CN116754760B - 2,4-二硝基苯酚(dnp)与抗体可控断裂偶联的方法 - Google Patents
2,4-二硝基苯酚(dnp)与抗体可控断裂偶联的方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种2,4‑二硝基苯酚(DNP)与抗体可控断裂偶联的方法,包括使巯基醇氧化,形成双(2‑羟乙基)二硫醚;使双(2‑羟乙基)二硫醚氯甲酰化,获得氯甲酰化的双(2‑羟乙基)二硫醚,然后使氯甲酰化的双(2‑羟乙基)二硫醚与NHS反应,形成双(2‑羟乙基)二硫醚‑NHS酯;使DNP前驱体与醇胺反应,形成含氨基的DNP,然后使所述含氨基的DNP与双(2‑羟乙基)二硫醚‑NHS酯反应,获得DNP‑双(2‑羟乙基)二硫醚‑NHS酯,其中所述DNP前驱体为1‑氯‑2,4‑二硝基苯、1‑溴‑2,4‑二硝基苯、1‑碘‑2,4‑二硝基苯、或1‑氟‑2,4‑二硝基苯;以及使DNP‑双(2‑羟乙基)二硫醚‑NHS酯与抗体反应,获得DNP标记的抗体。
Description
技术领域
本发明涉及一种2,4-二硝基苯酚(DNP)与抗体可控断裂偶联的方法。
背景技术
免疫学检测主要通过利用抗体-抗原特异性,对体内需要检测的一些标志物进行免疫分析,但被检测物浓度低,需要偶联一些荧光基团进行级联放大。偶联物主要通过抗体上存在的一些高活性基团,如巯基、氨基、羟基、羧基以及其他可以偶联的基团,进行化学偶联。但存在一些问题。一是,大部分偶联物水溶性差,而抗体大部分都是在水溶液环境中,造成偶联物无法有效的溶于水溶液与抗体偶联;二是,偶联物上没有活化基团,需要进一步化学修饰,化学修饰本身可能会对偶联物产生一定影响;三是,偶联物与抗体之间存在偶联效率低的问题。因此,建立一种成熟的抗体偶联方法极其重要。理想的方法是通过简单的反应就能高效地将偶联物与抗体偶联。因此,点击反应,如比较经典的点击反应-叠氮与炔基的1,3-偶极环加成反应、D-A反应、巯基与巯基反应以及巯基与烯烃的反应等等,成为抗体偶联的理想方法。该类反应具有生物相容性好的特性,不会产生生物毒性,且水溶性好,反应条件温和,几乎不用加热,因此不会影响抗体的活性,产物不用特殊纯化,可以直接用于免疫反应。同时在高分子偶联、生物传感分析、药物-抗体偶联、纳米水凝胶的制备与应用方面也发挥着重要作用。
发明内容
本发明的目的是提供一种2,4-二硝基苯酚(DNP)与抗体可控断裂偶联的方法。
本发明所提供的2,4-二硝基苯酚(DNP)与抗体可控断裂偶联的方法,包括:
使巯基醇氧化,形成双(2-羟乙基)二硫醚;
使双(2-羟乙基)二硫醚氯甲酰化,获得氯甲酰化的双(2-羟乙基)二硫醚,然后使氯甲酰化的双(2-羟乙基)二硫醚与NHS反应,形成双(2-羟乙基)二硫醚-NHS酯;
使DNP前驱体与醇胺反应,形成含氨基的DNP,然后使所述含氨基的DNP与双(2-羟乙基)二硫醚-NHS酯反应,获得DNP-双(2-羟乙基)二硫醚-NHS酯,其中所述DNP前驱体为1-氯-2,4-二硝基苯、1-溴-2,4-二硝基苯、1-碘-2,4-二硝基苯、或1-氟-2,4-二硝基苯;以及
使DNP-双(2-羟乙基)二硫醚-NHS酯与抗体反应,获得DNP标记的抗体。
在某些实施方案中,所述巯基醇为巯基乙醇、巯基丙醇、巯基丁醇或巯基戊醇。
在某些实施方案中,在碱性条件下在所述相转移催化剂存在下使DNP前驱体与醇胺反应,形成含氨基的DNP。
在某些实施方案中,所述醇胺为甲醇胺、乙醇胺、3-氨基-1-丙醇、4-氨基-1-丁醇或5-氨基-1-丁醇。
在某些实施方案中,所述相转移催化剂为四丁基溴化铵、四丁基氟化铵、三乙基己基溴化铵或三乙基辛基溴化铵。
在某些实施方案中,在缚酸剂存在下,使所述氯甲酰化的双(2-羟乙基)二硫醚与所述NHS反应,形成所述双(2-羟乙基)二硫醚-NHS酯。
在某些实施方案中,所述缚酸剂为吡啶、三乙胺或乙二胺。
在某些实施方案中,所述氯甲酰化采用氯甲酰化试剂进行,所述氯甲酰化试剂为光气、双光气或三光气。
在某些实施方案中,在还原剂的存在下,所述DNP从DNP标记的抗体上解离下来。
在某些实施方案中,所述还原剂为GSH、二硫苏糖醇、二硫赤藓糖醇、三(2-甲酰乙基)膦盐酸盐或β-巯基乙醇。
本发明的2,4-二硝基苯酚(DNP)与抗体可控断裂偶联的方法,能将DNP偶联至抗体,同时在特定条件,又能将DNP从抗体上解离下来。制备的DNP标记的抗体具有可控断裂性的化学键。DNP标记的抗体以生物相容性极高的二硫键作为可控断裂的偶联位点,在还原性环境,如GSH,就能实现二硫键与巯基之间的可逆交换。
附图说明
图1示出了双(2-羟乙基)二硫醚的核磁共振氢谱图。
图2示出了双(2-羟乙基)二硫醚氯甲酰化核磁共振氢谱图。
图3示出了双(2-羟乙基)二硫醚-NHS酯核磁共振氢谱图。
图4示出了2,4-硝基苯氧基乙胺核磁共振氢谱图。
图5示出了DNP-双(2-羟乙基)二硫醚-NHS酯高效液相色谱图。
图6示出了DNP-双(2-羟乙基)二硫醚-NHS酯偶联至抗体上高效液相色谱图。
图7示出了DNP和Biotin标记的微珠荧光显色、荧光放大及还原剂处理后显微图。
具体实施方式
为实现上述目的,本发明提供了一种2,4-二硝基苯酚(DNP)与抗体可控断裂偶联的方法,包括(1)还原性二硫化合物的构建;(2)含NHS酯的二硫化合物的构建;3)将DNP偶联至双(2-羟乙基)二硫醚-NHS酯的一端;和(4)将DNP-双(2-羟乙基)二硫醚-NHS酯标记至抗体。
(1)还原性二硫化合物的构建
使巯基醇氧化,形成双(2-羟乙基)二硫醚。
在反应溶剂1中,以巯基醇为前驱体,通过氧化剂的作用,将巯基乙醇的巯基氧化成二硫键,从而构建可还原性断裂的二硫化合物-双(2-羟乙基)二硫醚。反应完后,通过硫代硫酸钠猝灭反应。
所述巯基醇为巯基乙醇、巯基丙醇、巯基丁醇或巯基戊醇,优选为巯基乙醇。所用氧化剂为O2、双氧水、单质碘或DMSO,优选为双氧水。所述巯基醇与氧化剂的摩尔比为1:1~1:1.5。所述反应溶剂1为乙酸乙酯、二氯甲烷、乙腈、***或四氢呋喃,优选为乙酸乙酯。反应温度为-20℃至室温;反应完后通过硅胶柱色谱分离纯化。
(2)含NHS酯的二硫化合物的构建
双(2-羟乙基)二硫醚氯甲酰化,获得氯甲酰化的双(2-羟乙基)二硫醚,然后使氯甲酰化的双(2-羟乙基)二硫醚与N-羟基丁二酰亚胺(NHS)反应,形成双(2-羟乙基)二硫醚-N-羟基丁二酰亚胺酯。
在反应溶剂2中,使双(2-羟乙基)二硫醚与氯甲酰化试剂反应,双(2-羟乙基)二硫醚上的羟基被氯甲酰化,获得双(2-羟乙基)二硫醚氯甲酸酯;在缚酸剂存在下,使氯甲酰化的双(2-羟乙基)二硫醚与NHS反应,形成双(2-羟乙基)二硫醚-NHS酯,从而构建能与氨基高效反应的NHS酯。
所述氯甲酰化试剂为光气、双光气、三光气等,优先为双光气。所述双(2-羟乙基)二硫醚与氯甲酰化试剂的摩尔比为1:1~1:5。所述反应溶剂2为二氯甲烷、***、或四氢呋喃,优选为***。反应温度为-20℃至室温,优选为0℃;反应后通过硅胶柱色谱进行分离纯化。所述双(2-羟乙基)二硫醚氯甲酸酯与NHS反应摩尔比为1:2~1:3;反应温度为-20℃~50℃,优选为0℃。所述缚酸剂为吡啶、三乙胺或乙二胺,优选为三乙胺。反应完后通过硅胶柱色谱进行分离纯化。
(3)将DNP偶联至双(2-羟乙基)二硫醚-NHS酯的一端
使DNP前驱体与醇胺反应,形成含氨基的DNP,然后使含氨基的DNP与双(2-羟乙基)二硫醚-NHS酯反应,获得DNP-双(2-羟乙基)二硫醚-NHS酯。
在碱性条件下在所述相转移催化剂存在下在反应溶剂3中使DNP前驱体与醇胺反应,形成含氨基的DNP。在反应溶剂4中使含氨基的DNP与双(2-羟乙基)二硫醚-NHS酯反应,获得DNP-双(2-羟乙基)二硫醚-NHS酯。DNP-双(2-羟乙基)二硫醚-NHS酯的一端含DNP,另一端含NHS酯的二硫化物。
所述DNP前驱体为1-氯-2,4-二硝基苯、1-溴-2,4-二硝基苯、1-碘-2,4-二硝基苯、或1-氟-2,4-二硝基苯,优选为1-氯-2,4-二硝基苯。所述醇胺为甲醇胺、乙醇胺、3-氨基-1-丙醇、4-氨基-1-丁醇或5-氨基-1-丁醇,优选为乙醇胺;所述反应溶剂3为甲苯、四氢呋喃或N,N-二甲基甲酰胺,优选为甲苯。所用碱为氢氧化钠、氢氧化钾、氢化钾或氢化钠,优选为氢氧化钾;所述相转移催化剂为四丁基溴化铵、四丁基氟化铵、三乙基己基溴化铵或三乙基辛基溴化铵,优选为四丁基溴化铵。DNP前驱体与醇胺反应的反应温度为室温至150℃,优选为70℃。含氨基的DNP与双(2-羟乙基)二硫醚-NHS酯的摩尔比为1:0.9~1:1.1,优选为1:1。所述反应溶剂4为二氯甲烷、四氢呋喃、甲醇、乙醇、乙酸乙酯等,优选为二氯甲烷。含氨基的DNP与双(2-羟乙基)二硫醚-NHS酯反应的反应时间为10min~6h,优选为1h;反应温度为0℃至室温,优选为室温。反应完后通过硅胶柱色谱进行分离纯化。
(4)DNP-双(2-羟乙基)二硫醚-NHS酯标记至抗体
使DNP-双(2-羟乙基)二硫醚-NHS酯与抗体反应,获得DNP标记的抗体。
在反应溶剂5中,使DNP-双(2-羟乙基)二硫醚-NHS酯与抗体反应。所述DNP-双(2-羟乙基)二硫醚-NHS酯与抗体的摩尔比为1:1~10:1,优选为1:1。反应溶剂5为DMSO。反应温度为0℃至室温,优选为室温;反应后通过超滤离心管离心纯化,洗涤3~5遍。
在还原性环境下可以将DNP标记的抗体上的DNP从抗体上裂解下来。其中,使用的还原剂为谷胱甘肽(GSH)、二硫苏糖醇、二硫赤藓糖醇、三(2-甲酰乙基)膦盐酸盐、或β-巯基乙醇,优先为GSH。
以下实施例旨在说明本发明而不是对本发明的进一步限定。
实施例1
(1)双(2-羟乙基)二硫醚的合成
称取巯基乙醇(10g)溶于100ml二氯甲烷溶液中,缓慢滴加10ml 30%双氧水溶液,加入0.01g单质碘作为指示剂,室温反应,反应完后,用饱和硫代硫酸钠溶液洗涤三次,再用饱和食盐水洗涤三次,无水硫酸钠干燥过夜,旋干溶剂,硅胶柱色谱分离纯化,洗脱剂为乙酸乙酯。图1示出了双(2-羟乙基)二硫醚的核磁共振氢谱图。
(2)双(2-羟乙基)二硫醚-NHS酯的合成
称取双(2-羟乙基)二硫醚(1g)溶于10ml干燥的二氯甲烷溶液,分子筛除水过夜。称取三光气(1.9g)溶于干燥的10ml二氯甲烷溶液,0℃滴加双(2-羟乙基)二硫醚溶液,反应12h,获得氯甲酰化的双(2-羟乙基)二硫醚,反应完后,旋干溶剂,硅胶柱色谱分离纯化,洗脱剂为二氯甲烷。称取氯甲酰化的双(2-羟乙基)二硫醚(1g)溶于10ml干燥的二氯甲烷溶液,称取0.82g NHS溶于10ml***溶液中,并缓慢滴加至上述溶液中,冰浴反应,缓慢滴加1ml三乙胺,反应12h,反应完后,抽滤,旋干溶剂,硅胶柱色谱分离纯化(洗脱剂为二氯甲烷),获得双(2-羟乙基)二硫醚-NHS酯。图2示出了双(2-羟乙基)二硫醚氯甲酰化核磁共振氢谱图。图3示出了双(2-羟乙基)二硫醚-NHS酯核磁共振氢谱图。
(3)DNP偶联至双(2-羟乙基)二硫醚-NHS酯一端
称取1g 1-氯-2,4-二硝基苯溶于20ml乙腈溶液,加入0.28g氢氧化钾和0.01g四丁基溴化铵,加热至50℃反应1h,然后加入0.3g乙醇胺,继续反应12h。反应完后,硅胶柱色谱分离纯化,二氯甲烷/甲醇混合溶剂洗脱,获得2,4-硝基苯氧基乙胺。将制备好的2,4-硝基苯氧基乙胺(0.5g)与双(2-羟乙基)二硫醚-NHS酯(0.96g)溶于10ml干燥的二氯甲烷溶液,反应30min,旋干溶剂,硅胶柱色谱分离纯化(洗脱剂为氯甲烷/甲醇混合溶剂),获得DNP-双(2-羟乙基)二硫醚-NHS酯。
图4示出了2,4-硝基苯氧基乙胺核磁共振氢谱图。图5示出了DNP-双(2-羟乙基)二硫醚-NHS酯高效液相色谱图。
(4)将DNP-双(2-羟乙基)二硫醚-NHS酯标记至抗体
DNP-双(2-羟乙基)二硫醚-NHS酯(0.01g)溶于0.5ml DMSO中,配制成40mM溶液,将抗体与DNP-双(2-羟乙基)二硫醚-NHS酯等摩尔比加入,室温孵育20min,amicon离心管离心分离,DMSO洗涤3次,获得DNP标记的山羊抗兔IgG抗体。图6示出了DNP-双(2-羟乙基)二硫醚-NHS酯偶联至抗体上高效液相色谱图。
实施例2
(1)DNP和Biotin(生物素)标记的聚苯乙烯微球制备
超纯水配制吗啉乙磺酸缓冲液(MES,PH6.0,0.1M),与羧基聚苯乙烯微球配制成5mg/mL的悬浮液;然后加入利用MES配制的1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺(EDC)溶液和N-羟基丁二酰亚胺(NHS)溶液,使悬浮液体系中EDC和NHS的浓度为25mg/mL,震荡1h。
将10nmol寡核苷酸链干粉(5’-NH2-AGATCGTACGCTATCAGTGCCAC-3’)用MES缓冲液溶解后,与已活化的聚苯乙烯微球悬浮液混合,其中聚苯乙烯微球含量为5mg,室温震荡反应4小时,然后离心,利用PBST缓冲液(8mM Na2HPO4,2mM KH2PO4,10mM KCl,140mM NaCl,0.05%(V/V)Tween-20,pH 7.2~7.4)清洗三次(5000rpm,5min)后,用超纯水重悬,得到聚苯乙烯微球共价结合有寡核苷酸链的微珠溶液。
实验组:取0.1mg偶联有寡核苷酸链的聚苯乙烯微珠,加入100μL反应混合物[40mMTris-HCl(pH值7.5)、10mM MgCl2、5mM DTT、1.5μM DNP-11-ddATP、0.5μM寡核苷酸链(5’-TGTGGCACTGATAGCGTACGATCT-3’)、0.05u/μLSequenase版本2.0DNA聚合酶],37℃下孵育5分钟,离心,PBST清洗三次(5000rpm,5min),得到DNP标记的聚苯乙烯微球溶液。
对照组:取0.1mg偶联有寡核苷酸链的聚苯乙烯微珠,加入100μL反应混合物[40mMTris-HCl(pH值7.5)、10mM MgCl2、5mM DTT、1.5μM Biotin-11-ddGTP、0.5μM寡核苷酸链(5’-CGTGGCACTGATAGCGTACGATCT-3’)、0.05u/μLSequenase版本2.0DNA聚合酶],37℃下孵育5分钟,离心,PBST清洗三次(5000rpm,5min),得到Biotin标记的聚苯乙烯微球溶液。
(2)微珠荧光显色
实验组:取用DNP标记后的聚苯乙烯微球0.1mg,加入200μL 5μg/mL的Dinitrophenyl-KLH Polyclonal Antibody,Alexa FluorTM488(Alexa FluorTM488荧光基团标记的DNP抗体),37℃孵育30min,PBST缓冲液离心(5000rpm,3min)清洗3次,荧光显微镜拍照记录,如图7A。
对照组:取用Biotin标记后的聚苯乙烯微球0.1mg,加入200μL 5μg/mL的488-streptavidin conjugate(iFluor 488-标记链霉亲和素偶联物),37℃孵育30min,离心(5000rpm,3min),PBST缓冲液清洗3次,荧光显微镜拍照记录,如图7D。
(3)微珠荧光级联放大
按照实施例1步骤制备DNP标记的山羊抗兔IgG抗体作为二抗,用PBST缓冲液稀释标记后的二抗溶液至5μg/mL;分别取实验组和对照组所得荧光显色后的微珠,加入200μL稀释后的二抗溶液,37℃孵育30min,PBST清洗3次;再分别加入200μL 5μg/mL的Dinitrophenyl-KLH Polyclonal Antibody,Alexa FluorTM488(Alexa FluorTM488荧光基团标记的DNP抗体),37℃孵育30min,PBST清洗3次,荧光显微镜拍照记录,如图7B(实验组)和7E(对照组)。
(4)还原剂处理断裂二硫键
超纯水配置10mM谷胱甘肽(GSH)溶液,分别取实验组和对照组所得荧光级联放大后的微珠,加入200μL谷胱甘肽(GSH)溶液,37℃孵育30min,离心,PBST清洗3次,荧光显微镜拍照记录,如图7C(实验组)和7F(对照组)。
DNP介导的荧光级联放大原理:Dinitrophenyl-KLH Polyclonal Antibody,AlexaFluorTM488特异性识别DNP引入荧光基团,DNP标记的山羊抗兔IgG抗体作为二抗特异性识别Dinitrophenyl-KLH Polyclonal Antibody,Alexa FluorTM488再次引入新的DNP开启循环,利用一抗与二抗的级联识别实现荧光信号的级联放大。
如图7所示,实验组经过荧光级联放大后的微珠(图7B),相比较于荧光放大前(图7A),微珠的亮度明显提升;同等条件下用生物素标记、链霉亲和素偶联荧光基团显色的微珠,荧光级联放大前后(图7D、图7E)微珠亮度变化不大,说明并没有荧光级联放大效果。两组实验可以表明DNP标记的二抗特异性识别了Alexa FluorTM488荧光基团标记的DNP抗体并且引入了新的DNP启动了荧光级联放大,说明DNP与抗体连接成功,并且DNP的连接并不影响抗体的活性。
如图7所示,实验组经过GSH处理后的微珠(图7C),微珠亮度明显减弱至荧光级联放大前水平,对照组无明显变化(图7F),说明还原性环境使二硫键断裂,导致DNP标记的山羊抗兔IgG抗体上连接的DNP脱落,从而导致后续级联放大的荧光标记抗体脱落,微珠荧光减弱。
Claims (9)
1.一种2,4-二硝基苯酚与抗体可控断裂偶联的方法,包括:
使巯基乙醇氧化,形成双(2-羟乙基)二硫醚;
使双(2-羟乙基)二硫醚氯甲酰化,获得氯甲酰化的双(2-羟乙基)二硫醚,然后使氯甲酰化的双(2-羟乙基)二硫醚与NHS反应,形成双(2-羟乙基)二硫醚-NHS酯;
使2,4-二硝基苯酚前驱体与醇胺反应,形成含氨基的2,4-二硝基苯酚,然后使所述含氨基的2,4-二硝基苯酚与双(2-羟乙基)二硫醚-NHS酯反应,获得2,4-二硝基苯酚-双(2-羟乙基)二硫醚-NHS酯,其中所述2,4-二硝基苯酚前驱体为1-氯-2,4-二硝基苯、1-溴-2,4-二硝基苯、1-碘-2,4-二硝基苯、或1-氟-2,4-二硝基苯;以及
使2,4-二硝基苯酚-双(2-羟乙基)二硫醚-NHS酯与抗体反应,获得2,4-二硝基苯酚标记的抗体。
2.根据权利要求1所述的方法,其特征在于,在碱性条件下在相转移催化剂存在下使2,4-二硝基苯酚前驱体与醇胺反应,形成含氨基的2,4-二硝基苯酚。
3.根据权利要求2所述的方法,其特征在于,所述醇胺为甲醇胺、乙醇胺、3-氨基-1-丙醇、4-氨基-1-丁醇或5-氨基-1-丁醇。
4.根据权利要求2或3所述的方法,其特征在于,所述相转移催化剂为四丁基溴化铵、四丁基氟化铵、三乙基己基溴化铵或三乙基辛基溴化铵。
5.根据权利要求1所述的方法,其特征在于,在缚酸剂存在下,使所述氯甲酰化的双(2-羟乙基)二硫醚与所述NHS反应,形成所述双(2-羟乙基)二硫醚-NHS酯。
6.根据权利要求5所述的方法,其特征在于,所述缚酸剂为吡啶、三乙胺或乙二胺。
7.根据权利要求1所述的方法,其特征在于,所述氯甲酰化采用氯甲酰化试剂进行,所述氯甲酰化试剂为光气、双光气或三光气。
8.根据权利要求1所述的方法,其特征在于,在还原剂的存在下,2,4-二硝基苯酚标记从2,4-二硝基苯酚标记的抗体上解离下来。
9.根据权利要求8所述的方法,其特征在于,所述还原剂为GSH、二硫苏糖醇、二硫赤藓糖醇、三(2-甲酰乙基)膦盐酸盐或β-巯基乙醇。
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