CN107475453B

CN107475453B - 一种检测鸭瘟病毒ul48基因的引物以及rt-pcr和荧光定量pcr检测方法

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Publication number: CN107475453B
Application number: CN201710856164.8A
Authority: CN
Inventors: 汪铭书; 吴莉萍; 张雨薇; 程安春
Original assignee: Sichuan Agricultural University
Current assignee: Sichuan Agricultural University
Priority date: 2017-09-21
Filing date: 2017-09-21
Publication date: 2021-03-23
Anticipated expiration: 2037-09-21
Also published as: CN107475453A

Abstract

本发明公开了一种检测鸭瘟病毒UL48基因的引物以及RT‑PCR和荧光定量PCR检测方法，引物序列见SEQ ID No:1和2，采用该引物对样品RNA、DNA或cDNA进行RT‑PCR和荧光定量PCR检测，荧光定量PCR反应体系为2×SYBR Premix EX Taq^TMII 5μL，模板0.5μL，PCR Primer各0.5μL，添加ddH₂O至体系为10μL；反应程序95℃预变性30s，95℃变性10s，53.9℃退火和延伸30s，共40个循环。采用该引物和检测方法可简便、快捷的检测鸭瘟病毒及相应基因和基因转录情况，对潜伏感染病毒的鸭子进行及时处理，该引物特异性好，灵敏度高，检测结果可靠。

Description

一种检测鸭瘟病毒UL48基因的引物以及RT-PCR和荧光定量 PCR检测方法

技术领域

本发明属于鸭瘟病毒检测技术领域，具体涉及一种检测鸭瘟病毒UL48基因的引物以及RT-PCR和荧光定量PCR检测方法。

背景技术

鸭瘟病毒(Duck Plague Virus，DPV)又称鸭疱疹病毒1型，属于α疱疹病毒，DPV感染所致的鸭瘟(Duck plague，DP)引起鸭/鹅急性、热性、败血性疾病，是一种高度致死性传染病。

鸭瘟的传染源主要是病鸭和病鹅，以及带毒的家禽和野生水禽。感染潜伏期通常为2至4天。传播途径主要是消化道，也可经交配、眼结膜或呼吸道传播。口服、滴鼻、点眼、静脉注射、肌肉注射、皮下注射、泄殖腔接种等人工感染途径均可使易感鸭致病。该病一年四季均可流行，但以***和秋季流行最为严重。

鸭一旦感染鸭瘟病毒，其初期临床症状体温升高常达43℃或以上，呈高稽留热、精神沉郁、食欲减退或废绝，突出病状是流泪和肿头，病鸭的头和颈部皮肤肿胀，出现典型“大头瘟”的症状；同时病鸭伴随下痢，眼角膜浑浊，严重者可能产生溃疡的症状，病理变化主要表现为急性败血症，直肠和十二指肠最为严重，产蛋母鸭的卵巢滤泡增大，卵泡的形态不整齐。

根据鸭瘟的临床症状特点可对疾病进行初步的诊断，可禽类疾病种类繁多，临床表现存在相似的情况，容易造成误判并耽误疾病的最佳治疗和防控的时间；而且，未发病的鸭子体内常出现潜伏感染并会引起病鸭免疫抑制，鸭子更易感染疾病。故潜伏感染鸭子的检测与筛选也显得尤为重要。实验室检测方法是目前主要的检测DPV的手段，但现有方法中如中和试验、ELISA等免疫学手段检测病毒所需时间长，而传统PCR方法适合中到高拷贝数病毒的检测，在鸭瘟防控工作中容易出现疏漏，使得体内DPV含量较低的鸭子不能得到及时处理，时刻威胁着鸭场中其它未感染的健康鸭。

发明内容

针对现有技术中的上述不足，本发明提供一种检测鸭瘟病毒UL48基因的引物以及RT-PCR和荧光定量检测方法，可简便、快捷的检测鸭瘟病毒及相应基因转录情况，对潜伏感染病毒的鸭子进行及时处理，且引物及检测方法灵敏度高，特异性好，检测结果可靠。

为解决上述的技术问题，本发明采用的技术方案为：

一种用于检测鸭瘟病毒UL48基因的引物，引物序列为：

UL48-F：5’-GCGGGAAATATCATCACGACT-3’；

UL48-R：5’-CATTCAATAAGACGACGCCAT-3’。

一种鸭瘟病毒UL48基因的RT-PCR检测方法，包括以下步骤：

(1)提取样品RNA，经过反转录反应合成cDNA；

(2)以cDNA为模板，采用上述引物UL48-F和UL48-R进行RT-PCR反应，反应体系为：2×PCR Mix10μL，模板1μL，8μmol/L的UL48-F和UL48-R各1μL，添加ddH₂O至反应体系为20μL；

反应程序为95℃预变性30s，95℃变性10s，54℃退火25s，72℃延伸30s，共40个循环。

一种鸭瘟病毒UL48基因的荧光定量PCR检测方法，包括以下步骤：

(1)绘制标准曲线；

(2)模板的制备：提取样品总DNA或RNA，RNA经过反转录反应合成cDNA；

(3)以DNA或cDNA为模板，采用上述引物UL48-F和UL48-R以及内参基因引物进行荧光定量PCR反应，反应体系为SYBR Premix EX Taq^TMII(2×)5μL，模板0.5μL，PCR Primer各0.5μL，其中UL48-F和UL48-R的浓度为8μmol/L，内参基因引物浓度为10μmol/L，然后添加ddH₂O至反应体系为10μL；反应条件为：95℃预变性30s，95℃变性10s，53.9℃退火和延伸30s，共40个循环，读取检测样品的Ct值；

(4)根据样品Ct值和标准曲线计算出该样品的DNA或RNA拷贝数或相对表达量。

进一步地，步骤(3)中内参基因引物序列为：

β-actin-F：5’-CCGGGCATCGCTGACA-3’

β-actin-R：5’-GGATTCATCATACTCCTGCTTGCT-3’。

一种鸭瘟病毒UL48基因荧光定量PCR检测用试剂盒，该试剂盒包括独立分装的以下成分：SYBR Premix EX Taq^TMII、UL48-F、UL48-R、β-actin-F、β-actin-R、pMD18T-β-actin、pMD18T-UL48和RNase Free dH₂O；

其中，pMD18T-β-actin通过以下方法制备得到：以鸭RNA为模板，采用引物β-actin-F和β-actin-R进行RT-PCR扩增，将扩增产物进行回收，与载体pMD18T连接，转化至DH5α大肠杆菌中，经筛选和鉴定，制得；

pMD18T-UL48通过以下方法制备得到：以鸭瘟病毒DNA为模板，然后采用引物UL48-全基因-F和UL48-全基因-R进行PCR扩增，将扩增产物进行回收，与载体pMD18T连接，转化至DH5α大肠杆菌中，经筛选和鉴定，制得；

UL48-全基因-F和UL48-全基因-R的序列为：

UL48-全基因-F：5’-GGATCCGATATGGATACATTTGATGAACTCGAC-3’；

UL48-全基因-R：5’-GAATTCTGTAGGCTAATTATCTGGCGAGAAC-3’。

进一步地，UL48-F和UL48-R的浓度为8μmol/L；β-actin-F和β-actin-R的浓度为10μmol/L；pMD18T-β-actin的拷贝数为3.95×10¹⁰copies/μL，pMD18T-UL48的拷贝数为1.80×10¹⁰copies/μL。

上述试剂盒独立分装的成分具体为：

SYBR Premix EX Taq^TMII(2X) 1000μL；

UL48-F引物(8μmol/L) 100μL；

UL48-R引物(8μmol/L) 100μL；

β-actin-F引物(10μmol/L) 100μL；

β-actin-R引物(10μmol/L) 100μL；

pMD18T-β-actin(3.95×10¹⁰copies/μL) 10μL；

pMD18T-UL48(1.75×10¹⁰copies/μL) 10μL；

RNase Free dH₂O 1000μL×2；

其中SYBR Premix EX Taq^TMII(2X)具体配比参照宝生物工程(大连)有限公司的SYBR Premix EX Taq^TMII(2X)，上述剂量为100次量。

本发明的有益效果为：

采用本发明提供的引物和荧光定量PCR检测方法进行重复性检测，其重复性好，检测时间短，成本低；采用该引物对不含目的基因的样品进行普通PCR或RT-PCR扩增，均无特异性条带，说明该引物具有良好的特异性；采用该引物和荧光定量PCR检测方法最低可检测到1.80×10²copies/μL的模板，说明其灵敏度高。

附图说明

图1为UL48基因的PCR和RT-PCR的电泳图。

图2为UL48基因荧光定量PCR反应条件的优化结果图。

图3为实施例2中β-actin基因扩增曲线图和标准曲线图；其中，图3-1为β-actin基因扩增曲线图；图3-2为β-actin基因标准曲线图。

图4为实施例2中UL48基因扩增曲线图和标准曲线图；其中，图4-1为UL48基因扩增曲线图；图4-2为UL48基因标准曲线图。

图5为UL48基因的溶解曲线图。

图6为荧光定量PCR检测UL48基因的特异性检测图。

图7为荧光定量PCR检测UL48基因的灵敏度检测图。

图8为24只鸭血液中鸭瘟病毒UL48基因的扩增曲线图。

图9为荧光定量PCR检测ICP4基因的特异性检测图。

图10为荧光定量PCR检测ICP4基因的灵敏度检测图。

图11为TK基因PCR扩增曲线图和标准曲线图；其中，图11-1为TK基因PCR扩增曲线图；图11-2为TK基因标准曲线图。

图12为gC基因PCR扩增曲线图和标准曲线图；其中，图12-1为gC基因PCR扩增曲线图；图12-2为gC基因标准曲线图。

具体实施方式

下面对本发明的具体实施方式进行描述，以便于本技术领域的技术人员理解本发明，但应该清楚，本发明不限于具体实施方式的范围，对本技术领域的普通技术人员来讲，只要各种变化在所附的权利要求限定和确定的本发明的精神和范围内，这些变化是显而易见的，一切利用本发明构思的发明创造均在保护之列。

实施例1设计特异性引物及RT-PCR反应

1、引物设计与合成

根据GenBank发布的DPV UL48基因序列(登录号EU195110)，用Oligo 7软件设计UL48基因PCR和RT-PCR检测的引物，由上海英潍捷基生物技术有限公司合成，其序列为：

UL48-F：5’-GCGGGAAATATCATCACGACT-3’(SEQ ID No:1)；

UL48-R：5’-CATTCAATAAGACGACGCCAT-3’(SEQ ID No:2)；可扩增长度为146bp。

2、PCR检测

(1)鸭胚成纤维细胞的培养

取10日龄发育良好的健康鸭胚，取出胚体，剔除头、翅、爪和内脏，用PBS液冲洗3次去除残留血液及胚液；剪碎成1mm³的小块，加胰酶于37℃消化1min，PBS洗涤、离心去除胰酶；加入含10％小牛血清的MEM，吹打混匀细胞并用8层纱布和漏斗过滤细胞于培养瓶中，放入CO₂细胞培养箱培养，逐日观察细胞生长情况。

(2)DPV-CHv强毒株的增殖

待步骤(1)中细胞生长至覆盖率90％以上，加入DPV-CHv强毒细胞毒液500μL并同时加入6mL MEM营养液孵育2h，之后弃孵育液，用无菌PBS洗涤细胞表面一次，加入细胞维持液15mL/瓶，37℃培养至显微镜下观察到明显细胞病变。

(3)DNA的提取

将出现明显病变的细胞反复冻融三次，取0.5mL病毒液加0.5mL消化缓冲液和10μL蛋白酶K(10mg/mL)混匀，56℃水浴过夜，置4℃待SDS析出后，于4℃6000×g离心5min，取上清；加0.5mL饱和酚，颠倒混匀5min，于4℃13000×g离心5min，取上层水相；加0.5mL酚/氯仿/异戊醇(25/24/1)，颠倒混匀5min，于4℃13000×g离心5min，取上层水相；加0.5mL氯仿/异戊醇(24/1)颠倒混匀5min，于4℃13000×g离心5min，取上层水相；加1mL冰冷的无水乙醇和1/10体积3mol/L NaAc(pH5.2)，-20℃静置2h以上；于4℃13000×g离心20min沉淀核酸；弃上清，加1mL70％乙醇；于4℃13000×g离心20min，将EP管倒扣于吸水纸上，置通风处10min使乙醇充分挥发；加50μL TE溶解核酸，核酸蛋白仪检测OD₂₆₀和OD₂₈₀的值以判断核酸浓度及纯度，-20℃保存备用；

(4)PCR条件的优化与检测

利用UL48-F/R引物，以DPV-CHv DNA为模板，对PCR反应的各条件进行优化，获得PCR扩增体系为：2×PCR Mix 10μL，模板1μL，8μmol/L的UL48-F和UL48-R各1μL，添加ddH₂O至反应体系为20μL；

扩增程序为：95℃预变性30s，95℃变性10s，54℃退火25s，72℃延伸30s，共40个循环，其电泳结果见图1。

3、RT-PCR检测

(1)RNA的提取与完整性检测：向接种DPV的DEF中加入1mL Trizol试剂后转移至1.5mL EP管，加入200μL氯仿，用力振荡后静置5min，于4℃，12000r/min离心15min；吸取上清加入等体积异丙醇，轻轻上下颠倒后静置5min，于4℃，12000r/min离心10min，弃上清；沿管壁轻轻加入1mL 75％乙醇，轻柔颠倒使有机物溶解，于4℃，7500r/min离心10min，弃上清，于通风处干燥20min；加入30μL RNase free water溶解，于-20℃冻存备用；需注意的是，全程在冰上操作以减少RNA降解，并提前熔好1％的琼脂糖电泳胶，取5μL进行电泳检测总RNA的完整性，通过凝胶成像仪可观察到28s、18s、5s三条带，说明总RNA完整性良好；

(2)反转录反应：去除总RNA中的DNA，按照宝生物反转录试剂盒PrimeScript^TMRTreagent Kit with gDNA Eraser说明进行反转录反应，合成cDNA。

(3)以cDNA为模板，利用引物UL48-F和UL48-R进行RT-PCR反应，扩增体系为：2×PCR Mix 10μL，模板1μL，8μmol/L的UL48-F和UL48-R各1μL，添加ddH₂O至反应体系为20μL；

图1中，1和2泳道为DPV-Chv DNA的PCR电泳结果，3、4、5泳道为DPV-Chv cDNA的PCR电泳结果，6泳道为DEF的DNA，7泳道为DEF的cDNA。

4、PCR和RT-PCR方法的特异性

利用上述建立的PCR和RT-PCR方法对本实验室保存的DPV强毒Chv株、DPV弱毒Cha株、鸭肝炎病毒、雏鹅新型肠炎病毒、禽流感H5N1、鸭肿头败血症病毒、番鸭细小病毒、鸭坦布苏病毒、鸭圆环病毒、小鹅瘟病毒、鸭乙型肝炎病毒、肠炎沙门氏菌(No.50338)、大肠杆菌(078)、鸭疫里默氏杆菌、巴氏杆菌进行PCR和RT-PCR检测，结果只有DPV强毒与弱毒株病毒检测后出现146bp的特异性扩增条带，而其它细菌、病毒及阴性对照均无特异性扩增。说明上述方法特异性良好，可用于鸭瘟病毒UL48基因的PCR和RT-PCR检测。

实施例2建立荧光定量PCR检测方法

1、引物的设计与合成

根据GenBank发布的DPV UL48基因序列(登录号EU195110)及文献(李倩.鸭瘟病毒UL48基因的生物信息学分析及原核表达[D].四川农业大学,2011)设计包括整个UL48基因的ORF的克隆引物UL48全基因-F/R(扩增长度为1425bp)；UL48基因的荧光定量PCR为实施例1中的引物UL48-F/R；在做荧光定量PCR时，要准确检测目的基因的表达量是降低还是升高，当得出结果后，如果没有对照，并不知道是目的基因本身的表达量降低或者升高，还是操作过程中造成了误差，如提RNA时的损失等，因此，需同时检测另外的基因作为参照，该参照基因没有组织特异性，对外界环境刺激反应不灵敏，其表达量恒定，本实验中选β-actin为内参基因，β-actin-F和β-actin-R为内参基因引物(扩增长度为177bp)，其序列如下：

UL48-全基因-F：5’-GGATCCGATATGGATACATTTGATGAACTCGAC-3’(SEQ ID No:3)；

UL48-全基因-R：5’-GAATTCTGTAGGCTAATTATCTGGCGAGAAC-3’(SEQ ID No:4)；

β-actin-F：5’-CCGGGCATCGCTGACA-3’(SEQ ID No:5)；

β-actin-R：5’-GGATTCATCATACTCCTGCTTGCT-3’(SEQ ID No:6)。

2、提取病毒DNA或RNA，并将RNA反转录形成cDNA，同实施例1。

3、UL48基因克隆与鉴定

参照文献(李倩.鸭瘟病毒UL48基因的生物信息学分析及原核表达[D].四川农业大学,2011)。以DPVCHv DNA为模板，使用UL48全基因扩增引物UL48全基因-F/R进行PCR扩增，PCR的反应体系见表1，PCR的反应程序为：94℃30s，然后进入94℃30s、55℃45s、72℃90s，共30个循环，最后72℃延伸7min；PCR产物经过8g/L的琼脂糖凝胶电泳之后可以看见一条1425bp左右的DNA条带，扩增片段的大小与UL48基因预期的大小相符合。

表1 PCR的反应体系

取40μl PCR产物，在1.0％琼脂糖凝胶上电泳，用DNA胶回收试剂盒回收目的片段，操作步骤按照GelExtractionKit说明进行，最终得到30μL的纯化产物。将回收的目的片段按试剂盒DNALigationKitVer.2.1连接到pMD18-T载体中，反应体系为：pMD18-T，1μl；Solution I，4μl；胶回收产物，5μl。16℃水浴连接过夜。将得到的重组质粒命名为pMD18T-UL48，按照常规化学转化法步骤转化感受态DH5α大肠杆菌。

将pMD18T-UL48克隆菌培养后用质粒抽提试剂盒抽提质粒，将此质粒作PCR鉴定和BamHI+EcoRI双酶切鉴定，PCR反应过程同上，双酶切反应体系见表2。酶切反应环境是37℃4h，然后将PCR和酶切产物跑核酸电泳作鉴定。

表2 双酶切反应体系

pMD18T-UL48经过PCR和双酶切鉴定，结果表明重组质粒***片段与预期相符。将pMD18T-UL48送TaKaRa(大连)公司进行测序，测序结果和已知序列一致，说明质粒构建成功。

4、内标基因标准模板的克隆与重组质粒的构建

以DEF的RNA为模板，使用β-actin-F/R引物进行RT-PCR扩增，然后对扩增产物进行电泳分析，可扩增出大小约200bp的条带，再把扩增产物回收，纯化，连接到pMD18-T上，最后转化到DH5α大肠杆菌细胞内，提取其质粒DNA，筛选鉴定，得到重组质粒pMD18T-β-actin，委托Invitrogen公司进行序列测定，测序结果经比对证明鸭β-actin基因成功克隆到pMD18T载体上，说明成功构建了质粒pMD18T-β-actin。

5、荧光定量PCR条件的优化

采用10μL体系和两步PCR法在Bio-Rad CFX96实时荧光定量PCR反应仪上进行条件优化，反应体系为2×SYBR Premix EX Taq^TMII 5μL，模板0.5μL，PCR Primer各0.5μL，然后添加ddH₂O至反应体系为10μL；循环条件为：95℃预变性30s，95℃变性10s，退火和延伸温度30s，扩增40个循环，设定***在退火和延伸阶段收集荧光。对荧光定量PCR反应的引物浓度以及退火和延伸温度进行筛选优化，以得到最佳的反应条件，荧光定量PCR反应条件优化方案如表3所示：

表3 荧光定量PCR反应条件优化

优化结果显示当UL48引物终浓度为0.40μmol/L、退火和延伸温度为53.9℃时Ct值最小，高于或低于这两个指标Ct值都有所增加，并出现斜率下降，PCR扩增效率降低的现象，因此，UL48基因的荧光定量PCR反应的最佳终引物浓度为0.40μmol/L(见图2-1，图中1的引物终浓度为0.40μmol/L，2-9为其它浓度)，最佳退火/延伸温度为53.9℃(见图2-2，图中1的退火温度为53.9℃，2-7为其它温度)。

6、标准曲线的绘制

分别以质粒pMD18T-UL48和pMD18T-β-actin作为标准品，按公式：拷贝数(copies/μl)＝6.02×10²³×浓度(g/μl)÷(碱基数×660道尔顿/碱基)(g/mol)，计算拷贝数。采用pH值为7.4的TE或去离子水分别将其稀释成10倍系列浓度梯度，每个浓度3个重复，按照反应体系：SYBR Premix EX Taq^TMII(2×)5μL，模板质粒0.5μL，PCR Primer各0.5μL(UL48-F和UL48-R的浓度为8μmol/L；β-actin-F和β-actin-R为10μmol/L)，添加ddH₂O至反应体系为10μL；反应程序为95℃预变性30s，95℃变性10s，53.9℃退火和延伸30s，共40个循环，在Bio-Rad CFX96实时荧光定量PCR仪进行检测，通过Bio-Rad CFX Manager绘制标准曲线，同时根据溶解曲线分析验证引物的特异性。

分别测定pMD18T-UL48和pMD18T-β-actin质粒浓度并转化为初始拷贝数，以初始拷贝数的10^-2为起始浓度，再分别以10^-1为梯度稀释(表4)后作为模板进行荧光定量PCR扩增得到的扩增曲线使用Bio-Rad CFX软件绘制出相应的标准曲线(见图3和图4)，得出的标准曲线显示Ct值与起始模板浓度呈高度相关性(β-actin，R²＝0.996；UL48，R²＝0.997)，图5为UL48基因的溶解曲线图，根据溶解曲线可验证设计的引物的特异性。

表4 梯度稀释的标准品

7、荧光定量PCR的重复性、特异性和灵敏度检测

(1)重复性检测

使用优化后的荧光定量PCR条件，设立拷贝数1.80×10⁸～1.80×10³ copies/μL的UL48质粒的6个稀释度的标准样品，每个样品进行三个重复，计算每个稀释度的标准样品的平均Ct值、标准差(SD)值和变异系数(CV)值以检测UL48基因荧光定量PCR方法的重复性，结果见表5。

表5 UL48基因荧光定量PCR检测方法的重复性结果

由表5可知，每个稀释度三个重复标准品Ct值的SD都在0.5以内，说明荧光定量PCR方法重复性良好。

(2)特异性效果检测

用建立的UL48基因荧光定量PCR检测方法对DPV强毒Chv株、DPV弱毒Cha株、鸭肝炎病毒、雏鹅新型肠炎病毒、禽流感H5N1、鸭肿头败血症病毒、番鸭细小病毒、坦布苏病毒、圆环病毒、小鹅瘟病毒、鸭乙型肝炎病毒、肠炎沙门氏菌(No.50338)、大肠杆菌(078)、鸭疫里默氏杆菌、巴氏杆菌进行检测以评估荧光定量PCR方法的特异性，结果见图6，图6中1和2分别为DPV强毒Chv株、DPV弱毒Cha株，3-16为其它细菌、病毒及阴性对照。由图6可知，只有DPV强毒与弱毒株病毒DNA经荧光定量PCR后出现特异性扩增，而其它细菌、病毒及阴性对照均无特异性扩增，说明该荧光定量PCR方法特异性良好。

(3)灵敏度检测

用稀释度为1.80×10⁴～1.80×10¹copies/μL的UL48质粒标准品作为模板，以优化后的条件检测荧光定量PCR的灵敏度，结果见图7，图7中曲线1-4为稀释度1.80×10⁴～1.80×10¹copies/μL的pMD18T-UL48标准品，曲线5为阴性对照。经检测荧光定量PCR方法最低可准确检测到1.80×10²copies/μL的模板。

实施例3用RT-PCR方法检测UL48基因的转录

1、DPV感染DEF后不同时间样品的制备

按照实施例1中的方法培养DEF于细胞培养皿中，取毒株DPV CHv 200μL，接种于培养皿中，孵育30分钟后直接加入维持液，阴性对照不接种病毒，分别于30min、24h和48h时收集细胞样品。

2、DNA和RNA的提取

按照实施例1中的方法提取DNA和RNA，并进行RNA完整性检测。

3、RNA反转录为cDNA

去除总RNA中DNA以及Total mRNA反转录反应的方法，按照宝生物反转录试剂盒PrimeScript^TMRT reagent Kit with gDNA Eraser说明书进行。

4、用RT-PCR检测UL48基因的转录情况

以反转录的cDNA为模板，以相同时间点的DNA为对照，利用实施例1中的UL48-F/R引物及方法进行PCR检测，结果显示：24h和48h时cDNA和DNA的检测均为阳性；而30min时DNA检测为阳性，cDNA的检测为阴性。表明接种病毒后30min，已有病毒吸附在DEF上或进入细胞中，但UL48基因尚未开始转录；24h和48h时有UL48基因的转录。因此，基于DPV-UL48基因的RT-PCR方法可检测UL48基因的转录，用于UL48基因类型的鉴定、UL48基因的转录分析等。

实施例4采用实施例2建立的荧光定量PCR方法进行鸭瘟病毒检测

1、临床样品的收集

于某山区的一家民办养鸭场中随机挑选24只鸭和人工感染DPV的30只鸭进行颈部静脉血液收集，并向收集的血液中加入抗凝剂避免血液凝固。

2、样品DNA的提取

3、荧光定量PCR检测

采用实施例2建立的DPV UL48荧光定量PCR方法对临床样品的DNA进行检测，并与文献(宋涌,程安春,汪铭书,等.聚合酶链反应(PCR)检测鸭瘟病毒方法的建立和应用[J].中国兽医杂志,2005,41(2):17-20.)报道的鸭瘟病毒PCR检测方法进行比较，人工感染DPV鸭子的DNA两种方法检测均为阳性，随机选取的24只鸭的临床样品比较结果见表6。

表6 24只鸭血液中鸭瘟病毒荧光定量PCR与PCR检测结果

由表6可知，运用UL48基因荧光定量PCR方法检测鸭瘟病毒DNA阳性的鸭子有9只，阳性检出率为38％；运用传统PCR方法检测出鸭瘟阳性鸭5只，阳性检出率为21％。传统PCR方法检测为阳性的编号与本发明建立的DPV UL48基因荧光定量PCR方法检测出的阳性鸭编号对应，可以确定该鸭场有感染鸭瘟病毒；并且，使用传统PCR方法检测为DPV DNA阴性的样品可以被DPV UL48基因荧光定量PCR方法检测为阳性，说明DPV UL48基因荧光定量PCR方法灵敏度更高，检测结果更准确，荧光定量PCR扩增曲线见图8。

实施例5采用荧光定量PCR方法检测鸭瘟潜伏感染

1、ICP4、TK和gC荧光定量PCR方法的建立及标准曲线的绘制

1.1ICP4荧光定量PCR方法的建立及标准曲线的绘制

(1)引物的设计与合成

根据GenBank发布的DPV ICP4(IE180)基因序列(登录号EU195083.1)，用Oligo 7软件设计4对引物，ICP4基因的克隆引物ICP4-4-F/R(扩增长度为4881bp)可扩扩增出整个ICP4基因的ORF，ICP4基因的定量PCR和定量RT-PCR检测引物ICP4-1-F/R(扩增长度为113bp)，ICP4基因的鉴定引物ICP4-2-F/R(扩增长度为112bp)和ICP4-3-F/R(扩增长度为141bp)用于获得ICP4基因克隆后的鉴定以及内标基因鸭β-actin引物β-actin-F和β-actin-R(可扩增长度为177bp，与实施例2中相同)，由上海英潍捷基生物技术有限公司合成。

ICP4-1-F：5’-GCTTCACCTGCCCGGTCAC-3’(SEQ ID No:7)；

ICP4-1-R：5’-CCACTGTCGGCACATCTAGCA-3’(SEQ ID No:8)；

ICP4-2-F：5’-CCGACTTTTGTGATCCCGAAC-3’(SEQ ID No:9)；

ICP4-2-R：5’-CCACCAAAGCACTCGAGCA-3’(SEQ ID No:10)；

ICP4-3-F：5’-GCTCCGCAAACAATGTGCTT-3’(SEQ ID No:11)；

ICP4-3-R：5’-TTTTCATCAGACCACATAGGCAT-3’(SEQ ID No:12)；

ICP4-4-F：5’-ATGGCCAAGACGCAGTACC-3’(SEQ ID No:13)；

ICP4-4-R：5’-TCAGAAAAAGTCACGACAAGCT-3’(SEQ ID No:14)；

(2)病毒DNA和mRNA的提取同实施例1

(3)ICP4基因克隆与鉴定

以DPV-ChvDNA或cDNA为模板，使用ICP4-4-F/R引物进行PCR扩增，将扩增产物进行1.0％琼脂糖凝胶电泳，可扩增出大小约为4.8kb的条带。

取40μl PCR产物，在1.0％琼脂糖凝胶上电泳，用DNA胶回收试剂盒回收目的片段，操作步骤按照GelExtractionKit说明书进行，获得30μl纯化产物，将纯化产物按试剂盒DNALigationKitVer.2.1连接到pMD19-T载体中，反应体系为：pMD19-T，1μl；Solution I，4μl；胶回收产物，5μl；16℃水浴连接过夜，得到重组质粒pMD19T-ICP4，按照常规化学转化法转化至DH5α大肠杆菌细胞内。

将挑取的菌落按照E.Z.N.A.Plasmid Mini Kit I质粒提取试剂盒说明提取质粒DNA，并分别用ICP4-1-F/R、ICP4-2-F/R与ICP4-3-F/R引物进行PCR检测，分别可以得到113bp、112bp与141bp左右三个特异性条带，同时初步鉴定为阳性的克隆委托Invitrogen公司进行序列测定，测序结果经比对证明鸭瘟病毒ICP4基因成功克隆到载体上，说明成功构建了质粒pMD19T-ICP4。

(4)荧光定量PCR条件的优化

按实施例2中的荧光定量PCR条件的优化方法进行，优化结果显示当ICP4引物终浓度为0.40μmol/L、退火和延伸温度为53.9℃时Ct值最小，高于或低于这两个指标Ct值都有所增加，并出现斜率下降，PCR扩增效率降低的现象，因此，ICP4基因的荧光定量PCR反应的最佳引物终浓度为0.40μmol/L，最佳退火/延伸温度为53.9℃。

(5)标准曲线的绘制

按照实施例2中标准曲线的绘制方法进行，测定质粒pMD19T-ICP4的浓度并转化为初始拷贝数，以初始拷贝数的10^-2为起始浓度，再分别以10^-1为梯度稀释(表7)后作为模板进行荧光定量PCR扩增得到的扩增曲线使用Bio-Rad CFX软件绘制出相应的标准曲线，得出的标准曲线显示Ct值与起始模板浓度呈高度相关性(β-actin，R²＝0.996；ICP4，R²＝0.998)，绘制的ICP4基因的溶解曲线图，只有一个狭小的单峰，说明引物特异性好。

表7 梯度稀释的标准品

(6)重复性检测

使用优化后的荧光定量PCR条件，设立拷贝数1.75×10⁸～1.75×10³copies/μL的ICP4质粒的6个稀释度的标准样品，每个样品进行三个重复，计算每个稀释度的标准样品的平均Ct值、标准差(SD)值和变异系数(CV)值以检测ICP4基因荧光定量PCR方法的重复性，结果见表8。

表8 ICP4基因荧光定量PCR检测方法的重复性结果

由表8可知，每个稀释度三个重复标准品Ct值的SD都在0.5以内，说明荧光定量PCR方法重复性良好。

(7)特异性效果检测

用建立的ICP4基因荧光定量PCR检测方法对DPV强毒Chv株、DPV弱毒Cha株、鸭肝炎病毒、雏鹅新型肠炎病毒、禽流感H5N1、鸭肿头败血症病毒、番鸭细小病毒、坦布苏病毒、圆环病毒、小鹅瘟病毒、鸭乙型肝炎病毒、肠炎沙门氏菌(No.50338)、大肠杆菌(078)、鸭疫里默氏杆菌、巴氏杆菌进行检测以评估荧光定量PCR方法的特异性，结果见图9，图9中1和2分别为DPV强毒Chv株、DPV弱毒Cha株，3-16为其它细菌、病毒及阴性对照。由图9可知，只有DPV强毒与弱毒株病毒DNA经荧光定量PCR后出现特异性扩增，而其它细菌、病毒及阴性对照均无特异性扩增，说明该荧光定量PCR方法特异性良好。

(8)灵敏度检测

用稀释度为1.75×10⁴～1.75×10¹copies/μL的ICP4质粒标准品作为模板，以优化后的条件检测荧光定量PCR的灵敏度，结果见图10，图10中曲线1-4为稀释度1.75×10⁴～1.75×10¹copies/μL的pMD19T-ICP4标准品，曲线5为阴性对照。经检测荧光定量PCR方法最低可准确检测到1.75×10²copies/μL的模板。

1.2TK基因荧光定量PCR方法的建立及标准曲线的绘制

参照文献(葛菡.鸭瘟强毒TK基因的原核表达及在感染鸭组织亚细胞定位研究[D].四川农业大学,2008.)构建pMD18T-TK质粒作为标准品，并合成对应引物。

利用pMD18T-TK质粒及其对应引物进行荧光定量PCR反应，其扩增曲线和标准曲线分别见图11，得到的标准曲线相关系数R²＝0.999，标准曲线显示Ct值与起始模板浓度呈高度相关性，根据公式Y＝-3.386X+38.891可用于鸭瘟病毒TK基因的定量检测与拷贝数计算。

1.3gC基因荧光定量PCR方法的建立及标准曲线的绘制

参照文献(练蓓.鸭瘟病毒gC基因部分特征分析及gC基因疫苗诱导鸭免疫发生的研究[D].四川农业大学,2011.)构建pMD18T-gC质粒作为标准品，并合成对应引物。

利用pMD18T-gC质粒及其对应引物进行荧光定量PCR反应，其扩增曲线和标准曲线分别见图12，得到的标准曲线相关系数R²＝0.999，标准曲线显示Ct值与起始模板浓度呈高度相关性，根据公式Y＝-3.222X+37.511可用于鸭瘟病毒gC基因的定量检测与拷贝数计算。

2、鸭瘟潜伏感染模型的建立

选取25只1月龄来自非DPV疫区、未接种鸭瘟疫苗的健康鸭，采集静脉血，用文献报道的PCR方法(宋涌,程安春,汪铭书,等.聚合酶链反应(PCR)检测鸭瘟病毒方法的建立和应用[J].中国兽医杂志,2005,41(2):17-20.)和实施例1建立的DPV-UL48基因的PCR和RT-PCR方法进行DPV检测，确定鸭体内病原阴性，对鸭子使用DPV CHv强毒株肝脏毒进行攻毒，攻毒量为0.5LD₅₀/只；检测鸭泄殖腔拭子以及静脉血中病毒含量，及时淘汰病死鸭，选取不再向外排毒的耐过鸭作为鸭瘟潜伏感染模型。

随机选取5只固定的鸭，并于dpi5、dpi10、dpi15、dpi20、dpi25收集泄殖腔拭子，PCR检测病毒DNA，PCR结果显示攻毒后泄殖腔拭子中病毒检出率从最初的100％降至第15天40％，到第25天已检测不到病毒DNA。攻毒前25只实验鸭，攻毒后耐过的21只鸭，PCR静脉血检测结果均为阴性。

3、鸭三叉神经中鸭瘟病毒ICP4、UL48、TK、gC基因mRNA表达量

以实施例2建立的UL48基因荧光定量PCR方法及本实施例中建立的的ICP4、TK和gC基因荧光定量PCR检测方法对反转录获得的鸭三叉神经样品cDNA进行定量检测。以内参基因β-actin的拷贝数为内标，评价待测基因表达水平。对不同采样时间点鸭三叉神经中DPV的ICP4、UL48、TK和gC基因表达量进行统计比较。

于dpi26、dpi32、dpi35、dpi39、dpi42、dpi46、dpi49随机选取3只鸭子无菌采取三叉神经并进行RNA抽提与反转录，再用荧光定量PCR方法检测并计算拷贝数，将ICP4、UL48、TK、gC基因mRNA拷贝数与β-actin基因mRNA拷贝数相除得到比值，用于评价待测基因表达水平，来消除样本、RNA抽提、反转录以及荧光定量PCR反应的差异；结果显示，所有鸭三叉神经中都可检测到ICP4与UL48基因mRNA；部分鸭可以检测到TK与gC基因mRNA；将只能检测到ICP4与UL48基因的鸭分为I组，将检测出TK或gC基因的鸭分类到II组；两组鸭三叉神经中4种基因mRNA拷贝数以及相对表达量统计结果如表9和10所示。

表9 I组中ICP4、UL48、TK、gC与β-actin基因mRNA拷贝数

表10 II组中ICP4、UL48、TK、gC与β-actin基因mRNA拷贝数

本实验使用人工感染鸭瘟病毒的方法构建了DPV CHv株鸭潜伏感染模型，在全部潜伏感染鸭三叉神经中都可检测到立即早期基因ICP4与UL48特异性mRNA，部分鸭三叉神经中可以检测到早期TK与晚期基因gC特异性mRNA。

序列表

<110> 四川农业大学

<120> 一种检测鸭瘟病毒UL48基因的引物以及RT-PCR和荧光定量PCR检测方法

<160> 14

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

gcgggaaata tcatcacgac t 21

<210> 2

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

cattcaataa gacgacgcca t 21

<210> 3

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

ggatccgata tggatacatt tgatgaactc gac 33

<210> 4

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

gaattctgta ggctaattat ctggcgagaa c 31

<210> 5

<211> 16

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

ccgggcatcg ctgaca 16

<210> 6

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

ggattcatca tactcctgct tgct 24

<210> 7

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

gcttcacctg cccggtcac 19

<210> 8

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

ccactgtcgg cacatctagc a 21

<210> 9

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

ccgacttttg tgatcccgaa c 21

<210> 10

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

ccaccaaagc actcgagca 19

<210> 11

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

gctccgcaaa caatgtgctt 20

<210> 12

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 12

ttttcatcag accacatagg cat 23

<210> 13

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 13

atggccaaga cgcagtacc 19

<210> 14

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 14

tcagaaaaag tcacgacaag ct 22

Claims

1.一种用于检测鸭瘟病毒UL48基因的引物，其特征在于，引物序列为：

UL48-F：5’-GCGGGAAATATCATCACGACT-3’；

UL48-R：5’-CATTCAATAAGACGACGCCAT-3’。

2.一鸭瘟病毒UL48基因荧光定量PCR检测用试剂盒，其特征在于，该试剂盒包括独立分装的以下成分：SYBR Premix EX Taq^TMII、权利要求1所述的UL48-F、权利要求1所述的UL48-R、β-actin-F、β-actin-R、pMD18T-β-actin、pMD18T-UL48和RNase Free dH₂O；

其中，β-actin-F：5’-CCGGGCATCGCTGACA-3’

β-actin-R：5’-GGATTCATCATACTCCTGCTTGCT-3’；

pMD18T-β-actin通过以下方法制备得到：以鸭RNA为模板，采用引物β-actin-F和β-actin-R进行RT-PCR扩增，将扩增产物进行回收，与载体pMD18T连接，转化至DH5α大肠杆菌中，经筛选和鉴定，制得；

UL48-全基因-F和UL48-全基因-R的序列为：

UL48-全基因-F：5’-GGATCCGATATGGATACATTTGATGAACTCGAC-3’；

UL48-全基因-R：5’-GAATTCTGTAGGCTAATTATCTGGCGAGAAC-3’。

3.根据权利要求2所述的鸭瘟病毒UL48基因荧光定量PCR检测用试剂盒，其特征在于，UL48-F和UL48-R的浓度为8μmol/L。

4.根据权利要求2所述的鸭瘟病毒UL48基因荧光定量PCR检测用试剂盒，其特征在于，β-actin-F和β-actin-R的浓度为10μmol/L。

5.根据权利要求2所述的鸭瘟病毒UL48基因荧光定量PCR检测用试剂盒，其特征在于，pMD18T-β-actin的拷贝数为3.95×10¹⁰copies/μL，pMD18T-UL48的拷贝数为1.80×10¹⁰copies/μL。