，其与巯基相连的碳原子可以通过所述的制备方法，具有不同的取代基，使得巯基周围的化学环境不同，也会影响断裂的速率。通过这两个方法，可以得到适应不同的传感及递送释放需求的连接物。此外，该类连接物体积较小、水溶性好，使得其对运载物的影响进一步减小。
(4)使用所述一类含双二硫键的化学连接物构建了荧光探针，该探针具有良好的稳定性、较低的副作用，可以有效应用于生物荧光成像及生物还原性环境的传感。
附图说明
图1为优选的双二硫键连接物在模拟生理条件的1mM及10mM GSH的释放动力学曲线；
图2为所合成的双二硫键连接物应用于生物传感的细胞成像图(荧光探针浓度2uM)，明场、荧光叠加图像(a)，荧光图像(b)；
图3为所合成的双二硫键连接物应用于生物传感的细胞成像图(荧光探针浓度5uM)，明场、荧光叠加图像(a)，荧光图像(b)；
图4为10mM GSH还原荧光探针F2的荧光光谱。
具体实施方式
本发明的化合物及方法将通过下列实施例进一步展示。
对以下优选化学连接物及其单二硫键参照物进行体外模拟释放实验：
当模拟血液循环时，单二硫键连接物在1mM及10mM时都快速释放，释放半衰期和GSH浓度呈线性关系。不同的是，1mM GSH的条件下，720min时双二硫键连接物仅发生极少的释放；而当模拟细胞内环境，10mM GSH的条件下，240min时双二硫键连接物几乎完全释放。以上结果说明该类双二硫键连接物具有良好的非线性的还原响应性质。
这种非线性响应的原理所示：其一，传统的单二硫键在巯基分子还原剂存在的情况下，会直接发生一步巯基–二硫键交换反应，从而导致二硫键断裂。在还原剂浓度不变的情况下，二硫键的断裂遵循一级反应动力学，其寿命(τ1/2)与还原剂的浓度呈线性关系。其二，双二硫键的氧化还原断裂过程与单二硫键不同，其在还原剂浓度较低的情况下，发生部分断裂的双二硫键(即其中一个二硫键发生断裂)中间体由于双二硫键间的协同稳定效应，会发生分子内的巯基–二硫键交换反应，从而重新形成双二硫键；但是，在还原剂浓度较高的情况下，发生部分断裂的双二硫键会进一步与环境中的还原剂发生巯基–二硫键交换反应，从而导致两个二硫键相继发生断裂。因此，双二硫键在弱还原性的条件下具有超高的稳定性，而在强还原性的条件下则与单二硫键类似，可以发生快速的断裂。本发明提出的双二硫键如下：
在本发明的一些实施方式中，合成了以下结构的荧光探针：
并利用荧光探针F2进行了细胞成像实验，细胞成像的结果与体外释放实验结果相符合，该类双二硫键连接物具有非线性还原响应性。
以下给出具体实施例。
实施例1
3,5-双(2-巯乙基)苯甲酸(1)的制备：
3,5-双(2-巯乙基)苯甲酸(1)的合成路线如下：
3,5-二乙烯基苯甲酸(1d)的合成。(1)3,5-二甲基苯甲酸(1a)(1.0g,6.6mmol)溶于10mL四氯化碳，加入N-溴代琥珀酰亚胺(2.37g,13.3mmol)及催化量的过氧化二苯甲酰(73mg)。加热回流3h，冷却过滤，收集滤液。真空旋去滤液得到白色固体3,5-双(溴甲基)苯甲酸(1b)。(2)将上述产物(1b)溶于25mL丙酮。缓慢加入三苯基膦(3.49g,13.3mmol)并回流过夜。冷却，过滤收集白色固体，并以己烷及***洗涤，得到中间体(1c)。(3)向盐(3c)加入30mL甲醛水溶液(240mmol,20mL 37％甲醛水溶液，10mL水)。向该混合物缓慢滴入5N氢氧化钠水溶液(7.5mL,37.5mmol)。溶液逐渐澄清，之后产生白色沉淀。室温反应3h。滤除白色沉淀，之后以浓盐酸中和至pH＝2。析出固体，过滤并干燥得到白色固体0.31g，产率26.5％。1HNMR(500MHz,CDCl3)δ8.07(d,J＝1.6Hz,2H),7.67(d,J＝1.8Hz,1H),6.79(dd,J＝17.5,10.9Hz,2H),5.92–5.85(m,2H),5.39(d,J＝10.9Hz,2H).13C NMR(125MHz,CDCl3)δ138.30,135.70,129.95,129.03,127.09,115.57.
3,5-双(2-(乙酰巯基(乙基)苯甲酸(1e)的合成。3d(50mg,0.29mmol),硫代乙酸(0.42mL,5.96mmol)及催化量安息香二甲醚(5mg)溶于3mL四氢呋喃。溶液在365nm UV-light(8W)照射下反应24h。旋去溶剂，以柱层析分离得到白色固体29mg，产率31％。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ7.85(d,J＝1.7Hz,2H),7.28(s,1H),3.15(dd,J＝8.5,6.5Hz,4H),2.94(dd,J＝8.6,6.5Hz,4H),2.36(s,6H).13C NMR(100MHz,CDCl3)δ195.62,171.73,140.67,135.70,134.44,129.75,129.49,128.59,126.27,77.36,77.24,77.04,76.72,35.49,35.44,30.68,30.27,30.21,21.20.ESI MS(m/z):348.8[M+Na]+.
3,5-双(2-(乙酰巯基(乙基)苯甲酸(1e)的合成。3d(50mg,0.29mmol),硫代乙酸(0.42mL,5.96mmol)及催化量偶氮二异丁腈(10mg)溶于10mL四氯化碳，回流6h，冷却后旋去溶剂，柱层析分离，得到白色固体，产率22％。
3,5-双(2-巯乙基)苯甲酸(1)的合成。3e(20mg,0.06mmol)溶于1mL甲醇，加入3N氢氧化钠溶液(1mL)，于氮气保护下室温搅拌1h。1N盐酸中和至pH＝2。白色固体析出，以离心分离，真空干燥得到白色固体14mg。1H NMR(500MHz,CDCl3)δ7.83(d,J＝1.7Hz,2H),7.64(d,J＝1.7Hz,1H),2.99～2.95(m,4H),2.83～2.79(m,4H),1.42～1.39(m,2H).
实施例2
2,5-双(2-巯乙基)苯甲酸(2)的制备：
2,5-双(2-巯乙基)苯甲酸(2)的合成路线如下：
2,5-二乙烯基苯甲酸(2d)的合成。(1)2,5-二甲基苯甲酸(2a)(1.0g,6.6mmol)溶于10mL四氯化碳加入N-溴代琥珀酰亚胺(2.37g,13.3mmol)及催化量的过氧化二苯甲酰(73mg)。加热回流3h，降温过滤，收集滤液。真空旋去滤液得到白色固体2,5-双(溴甲基)苯甲酸(2b)。(2)将上述产物(2b)溶于25mL丙酮。缓慢加入三苯基膦(3.49g,13.3mmol)并回流过夜。冷却，过滤收集白色固体，并以己烷及***洗涤，得到中间体(2c)。(3)向盐(4c)加入30mL甲醛水溶液(240mmol,20mL 37％甲醛水溶液，10mL水)。向该混合物缓慢滴入5N氢氧化钠水溶液(7.5mL,37.5mmol)。溶液逐渐澄清，之后产生白色沉淀。室温反应3h。滤除白色沉淀，之后以浓盐酸中和至pH＝2。析出固体，过滤并干燥得到白色固体0.4020g，产率35％。1HNMR(500MHz,CDCl3)δ8.08(s,1H),7.62～7.60(m,2H),7.60～7.55(m,1H),6.76(dd,J＝17.6,10.9Hz,1H),5.90～5.82(m,1H),5.71(dd,J＝17.4,1.3Hz,1H),5.38(ddd,J＝22.3,11.0,0.8Hz,2H).13C NMR(125MHz,CDCl3)δ171.93,139.54,136.94,135.48,132.13,130.18,129.14,128.54,127.61,116.62,115.09。
2,5-双(2-(乙酰巯基)乙基)苯甲酸(2e)的合成。2d(50mg,0.29mmol),硫代乙酸(0.42mL,5.96mmol)及催化量安息香二甲醚(5mg)溶于3mL四氢呋喃。溶液在365nm UV-light(8W)照射下反应24h。旋去溶剂，以柱层析分离得到白色固体21mg，产率22％。1H NMR(500MHz,CDCl3)δ7.92(d,J＝1.9Hz,1H),7.39(dd,J＝7.8,2.0Hz,1H),7.31(d,J＝7.8Hz,1H),3.27(t,J＝7.7Hz,2H),3.19～3.15(m,4H),2.93(t,J＝8.0Hz,2H),2.36(s,3H),2.35(s,3H).13C NMR(125MHz,CDCl3)δ195.85,195.51,171.67,140.77,138.62,133.24,132.07,131.84,128.28,35.13,34.21,30.64,30.61,30.22,30.17.ESI MS(m/z):348.8[M+Na]+。
2,5-双(2-巯乙基)苯甲酸(2)的合成。2e(20mg,0.06mmol)溶于1mL甲醇，加入3N氢氧化钠溶液(1mL)，于氮气保护下室温搅拌1h。1N盐酸中和至pH＝2。白色固体析出，以离心分离，真空干燥得到白色固体13mg。1H NMR(500MHz,CDCl3)δ7.93(d,J＝2.0Hz,1H),7.38(dd,J＝7.8,2.1Hz,1H),7.30(s,1H),3.34～3.30(m,2H),2.99～2.96(m,2H),2.86～2.81(m,4H),1.45(t,J＝8.1Hz,1H),1.41(t,J＝7.9Hz,1H)。
实施例3
3-(2-巯乙基)-5-(巯甲基)苯甲酸(3)的制备：
3-(2-巯乙基)-5-(巯甲基)苯甲酸(3)的合成路线如下：
3-甲基-5-乙烯基苯甲酸(3d)的合成。(1)3,5-二甲基苯甲酸(3a)(1.0g,6.6mmol)溶于10mL四氯化碳加入N-溴代琥珀酰亚胺(1.18g,6.7mmol)及催化量的过氧化二苯甲酰(37mg)。加热回流3h，降温过滤，收集滤液。真空旋去滤液得到白色固体。(2)将上述产物(5b)溶于25mL丙酮。缓慢加入三苯基膦(1.75g,6.7mmol)并回流过夜。冷却，过滤收集白色固体，并以己烷及***洗涤，得到中间体(3c)。(3)向盐(3c)加入20mL甲醛水溶液(120mmol,10mL37％甲醛水溶液，10mL水)。向该混合物缓慢滴入5N氢氧化钠水溶液(3.75mL,18.8mmol)。溶液逐渐澄清，之后产生白色沉淀。室温反应3h。滤除白色沉淀，之后以浓盐酸中和至pH＝2。析出固体，过滤并干燥得到白色固体0.4360g，产率40.8％。1H NMR(500MHz,CDCl3)δ7.98(s,1H),7.84(s,1H),7.48(s,1H),6.75(dd,J＝17.5,10.9Hz,1H),5.85(d,J＝17.6Hz,1H),5.34(d,J＝10.9Hz,1H),2.44(s,3H).13C NMR(125MHz,CDCl3)δ170.99,138.52,137.96,135.92,132.04,129.98,129.54,125.25,115.05,21.19.
3-(2-(乙酰巯基)乙基)-甲基苯甲酸(3e)的合成。3d(150mg,0.92mmol),硫代乙酸(0.50mL,7.3mmol)及催化量安息香二甲醚(30mg)溶于3mL四氢呋喃。溶液在365nm UV-light(8W)照射下反应24h。旋去溶剂，以柱层析分离得到白色固体75.9mg，产率34.7％。1HNMR(500MHz,CDCl3)δ7.80(s,1H),7.76(s,1H),7.29(s,1H),3.18～3.10(m,2H),2.92～2.87(m,2H),2.40(s,3H),2.34(s,3H).13C NMR(125MHz,CDCl3)δ195.64,172.07,140.31,138.57,134.92,129.05,128.26,127.44,35.45,30.66,30.27,21.19。
3-(2-(乙酰巯基)乙基)-5-(溴甲基)苯甲酸(3f)的合成。3e(70mg,0.29mmol)溶于10mL四氯化碳，加入N-溴代琥珀酰亚胺(56mg,0.32mmol)、催化量过氧化二苯甲酰。加热回流3h，冷却过滤，旋干滤液。以乙酸乙酯及己烷重结晶，得到白色固体81mg，产率89.1％。1HNMR(500MHz,CDCl3)δ7.98(s,1H),7.86(s,1H),7.39(s,1H),4.51(s,2H),3.22～3.12(m,2H),2.90～2.85(m,2H),2.33(s,3H)。
3-(2-(乙酰巯基)乙基)-5-(2-(乙酰巯基)甲基)苯甲酸(3g)的合成。3f(81mg,0.26mmol)溶于10mL丙酮，加入硫代乙酸钾(58mg,0.52mmol)室温搅拌3h。加入乙酸乙酯及水分层，以乙酸乙酯萃取3次，旋去溶剂，以乙酸乙酯及己烷重结晶，得到白色固体77mg，产率95.0％。1H NMR(500MHz,CDCl3)δ7.82(s,1H),7.78(s,1H),7.35(s,1H),3.87(s,2H),3.12～2.80(m,4H),2.33(m,6H)。
3-(2-巯乙基)-5-(巯甲基)苯甲酸(3)的合成。3g(20mg,0.06mmol)溶于1mL甲醇，加入3N氢氧化钠溶液(1mL)，于氮气保护下室温搅拌1h。1N盐酸中和至pH＝2。白色固体析出，以离心分离，真空干燥得到白色固体12.1mg。1H NMR(500MHz,CDCl3)δ7.80(s,1H),7.76(s,1H),7.30(s,1H),3.80(s,2H),2.95～2.81(m,4H),2.30(s,1H),1.40(s,1H).
实施例4
3,5-双(2-巯丙基)-苯甲酸的制备：
3,5-双(2-巯丙基)-苯甲酸的合成路线如下：
3,5-双(丙烯基)-苯甲酸(4b)的合成。氮气氛围下，4a(280mg,1mmol)溶于6mL N，N-二甲基甲酰胺，加入四三苯基磷钯(230mg,0.2mmol)，室温搅拌10min，加入碳酸钠(1.1g,10.5mmol)、4mL水及1-丙烯-1-硼酸(179mg,2.1mmol)，回流12h。冷却后，加入30mL水，1N盐酸中和至pH＝2，得到灰色沉淀，过滤。柱层析分离白色固体145.4mg，产率72％。
3,5-双(2-巯丙基)-苯甲酸(4)的合成。4b(100mg,0.5mmol),硫代乙酸(0.27mL,4mmol)及催化量安息香二甲醚(30mg)溶于3mL乙腈。溶液在365nm UV-light(8W)照射下反应24h。旋转蒸发仪浓缩，以柱层析分离。之后溶于1mL甲醇，加入3N氢氧化钠溶液(1mL)，于氮气保护下室温搅拌1h。1N盐酸中和至pH＝2。白色固体析出，以离心分离，真空干燥得到白色固体24.2mg，产率17.9％。1H NMR(500MHz,CDCl3)δ7.85(d,J＝1.6Hz,2H),7.62(d,J＝1.6Hz,1H),3.01～2.72(m,6H),1.47(d,6H),1.41～1.38(m,2H).ESI MS(m/z):268.9[M-H]-。
实施例5
羧基苯二硫酚和3,5-双(巯甲基)苯甲酸组成的双二硫键连接物的制备：
羧基苯二硫酚及3,5-双(巯甲基)苯甲酸的合成参考自West,K.R.,et al.,Organic Letters7.13(2005):2615-8。将羧基苯二硫酚(3.7mg,0.02mmol)与3,5-双(巯甲基)苯甲酸(4.2mg,0.02mmol)溶于5mL二甲基亚砜与pH 7.4磷酸缓冲液混合溶液中(20︰80)，巯基化合物浓度控制为约1mM。室温反应2天，反应结束后，旋转蒸发仪浓缩后使用制备色谱分离，得到5.1mg产物，产率约65％。ESI MS(m/z):395.0[M-H]-。
实施例6
3,5-双(巯甲基)苯甲酸组成的双二硫键连接物的制备：
将2,2'-二硫二吡啶(220mg，1mmol)溶于20mL甲醇。将3,5-双(巯甲基)苯甲酸(20mg,0.09mmol)溶于5mL甲醇中，并滴入二硫二吡啶的甲醇溶液中，室温反应8h，之后旋转蒸发仪浓缩，制备色谱分离。制备色谱分离得到的中间体溶于5mL甲醇中，加入等量的3,5-双(巯甲基)苯甲酸，室温反应1h，浓缩后制备色谱纯化，得到产物32.2mg，产率约81％。ESIMS(m/z):422.3[M-H]-。
实施例7
3,5-双(2-巯乙基)苯甲酸组成的双二硫键连接物的制备：
3,5-双(2-巯乙基)苯甲酸(4.8mg,0.02mmol)溶于5mL二甲基亚砜与pH 7.4磷酸缓冲液混合溶液中(20︰80)，巯基化合物浓度控制为约1mM。室温反应2天，反应结束后，旋转蒸发仪浓缩后使用制备色谱分离，得到3.8mg产物，产率约79％。ESI MS(m/z):479.0[M-H]-。
实施例8
3,5-双(2-巯乙基)苯甲酸组成的双二硫键连接物的制备：
将2,2'-二硫二吡啶(220mg，1mmol)溶于20mL甲醇。将3,5-双(2-巯乙基)苯甲酸(24mg,0.1mmol)溶于5mL甲醇中，并滴入二硫二吡啶的甲醇溶液中，室温反应8h，之后旋转蒸发仪浓缩，制备色谱分离。制备色谱分离得到的中间体溶于5mL甲醇中，加入等量的3,5-双(2-巯乙基)苯甲酸，室温反应1h，浓缩后制备色谱纯化，得到产物41.7mg，产率约87％。ESI MS(m/z):479.0[M-H]-。
实施例9
基于双二硫键连接物的还原响应型荧光探针的制备：
3,5-双(2-巯乙基)苯甲酸(9a)(3.26mg,13.5umol)，溶于2mL N，N-二甲基甲酰胺中，加入2-(7-偶氮苯并三氮唑)-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸酯(20mg,52.6umol)，N,N-二异丙基乙胺(13mg,100umol)。室温反应1h，之后滴加4,7,10-三氧-1,13-十三烷二胺(22mg,100umol)，室温反应4h，之后加入三(2-羧乙基)膦还原30min。经浓缩，制备色谱纯化，冻干后得到白色固体(9b)2.2mg，产率36％。
中间体(9b)(2.2mg,4.9umol)溶于1mLpH7.4的磷酸缓冲液中，并迅速加入到含有2,2'-二硫二吡啶(22mg,98umol)的1mL pH7.4的磷酸缓冲液中。室温搅拌反应3h，之后以高效液相色谱纯化，冻干后得白色固体(9c)2.3mg，产率为70％。
中间体(9c)与氟代荧光素N-羟基琥珀酰亚胺酯分别溶于无水二甲基亚砜中，配为2mM溶液。各取100μL溶液，以1︰1比例混合，并加入少量N,N-二异丙基乙胺调节pH至8～9，室温摇床反应8h，之后以高效液相色谱纯化，冻干后得到黄色固体(9d)，溶于无水二甲基亚砜中，并以紫外可见吸收光谱定量，产率91％。
3,5-双(2-巯乙基)苯甲酸(9a)(30mg,0.14mmol)，溶于1mL N，N-二甲基甲酰胺，加入RRRRRK-Dabcyl(52.9mg,0.045mmol)、2-(7-偶氮苯并三氮唑)-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸酯(38.5mg,0.1mmol)以及N,N-二异丙基乙胺(35mg,0.27mmol)，室温反应12h。之后加入三(2-羧乙基)膦还原30min。制备色谱纯化，冻干后得到橙色固体(9e)51.2mg，产率82％。
将中间体(9d)和中间体(9e)分别溶于无水二甲基亚砜中，配为2mM溶液。各取100μL溶液，按1︰1当量投入2mL pH7.4的磷酸缓冲溶液中，反应30min，高效液相色谱纯化并冻干得到荧光探针(F1)，溶于无水二甲基亚砜中，并以紫外可见吸收光谱定量，产率91％。MALDI-TOF(m/z):2236.2[M+H]+。
实施例10
基于双二硫键连接物的还原响应型荧光探针的制备：
使用实施例9中的类似方法，以乙二胺为原料得到中间体(10d)。将其和多肽Ac-WGCGGCGRKKRRQRRR-NH2分别溶于无水二甲基亚砜中，配为2mM溶液。各取100μL溶液，按1︰1当量投入2mL pH7.4的磷酸缓冲溶液中，反应30min，高效液相色谱纯化并冻干得到荧光探针(F2)，溶于无水二甲基亚砜中，并以紫外可见吸收光谱定量，产率92％。MALDI-TOF MS(m/z):2674.4[M-H]-。
实施例11
体外模拟释放实验：
本发明中的双二硫连接物与传统的单二硫键在不同浓度的谷胱甘肽(GSH)溶液中的还原释放对比，试验中以1mM GSH模拟血液循环时的环境，10mM GSH细胞内释放时的环境。用于释放实验的化合物如下所示。其中，所使用的单二硫键连接物通过相应单体上屏蔽或减少巯基后，再经过氧化得到。
所用溶液在使用前均放置于带有橡胶塞的圆底烧瓶中用氮气鼓泡除氧。为了避免氧气的影响，所有过程均在厌氧培养箱中进行。具体过程如下：取0.2mL磷酸缓冲液(100mM,pH7.4)于1.5mL低蛋白吸附离心管中，分别加入50μL双/单二硫键化合物溶液(最终浓度为5uM)和0.25mL不同浓度的谷胱甘肽溶液。每隔一定时间，取40μL反应液于空离心管中迅速用液氮冷冻猝灭反应。待取样结束后，将每个样品进行高效液相色谱(HPLC)分析(进样体积30μL)定量，绘制动力学曲线拟合计算半衰期。不同单、双二硫键连接物在1mM及10mM GSH下的释放半衰期结果参见表1，提供的数据表明双二硫键连接物相比传统单二硫键连接物，具有可控的非线性还原响应性，可以作为前药中的连接物，能达到在血液循环中几乎不释放，而进入目标位点后快速释放的效用。对于不同的双二硫键连接物，如D2及D4，其具有不同的还原响应性，解决了在不同还原条件下释放的需求。其中，优选的双二硫键连接物D4的释放动力学曲线见图1。
表1
注*：半衰期极短，采样时间已经影响最后的结果。
注**：半衰期极长，720min仅断裂7％，无法拟合。
注***：参见Zhai,LX,et al.Chem.Eur.J.,20.52(2014):17507-14.
实施例12
实施例10中荧光探针F2的细胞成像实验使用Hela细胞，其在37℃、5％CO2下的环境中，于无血清的DMEM培养基中养殖。实验前，细胞接种于培养板中，每孔浓度105个，在上述条件下孵育24h后，去掉基质，并用PBS清洗。加入相应浓度的荧光探针F2，并孵育相应的时间。之后，使用荧光显微镜成像进行细胞成像实验(488nm激光激发)，实验结果见图2及图3。
荧光探针F2中的多肽对荧光基团氟代荧光素具有荧光猝灭效果，当双二硫键连接物断裂时，多肽与荧光基团分离，荧光会发生恢复。从细胞成像的结果上可见，当孵育4h时，2uM或5uM浓度的探针的成像中的荧光都较弱，说明探针并未发生或仅发生小部分断裂。当孵育24h时，2uM或5uM浓度的探针的成像中的荧光都有显著增强，说明探针大部分发生了断裂，使得荧光发生恢复。荧光成像的结果与体外模拟释放的结果相符合，该类双二硫键连接物具有非线性还原响应性。
图4给出10mM GSH还原荧光探针F2的荧光光谱。

Claims (5)

1.还原响应型含双二硫键的化学连接物，其特征在于其化学通式为：
其是由含双巯基的化合物SH-M1-SH及SH-M2-SH依靠各自的双巯基形成的双二硫键连接所构成的二聚体；其中SH是巯基，S是硫原子，M1及M2是除去巯基部分的残基结构；
SH-M1-SH选自具有以下化学通式的双巯基化合物：
SH-M2-SH选自具有以下化学通式的双巯基化合物：
2,3-二巯基丙醇、2,3-二巯基丙酸、1,2-二巯基丙胺、具有Cys-Xaa-Cys或Cys-Xaa-Xaa-Cys序列的由3-30氨基酸残基组成的多肽中的一种；
以上化学通式中Ar表示苯基；R1表示单键；Y表示羧基、氨基、羟基、叠氮基、磺酸基；R2表示氢，并且a为3；R3、R4各自独立地选自单键、1～3个碳原子的亚烷基；R5表示氢；
当SH-M1-SH为羧基苯二硫酚时，SH-M2-SH不能为羧基苯二硫酚；所述多肽中残基Xaa选自氨基酸甘氨酸(Gly，G)、丙氨酸(Ala，a)、缬氨酸(Val，V)、亮氨酸(Leu，L)、异亮氨酸(Ile，I)、苯丙氨酸(Phe，P)、色氨酸(Trp，W)、酪氨酸(Tyr，Y)、天冬氨酸(Asp，D)、天冬酰胺(Asn，N)、谷氨酸(Glu，E)、赖氨酸(Lys，K)、谷氨酰胺(Gln，Q)、甲硫氨酸(Met，M)、丝氨酸(Ser，S)、苏氨酸(Thr，T)、脯氨酸(Pro，P)、组氨酸(His，H)、精氨酸(Arg，R)中一种。
2.如权利要求1所述还原响应型含双二硫键的化学连接物，其特征在于形成二聚体的双巯基化合物SH-M1-SH及SH-M2-SH化学通式为：
3.如权利要求1所述还原响应型含双二硫键的化学连接物，其特征在于所述还原响应型含双二硫键的化学连接物的制备方法，以含双巯基的化合物为原料，通过二硫二吡啶活化或二甲亚砜氧化的方法制备，二甲亚砜氧化使用的溶剂为二甲基亚砜与pH 7.4磷酸缓冲液混合溶液，所述二甲基亚砜与pH 7.4磷酸缓冲液的体积比为20︰80，氧化巯基化合物摩尔浓度控制为1mM；二硫二吡啶与每个能够反应的巯基位点投料量摩尔比为(1～10)︰1，二硫二吡啶使用的溶剂为甲醇、乙醇、乙腈、水、二甲基亚砜、N，N-二甲基甲酰胺中的一种。
4.一种基于键间协同效应调控二硫键氧化还原响应性的方法，所述方法包括提供如权利要求1所述的一类还原响应型含双二硫键的化学连接物及其制备方法，所述方法由含双巯基的化合物SH-M1-SH及SH-M2-SH依靠各自的双巯基形成的双二硫键。
5.如权利要求1所述还原响应型含双二硫键的化学连接物在合成具有可控药物递送、释放及生物传感功能的分子的用途。
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